Sunteți pe pagina 1din 1

Optimizarea unei metode de izolare ADN din bob

(gru, orz i secar)


Daniel Cristina 1, 2,*, Matilda Ciuca 1 i Calina-Petruta Cornea 2
1 - Institutul Naional de Cercetare i Dezvoltare Agricol (INCDA) Fundulea, 915200 Clrai, Romnia
2- Universitatea de tiine Agronomice i Medicin Veterinar (USAMV), 011464, Bucuresti, Romania
*E-mail: danielcristina89@gmail.com
INTRODUCERE
Programele moderne de amelioarea datorit progresului n genetic, biologie molecular i cultur a esuturilor, se desfaoar astzi cu
ajutorul uneltelor genetice moleculare. Selecia genotipic, n special la nivelul ADN, poate fi exploatat n selecia asistat de markeri (MAS)
pentru identificarea recombinanilor n populaiile segregante.
Amplificarea ADN este vitala pentru detecia unor fragmente specifice de ADN, aceasta fiind influenat n mod direct de metoda de extracie
utilizat. Prezena peretelui celular rigid, polizaharidele, proteinele i inhibitorii ADN polimerazelor (tanini, alcaloizi i polifenoli) fac izolarea
ADN din cereale o sarcin dificil. Metodele de izolare ADN sunt influenate n principal de factori precum cantitatea de material necesar i
disponibilitatea, numrul de pai i soluiile utilizate n protocolul de extracie etc.
Scopul acestui studiu a constat n evidenierea unei metode de izolare ADN optim pentru izolarea ADN dintr-un singur bob (gru, orz i
secar). Pentru realizarea acestui scop au fost testate i comparate patru metode de izolare ADN (o metod cu CTAB i trei metode pe baz de
SDS).

MATERIALE SI METODE
Materialul vegetal a fost obinut de la INCDA Fundulea i a constat din boabe de la 3 tipuri de cereale, respectiv, gru (soiul Izvor ce prezint
gena de rezisten la rugina brun Lr34), orz (soiul Scnteia) i secar (soiul Harkovskaya). Pentru fiecare metoda de izolare s-au mojarat cte
12 boabe individuale (cte 4 boabe din fiecare genotip). Cantitatea de material rezultat n urma mojararii boabelor a variat ntre 30 si 60 mg.
Tampoanele de extracie utilizate sunt prezentate n tabelul 1 iar etapele protocoalelor de izolare ADN sunt prezentate n tabelul 2. Eliminarea
proteinelor din amestecul tampon/prob, n cazul metodelor CTAB i SDS 1, a fost realizat utiliznd amestec diclormetan:alcool izoamilic
(24:1) n locul amestecului cloroform:alcool izoamilic. Diclormetanul reprezint o alternativ mai ieftin, mai putin toxic la cloroform (Chaves,
1995). Calitatea ADN extras a fost evaluat cu ajutorul msurtorilor spectofotometrice, electroforez pe gel de agaroz i amplificare PCR.
Tabel 1. Tampoane de extracie Tabel 2. Etapele protocoalelor de extracie
Etap CTAB SDS 1 SDS 2 SDS 3
CTAB SDS 1 SDS 2 SDS 3 Tampon de extracie 600 l (proaspt pregtit) 500 l 500 l (proaspt pregtit) 500 l
Incubare 65C 60 60 - 30
100mM Rcire probe 2-3 2-3 - -
100mM Tris 100mM Tris 100mM Tris
Tris
Incubare 4-7C - - - 15
Vortexare - - 1 -
700mM NaCl - 500mM NaCl - Mixare cu 1:1 vol. 200 l Mixare cu 250 l Acetat de
Mixare cu 270 l Acetat de potasiu
Purificare ADN Diclormetan:alcool izoamilic (24:1, Acetat de potasiu 3M (conc. fin. amoniu 6M (conc. fin.
50mM 3M (conc. fin. 1.62M)
50mM EDTA 50mM EDTA 50mM EDTA V:V) 1.2M) 3M)
EDTA
Vortexare - - 2 -
Incubare 4-7C - - - 15
2% CTAB 1.5% SDS 1% SDS 1.25% SDS Centrifugare 12 9500 RCF 15 7690 RCF 15 16055 RCF 15 7690 RCF
>500 l supernatant amestecat cu >400 l supernatant mixed with
- - 2.5% D-Sorbitol - Purificare ADN 1:1 vol. Diclormetan:alcool 1:1 vol. Diclormetan:alcool - -
izoamilic(24:1, V:V) izoamilic(24:1, V:V)
Centrifugare 12 9500 RCF 10 7690 RCF - -
2%
- - N-Lauroylsarcosine -
Tratament RN-az 45
sodium salt 5l NaCl (5M) la 100l prob + 2 vol. Etanol absolut (inut la -20C)
Precipitare ADN
*opional, pentru o precipitare mai bun, probele se in pe ghea 2-3
140mM Centrifugare 6 16055 RCF
- - -
-mercaptoethanol Splare pelet 200-300 l Tampon splare (76% Etanol, 10mM NH4OAc) 200 l Etanol 70%
Centrifugare 5 18620 RCF
Uscare pelet 10-30 la temperature camerei
100 l TE (cantitatea de TE se modific n funie de dimensiunea peletului) > probele sunt inute peste noapte la 4-7C pentru dizolvarea
Dizolvare pelet
peletului
Dac peletul nu este dizolvat n ziua urmtoare se poate muta faza apoas/supernatantul n tuburi noi nainte de verificarea
Opional
cantitativ/calitativ a ADN.

