UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS - UFMG

ESCOLA DE VETERINRIA
Colegiado dos Cursos de Ps-Graduao

CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS E MICROBIOLGICAS E

ACEITAO SENSORIAL DE LEITES FERMENTADOS POR
BACTRIAS PRODUTORAS DE CIDO LCTICO ISOLADAS DE
QUEIJO COALHO DE PERNAMBUCO

DEBORA PINHEIRO GUIMARES MENDES

BELO HORIZONTE
2011
 Debora Pinheiro Guimares Mendes

CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS E MICROBIOLGICAS E

ACEITAO SENSORIAL DE LEITES FERMENTADOS POR
BACTRIAS PRODUTORAS DE CIDO LCTICO ISOLADAS DE
QUEIJO COALHO DE PERNAMBUCO

Dissertao apresentada Escola de

Veterinria da Universidade Federal de
Minas Gerais - UFMG, como requisito
parcial para obteno do grau de Mestre em
Cincia Animal.
rea de concentrao: Tecnologia e
Inspeo de Produtos de Origem Animal.
Orientador: Marcelo Resende de Souza

BELO HORIZONTE
Escola de Veterinria UFMG
2011
 Mendes, Debora Pinheiro Guimares, 1985-
M538c Caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas e aceitao sensorial de leites
fermentados por bactrias produtoras de cido lctico isoladas de queijo coalho de
Pernambuco / Debora Pinheiro Guimares Mendes. 2011.
63 p. : il.
Orientador: Marcelo Resende de Souza
Dissertao (mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinria
Inclui bibliografia

1. Leite fermentado Anlise Teses. 2. Bactrias produtoras de cido lctico Teses.

3. Avaliao sensorial Teses. 4. Lactobacilo Teses. I. Souza, Marcelo Resende de.
II. Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinria. III. Ttulo.

CDD 637.3

2
ASSINATURAS

3
4
AGRADECIMENTOS

Agradeo primeiramente a Deus, que sempre esteve e estar comigo.

Ao meu esposo, Ricardo, pelo apoio, carinho, amor e compreenso. Pela oportunidade
que me deu de fazer esse mestrado, e pelas inmeras vezes que ficou em casa sozinho
enquanto eu estava na UFMG.

minha me, aos meus avs e aos meus tios Alexandre, Aparecida e Ceclia e suas
respectivas famlias e ao meu tio Gasto, que sempre apoiaram e entenderam que as
ausncias eram necessrias para que hoje eu chegasse at aqui.

Ao professor Marcelo Resende pela orientao, dedicao, amizade e confiana.

Aos meus amigos e companheiros de mestrado, em especial Fernanda Magalhes, Alice

Ferreira, Camila Couto, Maria Carolina Paes, Guilherme Marcondes, Leonardo Acurcio
pelo companheirismo, amizade, carinho.

Aos professores do DTIPOA, em especial Mnica Leite e Claudia Penna, pela

colaborao neste projeto, sempre com boas sugestes.

Aos funcionrios do DTIPOA, em especial Maura, Taynara, Marco Antnio, pelo

suporte nas anlises e nos momentos de dvida, ao Milton, por sempre estar disposto a
nos atender na secretaria com um sorriso no rosto.

Aos alunos de iniciao cientfica, Marcos Galletti e Dalila Lapinha, que sempre
estavam dispostos quando solicitados, pela ajuda em todos os momentos e pelo
companheirismo.

Ao Danilo, pelo brilhante suporte na estatstica e durante todo o processo de discusso

dos resultados.

Aos professores e ex-professores do Centro Universitrio de Belo Horizonte, em

especial professora Lcia Peret, Viviane Birchal e Clia Ornellas, que sempre me
apoiaram.

Aos colegas da UNIPAC VALE DO AO, em especial aos coordenadores William

Saliba e Arilton Barcelar. Aos meus alunos, em especial turma de formandos do 2
semestre de 2010 do Curso de Farmcia, pelo apoio, carinho e amizade.

Aos amigos, especialmente Vivianne Rosental, William Silva, Isismlian Hastenreiter,

Silvana Anglica, que sempre apoiaram para a realizao deste sonho.

5
A todos que de alguma forma contriburam para a realizao deste projeto, por
confiarem e acreditarem em mim e no meu potencial.

No conheo ningum que conseguiu realizar seu sonho sem sacrificar sbados e
domingos pelo menos uma centena de vezes. Se quiser atingir uma meta em especial,
ter de estudar no horrio em que os outros esto tomando chopp e comendo batata frita.
Ter de planejar, enquanto os outros permanecem na frente da televiso. Ter de
trabalhar enquanto os outros tomam sol beira da piscina. A realizao de um sonho
depende da dedicao.
Roberto Shinyashiki

