UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

Campus Xalapa

PROGRAMA EDUCATIVO:
INGENIERA AMBIENTAL

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS HIDROCARBUROCLASTAS

DE SUELO CONTAMINADO DEL SUR DEL ESTADO DE VERACRUZ

TESIS

Que para acreditar la Experiencia Educativa:

Experiencia Recepcional

Presenta
SUSANA RODRGUEZ AGUILAR

Director
Dr. Oswaldo Guzmn Lpez
Codirector
Dr. Csar Espinoza Ramrez

Xalapa, Ver., Diciembre, 2014

 AGRADECIMIENTOS

A Dios

Por permitirme vivir y darme la dicha de alcanzar una de mis ms grandes ilusiones.

A mis padres

Por el apoyo y la comprensin brindados durante la realizacin de este proyecto y a lo largo

de mi vida. Los quiero.

A mi director el Dr. Oswaldo y a mi codirector el Dr. Csar

Por la confianza que tuvieron en mi para desarrollar esta investigacin, por toda su ayuda y
por la paciencia que me tuvieron durante todo este tiempo.

A mi familia

Que ha estado a mi lado en todo momento, pero en especial a Lisbet por escucharme todos
estos meses y siempre tener la palabra correcta para darme nimos.

A mis amigos

o Lizeth, porque a pesar de la distancia siempre estuviste conmigo. Te adoro hermana.

o Alejandra y Angelina, por su amistad incondicional y por estar conmigo en las buenas
y en las malas, no s que habra hecho sin ustedes. Las quiero.
o Alaffita, porque de una u otra forma siempre he contado con tu apoyo y consejos que
me han alentado a sacar este proyecto adelante. .
A mi jurado.

M.A Mara Ariadna Escalante Rebolledo y Dr. Guillermo Mendoza Cervantes. Por el
tiempo brindado en la realizacin de esta tesis.

Al Dr. ngel Trigos

Por proporcionarme los medios y permitirme desarrollar este trabajo de investigacin.

A los jefes de reas, tcnicos y compaeros de LATEX

Por el apoyo brindado, por compartirme sus conocimientos, amenizar los das de trabajo y su
preocupacin durante la realizacin de este proyecto. Gracias a todos y cada uno de
ustedes.

A mis compaeros de universidad

A todos y cada uno de ustedes por las aventuras que compartimos este tiempo. Les deseo
todo el xito del mundo.
 RESUMEN

La actividad bioqumica de los microorganismos nativos de suelos es fundamental

para la biorremediacin de aquellos contaminados por hidrocarburos. La presencia
de petrleo en el suelo enriquece selectivamente la comunidad microbiana capaz
de adaptarse y utilizar el nuevo sustrato. Los microorganismos con capacidad de
metabolizar, degradar y transformar diversos hidrocarburos son llamados
hidrocarburoclastas y algunos gneros bacterianos representativos son
Pseudomonas spp, Bacillus spp, Citrobacter spp, Xanthomonas spp y Vibrio spp.
Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue aislar e identificar bacterias
hidrocarburoclastas provenientes de suelo contaminado con hidrocarburos (62
589.83 mg Kg-1 de suelo) de la localidad El Polvorn, en Coatzacoalcos, Veracruz.
Las cepas fueron aisladas en medio mineral por dilucin en placa teniendo
hidrocarburo como nica fuente de carbono y energa, a partir de esto se
realizaron resiembras en agar nutritivo hasta una purificacin basada en la
morfologa de las colonias, y una posterior identificacin a nivel de gnero
utilizando pruebas bioqumicas. Finalmente se lograron identificar los gneros de
Erwinia spp, Pseudomonas spp, Xanthomonas spp y Agrobacterium spp.
 CONTENIDO
NDICE DE FIGURAS ............................................................................................ IV
NDICE DE TABLAS ............................................................................................... V
INTRODUCCIN .................................................................................................... 1
ANTECEDENTES ................................................................................................... 2
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................... 6
JUSTIFICACIN ..................................................................................................... 6
OBJETIVOS ............................................................................................................ 7
Objetivo General .................................................................................................. 7
Objetivos Especficos .......................................................................................... 7
HIPTESIS ............................................................................................................. 7
ESQUEMA DE TRABAJO. ..................................................................................... 8
CAPTULO I MARCO TERICO ......................................................................... 9
1.1 Situacin actual de contaminacin por hidrocarburos en Mxico .... 10
1.1.1 Contaminacin en la regin sur del Estado de Veracruz....................... 11
1.1.2 Situacin de lugar de muestreo ............................................................. 12
1.2 Hidrocarburos ............................................................................................ 12
1.2.1 Composicin general............................................................................. 12
1.2.2 Caractersticas del petrleo ................................................................... 13
1.2.3 Clasificacin del petrleo ...................................................................... 14
1.2.4 Formas de contaminacin por la operacin .......................................... 14
1.2.5 Definicin de HTPs ............................................................................... 16
1.2.6 Toxicologa de los HTPs ....................................................................... 17
1.2.7 Normatividad ......................................................................................... 17
1.3 Suelo ........................................................................................................... 19
1.3.1 Composicin ......................................................................................... 19
1.3.2 Clasificacin de los suelos .................................................................... 20
1.3.3 Contaminacin de suelos ...................................................................... 21
1.3.4 Hidrocarburos en el suelo ..................................................................... 22
1.3.5 Consecuencias de la contaminacin por hidrocarburos ........................ 22
1.4 Biorremediacin ........................................................................................ 22

I
 1.4.1 Fundamentos bioqumicos .................................................................... 23
1.4.2 Factores que condicionan la biorremediacin ....................................... 24
1.4.3 Microorganismo para la biorremediacin .............................................. 27
CAPTULO II MATERIALES Y MTODOS ...................................................... 33
2.1 Anlisis fsicos y qumicos del suelo....................................................... 34
2.1.1 Determinacin de textura (Mtodo de Bouyoucus) ............................... 34
2.1.2 Determinacin de humedad (Mtodo gravimtrico)............................... 34
2.1.3 Determinacin de pH (Mtodo potenciomtrico) ................................... 35
2.1.4 Determinacin de la materia orgnica (Mtodo de Walkey-Black) ....... 35
2.1.5 Determinacin de nitrgeno orgnico (Mtodo matemtico) ................. 35
2.1.6 Determinacin de nitratos (Mtodo colorimtrico) ................................. 35
2.1.7 Determinacin de fosforo (Mtodo de Olsen) ........................................ 36
2.1.8 Determinacin de hidrocarburos totales del petrleo (HTPs). (Mtodo de
extraccin agitacin centrifugacin) ............................................................ 36
2.2 Anlisis Microbiolgicos........................................................................... 37
2.2.1 Fase I: Bacterias totales del suelo contaminado por la tcnica de dilucin
en placa para conteo de unidades formadoras de colonias (UFC). ............... 37
2.2.2 Fase II: Conteo, aislamiento y purificacin de bacterias
hidrocarburoclastas por la tcnica de dilucin en placa ................................. 37
2.2.3 Fase III: Pruebas para la identificacin de gnero de bacterias
hidrocarburoclastas. ....................................................................................... 38
CAPTULO III RESULTADOS Y DISCUSIN.................................................. 43
3.1 Anlisis fsicos y qumicos ....................................................................... 44
3.1.1 Textura .................................................................................................. 44
3.1.2 Humedad ............................................................................................... 45
3.1.3 pH.......................................................................................................... 46
3.1.4 Materia orgnica y nitrgeno orgnico .................................................. 47
3.1.5 Nitratos .................................................................................................. 48
3.1.6 Fsforo .................................................................................................. 48
3.1.7 Cuantificacin de hidrocarburos totales del petrleo. (HTPs) ............... 49
3.2 Anlisis microbiolgicos .......................................................................... 49

II
 3.2.1 Fase I: Conteo de bacterias totales del suelo contaminado .................. 49
3.2.2 Fase II: Bacterias hidrocarburoclastas .................................................. 52
3.2.3 Fase III: Identificacin de gnero. ........................................................ 58
4. CONCLUSIONES. ............................................................................................ 67
5. RECOMENDACIONES. .................................................................................... 68
REFERENCIAS..................................................................................................... 69
ANEXOS .............................................................................................................. 74
ANEXO I. METODOLOGA ANLISIS FSICOS Y QUMICOS DEL SUELO ...... 75
A1.1 Determinacin de textura (Mtodo de Bouyoucus) ................................... 75
A1.2 Determinacin de humedad (Mtodo gravimtrico) .................................. 77
A1.3 Determinacin de pH (Mtodo potenciomtrico) ....................................... 77
A1.4 Determinacin de la materia orgnica (Mtodo de Walkey-Black) ........... 78
A1.5 Determinacin de nitrgeno orgnico (Mtodo matemtico) ..................... 79
A1.6 Determinacin de nitratos (Mtodo colorimtrico) ..................................... 79
A1.7 Determinacin de fsforo (Mtodo de Olsen)............................................ 80
A1.8 Determinacin de hidrocarburos totales del petrleo (HTPs). (Mtodo de
extraccin agitacin centrifugacin) ................................................................ 80
ANEXO II. METODOLOGA ANLISIS MICROBIOLGICOS ............................. 82
A2.1 Fase I: Bacterias totales del suelo contaminado por la tcnica de dilucin
en placa para conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) .................... 82
A2.2 Fase II: Conteo, aislamiento y purificacin de bacterias hidrocarburoclastas
por la tcnica de dilucin en placa ..................................................................... 84
A2.3 Fase III: Pruebas para la identificacin de gnero de bacterias
hidrocarburoclastas. .......................................................................................... 85
ANEXO III. PREPARACIN DE SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO .......... 88
A3.1 Preparacin de soluciones ........................................................................ 88
A3.2 Preparacin de medios de cultivo ............................................................ 90

III
 NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructuras qumicas de algunos hidrocarburos del petrleo. ................ 13
Figura 2. Diagrama de la biodegradacin de hidrocarburos de petrleo. .............. 24
Figura 3. Morfologa general de las bacterias ....................................................... 28
Figura 4. Morfologa general de colonias bacterianas. .......................................... 30
Figura 5. Diferenciacin de gneros comnmente aislados .................................. 39
Figura 6. FASE I. Bacterias totales por dilucin en placa incubadas por 24 horas a
350.2C ............................................................................................................... 51
Figura 7. Conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFCs) ......................... 52
Figura 8. FASE II. Bacterias hidrocarburoclastas por dilucin en placa incubadas
por 24 horas a 350.2C ....................................................................................... 54
Figura 9. Vistas macro y microscpicas de algunas cepas de la resiembra 6 ...... 56
Figura 10. Cepas de la resiembra 7 seleccionadas para pruebas de identificacin
.............................................................................................................................. 57
Figura 11. Preparaciones de las tinciones de Gram ............................................. 58
Figura 12. Resultados crecimiento anaerobio (Hugh y Leifson) ............................ 59
Figura 13. Revisin en luz UV (366nm) de cultivos en medio KB ......................... 60
Figura 14. Resultados del crecimiento en medio YDC .......................................... 61
Figura 15. Resultados prueba de ureasa .............................................................. 62
Figura 16. Resultado crecimiento en agar D1M .................................................... 63
Figura 17. Resultados prueba de catalasa ............................................................ 63
Figura 18. Resultados prueba de oxidasa ............................................................. 64
Figura 19. Tringulo de texturas del suelo ............................................................ 76
Figura 20. Preparacin de diluciones .................................................................... 82
Figura 21. Siembra por mtodo de placa vaciada ................................................. 83
Figura 22. Siembra de bacterias hidrocarburoclastas ........................................... 84
Figura 23. Tcnicas de estriado ............................................................................ 85

IV
 NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Tipos de petrleo ..................................................................................... 14
Tabla 2. Hidrocarburos que debern analizarse en funcin del producto
contaminante ......................................................................................................... 18
Tabla 3. Lmites mximos permisibles para fracciones de hidrocarburos en suelo.
.............................................................................................................................. 18
Tabla 4. Lmites mximos permisibles para hidrocarburos especficos en suelo. . 19
Tabla 5. Gneros bacterianos conocidos como degradadores de hidrocarburos . 31
Tabla 6. Clasificacin de gneros bacterianos conocidos como degradadores de
hidrocarburos ........................................................................................................ 32
Tabla 7. Resultados del clculo de porcentajes de arena, arcilla y limo ............... 44
Tabla 8. Porcentajes de humedad......................................................................... 45
Tabla 9. Medicin de pH ....................................................................................... 46
Tabla 10. Clasificacin del suelo en cuanto a su valor de pH .............................. 46
Tabla 11. Porcentajes de carbono, materia y nitrgeno orgnicos........................ 47
Tabla 12. Interpretacin de resultados de materia orgnica ................................. 47
Tabla 13. Cantidad de nitratos en ppm ................................................................. 48
Tabla 14. Contenido de fosforo en forma de fosfatos ............................................ 49
Tabla 15. Interpretacin de resultados Fsforo - Olsen ....................................... 49
Tabla 16. Total de Hidrocarburos Totales de petrleo (mg Kg-1)........................... 49
Tabla 17. Resultado de clculos de UFCs totales ................................................ 52
Tabla 18. Resultado de clculos de UFCs hidrocarburoclastas. .......................... 55
Tabla 19. Resultados pruebas bioqumicas .......................................................... 65
Tabla 20. Resultado de identificacin de generos de bacterias hidrocarburoclastas
.............................................................................................................................. 65
Tabla 21. Correccin de temperatura para las lecturas del hidrmetro. ................ 77
Tabla 22. Equivalencia de diluciones .................................................................... 83

V
INTRODUCCIN
En Mxico, los hidrocarburos fsiles afectan de manera constante a los suelos
como resultado de las actividades humanas durante la combustin y su transporte.
Estos hidrocarburos estn presentes de tres formas en la naturaleza: gas natural,
petrleo crudo y arenas asflticas. Van desde sustancias simples altamente
voltiles hasta ceras complejas y compuestos asflticos que no pueden destilarse
(Silos, 2008).

La actividad bioqumica de los microorganismos nativos del suelo es fundamental

no slo en la ausencia o permanencia de compuestos qumicos orgnicos
contaminantes, sino en la biodegradacin de toda la materia orgnica que llega al
suelo. De ah que tambin es posible que algunos microorganismos puedan
adaptarse y tengan la capacidad de metabolizar los hidrocarburos a travs de su
maquinaria enzimtica. La diversidad de los microorganismos asegura la
multiplicidad de funciones atribuidas en el suelo, as como la permanencia de
estas tareas bajo condiciones de estrs o disturbacin (Sols y Lpez, 2003).

La regin sur del Estado de Veracruz es uno de los lugares con mayores eventos
de derrames de hidrocarburos en suelos (Vela, 2007), y en este trabajo se busca
aislar e identificar cepas de bacterias nativas que tengan la capacidad de crecer y
de degradar estos hidrocarburos utilizando una muestra de suelo de esta Regin y
as poder ser utilizados en posteriores estudios de biorremediacin y
bioaumentacin.

1
ANTECEDENTES
En la segunda mitad del siglo XX y el principio de este XXI, la industria del
petrleo y del gas se ha consolidado como la principal abastecedora de energa
para la humanidad. La exploracin, produccin y procesamiento de hidrocarburos
en territorio nacional, que Petrleos Mexicanos (PEMEX) ha podido llevar a cabo
desde hace prcticamente 75 aos, le ha permitido a Mxico mantener una
posicin independiente y de soberana (Comisin Nacional de Hidrocarburos,
2011). En el pas 17 entidades reportaron para el periodo de 1997 al 2001, 73
derrames, principalmente de hidrocarburos, 16 explosiones, 26 fugas y 9 incendios
(COFEPRIS, 2002).

El estado de Veracruz posee una riqueza natural nica. Entre los recursos
naturales ms explotados en la entidad, el petrleo figura en primer lugar: las
zonas productoras se localizan principalmente en el litoral del Golfo de Mxico, por
ejemplo en Coatzacoalcos, al sureste, donde se localizan instalaciones de
refinacin y petroqumica como los Complejos de Pajaritos, Cangrejera, Pemex
Refinacin, Pemex Petroqumica. Debido a la presencia de toda esta
infraestructura y por la dimensin de algunos eventos de riesgo, la ciudadana
veracruzana percibe que se est ocasionando un dao al medio ambiente, sin
embargo no se tiene el conocimiento pleno de la gravedad y frecuencia de los
daos, y mucho menos las acciones que se toman para reparar el dao
ocasionado al entorno. Los Hidrocarburos Totales de Petrleo, TPH por sus siglas
en ingls, son un grupo extenso de varios cientos de sustancias qumicas
derivadas originalmente del petrleo crudo que ocasionan este tipo de dao. Se
les llama hidrocarburos porque casi todos los componentes estn formados por
hidrgeno y carbono (ATSDR, 1999).

Los crudos de petrleo pueden tener diferentes cantidades de sustancias

qumicas; asimismo, los productos de petrleo tambin varan dependiendo del
crudo de petrleo del que se produjeron. Algunos TPH son lquidos incoloros o de
color claro que se evaporan fcilmente, mientras que otros son lquidos espesos

2
de color oscuro o semislidos que no se evaporan. Muchos de estos productos
tienen un olor caracterstico a gasolina, kerosn o aceite (ATSDR, 1999).

En la sociedad moderna se usan tantos productos derivados del petrleo (por

ejemplo, gasolina, kerosn, aceite combustible, aceite mineral y asfalto) que la
posibilidad de contaminacin ambiental es muy alta. La contaminacin con
productos de petrleo est constituida por una variedad de estos hidrocarburos de
manera que no es prctico medir cada uno de ellos. Sin embargo, es til medir la
cantidad total del conjunto de hidrocarburos que se encuentran en una muestra de
suelo, agua o aire (ATSDR, 1999).

