Sunteți pe pagina 1din 12

Izolarea i confirmarea Listeria monocytogenes

Consecina a epidemiilor de listerioz, metodele de izolare si identificare a germenilor din


genul Listeria si mai ales specia Listeria monocytogenes au nregistrat un important progres. Timpul
necesar pentru detectarea speciei L.monocytogenes s-a scurtat considerabil de la cteva
saptamni la 2-3 zile. Pe lnga metodele bacteriologice s-au dezvoltat metode imunologice
(ELISA,ELFA, tehnici de separare magnetica). n paralel cu metodele imunologice s-au dezvoltat si
numeroase metode de biologie moleculara (PCR) .

1. METODE BACTERIOLOGICE
Majoritatea procedeelor de izolare si mbogatire selectiva pentru detectarea speciei Listeria
monocytogenes se bazeaza pe rezistenta acestei bacterii la anumiti agenti selectivi care inhiba
dezvoltarea florei de asociatie.
Agentii selectivi cel mai frecvent utilizati n prepararea mediilor de mbogatire selectiva
includ: acriflavina, acidul nalidixic, clorura de litiu, feniletanolul, moxalactamul si altii .
Procedeele de detectare a acestei specii bacteriene n produsele alimentare sau n spatiile
de prelucrare a alimentelor, cele mai raspndite sunt cele recomandate de USDA -FSIS (US
Departament of Agriculture - Food Safety Inspection Service) pentru detectarea speciei Listeria
monocytogenes n carne si produsele din carne si de FDA (Food and Drug Administration), n lapte
si produsele lactate.

1.1. PROCEDEUL FDA


Acest procedeu implica o mbogatire initiala a 25g sau 25ml de proba n 225ml LEB (Listeria
enrichment broth). LEB contine TSB la care se adauga 0,6% extract de drojdie, 50mg
cicloheximida, 15mg acriflavina si 40mg acid nalidixic /litru.

1
Probele se incubeaza la 30C/24-48h, o modificare a procedeului original care cere o
mbogatire de 1-7 zile la 30 oC. Urmeaza transplantarea de pe LEB pe mediile: Oxford si LPM
(lithium chloride phenylethanol moxalactam), ambele medii nlocuiesc agarul Mc Bride modificat
(MMA), recomandat initial ca mediu selectiv de izolare. Mediile se incubeaza la 35C/48h apoi
coloniile trebuie confirmate ca apartin speciei Listeria monocytogenes. Testele de confirmare includ
examinarea coloniilor alb-bleo n lumina oblica la 45 o, mobilitatea, catalaza, hemoliza pe agarul cu
snge, testul CAMP, rosu-metil, Voges Proskauer, fermentarea manitolului, xilozei si ramnozei .
Procedeul FDA a fost conceput, n mod special pentru optimizarea izolarii speciei Listeria
monocytogenes n lapte si produsele lactate.