6
 SUMRIO

1. INTRODUO .......................................................................................................... 16
2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 18
3. HIPTESES ............................................................................................................... 18
4. REVISO DE LITERATURA .................................................................................. 19
4.1. Leites fermentados .................................................................................................. 19
4.1.1. Histrico ............................................................................................................... 19
4.1.2. Legislao brasileira ............................................................................................. 19
4.2. Probiticos ............................................................................................................... 21
4.2.1. Histrico ............................................................................................................... 21
4.2.2. Definies ............................................................................................................. 22
4.2.3. Leites fermentados probiticos............................................................................. 22
4.2.4. Efeitos benficos................................................................................................... 23
4.3. O gnero Lactobacillus............................................................................................ 24
4.3.1. Lactobacillus rhamnosus ...................................................................................... 26
4.3.2. Lactobacillus fermentum ...................................................................................... 27
5. MATERIAL E MTODOS ........................................................................................ 28
5.1. Delineamento experimental ..................................................................................... 28
5.2. Controle de qualidade do leite em p desnatado ..................................................... 29
5.3 Controle de qualidade do leite em p desnatado reconstitudo e tratado
termicamente .................................................................................................................. 29
5.4. Microrganismos ....................................................................................................... 29
5.5. Curvas de fermentao/ crescimento ....................................................................... 30
5.6. Preparo dos leites fermentados ................................................................................ 30
5.7. Anlises laboratoriais dos leites fermentados .......................................................... 31
5.7.1 Avaliao fsico-qumica dos leites fermentados .................................................. 31
5.7.2. Avaliao microbiolgica dos leites fermentados ................................................ 31
5.7.2.1. Enumerao dos microrganismos produtores de cido lctico .......................... 31
5.7.2.2. Pesquisa de coliformes totais e termotolerantes ................................................ 31

7
5.7.2.3. Pesquisa de bolores e leveduras......................................................................... 32

5.8. Avaliao sensorial dos leites fermentados ............................................................. 32

5.9. Anlise Estatstica ................................................................................................... 33
6. RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................... 33
6.1. Controle de qualidade do leite em p desnatado ..................................................... 33
6.2 Controle de qualidade do leite em p desnatado reconstitudo ................................ 35
6.3.Curva de Fermentao / Crescimento ....................................................................... 35
6.3.1. pH ......................................................................................................................... 35
6.3.2. Acidez Titulvel ................................................................................................... 37
6.3.3. Enumerao das bactrias produtoras de cido lctico ........................................ 38
6.4. Avaliao fsico-qumica dos leites fermentados .................................................... 39
6.4.1. pH ......................................................................................................................... 39
6.4.2. Acidez Titulvel ................................................................................................... 40
6.4.3. Teor de protena .................................................................................................... 41
6.4.4. Teor de gordura .................................................................................................... 41
6.4.5. Teor de umidade e extrato seco total .................................................................... 42
6.5. Avaliao microbiolgica dos leites fermentados ................................................... 43
6.5.1. Enumerao dos microrganismos produtores de cido lctico ............................. 43
6.5.2. Pesquisa de coliformes totais e termotolerantes ................................................... 44
6.5.3. Pesquisa de bolores e leveduras............................................................................ 45
6.6. Avaliao sensorial dos leites fermentados ............................................................. 45
6.6.1. Teste de aceitao pela escala hednica de cinco pontos ..................................... 45
6.6.2. Teste de aceitao pela escala no estruturada ..................................................... 46
7. RESUMO DOS RESULTADOS................................................................................ 47
8. CONCLUSES .......................................................................................................... 48
9. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ....................................................................... 49
10. ANEXOS .................................................................................................................. 55

8
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Teores percentuais mdios de acidez titulvel e componentes fsico-qumicos

dos trs lotes de leite em p desnatado ........................................................................... 34

Tabela 2: Resultados mdios percentuais de trs repeties pH de leites desnatados

esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus fermentum,
armazenados sob refrigerao entre 8 a 10 C, durante 45 dias de estocagem ............... 39

Tabela 3: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de acidez titulvel
de leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10C, durante 45 dias
de estocagem................................................................................................................... 40

Tabela 4: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de protena de

leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10C, durante 45 dias
de estocagem................................................................................................................... 41

Tabela 5: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de umidade de

leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao a 8-10 C, durante 45 dias de
estocagem ....................................................................................................................... 42

Tabela 6: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de extrato seco
total de leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10 C, durante 45 dias
de estocagem................................................................................................................... 43

Tabela 7: Contagens mdias (UFC/g) em gar MRS, de trs repeties de leites

desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus
fermentum, armazenados sob refrigerao a 8-10 C, durante 45 dias de estocagem .... 43

Tabela 8: Medianas dos resultados do teste de aceitao (escala hednica de cinco

pontos) de leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 a 10 C, durante 60 dias
de estocagem................................................................................................................... 45

Tabela 9: Medianas dos resultados do teste de aceitao (escala no estruturada) dos

leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10 C, durante 60 dias
de estocagem................................................................................................................... 46

9
 LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Requisitos fsico-qumicos oficiais para inspeo de leites fermentados no

Brasil ............................................................................................................................... 20

Quadro 2: Critrios microbiolgicos oficiais para inspeo de leites fermentados no

Brasil ............................................................................................................................... 20

Quadro 3: Contagem de microrganismos especficos para inspeo de leites fermentados

no Brasil .......................................................................................................................... 21

Quadro 4: Principais efeitos benficos do consumo de leites fermentados contendo

microrganismos probiticos e seus mecanismos ............................................................ 24

Quadro 5: Linhagens de Lactobacillus rhamnosus utilizadas na fermentao de

alimentos e seus respectivos benefcios sade humana ............................................... 27

Quadro 6: Linhagens de Lactobacillus fermentum utilizadas na fermentao de

alimentos e seus respectivos benefcios sade humana ............................................... 28