Actualmente, en nuestro Estado, existen escasas instancias especializada en el

registro y atencin a las afectaciones de PEMEX a particulares y medio ambiente
en general, que coordinen acciones integrales de prevencin y atencin definitiva
a dichas afectaciones, y que d a conocer a la opinin pblica y ciudadana los
resultados concretos sobre su actividad (Vela, 2007).

Dado toda la problemtica ambiental generada por los accidentes relacionados

con hidrocarburos, las Normas Oficiales Mexicanas (NOM) establecen lmites
permisibles de la cantidad de sustancias presentes en algn medio, e incluso la
forma de procesarlas y transportarlas, por ejemplo: NOM-086-SEMARNAT-
SENER-SCFI-2005, Especificaciones de los combustibles fsiles para la
proteccin ambiental; NOM-027-SESH-2010, Administracin de la integridad de
ductos de recoleccin y transporte de hidrocarburos; NOM-CCA-003-ECOL/1993,
que establece los lmites mximos permisibles de contaminantes en las descargas
de aguas residuales a cuerpos receptores provenientes de la industria de
refinacin de petrleo y petroqumica; NOM-138-SEMARNAT/SSA1-2012, Lmites
mximos permisibles de hidrocarburos en suelos y lineamientos para el muestreo
en la caracterizacin y especificaciones para la remediacin (SENER, 2012; INE,
2007).

3
En la bsqueda de mtodos para mitigar las afectaciones provocadas por los
desastres con hidrocarburos, en especifico los suelos contaminados por stos, se
han desarrollado algunas investigaciones a nivel internacional y nacional en donde
se buscan y analizan microorganismos con capacidad hidrocarburoclasta para
mejorar la eficiencia en tiempo de la biorremediacin del sitio contaminado. Militon
y colaboradores (2010), evaluaron la respuesta de los microorganismos presentes
en suelo contaminado con petrleo al ser bioestimulado con aire en reactores de
lecho fijo, monitoreando la actividad microbiana por dos aos, encontrndose
varios filotipos raros, adems de que la comunidad bacteriana cambi de
Grammaproteobacteria a Actinobacteria durante el tratamiento, pudiendo este
ltimo filotipo estar involucrado en la restauracin de los ecosistemas estudiados.

En India, Das y Chandran (2011) mencionan que la biorremediacin es una

tecnologa prometedora para el tratamiento de sitios contaminados ya que adems
de ser un mtodo rentable en comparacin a mtodos mecnicos o qumicos que
tienen una eficacia limitada y que pueden ser caros, dan lugar a una
mineralizacin completa de los contaminantes orgnicos en dixido de carbono,
agua, compuestos inorgnicos y la transformacin de los contaminantes a
compuestos ms simples por agentes biolgicos como los microorganismos, de
los cuales aquellos autctonos del agua o suelo son capaces de degradar
hidrocarburos contaminantes.

En el mismo ao, a causa el derrame de petrleo de Deepwater Horizon, se llev

a cabo un estudio en Pensacola Beach, FL., donde se encontraron altas
concentraciones del hidrocarburo del derrame en las playas, de donde se aislaron
24 cepas bacterianas de 14 gneros que fueron confirmadas como
microorganismos degradadores de petrleo. Las cepas bacterianas aisladas
fueron, principalmente, Gammaproteobacteria, incluyendo gneros representativos
conocidos como degradadores de petrleo (Alcanivorax, Marinobacter,
Pseudomonas y Acinetobacter). De estas cepas se pudo concluir que los
miembros de Gammaproteobacteria (Alcanivorax y Marinobacter) y

4
Alphaproteobacteria (Rhodobacteracea) tienen la capacidad de degradar petrleo
(Kostka et al, 2011).

Para el caso especfico de la regin de Coatzacoalcos en el Estado de Veracruz,

Prez (2012) aisl e identific dos cepas bacterianas del gnero Agrobacterium,
pero recomend realizar la identificacin bacteriana por medio de pruebas de
identificacin bioqumicas como Biolog ya que se obtienen resultados con mayor
confiabilidad y rapidez. Tambin se pueden utilizar otro tipo de pruebas
bioqumicas API 20NE o identificacin por herramientas de biologa molecular para
tener una mejor identificacin taxonmica de las cepas aisladas.

5
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los problemas de contaminacin de suelos son un hecho que no podemos dejar
de lado, es preocupante como se han ido deteriorando los ecosistemas de nuestro
planeta a causa de esto, y la corteza terrestre no ha sido la excepcin. La industria
petroqumica ha ocasionado uno de los problemas ms serios en contaminacin
de suelos donde, por ejemplo el derrame de hidrocarburos ocupa uno de los
primeros lugares.

Sin duda, las alternativas reportadas para mitigar estos daos es la

biorremediacin y muchas veces es ms viable utilizar los microorganismos
nativos de la regin en donde ha ocurrido el evento para restablecer el medio
contaminado, adems de que es una opcin econmicamente viable.

JUSTIFICACIN
En la regin sur del estado de Veracruz, la industria petrolera es sumamente
intensa. Existen instalaciones de explotacin y refinacin de cientos de kilmetros
adems de ductos que cruzan reas urbanas y rurales. Toda esta infraestructura
muchas veces no recibe el mantenimiento adecuado que garantice la seguridad
del proceso de obtencin y transporte de hidrocarburos, por lo que el riesgo de
que ocurra un derrame es bastante alto, y usualmente se aplican tcnicas
mecnicas para retirar fsicamente el contaminante del suelo.

Por todo lo anterior, en este trabajo se busca identificar bacterias que tengan la
capacidad de degradar hidrocarburos, mismas que sern aisladas y purificadas a
partir de muestras de suelo contaminado y se comprobar la capacidad de
adaptacin para degradacin de los hidrocarburos totales de petrleo, conocidos
como HTPs.

6
OBJETIVOS
Objetivo General
Aislar e identificar bacterias con capacidad de degradacin de hidrocarburos de
suelos contaminados de la zona sur del estado de Veracruz.

Objetivos Especficos
Caracterizar fsica y qumicamente el suelo contaminado con
hidrocarburos.

Cuantificar y comparar el nmero de microorganismos utilizando

distintas fuentes de carbono.

Aislar y purificar las cepas bacterianas hidrocarburoclastas utilizando

petrleo crudo como nica fuente de carbono.

Identificar bioqumicamente las cepas bacterianas aisladas

HIPTESIS
Si se han aislado cepas bacterianas en suelos contaminados con hidrocarburos,
es posible aislar cepas nativas con actividad hidrocarburoclasta en suelos
contaminados por hidrocarburos de la regin sur del Estado de Veracruz.

7
ESQUEMA DE TRABAJO.
Caracterizacin del Suelo
Anlisis Fsicos
Determinacin de Textura
(Mtodo de Bouyoucus)
Determinacin de Materia Orgnica
Determinacin de Humedad
(Mtodo Gravimtrico)
Muestreo de Suelo Contaminado
Anlisis Qumicos
Determinacin de pH
(Mtodo Potencio mtrico)
(Mtodo de Walkey-Bray)
Determinacin de Fsforo
(Mtodo de Olsen)
Determinacin de Nitratos
(Mtodo Colorimtrico)
Determinacin de Nitrgeno
Orgnico (Mtodo Matemtico)
Determinacin de HTPs
(Mtodo de extraccin
Agitacin - Centrifugacin)
.
Anlisis Microbiolgicos
FASE I.
Conteo de UFC totales del suelo
contaminado por la tcnica de
dilucin en placa.
FASE II.
Aislamiento y purificacin de
bacterias hidrocarburoclastas por
mtodo de dilucin en placa
usando petrleo crudo como
nica fuente de carbono.
FASE III.
Identificacin de las cepas
bacterianas puras obtenidas en la
fase anterior.
8
CAPTULO I
MARCO TERICO
1.1 Situacin actual de contaminacin por hidrocarburos en
Mxico
Como consecuencia de varios siglos de actividad minera en Mxico y
posteriormente, debido a la industria de la qumica bsica, petroqumica y de
refinacin del petrleo, se han producido cantidades muy grandes, pero muy
difciles de cuantificar, de residuos peligrosos. Aunado a lo anterior, la intensa
actividad de otras industrias, que conlleva a accidentes durante el
almacenamiento, transporte o trasvase de sustancias (fugas, derrames, incendios)
y la disposicin clandestina e incontrolada de residuos, contribuyen en gran
medida a la contaminacin de suelos (SEMARNAT, 1996).

De acuerdo con estadsticas de la Procuradura Federal de Proteccin al Ambiente

(PROFEPA), cada ao se presentan en Mxico un promedio de 550 emergencias
ambientales asociadas con materiales y residuos peligrosos. Dentro de los
compuestos peligrosos ms comnmente involucrados en emergencias
ambientales, se encuentran el petrleo y sus derivados (gasolinas, combustleo,
diesel), agroqumicos, gas LP y natural.

La industria petroqumica en Mxico se ha desarrollado aceleradamente,

generando diversos factores econmicos. Sin embargo, su expansin y desarrollo
tambin ha dado origen a graves problemas ambientales, derivados de
emergencias ambientales, con graves repercusiones a la salud de la poblacin y al
equilibrio ecolgico de los ecosistemas (Quadri, 1994; PROFEPA, 1999). Entre las
causas que han generado este deterioro ambiental por la contaminacin de
cuerpos de agua y suelos a lo largo de todo el pas, se encuentran las siguientes
(PROFEPA, 1999):
(i) Manejo inadecuado y abandono de materiales y residuos peligrosos
(ii) Mantenimiento inadecuado o falta de este en instalaciones petroleras
(iii) Explosiones en instalaciones de alto riesgo
(iv) Fugas en lneas de conduccin
(v) Derrames de hidrocarburos

10
Para el ao 2013 PEMEX report en el total de fugas y derrames una disminucin
de 39%, en comparacin con el cierre del ao de 2012, que en su mayora se dan
por el mal estado de los ductos. En cuanto a su pasivo ambiental al inicio de 2013
el inventario de sitios contaminados fue de 1,023.35 hectreas. Durante el ao se
incorporaron al inventario 50.70 hectreas, (21.88 hectreas de PEMEX-
Refinacin y 28.82 hectreas de PEMEX-Exploracin y Produccin). Asimismo, se
desincorporaron 53.81 hectreas de las cuales 18.89 corresponden a PEMEX-
Refinacin, 30.09 hectreas a PEMEX-Exploracin y Produccin, 3.63 hectreas a
PEMEX-Gas y Petroqumica Bsica y 1.20 a PEMEX-Petroqumica. Estas
acciones tuvieron como resultado un inventario total de 1,020.24 hectreas al
cierre de 2013, que representa una disminucin del 0.3 por ciento con relacin a
2012 (PEMEX, 2013).

1.1.1 Contaminacin en la regin sur del Estado de Veracruz

El 22 de diciembre de 2004 ocurri un incendio en la estacin de bombeo de
Mazumiapan, Veracruz, que origin la ruptura en el oleoducto de 30 de dimetro
Nuevo-Teapa-Poza Rica y el derrame de 5,000 barriles de petrleo crudo afect
11 km del margen derecha del Ro Coatzacoalcos y riveras de los arroyos
Tepeyac, Gopala y Teapa, adems de dos hectreas de suelo y manglares. En
2005, el nmero total de eventos ocurridos y registrados en el sistema de
transporte de ductos fue de 395, de los cuales 280 fueron derrames de
hidrocarburos lquidos y 115 de fugas de hidrocarburos fase gaseosa. De los
derrames, 68 de ellos (24%), fueron mayores a 5 barriles y, de estos, 67 %
ocurrieron en Oaxaca (7%), Tabasco (13%) y Veracruz, destacando que Veracruz
tuvo 32 derrames (47%), con un volumen de 3,368 barriles derramados y
afectacin de suelos de 3 hectreas. Durante 2008 asciende a 13,899 barriles, de
los cuales 8,745 (63 %) correspondieron a los sistemas de ductos,
fundamentalmente de PEMEX-Refinacin y 5,154 barriles (37%) a instalaciones
diferentes a ductos (terminales, auto tanques, refineras, etc.). Petrleos
Mexicanos sufri dos incidentes graves durante 2009, uno tuvo lugar en el

11
oleoducto de 16 de dimetro, localizado en el municipio de Cunduacan en
Tabasco, debido a la ruptura del ducto. El segundo incidente, en el municipio de
Guaymas en el estado de Sonora, cuyo impacto fue de 6,272 barriles destilados
(PEMEX, 2014).

1.1.2 Situacin de lugar de muestreo

Las muestras de suelo se obtuvieron de la localidad de El Polvorn ubicada en el
municipio de Cosoleacaque, Ver., donde en diciembre del 2011 se suscit un
derrame de hidrocarburo causado por una toma clandestina en un oleoducto de
30 de dimetro, que va de Nuevo Teapa a Poza Rica en el kilmetro 9 + 950.
Esto propici daos considerables en rboles y cultivos. Las lluvias y los fuertes
vientos del frente fro nmero 23 ocasionaron que el hidrocarburo se esparciera y
llegara a las aguas del ro Coatzacoalcos a lo largo de 12 km desde la zona de
origen del derrame, generando contaminacin de diversas especies y daos en la
pesca de la zona (CEISA, 2014) .

1.2 Hidrocarburos

1.2.1 Composicin general

El petrleo se compone de hidrocarburos, compuestos orgnicos que en trminos
de cantidad, representan uno de los contaminantes ms significativos de los
ecosistemas, calculndose que en promedio millones de toneladas impactan
anualmente en el mundo (Head y Swanell, 1999). Dependiendo del nmero de
tomos de carbono y de la estructura de los hidrocarburos que integran el
petrleo, se tienen diferentes propiedades que los caracterizan y determinan su
comportamiento como combustibles, lubricantes, ceras o solventes (IMP, 2011).
Pueden ser parafinas (alcanos lineales), isoparafinas (parafinas ramificadas) y
naftenos (alcanos cclicos); tambin hay cantidades significativas de hidrocarburos
aromticos y presencia de tomos de oxgeno, nitrgeno y sulfuro conformando

12
molculas polares. En la Figura 1, se observan estructuras de algunas molculas
que componen el petrleo (Prince, 2002).

Figura 1. Estructuras qumicas de algunos hidrocarburos del petrleo.

1.2.2 Caractersticas del petrleo

El petrleo es un recurso natural no renovable que aporta el mayor porcentaje del
total de la energa que se consume en el mundo, corresponde al energtico ms
importante en la historia de la humanidad. Es un lquido viscoso de color parduzco
constituido por un conjunto de hidrocarburos (tomos de carbono e hidrgeno)
formados naturalmente por reaccin cataltica de la materia orgnica de origen
animal o vegetal, actuando las arcillas y los lodos (silicatos de aluminio) como
catalizadores de las mismas. Se presenta de forma natural en depsitos de roca
sedimentaria y slo en lugares en los que hubo mar (Prias, 2011) .

El hecho de que su origen sea muy diverso, dependiendo de la combinacin de los

factores anteriormente dichos, provoca que su presencia sea tambin muy
variada: lquido, dentro de rocas porosas y entre los huecos de las piedras; voltil,
es decir, un lquido que se vuelve gas al contacto con el aire; semislido, con

13
textura de ceras. En cualquier caso, el petrleo, de por s, es un lquido y se
encuentra mezclado con gases y con agua.

1.2.3 Clasificacin del petrleo

La industria mundial de hidrocarburos lquidos clasifica el petrleo de acuerdo a su
densidad API (Parmetro internacional del Instituto Americano del Petrleo, que
diferencia las calidades del crudo) mostrados en la Tabla 1:

Tabla 1. Tipos de petrleo

Aceite crudo Densidad (g cm-3) Densidad
grados API
Extra pesado >1 10
Pesado 1.0-9.2 10-22.3
Mediano 0.92-0.87 22.3-31.1
Ligero 0.87-0.83 31.1-39
Supe ligero <0.83 >39
FUENTE: API, 2011

Para exportacin, en Mxico se preparan tres variedades de petrleo crudo (IMP,

2011):
Istmo: Ligero con densidad de 33.6 grados API y 1.3% de azufre en peso.
Maya: Pesado con densidad de 22 grados API y 3.3 % de azufre en peso.
Olmeca: Sper ligero con densidad de 39.3 grados API y 0.8% de azufre en
peso.

1.2.4 Formas de contaminacin por la operacin

De acuerdo a Torres y Zuluaga (2009), y a Prez (2012), existe el riesgo de
contaminacin en las siguientes etapas de la extraccin de hidrocarburos:

Operacin ssmica:
Es una de las ms utilizadas en la etapa de exploracin, y consiste en la medicin
de las ondas de resonancia que produce la detonacin de cargas de dinamita.

14
Esto significa que la zona explorada queda completamente llena de agujeros
dinamitados. Al encontrarse el lugar donde probablemente se puede dar la
explotacin del mineral, se procede a abrir los pozos exploratorios.

Exploracin:
Durante este proceso son utilizados lodos qumicos, los cuales son altamente
contaminantes, para la mayor penetracin en el terreno de los taladros que deben
ser enfriados constantemente con agua. Tambin se construyen piscinas para
depositar las aguas cidas y los lodos contaminados que salen junto con el
petrleo. Esta fase altera el equilibrio natural, ya que requiere de grandes
cantidades de agua del lugar y aumenta los niveles de contaminacin.

Fase de extraccin:
Comienza cuando alguno de los pozos exploratorios toca un yacimiento. En tierra
o en mar las operaciones a realizarse en esta etapa alteran el ambiente natural y
lo contaminan. Esta etapa presente riesgos adicionales de accidentes,
relacionados con gases txicos, aguas acidas y los depsitos de crudo.

Transporte:
Se da despus de la extraccin del crudo. El transporte del crudo es una de las
etapas ms riesgosas y costosas en trminos de destruccin ambiental. Desde
que se transporta el crudo masivamente, son millones de barriles que se han
derramado en zonas selvticas, ros, lagos y mares.

