PRACTICA N 18

DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS

DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA
I. INTRODUCCION:
La digestin de las protenas, o degradacin hasta aminocidos en el tubo digestivo, es un proceso
complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteolticas Entre estas enzimas
proteoliticas tenemos: a) de origen gstrico: pepsina y renina; b) de origen pancretico: tripsina,
quimotripsina, elastasa y carboxipeptidasa; c) de origen intestinal: aminopeptidasas, dipeptidasas.
Son endopeptidasas: pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasas. Son exopeptidasas: carboxipeptidasa
y aminopeptidasa. La tripsina, es activada por la enterocinasa en el intestino, y es especfica de los
enlaces peptidicos sobre el lado carboxlico de residuos de aminocidos bsicos: lisina y arginina
solamente. La quimotripsina es especfica para los enlaces peptidicos de los aminocidos sin carga
como los aromticos: tirosina, triptofano y fenilalanina. La elastasa tiene una especificidad amplia,
ataca a los residuos pequeos, como la glicina, alanina y serina. La carboxipeptidasa hidroliza el
enlace peptdico carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas.
La falta de enzimas proteolticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en
las heces, que provienen de la carne de los alimentos), y azorrea (gran cantidad de productos
nitrogenados en las heces). En el lactante con ausencia congnita de tripsinogeno y por consiguiente
por falta de activacin de quimotripsingeno y procarboxipeptidasa, existe hipoproteinemia, con
retardo marcado del crecimiento.

La presente prctica tiene como finalidad demostrar la accin hidroltica de las enzimas digestivas
contenidas en el pncreas sobre la casena o protena de la leche, determinado los productos
(aminocidos) con ninhidrina

II. REACTIVOS.
- Casena al 1% en buffer fosfato 0,1 M pH 8.
- Buffer fosfato 0,1 M pH 8.
- Solucin de extracto pancretico.
- Solucin acuosa de ninhidrina al 0,25% saturada con butanol.
- Acido tricloroactico al 10%.

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

Armar el siguiente sistema:

COMPONENTES (ml) I II III

Casena al 1% 1 1 ---
Buffer fosfato 0.1 M pH 8.0 1 1 1
Solucin de extracto pancretico 1 --- 1
Agua destilada --- 1 1

Pasos:
* Mezclar y colocar al bao de agua a 37 C por 30 minutos.
* Despus del tiempo de incubado tomar 0,5 ml, de cada uno de los tubos y trasladelos a
otro sistema numerado (I, II, III).
* En este nuevo sistema, agregar 1 ml de solucin de ninhidrina.
* Mezclar y llevar a un bao de agua hirviendo (franca ebullicin), durante 3 a 5 minutos.
* Observa los cambios de color de cada tubo.
 * Luego, agregue gota a gota 1 ml de cido tricloroactico al 10% agitando continuamente.
* Observe las variaciones que se produce en cada tubo.

IV. CUESTIONARIO:
1. Seale las enzimas digestivas pancreticas y los sustratos sobre los cules acta.

2. Cmo se explica los cambios de color, despus de la reaccin con ninhidrina en un

sistema donde se produce digestin de las protenas?

3. Qu efecto tiene el cido tricloroactico sobre las protenas? Qu variaciones se

obtienen en un sistema de digestin de protenas, despus de agregar cido
tricloroactico?
 INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS: ACCION
DE LA SOYA HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO
PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA

INTEGRANTES:

VILCHES SENAS CRISTIAN.

VILLACORTA PONCE LUZ.
VILLACORTA SEBATIN NANCY.

I. INTRODUCCION:

La tripsina acta como una endopeptidasa e hidroliza prcticamente toda clase de

protenas. Digiere las protenas desnaturalizadas y parcialmente digeridas, con mayor
rapidez que las originales desdoblndose en polipptidos de peso variable y algunos
aminocidos.

Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la

nutricin. Por ejemplo el frijol de soja contiene un principio cuya actividad
antitripsina dificulta la digestin de las protenas. Esta sustancia de naturaleza
peptdica es inactivada por el calor, ello explica en parte que el valor nutritivo del
frijol de Soja aumenta considerablemente si se coce a ebullicin por varios minutos.