10
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Mdias de duas repeties de pH durante a fermentao de leites fermentados

esterilizados adicionados de Lactobacillus rhamnosus (LR) e Lactobacillus fermentum
(LF) ................................................................................................................................. 36

Figura 2: Mdias de duas repeties de acidez titulvel (%) durante a fermentao de

leites fermentados esterilizados adicionados de Lactobacillus rhamnosus (LR) e
Lactobacillus fermentum (LF) ........................................................................................ 37

Figura 3: Mdias de duas repeties das contagens (log UFC/g) durante a fermentao
de leites fermentados esterilizados adicionados de Lactobacillus rhamnosus (LR) e
Lactobacillus fermentum (LF) ........................................................................................ 38

11
 LISTA DE ABREVIATURAS

% porcentagem
l microlitro
a.C. antes de Cristo
B. Bifidobacterium
B. lactis Bifidobacterium lactis
CPS Concentrado Proteico de Soro
COEP Comit de tica em Pesquisa
DTIPOA Departamento de Tecnologia e Inspeo de Produtos de Origem
Animal
EC Escherichia coli
EV Escola de Veterinria
g gramas
IN Instruo Normativa
L. Lactobacillus
L. fermentum Lactobacillus fermentum
L. reuteri Lactobacillus reuteri
L. rhamnosus Lactobacillus rhamnosus
LF Leite fermentado por Lactobacillus fermentum
LR Leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus
mn. mnimo
ml mililitro
MRS de Man, Rogosa e Sharpe
NaCl Cloreto de sdio
NMP nmero mais provvel
C Graus Celsius
RTIQ Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade
TGI Trato gastrintestinal
UFC unidades formadoras de colnia
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais

12
 ANEXOS

Anexo 1: Teste de Gram Lactobacillus rhamnosus (100x de aumento Microscpio

ptico) ............................................................................................................................. 55

Anexo 2: Teste de Gram Lactobacillus fermentum (100x de aumento Microscpio

ptico) ............................................................................................................................. 56

Anexo 3: Crescimento em caldo MRS do Lactobacillus fermentum aps 72 horas de

incubao ........................................................................................................................ 57

Anexo 4: Crescimento em Caldo MRS do Lactobacillus rhamnosus aps 72 horas de

incubao ........................................................................................................................ 58

Anexo 5: Fotografia do cogulo formado por Lactobacillus rhamnosus ....................... 59

Anexo 6: Fotografia do cogulo formado por Lactobacillus fermentum ....................... 60

Anexo 7: Modelo da Ficha de Anlise Sensorial utilizada nas anlises sensoriais dos
leites fermentados estocados por 15 e 60 dias sob refrigerao 8-10C...................... 61

Anexo 8: Modelo do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para a Anlise

Sensorial ......................................................................................................................... 62

Anexo 9: Mdia das duas repeties do tempo de fermentao dos leites desnatados
adoados esterilizados adicionados de Lactobacillus fermentum e Lactobacillus
rhamnosus....................................................................................................................... 63

13
 RESUMO

No Brasil, assim como em todo o mundo, o consumidor vem buscando alimentos que
alm de prover necessidades nutricionais tragam benefcios a sua sade; e neste
contexto que se destacam os alimentos contendo microrganismos probiticos, tendo
como principais representantes os leite fermentados. A produo brasileira de leites
fermentados baseada na utilizao de microrganismos iniciadores importados,
comercializados por empresas estrangeiras. Verifica-se que h um grande potencial para
a utilizao de bactrias produtoras de cido lctico, potencialmente probiticas,
isoladas de produtos lcteos artesanais brasileiros, como o queijo coalho de
Pernambuco. O presente trabalho teve como objetivo elaborar leites fermentados a
partir de bactrias produtoras de cido lctico isoladas de queijo coalho produzido em
Pernambuco, Brasil; avaliar a habilidade de bactrias produtoras de cido lctico,
Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus fermentum fermentarem isoladamente o leite e
resultar em produtos finais com caractersticas sensoriais distintas; e avaliar a
viabilidade dessas bactrias, bem como as caractersticas fsico-qumicas,
microbiolgicas e sensoriais dos leites fermentados durante 45 dias de estocagem sob
refrigerao a 8-10C. As curvas de fermentao obtidas a partir de valores de pH,
acidez titulvel (%) e enumerao dos microrganismos produtores de cido lctico,
indicaram valores mais altos de acidez titulvel e consequentemente valores mais baixos
de pH para Lactobacillus rhamnosus. Em relao s contagens de microrganismos
produtores de cido lctico, os dois leites fermentados apresentaram quantidades
adequadas de microrganismos viveis, acima de 108 UFC/g. Em relao s anlises
sensoriais, os leites fermentados com 15 dias apresentaram melhor aceitabilidade entre
os provadores, em relao queles analisados aos 60 dias de estocagem sob refrigerao
8-10C.