1.2.PROCEDEUL USDA- FSI


Procedeul de mbogatire selectiva USDA-FSIS pentru izolarea speciei Listeria
monocytogenes din carne, a fost dezvoltat de Mc Clain and Lee. Ulterior, acest procedeu a fost
utilizat cu succes si pentru produsele lactate si probele de mediu.
De asemenea, acest protocol include o mbogatire initala a 25ml sau 25g proba n 225ml
mediu LEB 1, care nlocuieste bulionul initial de mbogatire UVM (University of Vermont Medium).
Bulionul de mbogatire primara LEB 1 contine pe litru: 5g proteoza- peptona, 5g triptona, 5g
Leb Lemco, 5g extract de drojdie, 20g clorura de sodiu, 12g fosfat disodic - 7- hidratat, 1,35 fosfat
monobazic de potasiu, 1g esculina, 20g acid nalidixic, 1,2mg acriflavina.
Urmeaza incubarea la 30C/20-24h. Apoi 0,1ml mediu de mbogatire primara se transfera n
10ml bulion de mbogatire secundara Fraser si se incubeaza la 35 oC/ 24h si 40h.
Bulionul de mbogatire secundara Fraser, contine pe litru: 52g UVM, 3g clorura de litiu, 25mg
acriflavina si 0,5g citrat feric de amoniu.
Se incubeaza la 35C/24-48h, dupa care probele se trec pe agar Oxford modificat(MOX),
care se incubeaza la 35C/24h si se examineaza coloniile tipice de Listeria. Hidroliza esculinei si
reactia ulterioara cu citratul feric de amoniu, determina producerea unui precipitat negru n jurul
coloniilor de Listeria pe agarul MOX. Coloniile tipice sunt transplantate pe agar cu 5% snge de
2
cal. Coloniile transparente, betahemolitice sunt transplantate n bulion BHI, care se incubeaza peste
noapte la 35oC si se efectueaza testele de confirmare prezentate la procedeul FDA.
1.3. PROCEDEUL NGFIS
O metoda larg raspndita n Europa, pentru detectarea speciei Listeria monocytogenes n
alimente este metoda NGFIS, recomandata de Netherland Goverment Food Inspection Service,
elaborata de Van Netten si col.
Acesti autori au raportat o sensibilitate superioara a acestei metode, fata de procedeul
USDA, cnd se urmareste detectarea speciei Listeria monocytogenes din alimente n care se afla
sub nivelul de 10CFU/ml.
n procedeul NGFIS, pentru mbogatirea selectiva se utilizeaza bulionul L-PALCAMY, cu
incubare la 30oC/24-48h, apoi cultura se trece pe agar PALCAM.
Bulionul de mbogatire selectiva L-PALCAMY contine la litru de apa distilata: 23g peptona
Oxoid, 5g extract de drojdie, 5g Lab Lemco, 5g lapte peptonizat Oxoid, 5g Na Cl, 5g D-manitol, 0,8g
esculina, 0,5g citrat feric de amoniu, 80mg rosu fenol, 100000UI polimixina B, 5mg acriflavina, 10g
clorura de litiu, 30mg ceftazidime, moxalactam si 25ml emulsie de galbenus de ou.
Agarul PALCAM contine la litrul de apa distilata: 39g agar Columbia, 0,5g D-glucoza, 10g D-
manitol, 0,8g esculina, 0,5g citrat feric de amoniu, 80mg rosu fenol, 100000UI polimixina B, 5mg
acriflavina, 15g clorura de litiu si 20mg ceftazidime sau moxalactam.
Numeroase studii au urmarit compararea diferitelor procedee de izolare a speciei Listeria
monocytogenes din produsele alimentare. Doyle and Schoeni, au comparat procedeul FDA, cu
metoda de mbogatire la rece (Gray) si cu un procedeu propriu de mbogatire selectiva, SEP,
(selective enrichment procedure). S-a urmarit izolarea prin aceste procedee a speciei Listeria
monocytogenes dintr-un lot de brnza "soft ripened" contaminat. Prezenta bacteriei a fost
confirmata, n 41 din 90 de probe examinate. Prin procedeul de mbogatire la rece, prezenta
bacteriei a fost detectata n 21 probe, n timp ce prin procedeul FDA, numai n 16 probe.
n cadrul unui studiu, asupra factorilor de risc alimentari pentru listerioza sporadica, n
perioada noiembrie 1988, decembrie 1990, Hayes si col., au condus un studiu comparativ al celor 3
procedee microbiologice de izolare a bacteriei din 899 probe de alimente. Sensibilitatea de
3
detectare pentru fiecare metoda a fost: 65% pentru procedeul FDA, 74% pentru procedeele USDA
si NGFIS. Folosind o combinatie a ultimelor doua procedee, sensibilitatea de detectare a crescut la
90%. Pe baza acestor rezultate CDC a adoptat utilizarea simultana a metodelor USDA si NGFIS
pentru izolarea acestei bacterii din alimente.

