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ESTERILIZACIN INDUSTRIAL

Data January 2000

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Pedro Mateos
Universidad de Salamanca
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 TEMA 13: ESTERILIZACIN INDUSTRIAL
Dr. Pedro F. Mateos
I. INTRODUCCION
Para poder llevar a cabo una
fermentacin con xito es
imprescindible y obligatorio tener en
todas las etapas cultivos libres de
contaminantes, desde el cultivo
preliminar hasta el fermentador de
produccin. Por lo tanto, el
fermentador y su equipamiento, as
como el medio de cultivo deben estar
estriles antes de la inoculacin.
Adems, el aire que se suministra
durante la fermentacin debe ser estril
y no deben existir roturas mecnicas en
el fermentador que podran permitir la
entrada de microorganismos. Tambin
se deben esterilizar los aditivos
(antiespumantes), sin embargo los
cidos y bases concentrados no es
necesario esterilizarlos.
Un biorreactor puede ser esterilizado,
destruyendo los microorganismos, con
algn agente letal como calor,
radiacin o un producto qumico o bien
separando los organismos viables
mediante un procedimiento fsico
como la filtracin.
Durante la fermentacin se deben
observar dos puntos para asegurar la
esterilidad:
- Esterilidad en el medio de cultivo
- Esterilidad del aire que entra y sale
Para lo cual es necesario una
construccin apropiada del biorreactor
que facilite la esterilizacin as como
la prevencin de la contaminacin
durante la fermentacin.
II. ESTERILIZACION DEL MEDIO
DE CULTIVO
El medio nutritivo que se prepara
inicialmente contiene una variedad de
clulas vegetativas diferentes y de
esporas que proceden de los
constituyentes del medio, del agua y
del recipiente. Estos microorganismos
deben ser eliminados por un
procedimiento adecuado antes de la
inoculacin. Existen un conjunto de
procedimientos para la esterilizacin,
pero en la prctica, para instalaciones a
gran escala, el calor es el principal
mecanismo utilizado.
Un conjunto de factores influyen en el
xito de la esterilizacin por calor: el
nmero y tipo de microorganismos
presentes, la composicin del medio de
cultivo, el valor del pH y el tamao de
las partculas en suspensin. Las
clulas vegetativas son eliminadas
rpidamente a temperaturas
relativamente bajas, pero para la
destruccin de las esporas se necesitan
temperaturas de 121C.
Clulas Tiempo (min) Temp. ( C)
Cl. vegetativas 5-10 60
Esporas de hongos 15 80
Esporas bacterianas 5 121
Esporas de Bacillus
stearothermophilus 15 121
Tiempo y temperatura de esterilizacin de
varios grupos de microorganismos
La esterilizacin por filtracin se
utiliza frecuentemente para todos los
componentes de la solucin de
nutrientes que son sensibles al calor y
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que seran por tanto desnaturalizados
durante el proceso de esterilizacin por
vapor utilizado normalmente en
fermentacin industrial. Las vitaminas,
los antibiticos o los componentes de
la sangre son ejemplos de compuestos
lbiles al calor que deben ser
esterilizados por filtracin.
A.- Esterilizacin discontinua
La mayor parte de los medios de
cultivo se esterilizan en la actualidad
en volmenes discontinuos en el
biorreactor a 121C. Los tiempos de
esterilizacin aproximados pueden ser
calculados a partir de la naturaleza del
medio y del tamao del fermentador.
No solamente debe ser esterilizado el
medio nutritivo, sino tambin las
uniones, vlvulas y electrodos del
propio fermentador. Por consiguiente,
los tiempos de esterilizacin reales son
significativamente ms largos que los
calculados y deben ser determinados
empricamente para las soluciones
especficas de nutrientes presentes en
el fermentador. Un mtodo de
esterilizacin es inyectar vapor en la
camisa del fermentador o en los
serpentines interiores (esterilizacin
indirecta). Otro mtodo es inyectar
vapor en la propia solucin de
nutrientes (procedimiento directo), en
cuyo caso un pre-requisito es tener
vapor puro (libre de aditivos
qumicos). Muchos suministros de
vapor industrial contienen productos
qumicos txicos derivados de aditivos
anticorrosivos utilizados en el proceso
de produccin del vapor. Adems, con
la inyeccin directa de vapor el
condensado se acumula dentro del