Palavras chaves: leites fermentados, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus

fermentum, probiticos potenciais

14
 ABSTRACT

In Brazil, as well as around the world, the consumer has been searching for foods that
meet nutritional features and bring benefits to health, and one alternative for fit those
requirements are the foods containing probiotics, mainly fermented milks. The Brazilian
production of fermented milks is based on the use of imported starter cultures, marketed
by foreign companies. However, there is great potential for the use of lactic acid
bacteria isolated from artisanal dairy products made in Brazil, as the coalho cheese
from Pernambuco. This study aimed to elaborate fermented milks from potentially
probiotic lactic acid bacteria isolated from that cheese; to evaluate the ability of
Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus fermentum, isolatedly, ferment milk and
result in final products with different sensory characteristics; to assess the viability of
those bacteria in the fermented milks, as well as analyze the physical-chemical,
microbiological, and sensory properties of them during storage for 45 or 60 days under
refrigeration at 8-10C. Fermentation profiles showed higher levels of acidity and lower
values of pH in milks fermented by Lactobacillus rhamnosus. Both two fermented
milks presented adequate quantities of viable micro-organisms, above 108CFU/g
throughout the analyzed period. Regarding the sensory analysis, fermented milk
analyzed at 15 days showed better acceptability of the panelists than at 60 days.

Key-words: fermented milks, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum,

potentially probiotics

15
1. INTRODUO
Atualmente, o consumidor brasileiro
encontra sua disposio, nas
prateleiras dos supermercados, uma
grande variedade de leites fermentados.
Essa tendncia est associada com a
conscincia de que o consumo desses
alimentos traz benefcios sade.
Consequentemente, as indstrias, de um
modo geral, tm investido na produo
desse derivado do leite.
Oliveira et al. (2009) citam que,
atualmente, os consumidores brasileiros
esto buscando alimentos com mais
sabor e aroma agradveis, de baixo
valor calrico ou baixo contedo de
gordura, e com efeitos benficos para a
sade.
Esses benefcios associados com o
consumo de leites fermentados so
relacionados capacidade probitica
que os mesmos contm. De um modo
geral, os leites fermentados contm
microrganismos considerados
probiticos, como Lactobacillus spp. As
principais espcies de Lactobacillus que
so utilizadas nos leites fermentados
brasileiros so Lactobacillus casei,
Lactobacillus paracasei, Lactobacillus
bulgaricus e Lactobacillus acidophilus.
Alm de Lactobacillus spp.,
Streptococcus thermophilus,
Lactococcus lactis e Bifidobacterium
spp. tambm so empregados (Botelho,
2005).
A palavra probitico de origem grega
e tem como significado em favor da
vida (pr favor; bio vida).
Originalmente, a proposta, que foi
idealizada para microrganismos
probiticos era descrever compostos
produzidos por um protozorio que
estimulava o crescimento de outros
organismos (Lilley & Stillwell, 1965
citados por Gomes & Malcata, 1999).
Fuller (1989), aps revisar sobre o
assunto, definiu probiticos como
suplementos alimentares na forma de
microrganismos vivos que tm um
efeito benfico na sade dos
consumidores, por manter o equilbrio
da microbiota intestinal. Com o passar
do tempo e a execuo de pesquisas,
vrias definies para probiticos foram
idealizadas e, atualmente, a mais aceita
a que probiticos so microrganismos
vivos administrados em quantidades
suficientes para conferir efeito benfico
sade do hospedeiro (JOINT
FAO/WHO, 2002).
Atualmente, tm-se diversos estudos
mostrando os efeitos benficos de leites
fermentados contendo microrganismos
probiticos, dentre eles, a reduo da
diarreia infantil, reduo da
concentrao de colesterol no sangue e
estimulo ao sistema imunolgico
(Komatsu et al., 2008). Alm desses
benefcios, podem-se destacar efeitos
benficos no intestino, como por
exemplo, ao antibacteriana, com
possvel proteo contra gastrenterites,
contribuindo para o bom funcionamento
intestinal e uma potencial atividade
antitumoral (Gomes & Malcata, 1999).
Nas ltimas duas dcadas, o interesse na
manipulao da microbiota intestinal
vem crescendo, principalmente quando
se trata da preveno de enfermidades.
Com isso, o uso de microrganismos
produtores de cido lctico, entre os
quais esto includas a grande maioria
16
das bactrias potencialmente
probiticas, tem sido muito difundido,
com diversas aplicaes nutricionais e
mdicas em todo o mundo (Lara-
Villoslada, 2009).
O grupo Lactobacillus composto por
bactrias Gram-positivo, em forma de
bastonetes (bacilos), catalase-negativo.
Em alimentos, em geral, so
microaerfilos, mas tambm inclui
espcies anaerbicas, como no trato
gastrintestinal de humanos e animais
(Jay, 1996).
Os leites fermentados contm bactrias
do gnero Lactobacillus spp.,
principalmente do grupo Lactobacillus
casei, do qual faz parte o Lactobacillus
rhamnosus. Buriti & Saad (2007)
relataram que, desde aproximadamente
1930, h leites fermentados contendo
Lactobacillus casei.
Lactobacillus fermentum a principal
espcie de Lactobacillus
obrigatoriamente heterofermentativo
presente no trato digestivo humano, e
tambm empregado na indstria de
laticnios como cultura iniciadora (Fons
et al., 1997 e Dickson et al., 2005).
Leites fermentados contendo
Lactobacillus rhamnosus e como Lactobacillus fermentum e
Lactobacillus fermentum no so
comuns no Brasil, como j mencionado,
mas na Europa h leites fermentados
com essas bactrias produtoras de cido
lctico.
A utilizao de novas culturas lcticas
potencialmente probiticas, como
Lactobacillus fermentum e realizao deste trabalho.
Lactobacillus rhamnosus, em conjunto
com o desenvolvimento contnuo de
novas tecnologias de produo de leites
fermentados, podem ocasionar, para as
indstrias, aumento de rendimento e
lanamento de novos produtos
fermentados produzidos a partir de
bactrias produtoras de cido lctico
isoladas de produtos lcteos artesanais
brasileiros, tendo em vista que a
produo de leites fermentados no
Brasil baseia-se na fermentao a partir
de microrganismos iniciadores
comercializados por empresas
estrangeiras. Desta forma, o
desenvolvimento de leites fermentados
a partir dessas bactrias testadas quanto
s propriedades probiticas, e a
avaliao de suas caractersticas fsico-
qumicas e microbiolgicas e seus perfis
sensoriais pode viabilizar registros de
patentes, alm de estimular a elaborao
de produtos lcteos (Guedes Neto,
2004).
Neste trabalho, as espcies de
Lactobacillus utilizadas foram
Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, os quais,
segundo Gardiner et al. (2002), so
agentes probiticos capazes de auxiliar
no tratamento de infeces urogenitais
em mulheres, alm de outras funes.
Portanto, a utilizao de novas culturas
lcticas com potencial probiticas,
Lactobacillus rhamnosus, aliada ao
desenvolvimento de novas tecnologias
de produo dos leites fermentados
podem propiciar aumento de
rendimento para as indstrias e
lanamento de produtos fermentados
brasileiros, com maior potencial
funcional, sendo por isso justificada a
17
2. OBJETIVOS 3. HIPTESES