Exploracin y explotacin:
Tambin se da una compactacin de los suelos por la maquinaria pesada donde
se produce una contaminacin de los suelos de la zona por la prdida de
vegetacin. Los microorganismos del suelo son alterados por la contaminacin
con hidrocarburos, desapareciendo o disminuyendo las especies menos
resistentes sin dejar atrs las altas tasas de mutaciones. Las alteraciones al suelo

15
producen cambios en el pH de este y del agua, que pueden causar un deterioro
crnico de los ecosistemas.

Por lo tanto un manejo inadecuado de dicha fuente energtica puede causar

problemas de gran envergadura socio-ambiental

1.2.5 Definicin de HTPs

El trmino hidrocarburos totales de petrleo o HTPs (TPH, por sus siglas en
ingls) se usa para describir a un grupo extenso de varios cientos de sustancias
qumicas derivadas originalmente del petrleo crudo. En este sentido, los HTPs
son realmente una mezcla de sustancias qumicas. Se les llama hidrocarburos
porque casi todos los componentes estn formados enteramente de hidrgeno y
carbono. Los crudos de petrleo pueden tener diferentes cantidades de sustancias
qumicas; asimismo, los productos de petrleo tambin varan dependiendo del
crudo de petrleo del que se produjeron. La mayora de los productos que
contienen HTPs se incendian. Algunos son lquidos incoloros o de color claro que
se evaporan fcilmente, mientras que otros son lquidos espesos de color oscuro o
semislidos que no se evaporan. Muchos de estos productos tienen un olor
caracterstico a gasolina, kerosn o aceite.

Debido a que en la sociedad moderna se usan tantos productos derivados del

petrleo (por ejemplo, gasolina, kerosn, aceite combustible, aceite mineral y
asfalto), la posibilidad de contaminacin ambiental es alta. Debido al gran nmero
de hidrocarburos involucrados, generalmente no es prctico medir cada uno de
ellos. Sin embargo, es til medir la cantidad total del conjunto de hidrocarburos
que se encuentran en una muestra de suelo, agua o aire (ATSDR, 1999).

16
 1.2.6 Toxicologa de los HTPs
Los HTPs son liberados al ambiente por accidentes desde industrias o como
productos secundarios debido a su uso comercial o privado. Cuando hay escapes
o derrames de HTPs directamente al agua, algunas fracciones de los HTPs
flotan en el agua y forman una capa delgada en la superficie. Otras fracciones ms
pesadas se acumularn en el sedimento del fondo, lo que puede afectar a peces y
a otros organismos que se alimentan en el fondo.

Los HTPs que son liberados al suelo pueden movilizarse hacia el agua
subterrnea a travs del suelo. All, los componentes individuales pueden
separarse de la mezcla original dependiendo de las propiedades qumicas de cada
componente. Algunos de estos componentes se evaporan al aire y otros se
disolvern en el agua subterrnea y se alejarn del rea donde fueron liberados.
Otros compuestos se adherirn a partculas en el suelo y pueden permanecer en
el suelo durante mucho tiempo, mientras que otros sern degradados por
microorganismos en el suelo (ATSDR, 1999).

1.2.7 Normatividad
En septiembre de 2013 fue publicada la Norma Oficial Mexicana NOM-138-
SEMARNAT/SSA1-2012, que establece los lmites mximos permisibles de
hidrocarburos en suelo y lineamientos para muestreo, caracterizacin y
remediacin. Donde son establecidos los lmites en funcin de las fracciones
ligeras, medias y pesadas (DOF, 2014). Los productos asociados a los derrames
de hidrocarburos para los que se establecen lmites mximos permisibles de
contaminacin en suelos se enlistan en la Tabla 2.

17
 Tabla 2. Hidrocarburos que debern analizarse en funcin del producto
contaminante
HIDROCARBUROS
PRODUCTO
FRACCIN FRACCIN FRACCIN
CONTAMINANTE HAPs HAPs BTEX
PESADA MEDIA LIGERA
Mezclas
Petrleo crudo
Combustleo
Parafinas
Petrolatos
Aceites
Gasleo
Diesel
Turbosina
Keroseno
Creosota
Gas avin
Gasolvente
Gasolinas
Gasnafta
BTEX: B, benceno; T, tolueno; E, etilbenceno; X, xilenos (suma de ismeros); HAPs:
Hidrocarburos aromticos polinucleares. FUENTE: NOM-138-SEMARNAT/SSA1-2012

De igual forma, los lmites mximos permisibles de hidrocarburos en suelos se

detallan en las Tablas 3 y 4.
Tabla 3. Lmites mximos permisibles para fracciones de hidrocarburos en suelo.

USO DE SUELO PREDOMINANTE

FRACCIN DE (mg Kg-1 BASE SECA)
HIDROCARBUROS Agrcola, forestal,
Residencial y Industrial y
pecuario y de
recreativo comercial
conservacin
Ligera 200 200 500
Media 1 200 1 200 5 000
Pesada 3 000 3 000 6 000
FUENTE: NOM-138-SEMARNAT/SSA1-2012

18
 Tabla 4. Lmites mximos permisibles para hidrocarburos especficos en suelo.
Uso de suelo predominante
Hidrocarburos especficos (mg Kg-1 base seca)
Agrcola Residencial Industrial
Benceno 6 6 15
Tolueno 40 40 100
Etilbenceno 10 10 25
Xilenos (suma de ismeros) 40 40 100
Benzo [a] pireno 2 2 10
Benzo [a] antraceno 2 2 10
Benzo [a,h] antraceno 2 2 10
Benzo [b] fluoranteno 2 2 10
Benzo [k] fluoranteno 8 8 80
Indeno (1,2,2-cd) pireno 2 2 10
FUENTE: NOM-138-SEMARNAT/SSA1-2012

1.3 Suelo
El suelo constituye un recurso natural que desempea diversas funciones en la
superficie de la Tierra, proporcionando un soporte mecnico as como nutrientes
para el crecimiento de plantas y microorganismos. La matriz del suelo est
formada por cuatro componentes principales: minerales, materia orgnica, aire y
agua.

Todos estos factores definen el tipo de suelo, que junto con las condiciones
particulares de un sitio frecuentemente pueden limitar la seleccin de un proceso
de tratamiento en particular. Por otra parte, la posibilidad de usar una tecnologa
de tratamiento, puede eliminarse con base en la clasificacin del suelo u otras
caractersticas propias de este (Van Deuren et al. 1997).

1.3.1 Composicin
De acuerdo a Eweis y colaboradores (1998), la matriz de un suelo est compuesta
por:
Minerales: son los principales componentes estructurales y constituyen ms
del 50% del volumen total del suelo.

19
 Materia Orgnica: La fraccin orgnica del suelo est compuesta por:
o Residuos de plantas y animales.
o Productos resultantes del metabolismo microbiano, comnmente
llamado humus. El humus es materia orgnica que ha sufrido varias
degradaciones y transformaciones. Est compuesto en su mayor
parte por sustancias polimerizadas: compuestos aromticos,
polisacridos aminocidos, polmeros del cido urnico y
compuestos que contienen fsforo (Alexander, 1991).
Aire y Agua: Juntos ocupan el volumen de los espacios, y usualmente
conforman de 25% a 50% del volumen total. La proporcin relativa de
aire/agua flucta considerablemente con el contenido de humedad del
suelo.

1.3.2 Clasificacin de los suelos

Los sistemas modernos de clasificacin de ingeniera se disean para permitir una
fcil transicin de las observaciones en campo a las predicciones bsicas de
propiedades y de conductas de ingeniera de suelos. Algunos de los primeros
sistemas clasificatorios ingenieriles de suelo eran adaptaciones de los propios
sistemas de clasificacin de la ciencia del suelo (ASTM, 1985).

Los sistemas de clasificacin ms comunes de ingeniera para suelos en Estados

Unidos es el Sistema de Clasificacin de Suelo unificado, USCS por su acrnimo
en ingls. El USCS est basado en el anlisis granulomtrico y tiene tres grupos
de clasificacin mayores (ASTM, 1985):
Suelos de grano grueso (por ejemplo, arenas y gravas): se distingue
principalmente porque los granos son observables a simple vista.
Suelos de grano fino (por ejemplo, limos y arcillas): son buenos y algunos
no almacenan agua, retienen agua mejor que los granos superiores.
Suelos altamente orgnicos, tambin conocidos como turba: es un
material orgnico, de color pardo oscuro y rico en carbono. Est formado

20
 por una masa esponjosa y ligera en la que an se aprecian los
componentes vegetales que la originaron. Se emplea como combustible y
en la obtencin de abonos orgnicos.

1.3.3 Contaminacin de suelos

Un suelo contaminado es aqul que ha superado su capacidad de amortiguacin
para una o varias sustancias, y como consecuencia, pasa de actuar como un
sistema protector a ser causa de problemas para el agua, la atmosfera y los
organismos (Fernndez et al, 2006).

El comportamiento de los contaminantes orgnicos est en funcin de sus

caractersticas fsicas y qumicas (densidad, solubilidad, polaridad, entre otras),
adems de las caractersticas del medio como son la unidad de suelo,
permeabilidad, estructura, tamao de las partculas, contenido de humedad y de
materia orgnica, as como la profundidad del manto fretico. Factores
climatolgicos como la temperatura y la precipitacin pluvial tambin tienen una
gran influencia.

El suelo tiene una capacidad de depuracin que alcanza su lmite cuando deja de
ser eficaz y funciona como fuente de sustancias peligrosas para los organismos
que viven en l o no se pueden degradar al acumularse en l sustancias como los
HTPs a niveles tales que repercuten negativamente en el comportamiento de los
suelos. Dichas sustancias, a esos niveles de concentracin, se vuelven txicas
para los organismos del suelo. Se trata pues de una degradacin qumica que
provoca la prdida parcial o total de la productividad del suelo.

21
 1.3.4 Hidrocarburos en el suelo
Los hidrocarburos contaminantes llegan por la actividad humana (antrpicos), se
caracterizan por la presencia de molculas aromticas policclicas, agrupadas bajo
los nombres de HPAs, y se pueden encontrar en el suelo en forma lquida si son
hidroflicos, adsorbidos en las partculas del suelo, si son hidrofbicas, o en la
atmsfera edfica, si son voltiles (Sols y Lpez, 2003).

1.3.5 Consecuencias de la contaminacin por hidrocarburos

Los derrames de hidrocarburos de petrleo provocan daos en la composicin y
estructura de los suelos donde ocasionan grandes perturbaciones en los
ecosistemas que se encuentran afectando todas las cadenas trficas y todos los
procesos bioqumicos que se llevan a cabo. Este tipo de contingencias
ambientales originan efectos directos sobre la biota, ya que el petrleo contiene
compuestos qumicos txicos que producen daos a plantas, animales y humanos,
pero principalmente a las poblaciones de microorganismos, los cuales representan
parte importante del ecosistema (Vasudevan y Rajaram, 2001).

1.4 Biorremediacin
La biorremediacin hace referencia a todos los procesos biolgicos que se pueden
usar para minimizar un impacto negativo en el ambiente; usualmente, es la
remocin de un contaminante presente en el suelo, el agua o el aire. Algunos
microorganismos, especialmente ciertas bacterias, tienen la habilidad de convertir
las molculas de un contaminante orgnico en dixido de carbono, agua e iones
inorgnicos fundamentales para los ciclos biogeoqumicos, como tambin oxidar o
reducir los agentes inorgnicos que contaminan un ambiente, esto permite que se
regeneren los ecosistemas que han sido afectados por el vertimiento de
sustancias orgnicas como el petrleo y sus derivados (hidrocarburos),
plaguicidas (compuestos alifticos y aromticos halogenados); sustancias

22
inorgnicas (compuestos nitrogenados), y tambin algunos contaminantes
metlicos (Prince, 2002).

De acuerdo con datos proporcionados por la SEMARNAT (2002) todas las

tecnologas que ofrecen las empresas que cuentan con permisos para remediar
suelos contaminados, estn enfocadas exclusivamente a la remediacin de sitios
contaminados con compuestos orgnicos. Dentro de los contaminantes tratados,
principalmente se encuentran los hidrocarburos (HTP, HAP), lodos aceitosos,
lodos de perforacin y recortes de perforacin.

1.4.1 Fundamentos bioqumicos

La actividad bioqumica de los microorganismos nativos del suelo y de los
animales invertebrados que en l se encuentran, es fundamental no solo en la
ausencia o permanencia de compuestos orgnicos contaminantes, sino en la
biodegradacin de toda materia orgnica que llega al suelo (Sols y Lpez, 2003).

Los aceptores ms comnmente utilizados por los microorganismos son el

oxgeno, los nitratos, el hierro (III), los sulfatos y el dixido de carbono. Cuando el
oxgeno es el aceptor de electrones la respiracin microbiana es en condiciones
aerobias, y los procesos de biodegradacin sern aerobios; sin embargo, si utiliza
los sulfatos o el dixido de carbono se produce en condiciones reductoras o
anaerobias, y los procesos de biodegradacin sern de tipo anaerobio. A
continuacin se presentan las reacciones de degradacin.

Degradacin Aerobia:

Degradacin Anaerobia:

23
La siguiente frmula representa el modelo tpico de la biodegradacin de
hidrocarburo en condiciones aerbicas (OMI, 2005):

En la Figura 2, se observa la secuencia de reacciones que tienen lugar en el

proceso de degradacin de los hidrocarburos del petrleo por accin de una
bacteria (Prince, 2002).

Figura 2. Diagrama de la biodegradacin de hidrocarburos de petrleo.

1.4.2 Factores que condicionan la biorremediacin

La biodegradacin del petrleo mediante microorganismos solo puede tener lugar
en la interfase petrleo/agua, de tal forma que el petrleo debe estar mezclado
con un substrato hmedo y su eficacia depender de la temperatura,
disponibilidad de oxgeno y nutrientes como nitrgeno, fsforo y potasio.

24
 pH
El pH ptimo del suelo para que se desarrolle la biorremediacin debe ser
superior a 6.5, aadiendo cal por si fuera necesario para conseguirlo.
Tambin pueden aadirse fertilizantes como urea, fosfato amnico, etc.,
para acelerar la velocidad de degradacin de los hidrocarburos (Silos,
2008).

Materia Orgnica:
Se ha correlacionado positivamente con la adsorcin de compuestos
orgnicos en numerosos estudios. Un efecto inmediato del aumento de este
parmetro es el incremento de los sitios de adsorcin, disminuyendo la
concentracin en la fase acuosa y gaseosa del contaminante orgnico
como tambin su transporte y su biodisponibilidad. La adsorcin es
afectada por dos factores: la hidrofobicidad del contaminante (es la
dificultad para disolverse en agua) y la fraccin de la materia orgnica en el
suelo (contenido de carbono orgnico). Muchos de los compuestos
hidrofbicos pueden ser altamente adsorbidos, de acuerdo a varios estudios
de campo (Mackay et al., 1985).

Textura del suelo:

La lixiviacin en texturas gruesas (suelos arenosos y grava) es ms rpida
que en texturas finas (suelos arcillosos), con mayor capacidad de retener
los contaminantes y prevenir su alcance a aguas subterrneas. Adems,
otros parmetros dinmicos como permeabilidad, conductividad hidrulica y
espacio poroso son dependientes de la textura. El contenido de arcilla est
correlacionado con la capacidad de campo, rea superficial especfica,
capacidad de intercambio catinico influyendo en la adsorcin de iones.
Para compuestos orgnicos no polares, generalmente no existe correlacin
entre el contenido de arcilla y la adsorcin (Jury, 1989).

25
 Humedad:
Las bacterias requieren condiciones mnimas de humedad para su
crecimiento; el agua es importante para su desarrollo porque acta como
medio de transporte de nutrientes y oxgeno a la clula ya que forma parte
de su protoplasma bacteriano. Es conveniente mantener una humedad del
25-75% de la capacidad de campo, se refiere a la cantidad relativamente
constante de agua que contiene un suelo saturado despus de 48 horas de
drenaje (Shaxson y Barber, 2005)

La biodegradacin de hidrocarburos en ecosistemas terrestres puede ser

limitada por la cantidad de agua disponible en el medio para el crecimiento
y metabolismo de los microorganismos. Diferentes estudios reportan que
las tasas ptimas de biodegradacin se dan cuando la saturacin de agua
en el suelo se encuentra entre el 30 90%. En valores menores, la
degradacin se ve inhibida (Vias, 2005)

Temperatura:
La biorremediacion llevada a cabo entre 20 y 40C muestra que este
intervalo de temperatura es ptimo para la actividad microbiana, sin
embargo, en climas tropicales es mejor una temperatura aproximadamente
de 30 a 35C. La velocidad de degradacin aumenta con la temperatura,
por lo que un incremento de la misma es til. Cuando la temperatura se
incrementa en 10C la biorremediacion se duplica, pero se elevan los
costos. Para mantener constante este factor es necesario cubrir la zona con
paja, vegetacin o plstico para conservar la radiacin solar, o la utilizacin
de electrodos enterrados en el suelo o la circulacin constante de agua
caliente (Bossert y Bartha, 1984)

Cuando se supera los 40C se produce una disminucin de la actividad

microbiana, o puede decrecer la biorremediacion debido a la
desnaturalizacin de enzimas y protenas de las bacterias. Cuando ocurren

26
 derrames de petrleo en regiones cuyas temperaturas son entre 1 a 15C
se suelen usar microorganismos psicrfilos (Kerry, 1990).

La adicin de nutrientes sera indispensable para la biorremediacion, una reaccin

aceptada generalmente entre carbono, nitrgeno y fosforo es C:N:P = 100:10:1. El
proceso de biodegradacin se lleva a cabo en la interface hidrocarburo-agua, por
lo que debern estar disponibles de forma soluble (OMI, 2005).

