INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

LABORATORIO DE FISIOLOGA Y BIOQUMICA MICROBIANA

Prctica 5:
OXIDACIN DE
AZUFRE POR
BACTERIAS
QUIMIOLITOTRFICAS
HIPTESIS

Si Thiobacillus thiooxidans es un microorganismo quimiolitotrofo capaz de oxidar el azufre en

condiciones aerobias1, entonces la cantidad de azufre residual en los matraces deber ser menor en
comparacin a la cantidad de azufre inicial debido al crecimiento del microorganismo.
Si Thiobacillus thioparus es un microorganismo capaz de obtener energa a partir de fuentes con iones
tiosulfato en condiciones aerobias2, entonces la cantidad de iones tiosulfato inicial en el medio B debe
ser menor a la inicial debido al crecimiento del microorganismo.
Si la oxidacin bitica del azufre y tiosulfatos acidifican el medio1, entonces el pH de los medios de
cultivo al final del periodo de incubacin se ver reducido, siendo indicador dicha disminucin del pH
de crecimiento positivo.

OBJETIVOS

Objetivo general: Determinar mediante la estimacin de sustratos residuales o de los productos

oxidados, el crecimiento de los microorganismos quimiolittrofos bajo 2 condiciones de incubacin:
estacionario y en agitacin constante.

Objetivos especficos

Cuantificar el azufre oxidado despus del periodo de incubacin en condiciones de cultivo en

agitacin y estacionario cuando el microorganismo T. thiooxidans es inoculado en el medio A y
cuando est ausente.
Cuantificar el H2SO4 formado despus del periodo de incubacin en condiciones de cultivo en
agitacin y estacionario cuando los microorganismos T. thiooxidans y T. thioparus son inoculado en el
medio A y B (respectivamente) y cuando estn ausentes.
Cuantificar el S2O3 oxidado despus del periodo de incubacin en condiciones de cultivo en agitacin
y estacionario cuando el microorganismo T. thioparus es inoculado en el medio B y cuando est
ausente.
Observar los cambios de pH al final del periodo de incubacin en las distintas condiciones.

ANLISIS DE RESULTADOS
Tabla 1. Resultados de las diferentes determinaciones realizadas en los medios A y B
Cultivos
Resultados obtenidos
Agitados Estacionarios
Cultivo de T. thiooxidans en azufre elemental (Medio A)
1.- azufre utilizado (mg) 86.2 16.8
2.- H2SO4 formado (mg) 146.8 63.8
3.- S de SO4 formado 46.7 29.03
(mg)
4.- pH 0.4 4.5 0.9 4.5
Cultivo de T. thioparus en tiosulfato (Medio B)
1.- Tiosulfato oxidado 153.7 118.8
(mg)
2.- H2SO4 formado (mg) 124.3 81.1
3.- pH 1.4 6.5 1.5 6.5
En el medio A la cantidad de azufre utilizado, cido sulfrico y azufre de sulfatos formado fue mayor en los
cultivos agitados. El pH del medio disminuy de 3 a 4 unidades cuando fue inoculado con el consorcio
microbiano que contena a T. thiooxidans.
De la misma manera en el medio B la cantidad de tiosulfato oxidado, cido sulfrico formado fue mayor en los
cultivos agitados y el pH del medio disminuy 5 unidades cuando fue inoculado con el consorcio microbiano
que contena a T. thioparus.

En las determinaciones de azufre utilizado y tiosulfato oxidado se restaron los valores obtenidos en las
determinaciones de los matraces no inoculados para descartar la oxidacin abitica del azufre y tiosulfato.

DISCUSIN

MEDIO A

Azufre residual: Como es posible observar en la Tabla 1, la cantidad de azufre utilizado por T.
thiooxidans es mayor cuando ste se incuba en condiciones de agitacin constante (5.13 veces
mayor). Esto ocurre porque la oxidacin del azufre se favorece en condiciones aerobias, pues es mayor
la oxigenacin. Adems, los mg de cido sulfrico formado y azufre de sulfato formado fueron mayores
tambin cuando el medio estaba en agitacin. La enzima que cataliza la conversin de Azufre
elemental a sulfito es la enzima sulfito citocromo reductasa (SCR por sus siglas en ingls) 10. A pesar
de que la cadena de transporte de electrones no se conoce a detalle, se especula que al ser una
cadena para oxidacin aerobia su aceptor final de electrones es el oxgeno, siendo sta la razn por
la cual hay una diferencia significativa entre el medio que estuvo en agitacin contra el estacionario,
ya que en el primero se promueve una mayor oxigenacin al medio y por consiguiente ms oxidacin
del azufre elemental.