Os objetivos deste trabalho foram: Para a realizao deste trabalho foram

levantadas hipteses, as quais esto
Elaborar leites fermentados a descritas a seguir:
partir de bactrias produtoras de
cido lctico, isoladas de queijo Bactrias produtoras de cido
coalho produzido em lctico isoladas de queijo de
Pernambuco, Brasil. coalho poderiam ser utilizadas
isoladamente ou em associao
Avaliar a habilidade de bactrias na elaborao de leites
produtoras de cido lctico fermentados, resultando em
(Lactobacillus rhamnosus e produtos com diferentes
Lactobacillus fermentum) em caractersticas sensoriais.
fermentar o leite e resultar em
produtos finais com Os leites fermentados
caractersticas sensoriais produzidos a partir de
distintas. Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum
Avaliar a viabilidade de possuiriam caractersticas fsico-
bactrias produtoras de cido qumicas e microbiolgicas
lctico (Lactobacillus compatveis com os padres
rhamnosus e Lactobacillus brasileiros, incluindo a
fermentum), bem como as viabilidade de bactrias
caractersticas fsico-qumicas e probiticas, durante todo o
microbiolgicas durante 45 dias perodo de estocagem.
de estocagem sob refrigerao e
o perfil sensorial dos leites Leites fermentados por
fermentados durante 60 dias de Lactobacillus rhamnosus e
estocagem sob refrigerao. Lactobacillus fermentum
apresentariam caractersticas
sensoriais distintas entre si.

18
4. REVISO DE LITERATURA era de forma espontnea, ou seja, a
fermentao era realizada por
4.1. Leites fermentados microrganismos que j estavam
presentes no local. O uso de culturas
4.1.1. Histrico iniciadoras ficou mais conhecido e
difundido a partir da metade do sculo
Leites fermentados so produtos XX (Mongensen et al., 2003).
resultantes do crescimento seletivo de
bactrias especficas em leite. Estes Atualmente, os leites fermentados so
produtos esto presentes no mundo h produzidos em condies controladas
milhares de anos e acredita-se que os com culturas iniciadoras especficas. As
mesmos tenham surgido na rea que razes para fermentar leites so diversas
atualmente corresponde ao Oriente e a principal funo de aumentar a
Mdio. Isso foi em decorrncia, vida de prateleira, ou prazo de validade,
provavelmente, da necessidade de se alm das outras funes como: melhorar
conservar o leite por mais tempo na a textura do leite, reforar a
ausncia de refrigerao (Kosikowski, digestibilidade do produto e produo
1977). de outros produtos, como iogurte e
queijos (Robinson & Tamine, 2006).
Os leites fermentados no possuem uma
data de origem definida, pois h muito 4.1.2. Legislao brasileira
tempo so produzidos, mesmo que de
forma emprica. Na prpria Bblia, h Leites fermentados so definidos
indcios de que Abrao consumia este (Brasil, 2007) como os produtos
tipo de alimento, pois sua longevidade adicionados ou no de outras
era atribuda a um leite mgico, que substncias alimentcias, obtidas por
curava doenas (Robinson, 1991). coagulao e diminuio do pH do leite,
ou leite reconstitudo, adicionado ou
No comeo do sculo XX, a partir de no de produtos lcteos, por
estudos de Elia Metchnikoff (1845- fermentao lctica mediante ao de
1916), na Frana Instituto Pasteur, cultivos de microrganismos especficos.
houve uma associao da produo de Esses microrganismos devem ser
leites fermentados com o metabolismo viveis, ativos e abundantes no produto
de microrganismos lcteos. A partir final durante seu prazo de validade,
disso, ocorreu o isolamento e a segundo o Regulamento Tcnico de
caracterizao de vrias culturas Identidade e Qualidade de Leites
lcticas, assim como o processo Fermentados.
fermentativo comeou a ser controlado
e padronizado pelas indstrias O Regulamento Tcnico de Identidade e
(Robinson, 1991). Qualidade de Leites Fermentados inclui
na categoria de leites fermentados os
A tecnologia da produo de leites seguintes produtos: o iogurte, o leite
fermentados conhecida desde os fermentado ou cultivado, o leite
tempos mais remotos em vrias partes acidfilo ou acidofilado, o kefir, o
do mundo. Inicialmente, sua produo kumys e a coalhada (Brasil, 2007).