fermentador y de esta forma el
volumen del lquido aumenta durante
el proceso de esterilizacin.
Los inconvenientes del proceso de
esterilizacin discontinua por calor de
un fermentador discontinuo de 3.000 l
se muestran en la figura. Se necesitan
de 2 a 3 horas para alcanzar la
temperatura de esterilizacin (121C)
lo que depende de la conduccin del
vapor y del tamao del fermentador.
Una vez se ha alcanzado la temperatura
correcta se requieren otros 20 - 60
minutos para el proceso real de muerte,
seguidos de enfriamiento durante una
hora. Para enfriar el fermentador, la
energa que se requiere para el
calentamiento debe ser
subsecuentemente retirada y, si el agua
caliente que se obtiene durante el
enfriamiento no se puede aplicar a
algn uso, la esterilizacin por calor se
hace muy costosa.
Perfil de temperatura y cambios en el
medio de cultivo en una esterilizacin
discontinua para un fermentador de 3.000 l
Otra desventaja de la esterilizacin por
calor (y desde el punto de vista de la
Microbiologa el defecto que resulta
ms significativo) es que las fases de
calentamiento, esterilizacin y
enfriamiento no solamente matan a los
microorganismos, sino que tambin
alteran severamente la solucin de
nutrientes. La decoloracin y los
cambios en el valor del pH se originan
como consecuencia de la
caramelizacin y la reaccin de
Maillard. Las vitaminas se destruyen y
la calidad del medio de cultivo se
deteriora. La extensin en la que es
afectada la fermentacin subsecuente
depende del organismo y del proceso.
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B.- Esterilizacin continua En el proceso continuo que utiliza
intercambiadores de calor, la solucin
Las dos desventajas principales de la de nutrientes, en el primer
esterilizacin discontinua, dao al intercambiador de calor, se precalienta
medio de cultivo y alto consumo de a 90-120 C durante 20-30 segundos
energa, pueden ser evitadas en gran por la solucin nutritiva previamente
parte mediante el uso de un esterilizada que sale. Luego, en el
procedimiento de esterilizacin segundo intercambiador de calor, se
continua. Aunque la esterilizacin calienta indirectamente con vapor a
continua es la etapa preliminar lgica 140 C. Esta temperatura se mantiene
en una fermentacin continua a escala durante 30-120 segundos en una
industrial, tambin se puede utilizar en tubera de mantenimiento antes de que
la fermentacin discontinua obteniendo sea colocada en el primer
posibles mayores rendimientos en el intercambiador mediante enfriamiento
tiempo y el espacio asignados. La preliminar y posteriormente en un
razn para esto se debe a la relacin tercer cambiador para refrigeracin a la
exponencial entre velocidad de muerte temperatura del fermentador. La fase
y temperatura, que hace ms corto el de enfriamiento es slo de 20-30
tiempo necesario para la eliminacin segundos.
completa de los organismos vivos
cuando se utiliza una temperatura ms
alta. Mientras la esterilizacin
discontinua se lleva a cabo en 30-60
minutos a 121 C, la esterilizacin
continua se lleva a cabo normalmente
en 30-120 segundos a 140 C. El
calentamiento del medio de cultivo
para la esterilizacin continua puede
ser llevado a cabo mediante inyeccin
de vapor o mediante intercambiadores
de calor. La esterilizacin con
inyeccin de vapor se hace inyectando
vapor en la solucin de nutrientes. La
temperatura se eleva rpidamente a
140 C y se mantiene durante 30-120
segundos. Debido a la formacin de
condensados la solucin nutritiva se
diluye; para corregir esto la solucin
caliente se bombea a travs de una Esquema de una esterilizacin continua
vlvula de expansin a un vaporizador mediante intercambiadores de calor
y el condensado se retira mediante
bombas de vaco de forma que la En el proceso que utiliza
solucin esterilizada de nutrientes tiene intercambiadores de calor el 90% del
la misma concentracin despus del aporte de energa se recupera. La
proceso de enfriamiento que antes. La desventaja de este mtodo es que con
desventaja de este proceso es la algunas soluciones de nutrientes se
sensibilidad que presenta a cambios en forman sales insolubles (p. ej. fosfato
la viscosidad del medio y a variaciones clcico u oxalato clcico) y aparecen
en la presin. incrustaciones en el primer