El ovomucoide de la clara de huevo inhibe tambin de manera enrgica la tripsina.

Es interesante tambin que el aceite de semilla de algodn posea un pigmento, el
gisipol, con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el apetito y dificulta
la digestin de las protenas.Los extractos de pncreas poseen tambin un pptido
inhibidor de la tripsina, la alfa-1 antitripsina fecal (1-AT-Fecal) que es una
glicoprotena, secretada a la luz intestinal.
 II. REACTIVOS A UTILIZAR.
- Buffer fosfato 0,1 M pH 8,0.
- Solucin de ninhidrina 0,25% saturada con butanol.
- Solucin de tripsina 20 mg%.
- Protena de soya cruda 30%.
- Protena de soya hervida 30%.
- Etanol absoluto

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

Armar el siguiente sistema:

COMPONENTES (ml) I II III IV

Buffer fosfato 0.1 M pH 8.0 2,5 2,5 2,5 2,5
Protena de soja cruda 30% 0.5 0,5 - -
Protena de soja hervida 30% - - 0,5 0,5
Solucin de tripsina 20 mg% 0,2 - 0,2 -

Pasos:

a. Incubar en bao mara a 37C durante 1 hora.

b. Despus del tiempo de incubacin: agregar a cada uno de los tubos 2 ml
de etanol absoluto.
c. Mezclar y centrifugar a 2500 rpm por 10 min.
d. En otra serie de tubos numerados I , II, III, IV colocar 1 ml de
sobrenadante de los tubos respectivos del paso anterior y agregar 1 ml de
ninhidrina 0,25%.
e. Someter los tubos a temperatura de ebullicin del agua utilizando bao
mara durante 5 minutos.
f. Anotar los resultados.
IV. CUESTIONARIO:

1. Explique con sus propias palabras cul cree que es el objetivo de la

prctica que realiz.

El objetivo central del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor

del extracto de soya cruda sobre el efecto proteoltico de la tripsina.
Gran parte de los alimentos de origen vegetal, presentan inhibidores de
proteasas, en donde la mayor proporcin se manifiesta en la semilla.
Tambin se demuestra en esta prctica que tal efecto inhibidor desaparece al
utilizar soya hervida. Debido a que el hervor rompe con tal efecto.
Estudios relacionados con la inactivacin del inhibidor de soya fueron
realizados por Bainter (Bainter, 1981) y por Collins y Beaty (Collins y Beaty,
1980), indicando que es suficiente un tratamiento con agua hirviendo por tres
minutos para inactivar el 90% de inhibidor. La mayora de los inhibidores de
proteasas son inactivados por la accin del calor, por lo que en el cocimiento de
los alimentos que contienen este tipo de compuestos, generalmente va
acompaado de un incremento en la calidad nutritiva.

2. Por qu razn el ovomucoide de la clara del huevo inhibe la accin de la

tripsina.

El ovomucoide es una glicoprotena el cual tiene un inhibidor de tripsina de

una alta estabilidad trmica.
Posee una serie de enlaces azufrados. Es un inhibidor del tipo Kazal, siendo
su sitio activo en el residuo de lisina para la mayora de las aves, pero en
gallinas se encuentra en la arginina.

3. Qu es el gisipol y cmo acta en su accin antioxidante?

Qumicamente, el gisipol se clasifica como un polifenol, que permeabiliza las

clulas y acta como un inhibidor para varias de las enzimas deshidrogenasas.
Es un pigmento amarillo. Bsicamente, el gisipol se presenta en dos formas:
libre y ligado, siendo de mayor importancia la forma libre, que es
biolgicamente txica y que corresponde casi a la totalidad de gisipol de la
planta del algodn. Normalmente, en la semilla del algodn, el gisipol total
constituye de 0,8 a 1,4%. El gisipol (C30H30O8) es una toxina potente que
interfiere con la utilizacin de los elementos minerales, forma complejos
estables con cationes, como el Fe++, pudiendo producir anemia. Combina su
grupo carbonilo con las protenas y los aminocidos, siendo el factor principal
de la toxicidad su efecto acumulativo, causa alteraciones en las organelas
celulares, altera los procesos bioqumicos e inhibe la actividad de algunas
enzimas, as como la sntesis de DNA.