19
Os ingredientes obrigatrios para a mel, coco, cereais, vegetais, frutas
produo de leites fermentados so o secas, chocolate, especiarias, caf e
leite e/ou leite reconstitudo outras, ss ou combinadas.
padronizado em seu contedo de Adicionalmente, podem ser
gordura e o cultivo de bactrias lcticas incorporados acares e/ou glicdios
especficas ou no, dentre as quais (exceto polialcois e polissacardeos);
podem ser utilizadas: Lactobacillus cultivos de bactrias lcticas
acidophilus, Lactobacillus casei, subsidirias e amidos ou amidos
Streptococcus salivarius ssp. modificados em uma proporo mxima
thermophilus. Os ingredientes opcionais de 1% (m/m) do produto final. Os
so leite concentrado, creme, manteiga, ingredientes opcionais no lcteos, ss
gordura anidra de leite ou butter oil, ou combinados, devero estar presentes
leite em p, caseinatos alimentcios, em uma proporo mxima de 30%
protenas lcteas, outros slidos de (m/m) do produto final (Brasil, 2007).
origem lctea, soros lcteos,
concentrados de soros lcteos, frutas em Os requisitos fsico-qumicos e
forma de pedaos, polpa(s), suco(s) e microbiolgicos para o controle de
outros preparados base de frutas, qualidade de leites fermentados,
maltodextrinas, alm de outras segundo a legislao brasileira (Brasil,
substncias alimentcias, tais como: 2007), encontram-se no Quadro 1 e 2.

Quadro 1: Requisitos fsico-qumicos oficiais para inspeo de leites fermentados no

Brasil

Acidez (g de cido Protenas

Matria gorda lctea (g/100g)
ltico/100g) Norma lcteas
Norma FIL 116 A:1987
FIL 150:1991 (g/100g)
Com Parcialmente
Integral Desnatado
creme desnatado
Min. 6,0 3,0 a 5,9 0,6 a 2,9 0,6 a 2,0 Min. 2,9
Mx. 0,5
Fonte: Brasil (2007)

Quadro 2: Critrios microbiolgicos oficiais para inspeo de leites fermentados no

Brasil

Microrganismos Critrio de aceitao Norma

Coliformes/g (30C) n=5 c=2 m=10 M=100 FIL73A:1985
Coliformes/g (45C) n=5 c=2 m<3 M=10 APHA 1992c.24
Bolores e leveduras/g n=5 c=2 m=50 M=200 FIL94B:1990
Fonte: Brasil (2007)

20
As contagens mnimas de segundo a legislao brasileira, so
microrganismos especficos que devem apresentadas no Quadro 3.
estar presentes nos leites fermentados,

Quadro 3: Contagem de microrganismos especficos para inspeo de leites fermentados

no Brasil

Produto Contagem de bactrias Contagem de leveduras

lcticas totais (UFC/g) especficas (UFC/g)
Norma FIL 117A: 1988 Norma FIL 94 B: 1990
Iogurte mn. 107 (*) -
Leite fermentado ou mn.106(*) -
cultivado
Leite acidfilo ou mn. 107 -
acidofilado
Kefir mn. 107 mn. 104
Kumys mn. 107 mn. 104
Coalhada mn.106 -
(*) No caso em que se mencione o uso de bifidobactrias, a contagem ser no mnimo
106 bifidobactrias/g
Fonte: Brasil (2007)