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intercambiador de calor debido a las
diferencias de temperatura entre la
solucin de nutrientes esterilizada y la
solucin fra que entra. Si se produce
una precipitacin, el coeficiente de
transferencia de calor disminuye por lo
que el sistema se debe detener y tratar
con agentes que limpian (cido o base)
y re-esterilizarlo. Esterilizando
separadamente los componentes
crticos de la solucin de nutrientes se
mantiene constante el coeficiente de
transferencia de calor por lo que el
perodo til puede extenderse durante
semanas.
Las soluciones que contienen almidn,
que se hacen viscosas cuando se
calientan, son difciles de utilizar en
procesos de esterilizacin continua.
Antes de la esterilizacin real debe
llevarse a cabo una licuefacin e
hidrlisis parcial mediante cidos o
amilasas. Adems, si hay partculas en
suspensin en la solucin de
nutrientes, los cortos tiempos de
esterilizacin en el proceso continuo
pueden ser insuficientes para que el
calor permanezca completamente a
travs de ellas. El tiempo de
calentamiento para partculas de 1 mm
es de 1 segundo; para partculas de 1
cm es de 100 segundos. Por
consiguiente el tamao de las
partculas debera estar restringido a 1-
2 mm en procesos continuos de
esterilizacin.
III. ESTERILIZACION DEL AIRE
DE FERMENTACION
La mayor parte de las fermentaciones
industriales operan en condiciones de
agitacin vigorosa y el aire que se
suministra al fermentador debe ser
esterilizado. El nmero de partculas y
microorganismos en el aire vara en
gran medida dependiendo de la
localizacin de la planta, el
movimiento del aire y el tratamiento
previo del aire. Como media, el aire
exterior tiene 10 - 100.000 partculas
por m3 y 5 - 2.000 microorganismos
por m3. De estos, el 50% son esporas
de hongos y el 40% son bacterias G (-).
Los fermentadores funcionan
generalmente con velocidades de
aireacin de 0,5 - 1,0 vvm (volumen de
aire/volumen de lquido por minuto).
Un fermentador que tenga un volumen
de trabajo de 50 m3 con una velocidad
de aireacin de 1 vvm necesita 3.000
m3 de aire estril por hora. La
importancia crtica de la esterilizacin
del aire en la microbiologa industrial
puede ser deducida a partir de estos
valores.
Los mtodos existentes para la
esterilizacin de los gases incluyen la
filtracin, inyeccin de gas (ozono),
depuracin de gas, radiacin (UV) y
calor. De todos estos, slamente la
filtracin y el calor son prcticos a
escala industrial. Durante muchos aos
el aire se esteriliz pasndolo sobre
elementos calentados elctricamente,
pero debido al alto coste de la
electricidad a partir de la crisis del
petrleo de los aos 70, este proceso
ha sido reemplazado por la filtracin.
Actualmente, en los sistemas
industriales el aire se esteriliza por
filtracin. En los sistemas ms
antiguos se instalaban filtros en
profundidad como los de lana de vidrio
en los que las partculas son atrapadas
por una combinacin de efectos fsicos
(inercia, bloqueo, difusin, gravedad y
atraccin electrosttica). Los dos
ltimos mecanismos tienen un efecto
mnimo sobre la eliminacin de las
partculas. Las desventajas de los
filtros de lana de vidrio incluyen el
arrugamiento y la solidificacin
durante la esterilizacin por vapor.
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 Actualmente estn siendo
reemplazados por filtros de cartuchos
que utilizan membranas plegadas. Las
ventajas de estos filtros es que son
sustancialmente ms pequeos, debido
a la construccin de los cartuchos es
fcil reemplazar los elementos
filtrantes utilizados, al poseer una
estructura membranosa (steres de
celulosa, polisulfona o nylon) tienen
un efecto de filtros absolutos. La
desventaja de la mayor parte de los
sistemas instalados actualmente es que
no existen todava, para uso industrial,
filtros absolutos para bacterifagos.
Los bacterifagos pueden ocasionar el
fallo total de un sistema como por
ejemplo la produccin de cido
glutmico por C o r y n e b a c t e r i u m
g l u t a m i c u m o al trabajar con
Escherichia coli.

El aire que sale del fermentador

tambin debe ser esterilizado, sobre
todo si se trabaja con organismos
recombinantes. No slo como medida
de seguridad, sino tambin para
prevenir que las cepas industriales se
liberen al medio ambiente y por lo
tanto estn disponibles de una forma
gratuita para los competidores. De
nuevo, se utiliza la filtracin.

Esquema de un sistema de esterilizacin

del aire de fermentacin por filtracin

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