1.4. METODOLOGIA DE IZOLARE UTILIZATA N TARA NOASTRA


n tara nostra, se utilizeaza o metodologie de izolare si identificare a speciei Listeria
monocytogenes din produsele alimentare de origine animala, n care sunt incluse 3 metode de
izolare: USDA, TERPLAN si MERCK.
Procedeul USDA a fost prezentat anterior.
Metoda TERPLAN utilizeaza 4 medii de cultura si anume: un bulion de mbogatire, agarul
Oxford, mediile TSA si TSB.
Bulionul de mbogatire contine acid nalidixic, hidroxid de potasiu, triptona, peptona, dextroza,
fosfat dipotasic, extract de drojdie si apa distilata. Mediul TSA este un agar cu triptona din soia, iar
mediul TSB este un bulion cu triptona din soia si extract de drojdie.
Proba nsamntata n bulionul de mbogatire se incubeaza 48h la 30 oC, dupa care se fac
strieri pe agarul Oxford. Incubarea se realizeaza n aceleasi conditii. Coloniile caracteristice pentru
Listeria spp. sunt mici, nconjurate de un halou negru, 3-5 astfel de colonii se transplanteaza n
mediile TSA si TSB.
Metoda MERCK utilizeaza un bulion de mbogatire si agarul MERCK.
Bulionul de mbogatire contine: triptona, glucoza, clorura de sodiu, tiocianat de potasiu,
tiamina si tripaflavina n apa distilata. Agarul MERCK contine: triptona, glucoza, clorura de sodiu,
tiamina, tripaflavina, acid nalidixic, agar si apa distilata.
Proba se nsamnteaza n bulionul de mbogatire, se incubeaza 48h, la 30 oC, apoi se fac
strieri pe agarul MERCK. Se incubeaza n aceleasi conditii si 3-5 colonii caracteristice (mici cu
centrul galben-verzui si periferia transparenta usor verde- albastruie), se transplanteaza n bulion si
agar nutritiv.

4
n continuare se executa testele pentru identificare din care amintim: mobilitatea, reactia
catalazei, reactia oxidazei, fermentarea glucidelor, testul de hemoliza si testul CAMP. Dupa ce
bacteria izolata a fost identificata ca Listeria monocytogenes, urmeaza serotipizarea tulpinii
respective. Datorita faptului ca majoritatea cazurilor de listerioza la om sunt determinate de trei
serotipuri (1/2a, 1/2b si 4b), serotipizarea are o importanta minora n investigatiile epidemiologice.
Numeroase metode de subtipizare au fost utilizate n decursul timpului: tipizarea fagica, tipizarea
izoenzimatica (prin MEE-multilocus enzyme electrophoresis), ribotipizarea (utilizand Ribosomal
DNA fingerprinting), tipizarea plasmidica si tipizarea n functie de monocinele sintetizate de tulpinile
de Listeria monocytogenes.
n ultimul timp, pentru detectarea acestei specii bacteriene n produsele alimentare au fost
utilizate o serie de metode rapide care utilizeaza ELISA, flow citometria, sau amprente AND. nsa
aceste metode sunt conditionate de necesitatea mbogatirii probei la un nivel minim detectabil de
105-106 Listeria/ml.
Toate aceste procedee mentionate anterior, conventionale sau rapide, folosesc medii de
mbogatire nalt selective, care faciliteaza dezvoltarea bacteriilor din genul Listeria, n pofida florei
de asociatie. Totusi aceste medii selective nu permit detectarea celulelor bacteriene care au fost
afectate de caldura, frig sau substante chimice, nsa la un nivel subletal si care ar putea exista n
diferite alimente, sau spatiile tehnologice de obtinere a acestora.