Existen ciertas dudas de acerca de los mecanismos que este microorganismo utiliza para poder
incorporar el azufre elemental dentro de la clula debido a que este es un elemento insoluble por lo
que se han propuesto 2 mecanismos de entrada9:

1. El organismo reduce el azufre elemental a cido sulfhdrico, el cual entra en la clula y la re-oxida
a cido sulfrico.
2. El azufre se hidrata a azufre soluble hidratado que puede posteriormente entrar a la clula.

Si bien es cierto que los resultados obtenidos nos demuestran lo tericamente esperado, se debe
considerar que al menos una pequea cantidad de azufre residual determinada no es totalmente
debida a la oxidacin bitica del sustrato, ya que en las partculas de azufre se pueden formar esferas
de solvatacin y por lo tanto pueden dar un poco de peso extra y adems la estructura de la flor de
azufre se puede formar en medios acuosos, dando tambin una mnima cantidad de peso extra. Si
bien la cantidad de peso extra que se puede generar debido a lo anteriormente explicado es muy
mnima, es importante tenerlo en consideracin.

H2SO4: De acuerdo con los resultados obtenidos, se observ que como productos formados tenemos
la presencia de cido sulfrico, el cual reduce el pH inicial del medio de 4.5, a 0.4 en el caso del medio
en condiciones de agitacin y pH de 0.9 estacionario. Esta disminucin demuestra que efectivamente
hubo crecimiento del microorganismo. ste utiliza al azufre elemental presente en el medio como un
donador de electrones, oxidndolo hasta sulfatos y stos al ionizarse se transforman en cido sulfrico.
S de SO4 formado:Como puede observarse en la tabla 1 la cantidad de productos oxidados y que
pueden ser precipitados como el S de SO4= fue mayor en condiciones de agitacin. Esto puedo
deberse a que la agitacin favorece una mayor interaccin del Thiobacillus thiooxidans con el azufre
elemental con el que se inocul el medio A adems de que permite incorporar ms oxgeno, el cual,
es necesario para la oxidacin del azufre elemental 1.

S0+ O2+ H2O H2SO3

H2SO3 + O2 H2SO4

Reacciones de oxidacin del azufre elemental a cido slfurico por T.thiooxidans1.

Por otra parte, la cuantificacin de S de SO4, H2SO4 y azufre utilizado demuestran el metabolismo
quimiolitotrfo de T. thiooxidans ya que obtiene energa, necesaria para su crecimiento, de la oxidacin
del azufre y utiliza el CO2 como nica fuente de carbono3. As mismo las determinaciones
anteriormente mencionadas permiten comprobar que la oxidacin del azufre est ocurriendo de
manera total y no parcial.

pH: La acidificacin del medio debido a la produccin de H2SO4 5 fue mayor en los cultivos agitados,
ya que como se mencion anteriormente la agitacin favorece una mayor oxidacin del azufre. Es
importante mencionar que el pH inicial de medio fue de 4.5 lo cual favoreci tanto la oxidacin del
azufre como el crecimiento ya que aunque T. thiooxidans puede oxidar el azufre en un rango de pH de
0.9 a 7, la fijacin de CO2 y la sntesis de ATP disminuyen cuando el pH aumenta y cuando se
encuentra por arriba de 4. 3 4 .

MEDIO B

T. thioparus es capaz de oxidar tiosulfato a sulfato, utilizado el tiosulfato como fuente de energa
como fuente de energa, se lleva a cabo la siguiente reaccin 6:

S2O32- + H2O + 2O2 2SO42- + 2H2O G0 = -818.3 kJ/reaccin

Reaccin de oxidacin del tiosulfato por T. thioparus

Tiosulfato oxidado: Al validar el tiosulfato oxidado, mediante yodometra, el tiosulfato residual

reacciona con el triyoduro para formar tetrationato y yodo elemental. Observando los resultados de la
tabla 1 se obtuvo que al comparar entre los dos cultivos, en el cultivo la oxidacin se ve favorecida,es
decir, cantidad de tiosulfato oxidado es mayor. Esto debido ya que se necesita tener al oxgeno como
aceptor final de electrones y a agitacin favorece la oxigenacin del cultivo aumentando as la
probabilidad de oxidacin.