REZULTATE I DISCUII
Calitatea i cantitatea ADN sunt factori critici ce influeneaz amplificarea PCR. Analiza comparativ a profilelor
electroforetice (Fig.1) a evideniat benzi clare pentru toate metodele aplicate. Metodele SDS2 i SDS3 au
prezentat n general un profil electroforetic mai bun, urmate de metodele SDS1 i CTAB.
Rezultatele spectofotometrice au artat un raport A260/A280 cuprins ntre 1.767-2.146 n cazul metodei cu
CTAB, 1.693-1.860 n cazul metodei SDS1, 1.612-1.843 pentru metoda SDS2 i 1.569-1.746 pentru metoda
SDS3. Concentraiile ADN au variat ntre 20-195ng/l, concentraii mai mici fiind obinute cu metoda SDS3. Figura 1. Profil electroforetic pentru verificarea calitativ i
cantitativ a ADN
Reaciile de amplificare au fost efectuate utiliznd urmtorii markeri: cssfr5-marker funcional pentru selecia genei Lr34 la gru (Lagudah,
2009; Fig. 2), HvBM5A-exon2 utilizat pentru stabilirea haplotipurilor genei VRN-H1 la orz (Zlotina, 2013; Fig. 3) i SCM9 marker SSR pentru
secar (Saal and Wricke, 1999; Fig. 4). De asemenea, a fost testat amplificarea i cu markerii ISSR 17898B i UBC818 (Fig. 5).

Figura 2. Profil electroforetic obinut cu markerul Figura 3. Profil electroforetic obinut Figura 4. Profil electroforetic obinut Figura 5. Profil electroforetic obinut cu markerii ISSR 17898B i UBC 818
cssfr5 cu markerul HvBM5A-exon2 cu markerul SCM9

Rezultatele noastre au evideniat c detergentul SDS este mai potrivit pentru izolarea ADN din bob dect detergentul CTAB, iar dintre
metodele pe baz de SDS s-a remarcat metoda SDS3 care are un cost/prob mai sczut, timp mai redus de realizare a izolrii ADN iar
reaciile de amplificare au prezentat rezultate bune pentru cele trei specii de cereale cu toi markerii moleculari testai.

Sursa de finantare: Ministerul Agriculturii si Dezvoltarii Rurale - Proiect ADER116 (2015-2018)


Sesiunea anuala de referate tiintifice a INCDA Fundulea, 12 Mai 2017, ASAS, Bucuresti