1.4.3 Microorganismo para la biorremediacin

El suelo es un ecosistema que contiene una gran variedad de poblaciones
microbianas cuyos miembros representan muchos tipos fisiolgicos. La comunidad
microbiana en suelos es importante por su relacin con la fertilidad del suelo y con
los ciclos biogeoqumicos de los elementos, adems del uso potencial de los
miembros especficos para aplicaciones ambientales e industriales.

Bacterias
Es importante notar la presencia de microorganismos nativos del suelo que tienen
un papel fundamental en la ausencia y/o permanencia de compuestos orgnicos,
siendo considerado como una va de prdida de los compuestos orgnicos
voltiles, llamada biodegradacin; los compuestos qumicos que poseen otras
estructuras que los azcares, aminocidos y cidos grasos, no pueden entrar
inmediatamente dentro del metabolismo microbiano; esos compuestos requieren
de una aclimatacin definida en horas o meses, durante el cual poco o nada se
degrada. El periodo de retraso generalmente es causado por (EPA, 1983):
a) La transferencia de la informacin gentica responsable de la degradacin
para una poblacin.
b) La fase inicial de crecimiento exponencial de organismos capaces de
degradar el compuesto, la alta solubilidad al agua que puede favorecer una
rpida degradacin

27
Por su diversidad, las bacterias se encuentran regularmente en comunidades
heterogneas; algunas especies son degradadores primarios, es decir, ellas
inician la degradacin de la materia orgnica en el suelo; otras crecen en
compuestos resultantes de la degradacin parcial de complejos orgnicos o
productos residuales de degradadores primarios.

Las bacterias tienen tres morfologas generales (Figura 3)

Esfricas (cocos)
Forma de bastones (bacilos)
Forma de espiras (espirilos)

Figura 3. Morfologa general de las bacterias

28
Y se clasifican usando sus caractersticas fsicas, qumicas, genticas y
metablicas. El uso y tolerancia al oxgeno que es uno de los mtodos ms
generales de clasificacin. Los aerobios estrictos son bacterias que requieren
oxgeno como aceptor final de electrones y crecen solamente en presencia del
mismo. Las aerobias facultativas son bacterias que pueden utilizar aceptores de
electrones terminales alternativos y crecer en presencia o ausencia de oxgeno.
Algunas anaerobias son tolerantes al oxgeno, pero ste es txico a muchas
anaerobias estrictas (CULTIMED, 2012) .

Una colonia es una agrupacin de bacterias formada a partir de la reproduccin de

una Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio slido; aunque vara de
tamao generalmente es visible a simple vista. Una UFC puede ser un solo
microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma especie como
en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los
estafilococos o los estreptococos (Duarte, 2012).

Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos
color caractersticos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se
encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie
bacteriana que la forme. Debido a que las caractersticas de las colonias ocurren
en varios grados y combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo
muy uniformes, sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados (Figura 4).

29
 Figura 4. Morfologa general de colonias bacterianas.

Bacterias hidrocarburoclastas
Las bacterias hidrocarburoclastas son aquellas capaces de crecer en presencia de
hidrocarburos como nica fuente de carbono y energa. La presencia de petrleo
en el suelo enriquece selectivamente la comunidad microbiana capaz de
adaptarse y utilizar el nuevo sustrato, y crea una situacin selectiva. Sin embargo,
los componentes txicos del petrleo pueden inhibir a algunos miembros de la
comunidad microbiana, produciendo tanto una disminucin en el tamao de la
poblacin, como en la diversidad de especies (Fernndez et al, 2006). En la Tabla
5 se muestran algunas de los gneros reportados con capacidad
hidrocarburoclastas.

30
 Tabla 5. Gneros bacterianos conocidos como degradadores de hidrocarburos
GNEROS
Achromobacter Acidovorax Acinetobacter Actinomyces

Aeromonas Agmenellum Agrobacterium Alcaligenes

Alteromonas Anabaena Aphanocapsa Arthrobacter

Aureobacterium Azospilrillum Azotobacter Bacillus

Beijerinckia Beneckea Brevibacterium Brevundimonas

Clavibacter Clostridium Comamonas Crynebacterium

Curtobacterium Cycloclasticus Cytophaga Enterobacter

Erwinia Escherichia Flavobacterium Gordona

Klebsiella Lactobacillus Leucothrix Marinobacter

Micrococcus Microcoleus Moraxlela Mycobacterium

Nocardia Nostoc Oscillatoria Pasteurella

Peptococcus Phormidium Proteus Pseudomonas

Rhodococcus Sarcina Serratia Spherotilus

Sphingomonas Spirillum Stenotrophomonas Streptomyces

Thermoleophilum Vibrio Xanthobacter Xanthomonas

Fuente: Prince, 2002

Los microorganismos aislados en suelos poseen actividades de peroxidasas y

oxigenasas, que permiten la oxidacin de algunas fracciones del petrleo. Esta
oxidacin cambia las propiedades de los compuestos hacindolos susceptibles a
ataques secundarios y facilitando su conversin a bixido de carbono y agua.

31
En la Tabla 6 se muestra la clasificacin de algunos de los gneros incluidos en la
Tabla 5

Tabla 6. Clasificacin de gneros bacterianos conocidos como degradadores de

hidrocarburos
GRUPO FAMILIA GNERO ESPECIES
agarici, andropogonis,
avenae, caricapapaya,
caryophylli, cichorii, cissicola,
gladioli, glumae, marginales,
Pseudomonas pseudoalcaligenes subs.
cityrulli, rubrilineans,
Gram negativo, rubrisubalbicans, syringae,
Pseudomonadaceae
varillas y cocos solanacearum, tolaasii,
viridiflava
albilineans, ampelina,
Xanthomonas axonopodis, campestris,
fragaria.
Agrobacterium rhizogenes, rubi, tumefaciens
amylovora, ananas,
cancerogena, carnegieana,
carotovora subs. carotovora,
Gram negativo, chrysantemi, cypripedii,
carotovora subs atroseptica,
varillas
Enterobactereaceae Erwinia dissolvens, herbicola,
anaerbicas mallotivora, milletiae,
facultativas nigrifluens, nimipressuralis,
quercina, rhaponctici,
rubrifaciens, salicis, stewartii,
tracheiphila, uredovora.
betae, beticola, fascinas,
Gram positivo, flaccumaciens, ilicis,
actinomycetes y Ninguna Clavibacter insidiosum, michiganense,
organismos nebraskense, oortii,
poinsettiae, sepedonicum.
relacionados
Streptomycetaceae Streptomyces ipomeae, scabies.
Micoplasmas y Nocardia vaccinii
gneros de Nocardiaceae
afiliacin incierta Spiroplasma citri
FUENTE: Fierro y Mena, (2009)

32
CAPTULO II
MATERIALES Y MTODOS
Este trabajo de investigacin se llev a cabo en el Laboratorio de Alta Tecnologa
de Xalapa (LATEX), S.C. de la Universidad Veracruzana a partir de una muestra
de suelo donada por la Empresa Soluciones Ambientales, S.A. de C.V. (CEISA, de
C.V), la cual se dedica a brindar servicios ambientales industriales, como
tratamiento fsico-qumico-biolgico a lado del sitio contaminado y/o fuera del sitio,
lavado de suelos con proceso fluidizante, extraccin de vapores y biorremediacin
por bioventeo y por biolabranza.

2.1 Anlisis fsicos y qumicos del suelo

Las metodologas de este apartado se describen en el ANEXO I.

2.1.1 Determinacin de textura (Mtodo de Bouyoucus)

La textura del suelo es una propiedad fsica que corrientemente se determina
mediante el tacto. El anlisis del laboratorio de la distribucin del tamao de las
partculas proporciona un dato numrico de ella. Lo ms importante de este dato
es su uso en la descripcin e identificacin, documentacin y mapeo de suelo
(Forsythe, 1975). La metodologa detallada se describe en la seccin A1.1 del
ANEXO I.

2.1.2 Determinacin de humedad (Mtodo gravimtrico)

La humedad del suelo es muy dinmica y depende del clima, de las plantas, de la
profundidad del suelo y de las caractersticas y condiciones fsicas del perfil. En un
momento dado y a una profundidad dada, es muy variable y depende de la
ubicacin en el terreno del punto de consideracin (Forsythe, 1975). La humedad
del suelo influye significativamente en la actividad biolgica, puesto que un
suministro adecuado de agua es esencial para el crecimiento y la estabilidad
microbianos (Torres y Zuluaga, 2009). La metodologa se describe en la seccin
A1.2 del ANEXO I.

34
 2.1.3 Determinacin de pH (Mtodo potenciomtrico)
El pH del suelo condiciona de forma decisiva no slo la vida de los
microorganismos y los importantes procesos que en ellos intervienen, sino
tambin la mayor o menor asimilabilidad de muchos elementos qumicos que para
los seres vivos son esenciales, y la de otros que a determinadas concentraciones
pueden resultar txicos y producir en ella graves alteraciones (Navarro, 2003). La
metodologa se describe en la seccin A1.3 del ANEXO I.

2.1.4 Determinacin de la materia orgnica (Mtodo de Walkey-

Black)
No existe un mtodo de rutina con el cual se puede determinar la materia orgnica
en el suelo de una manera satisfactoria. Por esa razn normalmente se estima
Indirectamente utilizando la medida del contenido del carbn orgnico (CO) en el
suelo. Se usa un procedimiento modificado de Walkley y Black, que est basado
en una oxidacin hmeda, para determinar el contenido de CO en el suelo. Se
oxida la muestra en una solucin de dicromato de potasio (McKean, 1993). La
metodologa se describe en la seccin A1.4 del ANEXO I.

2.1.5 Determinacin de nitrgeno orgnico (Mtodo matemtico)

La determinacin del nitrgeno orgnico se realiza por medio de un clculo
matemtico, mismo que se describe en la seccin A1.5 del ANEXO I.

2.1.6 Determinacin de nitratos (Mtodo colorimtrico)

En un extracto claro de suelo mediante el uso de sulfato de potasio, el nitrato
forma un compuesto de coloracin amarilla en solucin alcalina con cido
saliclico, el cual es medido a 410nm. La extraccin no se debe de realizar con
cloruro de potasio, ya que el in Cl- puede causar interferencia con la reaccin
colorimtrica. Se debe de usar muestra de suelo fresca, puesto que el suelo
guardado puede acumular nitratos como consecuencia de la mineralizacin. La
metodologa se describe en la seccin A1.6 del ANEXO I.

35
 2.1.7 Determinacin de fosforo (Mtodo de Olsen)
En trminos generales, el fsforo del suelo se clasifica en fsforo orgnico e
inorgnico, dependiendo de la naturaleza de los compuestos que forme. La forma
orgnica se encuentra en el humus y la materia orgnica, y sus niveles en el suelo
pueden variar desde 0 hasta mayores que 0.2%. La fraccin inorgnica est
constituida por compuestos de hierro, aluminio, calcio y flor, entre otros, y
normalmente son ms abundantes que los compuestos orgnicos. Solo una
pequea parte del P aparece en solucin en suelo (< 0.01-1 mg L-1). Para suelos
neutros y alcalinos a medicin de P soluble se utiliza el mtodo Olsen, siendo una
determinacin por colorimetra (Fernndez et al., 2006). En suelos neutros,
calcreos o alcalinos, conteniendo fosfatos de calcio, el extractante disminuye la
concentracin de Ca en solucin a travs de una precipitacin del CaCO 3, por
tanto la concentracin de P en solucin se incrementa (Contreras, 2014). La
metodologa se describe en la seccin A1.7 del ANEXO I.

2.1.8 Determinacin de hidrocarburos totales del petrleo

(HTPs). (Mtodo de extraccin agitacin centrifugacin)
Aunque la extraccin con Soxhlet es una de las tcnicas ms utilizadas para la
extraccin de hidrocarburos por su eficiencia de extraccin (mayor a 80%), el
tiempo y nmero de muestras que se logran procesar son limitadas a la cantidad
de equipos disponibles. La tcnica para la extraccin de los hidrocarburos del
petrleo del suelo se basa en los mtodos 3500B y 3540C de la US EPA (1996) y
el reportado por Schwab et al. (1999), con algunas modificaciones (Arce et al.,
2004) en cuanto a la velocidad de agitacin y volmenes de solvente por utilizar.
Este mtodo se basa en la extraccin de hidrocarburos no voltiles y semivoltiles
de muestras slidas (suelo) a travs del contacto ntimo de la muestra con el
solvente, mediante la agitacin en un matraz o tubo (lavado), produciendo un
efecto de extracciones sucesivas, y separando posteriormente el solvente del
suelo por centrifugacin. (Fernndez et al., 2006). La metodologa se describe en
la seccin A1.8 del ANEXO I.

36
2.2 Anlisis Microbiolgicos
Las metodologas de este apartado se describen en el ANEXO II.

2.2.1 Fase I: Bacterias totales del suelo contaminado por la

tcnica de dilucin en placa para conteo de unidades formadoras de
colonias (UFC).
La cuenta de bacterias totales de un sistema se refiere a las bacterias hetertrofas
presentes en el suelo, es decir, aquellas que obtienen su fuente de carbono a
partir de compuestos orgnicos. Uno de los medios de cultivo recomendado para
su desarrollo es el agar nutritivo o caldo nutritivo, ya que es un medio
relativamente simple, rico en fuentes de carbono y/o protenas, capaz de permitir
el desarrollo de muchas bacterias hetertrofas y en corto tiempo, en menos de 3
das a 30C (Lorch et al., 1995; Madigan et al, 1998). Vase la seccin 2.1 del
ANEXO II.

2.2.2 Fase II: Conteo, aislamiento y purificacin de bacterias

hidrocarburoclastas por la tcnica de dilucin en placa
El mtodo para el aislamiento y cuenta de las bacterias hidrocarburoclastas del
suelo es por la tcnica de cuenta por dilucin en placa, utilizando un medio mineral
basal que contenga petrleo crudo o un hidrocarburo especifico de inters, como
nica fuente de carbono y energa. El petrleo crudo o hidrocarburo utilizado para
este mtodo debe ser ligero (voltil), ya que el acceso de esta fuente de carbono y
energa es a travs de los vapores que se generan de ella (Fernndez et al.,
2006). La cuenta microbiana provee evidencia de la presencia de grupos
determinados de microorganismos cuando se utiliza un medio de cultivo

37
especfico, y es usado como indicador del potencial de biodegradacin de un suelo
en particular (Bossert y Bartha, 1984).

Se sigui el procedimiento de dilucin en placa establecido en el Manual de

Tcnicas de Anlisis de Suelos Aplicadas a la Remediacin de Sitios
Contaminados (Fernndez et al. 2006), por duplicado. Utilizando un medio mineral
basal que contena petrleo crudo como nica fuente de carbono y energa. El
petrleo ligero que se impregna en un papel filtro permite que las bacterias
hidrocarburoclastas se alimenten de los hidrocarburos voltiles (Fernndez et al.,
2006). Vase la seccin 2.2 del ANEXO II.

2.2.3 Fase III: Pruebas para la identificacin de gnero de

bacterias hidrocarburoclastas.
Las pruebas que se realizaron para la identificacin del gnero correspondiente a
las cinco cepas obtenidas estn descritas por Schaad, et al (2001), mismas que
son indicadas en la Figura 5. Las metodologas se describen en la seccin 2.3 del
ANEXO II.

38
Figura 5. Diferenciacin de gneros comnmente aislados

39
 Tincin de Gram
Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse
en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas; en este caso, los trminos
positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias (Santambrosio, 2009).

Para establecer esta diferencia se aplica un disolvente del cristal violeta que no
tiene efecto sobre el grupo de microorganismos que lo retienen firmemente, pero
lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando completamente
decolorados. En este caso sera difcil poder observarlos por lo que son tratados
con otro colorante, como la safranina. Este color no modifica el color de los
microorganismos que haban retenido el cristal violeta, pero tie a los que se
haban decolorado. Siendo consideradas Gram positivas aquellas que retienen el
Cristal Violeta y como Gram negativas aquellas teidas por las Safranina. Vase
seccin A2.3.1.

Crecimiento anaerobio
Esta prueba se hace cuando las bacterias son Gram Negativas. Es una tcnica de
desarrollada por Hugh y Leifson para evidenciar la importancia del significado
taxonmico del metabolismo oxidativo-fermentativo (O.F.), de los hidratos de
carbono por las bacterias Gram negativas. Vase seccin A2.3.2.

Pigmento fluorescente en KB
Para el caso de una respuesta negativa al crecimiento anaerobio se hace la
prueba de fluorescencia en medio KB para identificar Pseudomonas, algunas
elaboran Fluorescena sin Piocianina, otras elaboran slo Piocianina y otras que
elaboran las dos. El Medio KB potencia la produccin de Fluorescena e inhibe la
de Piocianina. Ambos colorantes se difunden en el medio dando una coloracin
amarilla fluorescente (Fluorescena) y azul (Piocianina). Si se obtienen colores
intermedios ms o menos verdosos indica que se han producido ambos pigmentos
y que por lo tanto la Fluorescena o la Piocianina no han quedado completamente

40
inhibidas. Aqu la temperatura puede ser un factor determinante ya que la mayora
de cepas fluorescente no crecern a 35-37C, crecern a 25-30C (CULTIMED,
2012). Vase seccin A2.3.3.

Crecimiento de colonias amarillas en YDC

Se evala el crecimiento de colonias amarillas en YDC cuando se ha obtenido un
resultado positivo para el crecimiento anaerobio en bacterias Gram negativas y la
formacin de endoesporas en bacterias Gram positivas, as como cuando se
obtiene un resultado negativo a la fluorescencia en medio KB. Vase seccin
A2.3.4.