4.2. Probiticos o uso de probiticos, recomendando a

4.2.1. Histrico
A utilizao de microrganismos que
trazem benefcios ao homem acontece
desde milhares de anos atrs, apesar de
serem usados empiricamente. Leveduras
e bactrias acidificantes faziam-se
presentes nos primeiros alimentos
fermentados, os quais j eram
mencionados no Antigo Testamento da
Bblia, em Gnesis 18:8, passagem na
qual h meno sobre o consumo de
queijos. Em 76 a.C. Plinius, historiador
romano recomendou o uso de produtos
lcteos fermentados para o tratamento
de gastrenterites (Kroeger et al., 1989 e
Robinson, 1991).
Em 1906, Tissier, um cientista francs,
forneceu importantes informaes sobre
crianas que estavam com diarreia o uso
de Bifidobacterium spp., alegando que
as mesmas iriam competir com os
microrganismos indesejveis presentes
no intestino, eliminando-os e
dominando a microbiota intestinal,
acabando assim com a diarreia
(Ballongue, 1993).
Com o passar do tempo, a tecnologia de
processamento de leites fermentados foi
melhorada e, a partir de estudos de Elia
Metchnikoff (1845-1916), em 1907,
evidenciou-se, pela primeira vez, uma
relao entre a fermentao do leite e o
papel das bactrias e leveduras
acidificantes (Jay, 1996). Essa relao
foi possvel com o estudo da
longevidade dos blgaros realizada por
Metchnikoff, a qual era relacionada com
o consumo de leites fermentados por
esse povo. Metchnikoff, em 1908, foi o
primeiro pesquisador a defender
publicamente o consumo de leites
fermentados, principalmente o iogurte,
como alimentos que ocasionam
benefcios sade (Robinson, 1991).
Estudos realizados na tribo Maasai
(frica) mostraram que os nativos
ingeriam grandes quantidades de carnes
vermelhas, mas que consumiam um
leite fermentado local, denominado kule
naoto em altas quantidades e quase no
possuam problemas de
hipercolesterolemia. O kule naoto um
leite fermentado por Lactobacillus
plantarum e Lactobacillus rhamnosus.
Isso pode ser explicado pelo fato de que
essas bactrias possuem a capacidade de
desconjugar sais biliares no intestino,
evitando sua absoro e utilizao para
sntese de novo de colesterol (Jay,
1996).
4.2.2. Definies
Data-se 1960, a utilizao pela primeira
vez do termo probitico, por Richard
Parker, tendo como significado a favor
da vida, ressaltando que probitico
uma palavra de origem grega.
Logo aps essa definio, Lilley e
Stiwell, em 1965, utilizaram esse
mesmo termo para designar substncias
secretadas por microrganismos que
estimulam o crescimento de outro.
Posteriormente, Fuller (1989)
modificou tal conceito e introduziu uma
nova definio, caracterizando
probitico como suplemento alimentar
composto por microrganismos vivos
capazes de beneficiar o hospedeiro pelo
equilbrio da microbiota intestinal.
Em 1998 o Instituto Internacional de
Cincia da Vida (International Life
Science Institute), incluiu no conceito
de probiticos os termos sade e bem
estar, servindo como base para o
conceito de Salminem (1999), o qual
definiu probiticos como preparados de
microrganismos, ou seus constituintes,
que tm efeito benfico sobre a sade e
o bem estar do hospedeiro.
Atualmente, o conceito de probiticos
mais utilizado o designado por uma
cpula de pesquisadores da Organizao
de Agricultura e Alimentos e da
Organizao Mundial de Sade o
seguinte: probiticos so
microrganismos vivos administrados em
quantidades suficientes para conferir
efeito benfico sade do hospedeiro
(JOINT FAO/WHO, 2002).
Fuller (1989) apontou que os
microrganismos probiticos so
basicamente bactrias produtoras de
cido lctico, entre as quais se destacam
espcies de Lactobacillus,
Bifidobacterium, Lactococcus e
Streptococcus.
4.2.3. Leites fermentados probiticos
Segundo Fuller (1989), os probiticos
presentes no mercado contm
microrganismos dos gneros
Lactobacillus e Streptococcus,
principalmente Streptococcus
thermophilus, em sua maioria. Alguns
contm bifidobactrias, mas so poucos,
pois como so bactrias anaerbicas,
deve-se criar uma condio total de
anaerobiose para garantir o seu
crescimento, uma vez que qualquer
contato com o oxignio, estes no
sobrevivem. A justificativa do uso de
22
Lactobacillus devido ao fato de que os possua caractersticas importantes, entre
mesmos colonizam a microbiota do as quais se destacam: serem produzidos
organismo humano aps o nascimento, em larga escala, permanecerem estveis
em grande quantidade, e quando ocorre e viveis durante a estocagem; serem
o aumento da sua concentrao, ocorre capazes de resistir s condies
o decrscimo da concentrao de outros adversas do trato gastrintestinal e nele
microrganismos patognicos ou sobreviver; produzir efeito benfico ao
deteriorantes. hospedeiro; reduzir a adeso de
patgenos; modular a atividade
Kurmann e Rassic (1991), Gomes e imunolgica e a produo de toxinas e
Malcata (1999) e Lourens-Hatting e no ser patognico (JOINT FAO/WHO,
Viljoen (2001) enfatizaram que os 2002).
fabricantes de leites fermentados devem
observar se os produtos contm o Fuller (1989) relatou que o modo de
nmero satisfatrio de microrganismos ao de microrganismos probiticos
viveis para serem denominados ocorre de forma que o consumo de
probiticos. Esse nmero no mnimo alimentos contendo a concentrao
106 UFC/mL, devido dose teraputica adequada dos mesmos vai resultar na
ser de 108 a 109 clulas viveis em 100g produo de componentes
de produto. antimicrobianos e competio por
nutrientes, competio por stios de
A viabilidade dos microrganismos adeso; alm disso, eles alteram o
probiticos em leites fermentados pode metabolismo microbiolgico, ou
ser afetada durante as etapas de aumentando ou diminuindo a atividade
distribuio do produto (tanto da enzimtica (isso depende do que
indstria para o mercado quanto do melhor para o hospedeiro); e tambm
mercado para a casa do consumidor) estimulam a atividade imune.
devido exposio a diferentes fatores,
como aumento da acidez, Os benefcios ocasionados pelo
presena/ausncia de oxignio consumo de alimentos contendo
(dependendo do tipo de microrganismos probiticos so muitos,
microrganismo), presena de podendo ser citados reduo da diarreia
componentes antimicrobianos e infantil, preveno a diarreia do
temperatura de armazenamento. Alm viajante, reduo da concentrao de
disso, os microrganismos probiticos colesterol no sangue e estmulo ao
so muito susceptveis a condies no sistema imunolgico (Komatsu et al.,
ambiente em que esto crescendo, como 2008). Alm desses benefcios, podem-
acidez e altas temperaturas (Vasiljevic se destacar efeitos benficos no
& Shah, 2008). intestino, como por exemplo, ao
antibacteriana, com possvel proteo
4.2.4. Efeitos benficos contra gastrenterites e uma atividade
antitumor potencial (Gomes & Malcata,
Para que um microrganismo seja 1999). Outros benefcios que so
selecionado e utilizado em produtos destacados por Fuller (1989) so alivio
probiticos, necessrio que o mesmo