2. METODE BIOCHIMICE
Metodele biochimice se bazeaza pe sisteme biochimice miniaturale cu ajutorul carora sunt
testate tulpinile izolate pe mediile selective.
SISTEMUL API LISTERIA (Bio Merieux, Mary LaEtoile,
France) se bazeaza pe investigarea a zece caractere biochimice ntr-un sistem microtest, iar
rezultatele se obtin n 24h.
MONO CONFIRM TEST (AES Laboratoire, Combourg,

5
France) este o micrometoda bazata pe determinarea a patru caractere biochimice care permit
confirmarea genului Listeria si identificarea speciei Listeria monocytogenes. Evidentierea enzimei
D-aminopeptidaza, permite diferentierea tulpinilor de Listeria monocytogenes n 24 h de alte specii
de Listeria.
MICROBACT 12L (Rhone-Diagnostic-Lyon-France) este o
coloana de identificare compusa din 11 teste de fermentare a glucidelor si un test de hemoliza.
Rezultatele sunt obtinute n 6-24 ore.

3. METODE IMUNOCHIMICE
Aceste metode se bazeaza pe recunoasterea antigenului Listeria cu ajutorul anticorpilor
specifici anti-Listeria si mai recent anti-Listeria monocytogenes. Complexul antigen-anticorp este
pus n evidenta printr-o reactie chimica de culoare sau prin fluorescenta.

Aceste metode au o sensibilitate de 10 5-106 bacterii/ml, ceea ce necesita o mbogatire


prealabila, de obicei n doua etape (n bulion de mbogatire). Caracteristicele unor metode
imunochimice sunt prezentate n tabelul 1.
TABEL 1: Caracteristicile unor metode imunochimice pentru detectare Listeria
METODA KIT LISTERIA LISTERIA TEK VIDAS
Tehnica Elisa tip sandwich Elisa tip sandwich ELFA (Enzime Linked
Fluorescent Assay)
Specificitate Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp. Listeria
monocit.
mbogatire 2-3 zile 2 zile 2 zile 2 zile
Sensibilitate 7x10 4 10 5 10 5 5x10 5
(UFC/ml)
Rapiditate 1,5h 1,5h 45min. 1,1h

6
Colorimetrie (Ac. Colorimetrie (Ac. Florimetrie Florimetrie
Tehnica de cuplati cu cuplati cu (Ac. cuplati cu (Ac. cuplati cu
evidentiere peroxidaza) peroxidaza) fosfataza fosfataza
alcalina) alcalina)

Sistemul VIDAS permite detectarea Listeria spp. sau Listeria monocytogenes prin tehnica
ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay).
Dupa o dubla mbogatire n bulionul Fraser, proba este depusa ntr-un cartus al sistemului
automat. Prin aspirarea probei cu ajutorul unui un con sensibilizat cu anticorpi monoclonali se
asigura fixarea specifica a germenilor din genul Listeria. Complexul antigen-anticorp este pus n
contact cu anticorpi marcati cu fosfataza alcalina, iar ansamblul este evidentiat cu un substrat al
acestei enzime ( 4-metil-umbeliferil-fosfat), prin determinarea intensitatii fluorescentei la 450 nm.

4. METODE IMUNOFIZICE
Aceste metode au la baza formarea complexului antigen-anticorp care este evidentiat cu
ajutorul unei tehnici fizice. Principalele metode sunt prezentate n tabelul 2.