Prueba de ureasa
La urea es una diamida del cido carbnico y sta es fcilmente hidrolizada con la
liberacin de amonaco y dixido de carbono. La enzima ureasa que posee un
microorganismo puede hidrolizar a la urea que esta presente en el medio de
cultivo de acuerdo con la siguiente reaccin: El amonaco reaccionan en solucin
para formar carbonato de amonio, producindose una alcalinizacin y un aumento
del pH del medio, provocando el vire del medio. Esta prueba se realizo a las cinco
cepas de estudio como una manera de identificacin y no solo por seguir el
esquema propuesto por Schaad et al (2001). Vase seccin A2.3.5.

Crecimiento en agar D1M

El medio D1M es utilizado para diferenciar Agrobacterium de Acidovorax,
Burkholderia y Ralstonia. Un crecimiento positivo para este gnero ocurre cuando
en el agar D1M aparecen inicialmente colonias azul-verdoso y se tornan color
verde oscuro con el tiempo (Schaad et al, 2001; Bandara y Bandara, 1997). Vase
seccin A2.3.6.

Pruebas complementarias
De manera complementaria a las pruebas bioqumicas establecidas en el
diagrama de Schaad et al (2001), se hicieron las pruebas de CATALASA y

41
OXIDASA como apoyo para la identificacin de las cepas 1A(A), 2C(A), 2C(B),
5D(A) y 5D(B). Vase seccin A2.3.7.
Catalasa
Pone de manifiesto la presencia de la enzima catalasa en una bacteria. Esta
enzima es capaz de descomponer el perxido de hidrogeno (agua oxigenada en
agua y oxgeno, con la consiguiente aparicin de burbujas. La mayora de las
bacterias Gram negativas son catalasa positiva.
Oxidasa
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccin
de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la
oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que produce
agua o perxido de hidrogeno segn la especie bacteriana. Por lo general, el
sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos
anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo, pero los
anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa.

42
CAPTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIN
3.1 Anlisis fsicos y qumicos

3.1.1 Textura
El mtodo de Bouyoucos consiste en la determinacin de los porcentajes de
arena, limo y arcilla presentes en la fraccin mineral del suelo. Estos porcentajes
se obtienen mediante la separacin de las partculas en grados clasificados de
acuerdo su dimetro. En la suspensin de suelo colocada en una probeta de
sedimentacin, la densidad a una profundidad determinada va disminuyendo a
medida que se sedimentan las partculas. Como stas sedimentan a velocidades
proporcionales a su tamao, seleccionando los tiempos, una lectura de la
densidad puede servir de medida del contenido limo ms arcilla o de arcilla
(Chicaiza, 2001).

Despus de hacer las lecturas del hidrmetro y sus correcciones de acuerdo a la

Tabla 21, as como los clculos de porcentajes indicados en el punto 2.2.1, se
obtuvieron los resultados mostrados en la Tabla 7 con los cuales se pudo ver en el
tringulo de texturas (Figura 21) que la muestra de suelo corresponde ser de tipo
franco limoso.
Tabla 7. Resultados del clculo de porcentajes de arena, arcilla y limo
Muestra de Grupo
% Arena % Arcilla % Limo
Suelo Textural
Franco
S2Cc 29.12 10.52 60.36
Limoso

El suelo franco limoso es un suelo que posee una cantidad moderada de

partculas finas de arena, slo una cantidad reducida de arcilla y ms de la mitad
de las partculas pertenecen al tamao denominado limo. Al estado seco tienen
apariencia aterronada, pero los terrones pueden destruirse fcilmente. Al moler el
material se siente cierta suavidad y a la vista se aprecia polvoriento. Ya sea seco o
hmedo los moldes formados persistirn al manipularlos libremente, pero al

44
apretarlo entre el pulgar y el resto de los dedos no formarn una cinta continua
(SIAR Limari, 2006).

3.1.2 Humedad
Aunque es recomendable determinar la humedad a la capacidad de campo de los
suelos, es decir, la cantidad de humedad que un suelo retiene contra gravedad,
cuando se deja drenar libremente; en algunas ocasiones, cuando se trata de
suelos contaminados, por ejemplo con hidrocarburos del petrleo, es difcil llevar a
cabo esta medicin por la dificultad de rehidratar suelos secos con estas
caractersticas. Por lo que la medicin de humedad se realiza solo en funcin del
porcentaje de agua que retiene este tipo de suelos. La humedad del suelo se
calcula utilizando un mtodo gravimtrico, por la diferencia de peso entre una
misma muestra hmeda, y despus de haberse secado en la estufa hasta obtener
un peso constante. (Fernndez et al., 2006).

A continuacin se muestran los porcentajes obtenidos despus de hacer los

clculos correspondientes (Tabla 8).
Tabla 8. Porcentajes de humedad
MUESTRA % de Humedad

S2Cc 1 9.7085

S2Cc - 2 9.4326

Teniendo como promedio un 9.57 % de humedad. Es conveniente mantener una

humedad del orden del 20-75 % de la capacidad de campo, la cual se define como
la masa de agua que admite el suelo hasta la saturacin (Gmez et al, 2008). Por
lo anterior, la humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradacin
(Torres y Zuluaga, 2009)

45
 3.1.3 pH
El mtodo potenciomtrico o electroqumico para medir pH de un suelo es el ms
utilizado. Debido a que el pH del suelo es medido en una matriz acuosa como
agua o una solucin de sales diluidas, es dependiente del grado de dilucin
(relacin suelo-dilucin). En suelos contaminados con hidrocarburos la
interferencia va a depender de la concentracin y tipo de hidrocarburo, se puede
producir desde una simple iridiscencia sin afectar la determinacin, hasta un
impedimento de la determinacin por la alta concentracin y viscosidad del
contaminante (Fernndez et al., 2006).
Tabla 9. Medicin de pH
MUESTRA pH Temperatura (C)

S2Cc 7.2 27C

El resultado de esta determinacin se muestra en la Tabla 9. Comparando el

resultado obtenido y comparndolo con lo establecido en la Tabla 10 se puede
decir que la muestra de suelo tiene un pH neutro, que de acuerdo a Dias (2011),
es el pH ptimo para el crecimiento de las bacterias hetertrofas. Debido a que la
variacin del pH del suelo afecta a la actividad microbiana y tambin a la
solubilizacin y adsorcin/absorcin de los contaminantes.

Tabla 10. Clasificacin del suelo en cuanto a su valor de pH

CATEGORA Valor de pH
Fuertemente cido < 5.0
Moderadamente cido 5.1 6.5
Neutro 6.6 7-3
Medianamente alcalino 7.4 8.5
Fuertemente alcalino >8.5
Fuente: NOM-021-SEMARNAT-2000

46
 3.1.4 Materia orgnica y nitrgeno orgnico
La materia orgnica del suelo es la fraccin orgnica que incluye residuos
vegetales y animales en diferentes estados de descomposicin; tejidos y clulas
de organismos que viven en el suelo; y sustancias producidas y vertidas por esos
organismos. Esta definicin es muy amplia pues incluye tanto a los materiales
poco alterados como a aquellos que s han experimentado cambios de
descomposicin, transformacin y resntesis dentro del suelo. Adems se pueden
incluir compuestos orgnicos txicos, provenientes de las actividades industriales
del hombre, como la contaminacin de suelos por hidrocarburos del petrleo, que
tambin constituye parte de la materia orgnica del suelo (Fernndez et al., 2006)
En la Tabla 11 se muestran los porcentajes de carbono orgnico, materia orgnica
y nitrgeno orgnico. El nitrgeno orgnico es un valor obtenido matemticamente
por la relacin entre el porcentaje de materia orgnica y el porcentaje de nitrgeno
(5 %) contenido en ella.
Tabla 11. Porcentajes de carbono, materia y nitrgeno orgnicos.
% Carbono % Materia % Nitrgeno
MUESTRA
Orgnico Orgnica Orgnico
S2Cc 15.6 26.89 1.34

Al comparar el porcentaje de materia orgnica (26.89 %) con los valores de la

Tabla 12, podemos observar que la muestra de suelo se clasifica con un valor
Muy Alto.
Tabla 12. Interpretacin de resultados de materia orgnica
Materia Orgnica (%)
Clase
Suelos volcnicos Suelos no volcnicos
Muy bajo <4.0 <0.5
Bajo 4.1 6.0 0.6 1.5
Medio 6.1 10.9 1.6 3.5
Alto 11.0 16.0 3.6 6.0
Muy alto >16.1 >6.0
Fuente: NOM-021-SEMARNAT-2000

47
 3.1.5 Nitratos
El nitrgeno, en forma de nitrato, es fcilmente soluble en agua y es utilizado con
rapidez por la mayora de los cultivos. Tambin el nitrato es lixiviado del suelo por
las lluvias debido a su alta solubilidad y a que no es retenido en el suelo en grado
apreciable. Aunque la forma amoniacal del nitrgeno es soluble en agua, no es
lixiviado con tanta facilidad como el nitrato, debido a que grandes cantidades de
amonaco. Si el amoniaco no es absorbido por las races o los microorganismos o
fijado en arcilla, por lo general, es oxidado a nitrato. En la Tabla 13 se pueden ver
los resultados obtenidos.
Tabla 13. Cantidad de nitratos en ppm
MUESTRA ppm de Nitratos

S2Cc 1 2.73

S2Cc - 2 3.68

La cantidad de NO3 presente es baja para el adecuado desarrollo de la fauna

microbiana del suelo, por lo que para una biorremediacion se debera contemplar
una bioestimulacin del contenido de nitrgeno, fsforo, carbono y humedad para
una relacin de Carbono: Nitrgeno: Fsforo (C: N: P) adecuada, que garantice el
desarrollo adecuado de los microorganismos.

3.1.6 Fsforo
El fsforo (P) en forma de fosfatos es un indicador de la fertilidad de suelo, de esta
manera, interviene en la formacin de compuestos energticos dentro de las
clulas y es requerido para la sntesis de cidos nuclecos y fosfolpidos en los
procesos de reproduccin y degradacin en el suelo.

Los resultados obtenidos en esta determinacin pueden verse en la Tabla 14,

teniendo como promedio 9.28 ppm de fosforo en forma de fosfatos.

48
 Tabla 14. Contenido de fosforo en forma de fosfatos
Muestra ppm de Fosforo (P)
S2Cc A 9.28
S2Cc B 9.28

Se puede interpretar este resultado de acuerdo a la Tabla 15, donde se puede

observar que la muestra de suelo contaminada tiene un contenido medio de
fosforo.
Tabla 15. Interpretacin de resultados Fsforo - Olsen
Clase mg k-1 (ppm) de P
Bajo <5.5
Medio 5.5 - 11
Alto >11
Fuente: NOM-021-SEMARNAT-2000

3.1.7 Cuantificacin de hidrocarburos totales del petrleo.

(HTPs)
Los resultados obtenidos de la extraccin de HTPs de la muestra de suelo se
muestran en la Tabla 16, teniendo un promedio de 62,589.83 mg Kg-1 de HTPs.
Tabla 16. Total de Hidrocarburos Totales de petrleo (mg Kg-1)
Muestra Mg Kg-1 de HTPs
S2Cc - A 65 741.41
S2Cc - B 57 724.20
S2Cc - C 64 303.88

De acuerdo a la NOM-138-SEMARNAT/SSA1-2012 los lmites mximos

permisibles son los que se muestran en la Tabla 3, y comparando ambas tablas
podemos ver que para la fraccin pesada de hidrocarburos en un suelo industrial
se supera el lmite hasta 10 veces.

3.2 Anlisis microbiolgicos

3.2.1 Fase I: Conteo de bacterias totales del suelo contaminado
Como resultado de este procedimiento se obtuvieron los crecimientos que se
pueden ver en la Figura 7.

49
 -2
Dilucin 10

-3
Dilucin 10

-4
Dilucin 10

Figura 6. FASE I. Bacterias totales por dilucin en placa incubadas por 24 horas a
350.2C

50
 -5
Dilucin 10

-6
Dilucin 10

Figura 7. FASE I. Bacterias totales por dilucin en placa incubadas por 24 horas a
350.2C

Para realizar el conteo se seleccion una caja de la dilucin 10-3 para la tcnica de
sectores y una de la dilucin 10 4 para la tcnica de punteo (Figura 8), dando
los resultados mostrados en la Tabla 17.

51
 Figura 8. Conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFCs)

Tabla 17. Resultado de clculos de UFCs totales

Dilucin Mtodo Total de UFCs
empleado
-3 Sectores 4, 181, 666
-4 Punteo 6, 645, 000

3.2.2 Fase II: Bacterias hidrocarburoclastas

Despus de 24 horas de incubacin a 35C, se pudieron ver pequeos
crecimientos en las cajas con atmsfera de petrleo, como se muestra en la
Figura 10.

52
 CONTROL
Con Atmosfera de petrleo

-2
Dilucin 10

-3
Dilucin 10

Figura 9. FASE II. Bacterias hidrocarburoclastas por dilucin en placa incubadas

por 24 horas a 350.2C

53
 -4
Dilucin 10

-5
Dilucin 10

-6
Dilucin 10

Figura 10. FASE II. Bacterias hidrocarburoclastas por dilucin en placa incubadas
por 24 horas a 350.2C

54
Conteo:
Para el conteo de UFCs se tom una caja de las mismas diluciones que en el
conteo para bacterias totales (10-3 y 10-4), y los resultados se pueden ver en la
Tabla 18.
Tabla 18. Resultado de clculos de UFCs hidrocarburoclastas.
Mtodo
Dilucin Total de UFCs
empleado
10-3 Punteo 1460
10-4 Punteo 1955

Aislamiento y Purificacin:
Se hiceron 6 resiembras con estriado por dilucin, considerando que en la sexta
resiembra ya se tenan bacterias puras en las cajas Petri. Finalmente se obtuvo un
total de 24 cajas con siembra visiblemente pura. Para las pruebas de identificacin
se hizo una resiembra 7 de la cual se toman las muestras de bacterias
consideradas morfologicamente puras.

En la Figura 11 se muestran las vistas macro y microscopicas de algunas cepas

purificadas de la Resiembra 6.

55
Figura 11. Vistas macro y microscpicas de algunas cepas de la resiembra 6

56
Se tomaron cinco cajas que se consideraron con diferentes entre s, siendo
seleccionadas las cepas 1A(A), 2C(A), 2C(B), 5D(A) y 5D(B), de las cuales se
tomaron asadas para las pruebas bioqumicas (Figura 12).

Figura 12. Cepas de la resiembra 7 seleccionadas para pruebas de identificacin

En cuanto a la morfologa, y con ayuda de la Figura 4 las caractersticas

macroscpicas de las colonias aisladas son:
Cepa 2C(B):
Forma circular, elevada de aspecto liso y margen entero, color blanco cremoso
brilloso y textura cremosa
Cepas 1A(A), 2C(A), 5D(B) y 5D(A):
De forma circular, elevadas de aspecto liso y margen ondulado, color amarillo
plido translucido y de textura ligeramente viscosa

57
 3.2.3 Fase III: Identificacin de gnero.
Tincin de Gram
Despus de realizar los frotis y el procedimiento de coloracin en cada uno, se
pudo observar que las 5 cepas son GRAM NEGATIVAS, en formas de bacilos.
(Figura 13)

Figura 13. Preparaciones de las tinciones de Gram

Crecimiento anaerobio (Hugh y Leifson)

Se prepararon dos tubos por cada cepa con 10 mL de medio basal O.F., a los que
se les agreg 1mL de solucin de glucosa al 10% y fueron incubaron por 24 horas
a 25C.

El uso del hidrato de carbono, ya sea por fermentacin u oxidacin, produce

acidez en el medio, con el consecuente viraje del color verde al amarillo.
Microorganismos oxidativos del hidrato de carbono: producen una reaccin
cida solo en el tubo abierto. Presentan poco o nulo desarrollo y ausencia
de produccin de cido en el tubo cerrado.

58
 Microorganismos fermentadores del hidrato de carbono: producen una
reaccin cida en ambos tipos de tubos.
Microorganismos que no utilizan el hidrato de carbono: no producen cambio
ninguno de los dos tubos, los cuales permanecen verdes.

Figura 14. Resultados crecimiento anaerobio (Hugh y Leifson)

En la Figura 14 se puede ver que la cepa 2C(B) es la nica positiva (fermentativa),

y las otras cuatro cepas [1A(A); 2C(A); 5D(A); 5D(B)] son oxidativas del
carbohidrato (negativas a la prueba).

Fluorescencia en medio KB
Considerando que en el cultivo de crecimiento anaerobio se haba obtenido como
positiva la cepa 2C(B) no fue tomada en cuenta para esta prueba, ya que se est
siguiendo el esquema de la Figura 5. Se estriaron por dilucin dos cajas Petri

59
para cada cepa, despus de 24 horas de incubacin a 270.2C se hizo una
revisin de las cajas para verificar el crecimiento de las colonias y la ausencia de
contaminacin, a las 48 horas se hizo la visualizacin en la lmpara de luz UV, a
longitud de onda larga, comparndolas con una siembra positiva y una negativa,
previamente identificadas como tal, adems de un blanco, que consiste en una
caja Petri con medio estril (Figura 15).

Figura 15. Revisin en luz UV (366nm) de cultivos en medio KB

Como se puede ver en la Figura 15 las cepas 2C(A) y 5D(A) dan una fluorescencia
mayor que las otras dos, por lo que se les considera positivas y a las cepas 1A(A)
y 5D(B) negativas a fluorescencia en medio KB.

60
 Crecimiento de colonias amarillas en agar YDC
El medio YDC no es semi-selectivo pero ayuda a diferenciar por el color de las
colonias que crecen en l. Siguiendo lo propuesto por Schaad, et al (2001), al
obtener resultados negativos para la fluorescencia en medio KB [1A(A); 5D(B)], y
al tener un resultado positivo en crecimiento anaerobio [2C(B)] se procedi a
sembrar mediante estriado por dilucin.

