Universitatea POLITEHNICA din Bucureti

Facultatea de Inginerie Medical

Departamentul Biomateriale i Dispozitive Medicale (BDM)

Testarea in-vitro i in-vivo

a implanturilor

Curs 2
TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR
Pregtirea probelor

Proba de testat trebuie s reprezinte un specimen

reprezentativ pentru dispozitivul produs n cantiti
industriale.
Ea trebuie s fie finisat sau tratat (acoperit sau
sterilizat) n acelai mod ca i dispozitivul comerciabil.
Deoarece potenialul toxic al materialelor i dispozitivelor
depinde de gradul de eliberare a unor componente
solubile, toxice, sunt testate uzual extracte din proba de
analizat.
Totui unele teste necesit o evaluare n condiiile
normale de folosire a dispozitivului, i atunci se testeaz
direct citotoxicitatea unei piese din acesta.
TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR
Pregtirea probelor

n cazul solubilizrii unor componente din

dispozitiv se utilizeaz o serie de soluii cu o
polaritate descresctoare pentru a asigura o
extracie corespunztoare a compuilor cu
diferite solubiliti.
Cele mai comune medii de extracie utilizate
sunt:
ser fiziologic;
ulei vegetal;
dimetilsulfoxid;
etanol;
mediul de cultur al celulelor - pentru testarea
citotoxicitii in-vitro.
TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR
Pregtirea probelor

Temperatura de extracie este un factor

important n evaluarea citotoxicitii unor
materiale.
Unii compui solubilizai din prob sunt alterai
chimic la temperaturi nalte, motiv pentru care se
recomand ca extracia s fie realizat la 37C
(temperatura corpului), timp de 72 ore.
Pentru testele de citotoxicitate in-vitro se
recomand extracia la 37C timp de 24 ore,
deoarece unii constitueni din mediu sunt relativ
labili.
TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR
Culturi de celule

Cultura de celule (sau de esut) i are originile n

secolul al XIX-lea, cnd oamenii au nceput s
examineze n detaliu esuturile i organele din
organism n recipiente de sticl.
Termenul in-vitro nseamn literal n sticl, dei n
prezent majoritatea culturilor celulare se realizeaz n
sau pe plastic.
Prima ncercare, ncununat de succes, de a cultiva
celule izolate din organismul vertebratelor a fost
realizat n anul 1907 de ctre Ross Harrison, care
era interesat n diferenierea neuronilor.
 TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR
Culturi de celule

n prezent, culturile celulare reuesc s reproduc

condiiile existente in-vivo, pentru a permite celulelor
normale (netumorale) s creasc n cultur.
Iniial, celulele prelevate/izolate din orice tip de esut, de la
diferite organisme, au fost cultivate n laborator pentru studii
de morfologie i fiziologie.
Ulterior, culturile celulare au progresat de la examinarea
celulelor izolate care mor dup un numr limitat de diviziuni
(culturi primare),
primare la cultura de lung durat (linii celulare),
celulare
ale cror celule supravieuiesc un numr mare de generaii,
datorit unui proces de transformare spontan sau indus.
Astfel, culturile celulare se preteaz foarte bine pentru
studiile de dezvoltare i difereniere, dar i liniile celulare,
care pstreaz capacitatea de a se diferenia, in-vitro, sunt
utilizate pentru evaluarea interaciei implant mediu
fiziologic.
TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR
Culturi de celule

Odat separate din esut, exist 2 modaliti de baz

prin care celulele pot fi cultivate:
ntr-o cultur de mas, cnd n recipientul de cultur
celulele sunt nsmnate la o concentraie mare i
formeaz un monostrat de celule relativ uniform dup
cteva generaii;
ntr-o cultur clonal, cnd un numr relativ mic de
celule (diluie mare) este adugat n recipientul de
cultur, fapt care permite fixarea pe substrat la o
anumit distan.
o proliferarea celulelor determin formarea de colonii
individuale sau clone celulare, ai cror membri sunt
derivai din aceeai celul iniial.
TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR
Culturi de celule

n prezent, lista celulelor crescute n cultur este

extrem de larg i include:
elemente ale esuturilor conjunctive (fibroblaste,
osteoblaste, condrocite);
celule musculare;
celule epiteliale (de la nivelul ficatului, plmnului, pielii,
snului, rinichiului);
celule nervoase etc.
TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR

Presupune evaluarea biomaterialelor prin metode

care utilizeaz culturi de celule, pentru a msura
citotoxicitatea i compatibilitatea biologic a unui
material.
Citotoxicitatea identific efectele toxice la nivelul
celulelor:
moartea celulelor;
alterarea permeabilitii membranei celulare;
inhibiia enzimatic etc.
Citotoxicitatea in-vitro reprezint capacitatea potenial a
unui dispozitiv medical de a induce efecte subletale sau letale la
nivel celular.
 TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR

Exista 3 tipuri de dozri pe culturi de celule:

celule testul eluiei,
testul contactului direct si testul difuziei n agar:
Testul eluiei:
iei este preparat un extract eluat din biomaterialul
testat i adugat n diferite concentraii la culturile de celule.
Se monitorizeaz inhibiia creterii celulelor.
Testul contactului direct:
direct piese din materialul de testat sunt
plasate direct pe suprafaa stratului de celule, care este
acoperit cu o pelicul din mediul de cultur. Substanele
toxice eliberate din materialul testat pot scdea viteza
creterii celulelor sau pot provoca diferite leziuni.
Testul difuziei n agar:
agar o pies din materialul testat este
plasat pe un strat de agar ce acoper un monostrat
confluent de celule. Substanele toxice solubilizate din
material difuzeaz prin stratul subire de agar i vor omor
sau leza celulele din monostrat.
 TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR

Agar-agarul (numit i geloz) este un produs organic ce se

ntlnete ntr-o serie de alge marine (agarofite), din care este
extras cu ajutorul apei fierbini.
Se prezint sub form de fii semitransparente de culoare
cafenie-glbuie. Conine 7080% polizaharide, 1020% ap i
1,54% substane minerale.
Are o putere de gelificare foarte mare.
 TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR

n prezent, determinarile de citotoxicitate in-vitro trebuie

folosite ca teste screening i considerate n principal ca
evaluri suplimentare fa de diferitele teste in-vivo:
Testul cu Trypan Blue (TB) - colorant ce poate ptrunde n
celul cnd membrana este lezat. Celulele moarte colorate
n albastru se deosebesc de cele vii, incolore.
Testul MTT - sare de tetrazoliu galben redus de enzime
mitocondriale la un formazan albastru - permite aprecierea
proliferrii, viabilitii i citotoxicitii celulare.
Testul cu Rou Neutru (NR) - colorant slab cationic ce
penetreaz uor prin membranele celulare prin difuzie i se
acumuleaz intracelular n lizozomi unde se leag la situsuri
anionice din matricea lizozomal. Celulele vii ncorporeaz i
leag acest colorant, citotoxicitatea echivalnd cu o scdere
n preluarea i legarea NR.
 TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR
Testarea in vitro pe osteoblaste
Pentru studiile in-vitro de caracterizare a biocompatibilitii
materialelor se pot folosi spre exemplu culturi de osteoblaste,
obinute:
din explante de os;
din celule stem mezenchimale.
Citomorfologia osteoblastelor n cultur se testeaz n prezena i
absena materialelor, prin:
microscopie n contrast de faz;
o pe tot parcursul realizrii experimentului;
microscopie de fluorescen;
o la sfritul perioadei de meninere n cultur a celulelor
de regul 48-72 ore;
o pentru vizualizarea celulelor n fluorescen cultura va fi
tratat cu hipericin, care ptrunde n celule i le
marcheaz fluorescent.
 TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR

Estimarea numrului de celule viabile se realizeaz prin

testul cu Albastru tripan.
celulele moarte - colorate n albastru se deosebesc de cele vii
- incolore;
numrarea se realizeaz cu ajutorul unui hemocitometru =
lam de sticl mai groas, n care este practicat o fant; n
fant este plasat un volum mic din suspensia celular de
evaluat.
Hemocitometru
 TESTARE in-vitro PRIN INTERACIA CU DIFERITE
LINII CELULARE A MATERIALELOR
Micrografie n contrast de faz
a fibroblastelor CCD-1070Sk
din control (obiective A-10x; B-
20x; C-40x).

Micrografie n contrast de faz

a fibroblastelor CCD-1070Sk din
plcile Petri cu probele:
I; II; III (obiectiv 10x).

I II III

Micrografie n fluorescen
a fibroblastelor CCD-
1070Sk de pe suportul II
(obiective A-20x; B-40x).
 Cum se pregtete o prob pentru testri celulare i
care sunt factorii de influen?
Cte tipuri de linii celulare cunoatei i care sunt
modalitile de cultivare?
Ce reprezint citotoxicitatea?
Care sunt tehnicile experimentale de testare a
citotoxicitii?