4.1. TESTUL IMUNO-LATEX


KIT-ul Listeria Rapid Test (Unipath,Dardilly, France) este un test imunologic realizat pe o
placa ce contine anticorpi monoclonali anti antigenul flagelar B-Listeria, dispusi sub forma de
banda. Proba, dupa o dubla mbogatire n bulion Fraser si LEB tamponat, este depusa pe suportul
absorbant al placii, care contine particule de latex bleo sensibilizate cu anticorpi. Prezenta n proba
a germenilor din genul Listeria va induce formarea de complexe antigen-anticorp, cu anticorpii fixati
pe particulele de latex. Aceste complexe vor migra prin capilaritate, de-a lungul suportului pna vor

7
ntlni anticorpii monoclonali dispusi sub forma de banda. Datorita imobilizarii complexelor produse,
se formeaza o banda de coloare albastra, n cazul reactiei pozitive.
Principalele avantaje ale acestei tehnici sunt: ergonomia, simplitatea de aplicare si
rapiditatea de interpretare.
Ca si n cazul metodelor ELISA si ELFA, sensibilitatea intrinseca a acestui kit nu permite
ntotdeauna detectarea rapida a bacteriilor stresate, care se multiplica foarte lent.

TABEL 2: Metode imunofizice


METODA FLOW IMUNO-LATEX IMUNOCAPTARE
CITOMETRY
Detectare Calitativa Calitativa Listeria Cantitativa Calitativa
Rapid Test Lister Test Lister Screen
Specificitate Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp.
Sensibilitate
intrinseca 106 107 104 105 1 1
(UFC/ml)
mbogatire 24h 42h fara 18h
Rapiditate* 26h 43h 27h** 42-66h
Sistem de Imobilizarea Etalare pe Etalare pe
detectare Fluorescenta complexelor Ag/Ac- geloza dot- geloza
latex blot PALCAM
* Fara confirmarea rezultatelor
**Cu confirmarea coloniilor prin dot-blot.

4.2.FLOW- CITOMETRIA

8
Aceasta metoda permite detectarea unei populatii bacteriene marcate, n mediu lichid.
Dupa o mbogatire selectiva n bulion LEB, ADN-ul bacterian este colorat cu iodura de
propidium, apoi celulele bacteriene din genul Listeria, sunt marcate cu anticorpi specifici cuplati cu
izotiocianat de fluoresceina. n faza urmatoare, proba este expusa unui fascicul de raze laser si se
realizeaza interpretarea. Celulele bacteriene sunt caracterizate n functie de morfologie, antigenele
de suprafata si continutul n ADN.

Flow-citometria are o sensibilitate intrinseca de 10 6-107 Listeria monocytogenes/ml, iar cu o

faza de mbogatire de 24h, contaminarea minima detectabila este de 10 2 Listeria


monocytogenes/ml. Tehnica este aplicabila si pe probe de consistenta solida, daca examinarea se
executa n bulion de mbogatire.

4.3.IMUNOCAPTAREA
Imunocaptarea este o metoda originala care permite detectarea si concentrarea germenilor
din genul Listeria existenti ntr-o proba. Bacteriile sunt captate cu ajutorul anticorpilor policlonali
fixati pe bile magnetice microscopice. Complexele Listeria-imunobile sunt captate sub actiunea
cmpului magnetic, apoi imunobilele sunt spalate, iar complexele Listeria-anticorpi policlonali sunt
evidentiate prin diferite metode. n combinatie cu separarea imunomagnetica sunt utilizate
numeroase sisteme rapide de detectare pentru Listeria: ELISA, PCR, dot-blot, hibridare etc. Cea
mai folosita metoda consta n etalarea imunobilelor pe agar selectiv, ulterior coloniile caracteristice
sunt supuse confirmarii.
Aceasta metoda prezinta avantajul ca permite concentrarea germenilor din genul Listeria,
existenti ntr-o proba. Datorita utilizarii unui numar mare de imunobile magnetice, sensibilitatea
metodei este foarte mare (1 bacterie/ml.).
Din punct de vedere comercial imunobilele VICAM (Watertown SUA) sunt distribuite sub
forma a doua chituri:
9
Lister Screen
Lister TestTM .
Lister Screen este o metoda calitativa, combinnd imunocaptarea cu
etalarea pe agar selectiv PALCAM, totodata este o metoda foarte sensibila (0,5-1UFC/ml.) si
specifica, prezentnd avantajul ca permite decelarea bacteriilor stresate din alimente.