Figura 16. Resultados del crecimiento en medio YDC

Teniendo un control a las 24 horas para ver que hubiera crecimiento y ausencia de
contaminacin, se incubaron a 35C durante 48 horas. En la Figura 16 se pueden
ver que en la cepa 1A(A) hay crecimiento de color amarillo, y en los cultivos 2C(B)
y 5D(B) se puede ver crecimiento de otros colores. Para la cepa 2C(B) de color
blanco-cremoso y para la 5D(B) de una tonalidad caf claro-beige. Concluyendo
para esta prueba que los cultivos 2C(B) y 5D(B) es un resultado negativo y que
para la cepa 1A(A) es un resultado positivo ya que hay un crecimiento de color
amarillo y textura butirosa.

61
 Prueba de ureasa
Despus de 24 horas de incubacin no hubo ningn cambio en la coloracin del
medio en comparacin con el blanco (medio caldo urea sin inocular, ubicado en
medio de los dos tubos inoculados por cepa), as que todas dieron resultado
negativo. En la Figura 17 se muestra un control positivo para verificar que en
ninguno de los tubos inoculados hubo un cambio de coloracin.

Figura 17. Resultados prueba de ureasa

Crecimiento en agar D1M

Esta prueba solo se realiz a la cepa 5D(B) ya que an no haba sido clasificada
en un gnero como las otras cuatro. Con una revisin a las 24 horas para verificar
la ausencia de contaminacin y despus de 48horas a 270.2C se pudo observar
que hay un crecimiento de colonias con tonalidad azul verdosa semitransparente,
como se puede ver en la Figura 18, dando positivo al crecimiento de
Agrobacterium spp en agar D1M.

62
 Figura 18. Resultado crecimiento en agar D1M

Pruebas complementarias
Catalasa
Para poder observar la efervescencia fue necesario hacer la prueba en el
microscopio estereoscpico.

Figura 19. Resultados prueba de catalasa

Al observar la Figura 19 se puede ver que las cinco cepas analizadas dan como
resultado positivo a esta prueba.

63
 Oxidasa
En condiciones de esterilidad se tom una pequea porcin de masa de bacterias
para despus ponerla en el papel filtro ya hmedo por la solucin de N,N dimetil-
para-fenilen-diamina, recin preparada.

Figura 20. Resultados prueba de oxidasa

En cuestin de segundos se pudo observar el cambio de la coloracin a un rojo-

magenta en las cepas 1A(A), 5D(B), 2C(A), 5D(B), como se puede ver en la Figura
20. Aunque la cepa 1A(A) di positivo a la prueba, fue un positivo tardo y la
coloracin no fue tan intensa como las otras 3 positivas.

64
 Resultados de las pruebas bioqumicas
En la Tabla 19 se puede observar un resumen de los resultados obtenidos en las
pruebas bioqumicas que permitieron encontrar la familia bacteriana de las cepas:
Tabla 19. Resultados pruebas bioqumicas
PRUEBAS BIOQUMICAS
CEPA Hugh y
Gram Forma Ureasa Catalasa Oxidasa KB YDC D1M
Leifson
1A(A) - B - - + + - + N.A
retardado
2C(A) - B - - + + + N.A N.A
2C(B) - B + - + - - - N.A
5D(A) - B - - + + + N.A N.A
5D(B) - B - - + + - + +
Gram: tincin de Gram; Hugh y Leifson: Crecimiento anaerobio; KB: Crecimiento fluorescente;
YDC: Colonias amarillas; D1M: Crecimiento en agar D1M; B: Bacilos; N.A: No Aplicada

De acuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas bioqumicas y

comparndolos con la clasificacin presentada en la Tabla 6 se concluye lo
siguiente (Tabla 20):
Tabla 20. Resultado de identificacin de generos de bacterias hidrocarburoclastas
CEPA GNERO FAMILIA
2C(B) Erwinia spp. Enterobactereacea
1A(A) Xanthomona spp.
5D(A) Pseudomonas spp
Pseudomonadaceae
2C(A) Pseudomonas spp
5D(B) Agrobacterium spp.

La cepa 2C(B) pertenece a la familia Enterobactereacea, gnero Erwinia.

Los miembros del gnero Erwinia son varillas rectas de 0.5 a 1.0 x 1.0 a 3.0
micras, se les encuentra como clulas simples, en pares u ocasionalmente en
cadenas cortas; son Gram negativo, mviles (con flagelacin pertrica) y
anaerobias facultativas. La temperatura para el crecimiento ptimo es de 27-30C,
y el mximo est entre 32 a arriba de 40C. Son fermentativas, oxidasa negativo y
catalasa positivo; producen cido de glucosa. Sus colonias son de color crema,
amarillas o crema blanquecinas (Fierro y Mena, 2009).

65
 Las cepas 1A(A), 2C(A), 5D(A) y 5D(B) pertenecen a la familia
Pseudomonadaceae, donde hay tres gneros: Pseudomonas,
Xanthomonas y Agrobacterium.
Las cepas 2C(A) y 5D(A) pertenecen al gnero Pseudomonas:
Las clulas del gnero son varillas rectas o curvas que miden 0.5 a 1.0 x 1.5 a 4.0
micras. Son Gram negativas y aerobias, catalasa y oxidasa positivas, y presentan
uno o ms flagelos polares. En agar simple forman colonias brillantes,
confluentes, de borde continuo y a veces ondulado con un centro opaco. El
pigmento (piocianina) se difunde en el medio dndole una tonalidad azul verdosa
(Krieg, 1984).
La cepa 1A(A) pertenece al gnero Xanthomonas:
Son bacilos, usualmente de entre 0.4-0.6 x 0.8-2.0 m, predominantemente
individuales pocas veces en pares, ocasionalmente en cadenas cortas y
raramente en filamentos. Circulares, enteras y butirosas cuando son jvenes, pero
muchas pueden mostrar superficies estriadas legando a ser lobuladas cuando
envejecen; inicialmente las colonias son transparentes a amarillo plido; Gram
negativo, mviles por un flagelo polar, aerbicas estrictas, catalasa positivas y
oxidasa negativas o positivas tardas. Las colonias son usualmente amarillas,
hmedas y butirosas, mucoides o viscosas. (Schaad et al, 2001; Hernandez y
Trujillo, 2000; Sosa et al, 1997).
La cepa 5D(B) pertenece al gnero Agrobacterium:
Los miembros de este grupo son aerobias obligadas, Gram negativo, tienen forma
de varilla y miden de 0.6 a 1.0 x 1.5 a 3.0 micras y son mtiles con 1 a 6 flagelos
pertricos (cuando tienen uno solo ste es ms lateral que polar). Las colonias son
blancas, lisas y mucosas. En medios que contienen carbohidratos, producen gran
cantidad de polisacridos extracelulares mucilaginosos (Fierro y Mena, 2009).

Los resultados obtenidos sugieren que las bacterias de los gneros Erwinia,
Pseudomonas, Xanthomonas y Agrobacterium seran excelentes candidatas para
el saneamiento de suelos contaminados con hidrocarburos, ya que inicialmente su
nica fuente de carbono fueron los compuestos voltiles del petrleo crudo.

66
4. CONCLUSIONES.
El suelo utilizado tena hasta 10 veces ms HTPs (62 589.83 mg Kg-1) que
el lmite permisible por la normatividad mexicana y los microorganismos
encontrados puede ser que tengan la capacidad metablica para tolerar esa
concentracin y adems de que pueden consumirlos.

El contenido de materia orgnica del suelo es considerada muy alta, tiene

un pH que permite el crecimiento de los microorganismos y su textura es
franco limoso reducida en arcilla lo que facilita el crecimiento de
microorganismos.

Las metodologas utilizadas para el aislamiento e identificacin permitieron

obtener cuatro gneros diferentes dentro de 5 cultivos bacterianos
morfolgicamente diferentes aislados a partir del suelo contaminado por
hidrocarburos en estudio, siendo Erwinia spp, Xanthomonas spp,
Agrobacterium spp y dos cepas de Pseudomonas spp.

La caracterizacin fsica y qumica del suelo permiti observar bajo qu

condiciones se encontraban las bacterias que fueron aisladas, y dan un
panorama de cmo mejorar estas condiciones, para que el consorcio
bacteriano se desarrolle de mejor manera.

La construccin de un consorcio de bacterias que pueda restaurar el

equilibrio de un sitio contaminado con hidrocarburos implica la adaptacin
de las cepas a las diferentes condiciones ambientales presentes y sobre
todo, a la accesibilidad a la fuente de carbono y de energa. Con el fin de
evitar la utilizacin de agentes sintticos, se recomienda utilizar cepas que
produzcan bioemulsificantes que faciliten el acceso al hidrocarburo y as su
degradacin, lo que abre paso a posteriores estudios para ver si pueden
producirlos.

67
 Comparando los resultados en este trabajo con el de Prez (2012), que es
un trabajo donde tambin se aslan bacterias hidrocarburoclastas de suelo
contaminado por hidrocarburos, se puede apreciar que a pesar de ser
muestras de suelos de la misma regin tienen caractersticas fisicoqumicas
diferentes y aun as se reportan dos gneros iguales en ambas
investigaciones, Agrobacterium spp y Xanthomonas spp. Por lo tanto se
puede concluir que existe la posibilidad de que las bacterias nativas del
suelo contaminado puedan degradar los hidrocarburos presentes en el
suelo.

5. RECOMENDACIONES.
Realizar tcnicas de purificacin empleando las diluciones seriadas de las
colonias morfolgicamente unnimes, para garantizar mejor la pureza de
stas.

Hacer la identificacin por medio de pruebas Biolog, pruebas API 20NE o

hacer la identificacin por herramientas de biologa molecular para tener
una mejor identificacin taxonmica de las cepas aisladas. Aunque ya se
tienen un avance general de su perfil bioqumico.

Evaluar en posteriores estudios si las bacterias identificadas pueden

degradar individualmente hidrocarburos puros en sistemas controlados
como fermentadores (reactores) o matraces Erlenmeyer agitados

Se propone usar tcnicas de bioaumentacion1 y bioestimulacion2 para

crear las condiciones ptimas para el crecimiento de las cepas bacterianas
deseadas y lograr la biodegradacin del contaminante.

1
Adicionar bacterias altamente especializadas para incrementar y mejorar la capacidad de
biodegradacin total de la poblacin bacteriana natural.
2
Circulacin de soluciones acuosas (que contengan nutrientes y/u oxgeno) a travs del suelo
contaminado, para estimular la actividad de los microorganismos autctonos, y mejorar as la
biodegradacin de contaminantes orgnicos.

68
 REFERENCIAS
ALEXANDER, M. (1991). Introduccin a la microbiologa del suelo. Mxico, DF.:
AGT.
API. (2011). American Petroleum Institute. Obtenido de www.api.org
ARCE, T., RODRIGUEZ, V., & ROJAS, A. (2004). Identification of recalcitrant
hydrocarbons present in a drillin waste-polluted soil. Journal environ Sci & Health
Part A , 39 (6), 1535-1545.
ASTM. (1985). Classification of Soils for Engineering Purposes: Annual Book of
ASTM Standards. Estados Unidos: American Society for Testing and Materials.
ATSDR. (1999). Resumen de Salud Pblica. Hidrocarburos Totales de Petrleo.
Agencia para Sustancias Toxicas y el Riesgo de Enfermedades, Division de
Toxicologia y Medicina Medio Ambiental, E.E.U.U.
BAILN, L., GONZLEZ, M. R., & CERVANTES, S. (2003). Atlas de Pruebas
Bioqumicas para Identificar Bacterias. UNAM.
BANDARA, J., & BANDARA, J. (1997). Agrobacterium tumuors in Kapok (Ceiba
Pentandra L.) in Sri Lanka. J.Natn. Sci. Coun. , 25 (2), 105-112.
BOSSERT, I., & BARTHA, R. (1984). The fate of petroleum in soil ecosystems. En
Petroleum microbiology. New York: R. M. Atlas.
BOSSERT, I., & BARTHA, R. (1984). The fate of pretroleum in soil ecosystems. En
P. microbiology (Ed.), R.M. Atlas (pgs. 434-476). New York: Macmillan Publishing
Co.
CEISA. (2014). Comunicaciones y Electrnica Industrial SA de CV. Obtenido de
http://ceisaambiental.com/
CHICAIZA, H. N. (2001). Correlacin y calibracin de mtodos de anlisis qumico
y determinacin del nivel crtico de calcio en suelos ecuatorianos. Tesis de
Licenciatura . Quito, Ecuador: Universidad Central de Ecuador.
COFEPRIS. (2002). Primer Diagnstico Nacional de Salud Ambiental. Mxico:
Direccion General de Salud Ambiental.
COMISIN NACIONAL DE HIDROCARBUROS. (2011). Documento Tcnico 2. La
Tecnologa de Exploracin y Produccin en Mxico y en el Mundo. Situacin
Actual y Retos. Secretaria de Energia (SENER), Comision Nacional de
Hidrocarburos, Mxico.
CONTRERAS, V. A. (2014). Aislamiento y adaptacin de microorganismos
fungicos con actividad hidrocarburoclasta. Tesis de Licenciatura, Universidad
Veracruzana, Facultad de Ciencias Quimicas, Xalapa.

69
CORNELIS, P. (2008). Pseudomonas: Genomics and Molecular Biology. Caister
Academic Press.
CULTIMED. (2012). Manual Bsico de Microbiologa. Instrumentacion Cientifico
Tcnica, I.C.T, S.L.
DAS, N., & CHANDRAN, P. (2011). Microbial Degradation of Petroleum
Hydrocarbon Contaminants: An Overview. Biotechnology Research International .
DIAS, L. (2011). Biorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburos en
clima fro y templado. Tesis Doctoral, Universidad Nacional de la Plata,
Departamento de Ciencias Biolgicas.
DOF. (2014). Diario Oficial de la Federacion. From www.dof.gob.mx
DUARTE, R. B. (2012). Estudio y descripcin de las bacterias y hongos comunes
de estudio en el laboratorio y muestras de origen ambiental. Universidad de
Cauca, Departamento de Biologia FACENED, Colombia.
EPA. (1983). Hazardous Waste Land Treatment. Municipal Environmental
Research Laboratory. Office of Research and Development, Cincinnati, Ohio.
EWEIS, J., ERGAS, S., CHANG, D., & SCHROEDER, E. (1999). Principios de la
biorrecuperacin. Mc Graw Hill.
FERNNDEZ, L., ROJAS, T., ROLDN, M., RAMREZ, H., ZEGARRA, R.,
HERNNDEZ, R., y otros. (2006). Manual de tcnicas de anlisis de suelos
aplicadas a la remediacin de sitios contaminados. Mxico: Instituto Mexicano del
Petrleo; Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales; Instituto Nacional
de Ecologa.
FERNANDEZ, O. A., GARCIA, D. L., SAZ, N. J., & VALDEZATE, R. S. (2010).
Procedimientos de Microbiologa Clnica. Mtodos de identificacin bacteriana en
el laboratorio de microbiologa . SEIMC.
FIERRO, D., & MENA, J. (2009). Parasitologia 7mo. Semestre. En Notas del curso
de: Bacteriologa y Virologa. Sinaloa: Universidad Autonoma de Sinaloa.
FORSYTHE, W. (1975). Fisica de Suelos. Manual de Laboratorio. San Jos, Costa
Rica: IICA.
GMEZ, S., GUTIRREZ, D., HERNNDEZ, A., HERNNDEZ, C., LOSADA, M.,
& MANTILLA, P. (2008). Factores Biticos y Abiticos que Condicionan la
Biorremediacin por Pseudomonas en Suelos Contaminados por Hidrocarburos.
Tesis de Grado, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca., Bacteriologa y
Laboratorio Clnico, Bogota.
HEAD, M., & SWANNELL, R. (1999). Biorremediation of petroleum hydrocarbon
contaminants in marine habitats. Current Opinion in biotechnology , 10, 234-239.

70
HERNANDEZ, Y., & TRUJILLO, G. (2000). Xanthomonas campestris pv. zinniae,
infectando plantas de cuarentona (Zinnia elegans Jacq.) en Venezuela. Rev. Fac.
Agron. (17), 156-163.
IMP. (2011). Instituto Mexico del Petroleo. Obtenido de
http://www.imp.mx/petroleo/
INE. (2007). Instituto Nacional de Ecologa . Obtenido de
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/gacetas/214/cca3.html
JURY, W. (1989). Chemical Movement through Soil. Vadose Zone Modeling of
Organic Pollutants. . Estados Unidos: Lewis Publishers Inc.
KERRY, E. (1990). Microorganism colonizing plants and soil subjected to different
degrees of human activity, including petroleum contamination in the Vestfold Hills
and MacRobertson Land Antarctica. Polar Biol (10), 423-430.
KOSTKA, J., PRAKASH, O., OVERHOLT, W., GREEN, S., FREYER, G., &
CANIOIN, A. (2011). Hydrocarbon-Degrading Bacteria and the Bacterial
Community Response in Gulf of Mexico Beach Sands Impacted by the Deepwater
Horizon Oil Spill. Appl. Environ. Microbiol. , 77 (22), 7962-7974.
KRIEG, N. (1984). Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. . Baltimore:
Williams & Wilkins.
LORCH, H. J., BENCKIESSER, G. G., & OTTOW, J. (1995). Basic methods for
counting microorganisms in soil and water. In Methods in applied soil microbiology
and biochemistry. (pp. 146-161). Academia Press.
MACFADDIN, J. F. (2003). Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias
de importancia clnica. Espaa: Mdica Panamericana.
MACKAY, M. D., CHERRY, J., & ROBERTS, P. (1985). Transport of Organic
Contaminants in Groundwater. Environmental Science & Technology , 19 (5), 384-
392.
MADIGAN, M., MARTINKO, J., & PARKER, J. (1998). Biologa de los
microorganismos. Espaa: Prentice may Iberia.
MCKEAN, S. J. (1993). Manual de anlisis de suelos y tejido vegetal. Centro
Internacional de Agricultura Tropical CIAT.
MILITON, C., BOUCHER, D., VACHELARD, C., PERCHET, G., BARRA, V.,
TROQUET, J., y otros. (2010). Bacterial community changes during bioremediation
of aliphatic hydrocarbon-contaminated soil. FEMS Microbiology Ecology , 74, 669
681.
NAVARRO, G. (2003). Qumica Agricola. Madrid, Espaa: Mundi-Prensa (MP).