Ejerce un efecto inhibidor en las enzimas digestivas. Es un antioxidante

biolgico que hace que disminuya el apetito y que se produzca estreimiento.
Las gallinas alimentadas con harina de semilla de algodn pueden dar huevos
con yemas moteadas debido al efecto del gisipol.
El gisipol es txico para los animales monogstricos cuando se les suministra
en cantidades excesivas. El cerdo y los conejos son los animales ms
sensibles. Las aves de corral son ms tolerantes. Los rumiantes adultos
pueden ingerir gisipol mientras que los bovinos jvenes son mucho ms
susceptibles.

El efecto biolgico del gisipol puede evitarse aadiendo hierro, en forma de

sulfato frrico.
 4. Con dibujos represente la prctica realizada.

TUBO I

BUFFER FOSFATO
0,1M / pH 8 ETANOL
37C x 1 hora ABSOLUTO

SOLUCIN
DE TRIPSINA PROTENA DE
SOYA CRUDA 30%

C
E
N
T
R
IF
U
G
NIHIDRINA A
R
NO HUBO
REACCIN, DEBIDO
A LA INACCIN DE
LA TRIPSINA, YA Extraer 1ml
HERVIR del
QUE FUE INHIBIDO
sobrenadante
POR LA ACCIN DE
LA SOYA CRUDA.
 TUBO II

BUFFER FOSFATO ETANOL

0,1M / pH 8 ABSOLUTO
37C x 1 hora

PROTENA DE
SOYA CRUDA 30%

C
E
N
T
R
NIHIDRINA IF
U
G
A
NO HUBO R
REACCIN POR Extraer 1ml
HERVIR del
LA AUSENCIA sobrenadante
DE TRIPSINA

TUBO III

BUFFER FOSFATO ETANOL

0,1M / pH 8 ABSOLUTO
37C x 1 hora

PROTENA DE
SOYA HERVIDA
30%
C
E
N
T
SOLUCIN R
DE TRIPSINA NIHIDRINA IF
U
LA SOYA HERVIDA G
A
PERDI SU
R
ACTIVIDAD Extraer 1ml
ANTITRIPSINA. AL HERVIR del
AGREGAR sobrenadante
NIHIDRINA, PONE
DE MANIFIESTO LA
ACCIN DE LA
TRIPSINA.
 TUBO IV

BUFFER FOSFATO ETANOL

0,1M / pH 8 ABSOLUTO
37C x 1 hora

PROTENA DE
SOYA HERVIDA
30%
C
E
N
T
R
NIHIDRINA I
F
U
G
A
Extraer 1ml R
HERVIR del
sobrenadante

CONCLUSIONES:

* LA SOYA CRUDA TIENE PROPIEDADES INHIBITORIAS PARA LA TRIPSINA,

IMPIDIENDO LA PROTELISIS DE LAS PROTENAS Y LA FORMACIN DE
AMINOCIDOS. EN LOS TUBOS 1 Y 2, NO OCURRI PROTELISIS, NO
HUBO AMINOCIDOS LIBRES, LO QUE SE DEMOSTR CON LA NIHIDRINA
(INDICADOR DE AMINOCIDOS LIBRES).

* LA ACTIVIDAD ANTITRIPSINA ES INHIBIDA AL HERVIR LA SOYA, LO QUE

PERMITE LA ACCIN DE LA TRIPSINAY LA FORMACIN DE AMINOCIDOS
LIBRES. LA NIHIDRINA TIE LA SOLUCIN DE COLOR VIOLETA OSCURO.
LO QUE SE OBSERV CON MS ACENTUACIN EN EL TUBO N 3.
TUBO 1
TUBO 2 TUBO 3
TUBO 4

RESULTADOS FINALES