Lister TestTM permite o analiza cantitativa a germenilor din genul


Listeria dintr-un produs alimentar sau o proba de mediu. Dupa etapa de imunocaptare imunobilele
sunt etalate pe agar selectiv cu ceftazidima si acid nalidixic. Coloniile caracteristice sunt supuse
confirmarii prin tehnica dot-blot, cu anticorpi monoclonali. Complexele imune sunt apoi puse n
evidenta printr-o reactie enzimatica.
Metoda MIPA (Magnetic Immuno PCR Assay) combina imunocaptarea cu detectarea prin
PCR (poymerase chain reaction). Prin imunocaptare, pe lnga concentrarea germenilor se asigura
si eliminarea unor inhibitori ai polimerizarii, prezenti n unele produse alimentare. Timpul necesar
obtinerii rezultatelor este de 55h.

5. METODE FIZICE: IMPEDANSMETRIA


Aceasta metoda se bazeaza pe determinarea variatiilor electrice dintr-un mediu de cultura,
datorate metabolismului microbian. n cultura obtinuta n bulion se aplica 2 electrozi care vor
nregistra variatia impedantei n urma dezvoltarii culturii. Tehnica poate fi utilizata si pentru
determinarea numarului de germeni si prezinta o serie de avantaje: rapiditatea de detectare (24h),
automatizare, economie de medii si manopera. Totusi, detectarea este dificila atunci cnd probele
sunt puternic contaminate si impune utilizarea unor medii nalt selective.

6. METODE DE BIOLOGIE MOLECULARA

10
Tehnicile de biologie moleculara permit detectarea secifica a germenilor din genul Listeria,
sau chiar a speciei Listeria monocytogenes cu ajutorul unor sonde nucleare a caror tinte sunt
localizate pe ADN sau ARN. Totodata sunt metode deosebit de specifice care asigura detectarea
inclusiv a tulpinilor atipice. Dupa utilizarea sondelor nucleare constituite spre exemplu dintr-un
fragment a genei care codifica listeriolizina O, au fost sintetizate oligonucleotide pentru detectarea
bacteriei fie prin hibridare cu o sonda, fie prin tehnica PCR cu ,,amorse".

6.1.HIBRIDAREA CU SONDE NUCLEARE


Tehnicile de hibridare a acizilor nucleici se bazeaza pe capacitatea catenelor complementare
de ADN sau ARN de legare specifica si de a forma complexe stabile dublu catenare. Pentru
detectarea speciei Listeria monocytogenes prin hibridare nucleara, se utilizeaza 2 sonde specifice
de ARN ribozomal 16S (Metoda Gene Track sau AccuProbe). Aceste metode necesita o faza de
mbogatire prealabila indiferent de sonda utilizata (Tabel 3).

TABEL 3: Metode de hibridare cu sonde comerciale pentru detectare Listeria


METODA GENE-TRACK ACCUPROBE TM
Specificitate Listeria spp. sau L.m. L. monocytogenes
mbogatire 24h 24-48h*
Sensibilitate 5x104 106
(UFC/ml)
Rapiditate 30 min. 2h 30min
Sistem de evidentiere Colorimetrie (Reactie Luminiscenta
imuno-enzimatica) (ester de acridinium)
*n caz de rezultat negativ se aplica o mbogatire secundara.
Kit-ul Accuprobe TM(Gen-Probe sau Diego, USA) permite detectarea specifica a speciei
Listeria monocytogenes dupa mbogatire si etalare pe geloza. Apoi celulele bacteriene sunt lizate
pentru a elibera ARN-ul ribozomal, iar hibridarea se realizeaza cu o sonda de ADN monocatenar

11
marcata cu ester de acridinium. Hibrizii sunt detectati prin luminiscenta (cantitatea de lumina este
direct proportionala cu cantitatea de ARN ribozomal).

12