71
NOM-021-SEMARMAT-2000. Que establece las especificaciones de fertilidad,
salinidad y clasificacin de suelos. Estudios, muestreo y anlisis.
NOM-138-SEMARNAT/SSA1-2012. Lmites mximos permisibles de hidrocarburos
en suelos y lineamientos para el muestreo en la caracterizacin y especificaciones
para la remediacin.
OMI. (2005). Manual sobre la contaminacin ocacionada por hidrocarburos
(Organizacion Maritima Internacional ed.). IMO publishing.
PEMEX. (2013). Desempeo ambiental. En Informe de Sustentabilidad 2013.
Mxico.
PEMEX. (2014). Petroleos de Mxico. Obtenido de www.pemex.com
PREZ, B. M. (2012). Seleccin de bacterias y hongos hidrocarburoclastas en
suelos contaminados en la localidad de Medias Aguas, Veracruz. Tesis de
Licenciatura. Coatzacoalcos, Veracruz, Mxico: Universidad Veracruzana.
PRIAS, C. (2011). Ahorro de energia en la industria del refino y petroqumica.
Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnologia, Unidad de
Planeacion Minero Energetica de Colombia, Colombia.
PRINCE, R. (2002). Bioremediation: an overview of how microbiological processes
can be applied to the cleanup of organic and inorganic enviromental pollutants. En
G. Bitton, Encyclopedia of enviromental microbiology (pgs. 693-712). New York:
John Wiley & Sons.
PRINCE, R. (2002). Petroleum and other hydrocarbons, Biodegradation of. En G.
Bitton, Encyclopedia of enviromental microbiology. New York: John Wiley & Sons.
PROFEPA. (1999). Restauracin de suelos contaminados. Grupo de trabajo sobre
la restauracion de suelos contaminados.
QUADRI, G. (1994). Industria y poltica ambiental. El Nacional .
SANTAMBROSIO, E. (2009). Tincin y observacin de microorganismos.
Argentina: Universidad Tecnologica Nacional.
SCHAAD, N., JONES, J., & CHUN, W. (2001). Laboratory Guide for identification
of PLANT PATHOGENIC BACTERIA (3ra. ed.). San Paul, Minn: Sociedad
Americana de Fitopatologa.
SCHWAB, A., SU, J., WETZEL, S., PEKAREK, S., & BANKS, M. (1999). Extraction
of petroleum hydrocarbons from soil by mechanical shaking. Environ Sci Technol ,
33 (11), 1940-1945.
SEMARNAT. (1996). Los Suelos de Tabasco Restauracin, Conservacin y Uso.
Gobiernos Constitucional de Tabasco.

72
SENER. (2012). Obtenido de
http://www.energia.gob.mx/portal/Default.aspx?id=983
SHAXSON, F., & BARBER, R. (2005). Optimizacin de la humedad del suelo para
la produccin vegetal. Boletin de suelos de la FAO (79).
SIAR Limari. (2006). Determinacin de la tectura del suelo en terreno. Chile.
SILOS, R. J. (2008). Manual de lucha contra la contaminacin por hidrocarburos.
Espaa: Servicio de Publicaciones Universidad de Cdiz.
SOLIS, L., & LOPEZ, J. (2003). Principios bsicos de contaminacin ambiental.
UAEM.
SOSA, M. C., PERDOMO, R., BRATHWAITE, C., & SALAZAR, C. (1997). Manual
de tecnicas para el diagnostico de enfermedades de las plantas. Mxico: Instituto
Interamericano de Cooperacion para la Agricultura.
TORRES, D. K., & ZULUAGA, M. T. (2009). Biorremediacin de suelos
contaminados por hidrocarburos. Tesis de Licenciatura, Universidad Nacional de
Colombia, Facultad de Minas. Ingenieria Quimica, Medellin.
US EPA 3500B. (1996). Organic extraction and sample preparation. SW 846 Test
methods for evaluating solid waste, physical/chemical methods.
US EPA 3540C. (1996). Soxhlet extraction organics. SW 846 Test methods for
evaluating solid waste, physical/chemical methods.
VAN DEUREN, J., WANG, Z., & LEDBETTER, J. (1997). Remediation
technologies screening matrix and reference guide. Obtenido de EPA:
http://www.epa.gov/tio/remed.htm
VASUDEVAN, N., & RAJARAM, P. (2001). Bioremediation of soil sludge-
contaminated. Enviroment International , 26, 409-411.
VELA, M. R. (2007). Daos ambientales en Veracuz provocados por PEMEX.
Mxico: COLVER.
VIAS, C. (2005). Biorremediacin de suelos contaminados por hidrocarburos:
caracterizacin microbiolgica, qumica y ecotoxicolgica. Tesis Doctoral,
Universidad de Barcelona, Barcelona.

73
ANEXOS
 ANEXO I. METODOLOGA ANLISIS FSICOS Y QUMICOS DEL
SUELO

A1.1 Determinacin de textura (Mtodo de Bouyoucus)

Para la preparacin de la muestra se pesaron 60 g de suelo tamizado (Tamiz No. 2) y se
agregaron aproximadamente 40 mL de perxido de hidrgeno para la digestin de la
materia orgnica, se homogeneiz y puso a evaporar hasta sequedad. Este paso se
repiti hasta que ya no hubo efervescencia en el suelo al humedecerse con el agua
oxigenada.

Una vez que la muestra estaba seca, se pas a la estufa de 100C y se dej secar
durante varios das. Despus se sac de la estufa para que se enfriara a temperatura
ambiente y se continu con la determinacin. De la muestra ya digerida y seca se pesaron
50 g de suelo, saturndola con agua destilada y 10 mL de solucin de calgn al 10% y se
homogeneiz, dejndola reposar por 15 minutos, la suspensin fue mezclada en una
batidora y despus se vaci en una probeta de 1000 mL. Finalmente, la suspensin fue
bien mezclada mediante la agitacin de la probeta tapada con un trozo de papel adhesivo,
despus se introdujo el hidrmetro dentro de la probeta, y 40 segundos despus se tom
una lectura del hidrmetro y la temperatura; se dej en reposo la suspensin por dos
horas y se tom una segunda lectura del hidrmetro y de la temperatura.

Clculos:
% de arena
Para calcular la cantidad de arena presente en 1 litro de la suspensin, restar este
valor del peso original de la muestra. Por ejemplo, si la lectura del hidrmetro
despus de los 40 segundos a temperatura corregida es de 18.0 g L-1, entonces
limo + arcilla pesan 18.0 en 1 litro de suspensin de suelo. Entonces la arena pesa
50.0-18.0 = 32 g en 1 litro de suspensin (50.0 g es el peso original de la muestra
de suelo secado al aire).
El porcentaje de arena es calculado dividiendo el contenido de arena (32 g) entre
el total (50 g) y multiplicndolo por 100 de la manera siguiente:
% de arena = 32 / 50 x 100 = 64%

75
% de arcilla
Despus de 2 horas, el limo se ha sedimentado.
La lectura del hidrmetro refleja ahora el contenido de arcilla de la suspensin
original. Por ejemplo, si la lectura del hidrmetro despus de corregir la
temperatura es de 4.7 g L-1, entonces el porcentaje de arcilla en el suelo es:
% de arcilla = 4.7 / 50 x 100 = 9.4% = 9%

% de limo

Figura 21. Tringulo de texturas del suelo

Textura del suelo

Una vez medidos los porcentajes de arena, limo y arcilla, el suelo puede ser asignado a
una clase textural basada en el tringulo textural del suelo (Figura 21) y esto depender
de las proporciones de las partculas del suelo

76
 Tabla 21. Correccin de temperatura para las lecturas del hidrmetro.
Temperatura Correccin del Temperatura Correccin del
(C) hidrmetro (g L-1) (C) hidrmetro (g L-1)
15 -1.62 22.0 +0.90
15.5 -1.44 22.5 +1.08
16 -1.26 23.0 +1.26
16.5 -1.08 23.5 +1.44
17 -0.90 24.0 +1.62
17.5 -0.72 24.5 +1.80
18.0 -0.54 25.0 +1.98
18.5 -0.36 25.5 +2.15
19.0 -0.18 26.0 +2.34
19.5 0 26.5 +2.52
20.0 +0.18 27.0 +2.70
20.5 +0.36 27.5 +2.858
21.0 +0.54 28.0 +3.06

A1.2 Determinacin de humedad (Mtodo gravimtrico)

En esta determinacin se realiz por duplicado siguiendo el mtodo gravimtrico, para lo
cual se pesaron dos muestras de 2 g cada una en una cpsula de porcelana a peso
constante y se dejaron 24 horas en estufa de secado a 80C. Pasado el tiempo, se pes
en balanza analtica las cpsulas con muestras secas del suelo, despus se dejaron
media hora ms para comprobar que estaban a peso contante, al final se compararon los
pesos finales con los iniciales de cada una, para as poder calcular el porcentaje de
humedad mediante la siguiente frmula:

A1.3 Determinacin de pH (Mtodo potenciomtrico)

Para determinar el pH de la muestra de suelo se pesaron 10 g de suelo tamizado (Tamiz
No.1) y se agregaron 20 mL de agua destilada, dejando en agitacin por 30 minutos,
despus se dej reposar y se tom la lectura directamente del potencimetro, anotando
tambin la temperatura.

77
A1.4 Determinacin de la materia orgnica (Mtodo de Walkey-Black)
Se pesaron 0.05 g de suelo de tamiz No.0.5 en un matraz de 500 mL al que, para oxidar
la materia orgnica, se le aadi 10 mL de dicromato de potasio 1 N mezclando con
movimiento rotatorios y 20 mL de cido sulfrico concentrado dejndolo caer suavemente
por la pared del matraz, ya que se genera una reaccin violenta y exotrmica. Se dej
reposar por 30 minutos y simultneamente se realiz de la misma forma un ensayo en
blanco, es decir sin muestra de suelo. Para hacer la valoracin por retroceso se le
agregaron 200 mL de agua destilada, 5 mL de cido fosfrico y de 5 a 8 gotas de
indicador difenilaminasulfonato de bario, valorando con la solucin de sulfato ferroso
amnico 1 N.

El color verde obscuro debido a los iones cromo en un precipitado, se desplaza hacia el
azul turbio a medida que avanza la valoracin. En el punto final este color cambia
bruscamente a verde brillante, dando el viraje con una gota. Si se han gastado 8 de los 10
mL de cido crmico se repite el ensayo tomando una muestra de suelo ms pequea.

Clculos:

Donde:
B = valoracin del blanco, mL de la solucin ferrosa
M = valoracin de la muestra, mL de la solucin ferrosa
N = normalidad del sulfato ferroso amoniacal
0.0039 = (12/4000) x (1/0.77)
12/4000 = miliequivalente del carbono
1/0.77 = es un factor de correccin debido a que se supone que el mtodo solo
oxida 77% del carbono
1.724 = factor resultante de considerar que un 58% de la materia
orgnica del suelo es carbono (1/0.58) (factor de Van Benmelen)
W = peso del suelo en g.

78
A1.5 Determinacin de nitrgeno orgnico (Mtodo matemtico)
El porcentaje de nitrgeno orgnico se obtiene a partir del clculo de porcentaje de
materia orgnica, mediante el uso de la siguiente expresin:

Donde:
20 = 5% del nitrgeno contenido en la materia orgnica lo que equivale a 100/5 =
20

A1.6 Determinacin de nitratos (Mtodo colorimtrico)

Se pesaron 10 g de suelo fresco se le agregaron 20 mL de solucin extractante de sulfato
de potasio 0.5 M, se agit durante 30 minutos a 60 rpm. Despus se filtr y centrifug a
2500 rpm por 5 minutos, para eliminar cualquier partcula suspendida.

De la parte clara de esta solucin, se tomaron 0.5 mL de cada estndar y muestra en

tubos de ensaye a los que se les adicion 1 mL de solucin de cido saliclico al 5 %,
agitando inmediatamente con vrtex y se dej reposar 30 minutos. Para terminar se
adicionaron 10 mL de solucin de hidrxido de sodio 4 M, se mezcl manualmente y se
dej reposar durante 1 hora para que las muestras revelaran color.

Clculos:
La cantidad de N - NO3, expresada en ppm o mg Kg-1 se calcula de la siguiente forma:

Donde:
C= lectura en ppm
V= volumen del extractante (20 mL)
f.d. = factor de dilucin
W= peso de la muestra (g)
Corregir el valor final por el contenido de agua en el suelo:

Donde:
A= ppm o mg Kg-1 de N-NO3

79
A1.7 Determinacin de fsforo (Mtodo de Olsen)
Para determinar el fsforo de la muestra se pesaron, por duplicado, 2.5 g de suelo en
tamiz No. 2 y se colocaron en tubos de polietileno, se adicionaron 50 mL de solucin
extractora y agit la suspensin en agitador de accin recproca durante 30 minutos, a
180 oscilaciones por minuto para posteriormente filtrarlas a travs de papel filtro Whatman
No. 42. Despus de esto se tom 5 mL ( 10 si la concentracin de P es muy baja) del
filtrado y se coloc en un matraz aforado de 50 mL. Finalmente, se agregaron 5 mL de la
solucin reductora, se agit y afor, al mismo tiempo se preparaba un blanco de la misma
manera. Las preparaciones se dejaron reposar por una hora para que el color se revelara
y despus se hizo la lectura en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 882 nm.
Para preparar la curva de calibracin se usaron de 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 mg L-1 de
P.

Clculos:

Donde:
CC= mg L-1 de P en la solucin. Se obtiene graficando la curva de calibracin
(absorbancia contra mg L-1) e interpolando en la misma los valores de absorbancia
de las muestras analizadas.
Vi = volumen de la solucin extractora adicionada.
P = peso de la muestra de suelo seca al aire.
Vf = volumen final de la solucin colorimtrica a leer.
a = alcuota de la muestra empleada para la cuantificacin.

A1.8 Determinacin de hidrocarburos totales del petrleo (HTPs). (Mtodo de

extraccin agitacin centrifugacin)
Para realizar la extraccin de HTPs de la muestra de suelo, por triplicado, se pesaron 2 g
de muestra y 3 g de sulfato de sodio anhidro en tubos para centrfuga de 15 mL,
mezclndose con vrtex. Se les aadieron 5 mL de diclorometano grado analtico y se
agitaron por 45 segundos, nuevamente en vrtex, para garantizar la mezcla del solvente
con los slidos. Despus se centrifugaron los tubos a 6 000 rpm durante 10 minutos. El
sobrenadante de cada tubo se coloc en un matraz baln, repitiendo el proceso anterior

80
hasta que el sobrenadante era de un color caf claro amarillento, tres veces en total.
Finalmente, en un rotaevaporador, se evapor el diclorometano hasta la sequedad, el
residuo obtenido contena todos los hidrocarburos solubles en diclorometano. Los
extractos orgnicos fueron puestos en recipientes (viales) a peso constante. La diferencia
de dichos pesos corresponda al contenido total de HTPs.

Clculos:
Para hacer el clculo de concentracin de hidrocarburos totales del petrleo provenientes
de la muestra, se debe considerar la cantidad de suelo que se pes para la extraccin, as
como la humedad de la muestra. El resultado debe expresarse en mg de HTP Kg -1 de
suelo seco, y se calcula de la siguiente manera:

Donde:
HTPs (mg Kg-1 de s.s.) = hidrocarburos totales del petrleo en mg Kg-1 de suelo
seco.
RA = peso (mg) del recipiente vaco a peso constante.
RB = peso (mg) del recipiente con el extracto orgnico concentrado.
P = cantidad de suelo extrado (g).

FH = facto de correccin de humedad [

FC = factor de correccin para transformar a Kg de s.s = 1000.

81
 ANEXO II. METODOLOGA ANLISIS MICROBIOLGICOS

A2.1 Fase I: Bacterias totales del suelo contaminado por la tcnica de

dilucin en placa para conteo de unidades formadoras de colonias
(UFC)

Para el conteo de bacterias totales del suelo contaminado se realiz esta tcnica usando
agar nutritivo (AN), tubos con tapn de rosca con 9 mL y frascos con 90 mL de solucin
salina isotnica al 0.85% as como cajas Petri y puntas para pipeta automtica,
esterilizados por 20 minutos a 15 lb de presin. Para la preparacin de la muestra se
pesaron, en condiciones de esterilidad, 10 g de suelo que fueron agregados al frasco que
contenia 90 mL de solucion isotnica estril, dejndose en incubacin a 35C para la
activacin de los microorganismos. Despues de 24 horas de incubacin se procedi a la
preparacin de diluciones tomando 1 mL de la muestra incubada y transfirindolo a uno
de los tubos (dilucin 10-2), previamente se dispers el suelo y homogeneiz la muestra.
Se repiti este paso preparando diluciones sucesivas hasta la dilucin 10-6, asegurndose
de utilizar una punta estril diferente en cada paso. Se debe agitar de forma constante en
cada paso (Figura 22)

Figura 22. Preparacin de diluciones

Posteriormente, se tom 1 mL de cada dilucin y se coloc en el centro de una caja Petri

estril, hasta tener dos cajas por cada dilucin. Una vez que las cajas tenan el inoculo se
procedi a vaciar el medio (AN) a cada caja mezclando cuidadosamente, haciendo giros a

82
la derecha y a la izquierda, y moviendo la caja horizontal y verticalmente. Despus se dej
que el medio se solidificara y se pusieron a incubar por 24 horas a 35C (Figura 23).