H2SO4 formado: Al igual que con el tiosulfato oxidado, la cantidad de H2SO4 formado fue mayor en el
cultivo en agitacin sin embargo se esperaba que la cantidad de tiosulfato oxidado obtenido fuera
similar a la cantidad de H2SO4 producido, ya que es un producto de esta oxidacin sin embargo esto
no ocurrey se observa una cantidad menor obtenida. Esto puede deberse a que durante la oxidacin
del tiosulfato, se producen de intermediarios como el tetrationato y el tritionato 7 que podran interferir
con la cantidad de H2 SO4 producida.La formacin de dichos intermediarios se muestra en las
siguientes reacciones:
 Reacciones de la oxidacin de tiosulfato por Thiobacillus thioparus

Otro factor importante sera que la oxidacin de tiosulfato a cido sulfrico es parcial 8

pH: Debido a la produccin de H2SO4, se explica la disminucin del pH en cada cultivo indicando que
T.thioparus creci.

CONCLUSIONES

Thiobacillus thiooxidans es capaz de oxidar el azufre a sulfatos, los cuales pasan hasta cido
sulfrico, siempre y cuando en el medio est presente alguna fuente de azufre as como en
condiciones de agitacin constante para un mayor crecimiento del microorganismo.
La oxidacin del azufre por Thiobacillus thiooxidans disminuy el pH del medio inicial hasta
0.4 en condiciones de agitacin y a 0.9 en condiciones de cultivo estacionario, siendo dicha
disminucin del pH un indicador de crecimiento del microorganismo.
La cantidad de tiosulfato que es oxidado es mayor cuando a ste se le pone en contacto con
un consorcio microbiano que contiene a T. thioparus en condiciones de agitacin en
comparacin de condiciones de cultivo estacionario, indicando tambin crecimiento del
microorganismo.
La oxidacin del tiosulfato por T. thioparus disminuy el pH inicial del medio hasta 1.4 en
condiciones de agitacin y a 1.5 en condiciones de cultivo estacionario, indicando dicha
disminucin crecimiento del microorganismo.
La cantidad de productos oxidados y metabolitos solubles en el medio, generados a partir del
metabolismo de los organismos quimiolittrofos son directamente proporcionales al crecimiento
de dichos microorganismos (biomasa).
 Thiobacillus thioparus es capaz de oxidar completamente el tiosulfato a sulfato y parcialmente
a cido sulfrico
Es probable que a formacin de intermediarios como el tetraionato y tritionato disminuya la
cantidad de H2SO4 producido

BIBLIOGRAFA CONSULTADA
1.ISAMU SUZUKI, C. W. CHAN, T. L. TAKEUCHIO. (1992) Oxidation of Elemental Sulfur to Sulfite by Thiobacillus
thiooxidans Cells . APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY. 58(11):3767-3769
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sulfur 26(1):89. DOI: 10.1085/jgp.26.1.89
4. Silvaji Rao,R. Berger,L. (1971) The requirement of low pH for growth of Thiobacillus thiooxidans. Archiv fr Mikrobiologe.
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7.Vishniac, W., (1952); THE METABOLISM OF Thiobacillus thioparus, Journal of Bacteriology, Sep; 64(3): 365368.
8. Parker,C.(1953) The oxidation of inorganic compounds of Sulphur by various sulfur bacteria. Journal of general
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9. 5.K. G. Vloger, (1941), The necessity for direct contact in sulfur oxidation by Thiobacillus thiooxidans [EN LINEA],
Consultado el: 11/05/17, disponible en:
http://journals.lww.com/soilsci/Citation/1941/05000/The_Necessity_for_Direct_Contact_in_Sulfur.1.aspx

10. 3.Byung Hong, Bacterial Physiology and Metabolism, Cambridge University Press, Inglaterra, 2008, pps. 362-363