Figura 23. Siembra por mtodo de placa vaciada

Pasadas las 24 horas de incubacin, se procedi al conteo de UFC en las cajas por
medio de tcnicas empleadas en el rea de Inocuidad Alimentaria de LATEX; la tcnica
de sectores y por punteo.

La tcnica de sectores consiste en dibujar tres cuadrados de 1 cm2, ubicados

aleatoriamente en la caja y hacer el conteo de las colonias visibles dentro de cada uno,
para despus sacar un promedio y multiplicando por el total de centmetros cuadrados
que hay en una caja Petri. La tcnica de punteo consiste en contar directamente de la
caja todas las colonias visibles y con un marcador indicar las colonias ya contadas, se
saca un promedio del total de colonias contadas entre el nmero de cajas contadas por
cada dilucin. Para ambas tcnicas los promedios obtenidos se deben multiplicar por la
equivalencia de la dilucin, como se muestra en la Tabla 22.
Tabla 22. Equivalencia de diluciones
DILUCIN EQUIVALENCIA
-1
10 10
-2
10 100
-3
10 1,000
-4
10 10,000
10-5 100,000
-6
10 1,000,000

Clculos:
Por Sectores:

83
Donde:
C1,2,3= Total de colonias contadas en cada uno de los tres cuadrantes dibujados en
cada caja
65= Total de centmetros cuadrados que hay en una caja Petri
E.D = Equivalente de la dilucin en la que se realiz el conteo

Por Punteo:

Donde:
C1,2,= Total de colonias contadas en cada caja Petri
E.D = Equivalente de la dilucin en la que se realiz el conteo

A2.2 Fase II: Conteo, aislamiento y purificacin de bacterias

hidrocarburoclastas por la tcnica de dilucin en placa
Se preparo el medio mineral, ajustando el pH a 7 para despus agregarle el agar noble.
Se esteriliz a 15 lb por 15 minutos, dejndose enfriar a unos 50 para aadir la solucin
mineral estril. Despues se vaci en cajas Petri y se espero a que solidificaran, mientras
tanto se humedecieron discos de papel filtro estril con petroleo crudo ligero estril, el
petroleo fue esterilizado en 3 ocaciones, a 15 lb durante 15 minutos, dejando pasar un
dia a temperatura ambiente entre cada una, y se coloc en la parte interna de la tapa de
la caja Petri. Dejando as que el hidrocarburo se volatizara y sirviera como nica fuente de
carbono y energa. (Figura 24)

Figura 24. Siembra de bacterias hidrocarburoclastas

Conteo:
Para el conteo de las UFCs, se emplearon los mismos clculos presentados en la seccin
2.1 del ANEXO 2.

84
Aislamiento y purificacion:
A partir del crecimiento de colonias en atmsfera de petrleo se procedi a identificar, con
ayuda de un microscopio estereoscpico, las diferentes colonias por su morfologia, a
partir de la cual se identificaron cinco tipos diferentes. Una vez diferenciadas, se marc la
ubicacin en la caja Petri para posteriormente sembrar cada cepa en agar nutritivo (AN) y
en agar tripteina soya (TSA) por agotamiento (Figura 25), siendo esta la Resiembra 1.

Las resiembras posteriores se hicieron usando el estriado por dilucin (Figura 25),
haciendo tres secciones y quemando el asa de platino antes de hacer el estriado 2 y 3.
Hasta la Resiembra 3 se mantena el medio de cultivo inicial (AN o TSA), pero para la
Resiembra 4 todas las cepas se estriaron en AN, para poder diferenciar mas fcilmente
las colonias. Todas las resiembras se cultivaron a 35C por 24 horas. Se hicieron
resiembras hasta obtener cultivos donde las colonias aisladas fueron observadas
morfologicamente puras.

Figura 25. Tcnicas de estriado

A2.3 Fase III: Pruebas para la identificacin de gnero de bacterias

hidrocarburoclastas.
A2.3.1 Tincin de Gram
La secuencia de la tincin fue la siguiente: el frotis fue fijado con calor a un
portaobjetos, agregndole por 1 minuto algunas gotas de cristal violeta, se
lava con agua destilada, se cubre con solucin yodada durante 1 minuto y
se lava de nuevo con agua destilada, se decolora con alcohol al 95%, se
deja escurrir y se cubre con safranina (color de contraste) durante 10

85
 minutos, se lava con agua destilada y se seca, para despus observar el
porta objetos en un microscopio compuesto.

A2.3.2 Crecimiento anaerobio

Se pusieron 5 mL de medio basal O.F. en 10 tubos con tapn y se
adicionaron 0.5 mL de solucin de glucosa al 10% y se esterilizaron a 10
psi por una hora. Se dejaron enfriar y se inocularon con una asada de cada
cultivo microbiano en dos tubos. A uno de los dos tubos inoculados por
cultivo se le adicion aceite mineral estril hasta alcanzar un nivel de 5 mm
de altura, para crear condiciones de anaerobiosis. Se incubaron entre 25-
28C por 24horas. Si hay un cambio de color del medio a amarillo en
ambos tubos, por cultivo, ser registrado como positivo para crecimiento
anaerobio (fermentativo).

A2.3.3 Pigmento fluorescente en KB

Se prepar el medio KB, se esteriliz a 15 psi a 121C por 15 minutos, se
dej enfriar a 45-50C para ser vaciado a cajas de Petri. Se dejaron
solidificar y se hizo la siembra por duplicado de las cuatro cepas que fueron
negativas al crecimiento anaerobio, usando el estriado por dilucin.
Estuvieron en incubacion a 270.2C hacindose revisiones a las 24 y 48
horas. Despus de 48 horas de incubacin, se procedi a observar las
cajas en la lmpara de luz UV a una longitud de onda larga (360nm),

A2.3.4 Crecimiento de colonias amarillas en YDC

Se prepar el medio YDC, se esteriliza a 10 psi por una hora. Se enfri a
45-50C y antes de vaciar a cajas Petri se agit hasta que la solucin
tuviera una apariencia lechosa. Una vez que solidific el medio, se hizo la
siembra de las cepas, que dieron negativo a la fluorescencia en medio KB,
por duplicado usando el estriado por dilucin, dejndose en incubacin a
30C con revisiones a las 24 y 48 horas.

86
 A2.3.5 Prueba de ureasa
Se inocularon dos tubos que contenan 5 mL de caldo urea con una asada
de la suspensin microbiana a estudiar y se incubaron a 35C durante 24
horas. En este caso el caldo urea no se esteriliza ya que la urea se
descompone al someterse al calor.

A2.3.6 Crecimiento en agar D1M

En una caja con agar D1M, para cada una de las cepas, se hizo una
siembra mediante el estriado por dilucin. Se dejaron incubar 24horas a
27+/- 0.2C, para despus hacer las observaciones correspondientes.

A2.3.7 Pruebas complementarias

- Catalasa
Con un asa de platino, en condiciones de esterilidad, se toma una porcin de cultivo
bacteriano y se coloca en un porta objetos limpio, despus se le agrega una gota de
perxido de hidrogeno al 3 %. Si se forman burbujas el cultivo es positivo a la prueba.
- Oxidasa
Se utilizan tiras de papel filtro impregnadas con el reactivo N,N dimetil-para-fenilen-
diamina, que se oxida por la citocromooxidasa. El procedimiento consiste en colocar una
masa de bacterias sobre la tira hmeda. La prueba ser positiva si al cabo de 10
segundos la muestra de cultivo bacteriano adquiere una coloracin rosa, roja o purpura.

87
 ANEXO III. PREPARACIN DE SOLUCIONES Y MEDIOS DE
CULTIVO

A3.1 Preparacin de soluciones

Solucin de Calgn al 10% (hexametafostato de sodio, (NaPO3)6
Disolver 100 g de calgon en un litro de agua destilada. Esta solucin se conserva durante
1 mes, con el tiempo pierde su eficiencia dispersante debido a que se convierte en otro
compuesto.

Solucin de dicromato de potasio 1 N

Secar dicromato de potasio a peso constante. Disolver en agua destilada exactamente
49.04 g. Diluir la solucin a 1 litro.

Solucin de difenilaminasulfonato de bario al 0.16%

Pesar 0.16 g de difenilaminasulfonato de bario. Disolver en aproximadamente 50 mL de
agua destilada tibia. Enfriar y aforar a 100 mL con agua destilada.

Solucin de sulfato ferroso amoniacal 1 N

Pesar 392.2 g de sulfato ferroso amoniacal. Disolver en 800 mL de agua destilada. Una
vez disuelto, agregar cuidadosamente 20 mL de cido sulfrico concentrado para luego
aforar a un litro.

Solucin de sulfato de potasio 0.5 M

Disolver 87.133 g de sulfato de potasio y disolverlos un litro de agua destilada. Solucin
de hidrxido de sodio 4M de hidrxido. Disolver 160 g de hidrxido de sodio en 1000 mL
de agua destilada libre de CO2.

Solucin de cido saliclico al 5 %

Disolver 5 g de cido saliclico en 95mL de cido sulfrico concentrado. Prepararlo el da
anterior al anlisis; es estable por 7 das guardado en lugar oscuro y fro. (Pesar
directamente el cido saliclico en el frasco mbar en que va a guardarse la solucin).

88
 Solucin stock de NO3-N de 1000 ppm
Secar aproximadamente 10 g de nitrato de potasio a 105C durante 2 horas. Enfriar en
desecador. Pesar 7.223 g. Disolver en un poco de agua destilada y aforar a un litro.

Solucin Stock de NO3-N de 50 ppm

Pipetear 25 mL de la solucin stock de 1000 ppm de NO3-N en un matraz aforado de 500
mL y llevar a la marca con agua destilada. O pesar directamente 0.1806 g de KNO3
previamente secado y aforar a 500 mL.

Hidrxido de sodio 1 M.
Disolver 4 g de NaOH en 100 mL de agua.

Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 0.5 M.

Disolver 42 g de NaHCO3 en aproximadamente 1 litro de agua. Ajustar el pH de esta
solucin a 8.5 mediante la adicin de solucin de NaOH 1 M. Llevar a volumen con agua
destilada.

Solucin de tartrato de antimonio y potasio al 0.5%.

Pesar 0.5 g de K(SbO) C4H4O6 H2O, transferirlo a un matrz volumtrico de 100 mL
disolver y aforar con agua destilada.

Solucin de molibdato de amonio [(NH4)6Mo7O24*4H2O].

Disolver 20 g de molibdato de amonio [(NH4)6Mo7O24*4H2O] en 300 mL de agua destilada
agregar lentamente bajo constante agitacin y con cuidado, 450 mL de H2SO4 (14 N)
(194.4 mL de H2SO4 concentrado diluido a 500 mL con agua da un concentracin de
aproximadamente 14N). Agregar 100mL de una solucin al 0.5 % (p/v) de tartrato de
antimonio y potasio. Diluir las mezclas a un litro con agua destilada. El frasco debe
taparse con papel aluminio y protegerse de la luz.

Solucin reductora con cido ascrbico

Disolver 0.50 g de cido ascrbico con un poco de solucin de molibdato de amonio y
aforar a 100 mL con la misma solucin.

89
 Solucin patrn de fsforo (200 mg L-1)
Pesar exactamente 0.8786 g de fosfato de potasio monobsico (KH2PO4) seco al horno a
105C, disolver en agua y aforar a un litro. Guardar en envase de plstico o vidrio y
conservar en refrigeracin.

Solucin patrn de 5 mg L-1 de P

Diluir 5 mL de la solucin de 200mg L-1 de P a 200 mL con agua destilada.

Solucin salina 0.85% estril.

Adicionar 8.5 g de cloruro de sodio (NaCl) en 1 L de agua destilada. Esterilizar a 121C
durante 20 minutos.

Solucin Mineral para Bacterias Hidrocarburoclastas

Disolver en un litro de agua destilada las siguientes sales 5.1 g de MgCl*2H2O; 0.66 g de
MnCl2*H2O; 1 g de NaCl; 1 g de FeCl3*6H2O; 0.1 g de CaCl2*2H2O; 0.01 g de CuCl2; 0.08
g de ZnCl2; 0.05 g de AlCl3; 0.01 g de H3BO3 y 0.04 g de Na2MoO4*2H2O.
Mezclar y hervir por 1 minuto con agitacin frecuente. Esterilizar a 121C durante 20
minutos

A3.2 Preparacin de medios de cultivo

Agar Nutritivo (AN)
Disolver 23 g del medio en un litro de agua destilada. Esterilizar a 121C por 15 minutos.
Dejar enfriar a 45-50C y vaciar en cajas Petri. Dejar solidificar.

Tripteina Soya Agar (TSA)

Disolver 40 g del medio en un litro de agua destilada. Esterilizar a 121C por 15 minutos.
Dejar enfriar a 45-50C y vaciar en cajas Petri. Dejar solidificar.

Medio Mineral para Bacterias Hidrocarburoclastas

Disolver Agar Noble 1.5 % p/v; 0.4 g de KH2PO4; 1.6 g de K2HPO4; 1.5 g de NH4Cl; 0.17
g de MgCl2*6H20; 0.609 de Na2SO4 y 0.045 g de CaCl2*2H2O en 1 L de agua destilada.

90
Mezclar hasta obtener una sujecin homognea. Calentar y hervir por 1 minuto con
agitacin frecuente. Esterilizar a 121C durante 20 minutos. Enfriar de 45 a 50C
aproximadamente. Agregar 1 mL de la solucin mineral para bacterias
hidrocarburoclastas estril y mezclar hasta homogeneizar.

Medio basal O.F. (Hugh y Leifson)

Pesar y disolver hasta ebullicin en un litro de agua destilada los siguientes reactivos: 2 g
de peptona; 5 g de NaCl; 0.3 g de K2HPO4; 3 g de agar; 3 mL de azul de bromotimol (sol.
acuosa <1%), vaciar 5 mL en tubos con tapn y esterilizar a 121C por 20 minutos y dejar
enfriar a 45-50C. De manera simultnea preparar solucin acuosa de glucosa al 10% y
esterilizar a 10 psi de presin por una hora y agregar 0.5 mL a cada tubo. El medio se
puede esterilizar a 10 psi por una hora, agregando todos los componentes, o bien utilizar
medio elaborado por alguna marca comercial siguiendo las instrucciones para su
preparacin. Vaciar en cajas Petri y dejar solidificar.

Medio Extracto de Levadura-Dextrosa-CaCO3 (YDC)

Pesar y disolver hasta ebullicin los siguientes reactivos en un litro de agua destilada: 10
g de extracto de levadura; 20 g de dextrosa (glucosa); 20 g de CaCO3, USP, polvo fino; 15
g de agar. El CaCO3 se debe agregar despus de la ebullicin para evitar que se derrame
el medio. Esterilizar a 10 psi por una hora, o esterilizar de manera separada la dextrosa
(glucosa) en 100 mL de agua y luego incorporarla al medio. Enfriar a 45-50C, agitar
hasta que la solucin presente una apariencia lechosa y vaciar en cajas Petri.

Medio King B (KB)

Pesar y disolver hasta ebullicin los siguientes reactivos en un litro de agua destilada: 20
g de proteasa peptona no.3 (puede sustituirse por polipeptona); 1.5 g de K2HPO4; 1.5 g de
MgSO4*7H2O; 15 mL de glicerol; 15 g de agar. Esterilizar a 15 psi, a 121C por 20
minutos, vaciar a cajas Petri estriles.

Medio Caldo Urea

Suspender 3.87 g en 100 mL de agua destilada; esterilizar por filtracin. Distribuir en
volmenes de 0.5 a 2 mL en tubos de ensayo pequeos estriles (se pueden emplear
cantidades ms grandes pero las reacciones son ms lentas). Cuando no se disponen de

91
filtros se puede esterilizar a 100-110C durante 10 minutos. Si este medio se prepara y se
inocula de inmediato se obtienen buenos resultados sin esterilizar.

Agar D1M
Pesar y disolver los siguientes reactivos en 100mL de agua destilada: 0.5 g de celubiosa;
0.1 g de NH4Cl; 0.1 g de NaH2PO4; 0.1 g de K2HPO4; 0.3 g de MgSO4*7H2O; 1 mg de
verde de malaquita y 1.5 g de agar. Ajustar el pH a 7, calentar hasta ebullicin. Esterilizar
a 15 psi, a 121C por 20 minutos, dejar enfriar a 45-50C y vaciar a cajas Petri estriles.

A3.3 Equipos
Agitador orbital LAB-LINE
Autoclave FELISA, modelo FE-399.
Balanza analtica Denver AA-200
Balanza digital AND, modelo GF-2000.
Bao de Agua APSA GB822
Bao isotrmico FISHER-Scientific, modelo ISOTEM 210.
Batidora de fuente de sodas
Cabina Cromato-Uve UVP Upland CA, modelo CC-10
Campana de extraccin
Campana de flujo laminar VECO, modelo GVFL-B09.
Centrfuga Eppendorf 5416
Centrifuga Universal HETTICH, modelo D788532
Estufa de secado FELISA
Incubadora FELISA, modelo FE-134.
Microscopio Estereoscpico CARL ZEISS, modelo STEMI 1000
Microscopio Compuesto CARL ZEISS, modelo K F2
Potencimetro ORION, modelo 420A.
Parrilla elctrica FELISA, modelo FE-311.
Tamizador elctrico
Vortex Thermolyne M16715.

92