23
da intolerncia lactose e da
constipao.
OSullivan et al. (1992) citaram que a
colonizao do trato gastrintestinal
humano sofre a interferncia de trs
tipos de fatores, a saber: fatores
microbiolgicos, ambientais e peristaltismo
relacionados aos hospedeiros. Os
fatores microbiolgicos incluem
interaes bacterianas (antagonismo e
simbiose) e exigncias do
microrganismo (requisitos de
crescimento, propriedades de adeso).
Quadro 4: Principais efeitos benficos do consumo de leites fermentados contendo
microrganismos probiticos e seus mecanismos
Efeito benfico
Alvio na intolerncia da lactose
Preveno e reduo dos sintomas da
diarreia causada por antibiticos e/ou
vrus
Reduo de risco associado a agentes
carcinognicos
Efeito de hipercolesterolemia
Inibio da Helicobacter pylori e
patgenos intestinais
Estmulo ao sistema imune
Fonte: Adaptado de Vasiljevic e Shah, 2008
4.3. O gnero Lactobacillus
O gnero Lactobacillus engloba
bactrias de muito interesse prtico e
cientfico. Bactrias produtoras de cido
lctico vm sendo usadas na preparao
Os fatores ambientais incluem
alimentao do hospedeiro e remdios
ingeridos pelo mesmo. Os fatores
relacionados ao hospedeiro incluem a
produo de cidos (clordrico, lctico e
cidos graxos), enzimas (gstricas,
pancreticas e epiteliais) e sais biliares;
e mecanismos de
imunidade.
Os principais benefcios do consumo de
leites fermentados que veiculam
microrganismos probiticos esto
resumidos no Quadro 4.
Mecanismo
Transporta -galactosidase para o trato
gastrintestinal humano.
Excluso competitiva;
aumento da resposta imune.
Alterao da microbiota intestinal;
alterao do metabolismo ativo intestinal,
aumentando a imunidade intestinal.
Desconjugao de sais bibliares.
Excluso competitiva;
efeito de barreira;
produo de compostos antimicrobianos.
Regulao da atividade de fagocitose;
reconhecimento pelos receptores toll-like
(TLR): regulao de citocinas pr-
inflamatrias e quimiocinas.
de vrios tipos de alimentos para
homens e animais desde os tempos mais
remotos (Bottazzi, 1998).
Lactobacillus ssp. inclui bactrias
produtoras de cido lctico que esto
24
presentes em vrios hbitats, sendo
bastante difundidas no ambiente (no
solo e na gua), presentes em alimentos
e tambm no organismo de animais e
humanos. Nestes, fazem parte da
microbiota indgena da cavidade oral,
do trato gastrintestinal e do trato genital
feminino (Lee & Salminem, 1995,
Gomes & Malcata, 1999 e Coudeyras et
al., 2008).
Segundo Bergeys Manual of
Determinative Bacteriology (Sneath et
al., 1996), as clulas de Lactobacillus
possuem formato de basto e possuem
tamanho regular. Sua temperatura tima
de crescimento est em torno de 30 a
40C. Esse gnero compreende um
grupo heterogneo de bastonetes Gram-
positivo, catalase-negativo, no
formadores de esporos, que so
componentes da microbiota indgena
intestinal de homens e outros animais,
alm de serem importantes bactrias
produtoras de cido lctico (Hammes &
Vogel, 1995 e Rush et al., 1997).
Em geral, Lactobacillus no esto
envolvidos em infeces gstricas e
intestinais, no sendo organismos
patognicos; sendo consideradas as
bactrias produtoras de cido lctico
mais importantes dentro do grupo
GRAS (Geralmente Reconhecido como
Seguro Generally Recognized as
Safe), com grande importncia
industrial (Lee & Salminem, 1995;
Gomes & Malcata, 1999 e Singh et al,
2009).
Em alimentos, a maioria dos
Lactobacillus tipicamente
microaerfila, mas h espcies
anaerbias facultativas, principalmente
nos organismos de humanos (Jay,
1996).
Axelsson (2004) relatou que h mais de
oitenta espcies identificadas e
reconhecidas de Lactobacillus, j
desconsiderando as cinco espcies que
foram reclassificadas como pertencentes
ao gnero Weissella. Essa classificao
s foi possvel devido ao avano das
tcnicas de biologia molecular.
De acordo com Hammes e Vogel
(1995), Jay (1996), Buriti e Saad (2007)
e Bernardeu et al. (2008), os
Lactobacillus so classificados em trs
grupos, baseado em suas caractersticas
fermentativas:
- homofermentativos obrigatrios:
convertem hexoses em cido lctico via
Embdem-Meyerhof Parnas, sendo
incapazes de utilizar as pentoses, como
por exemplo, Lactobacillus acidophilus
e Lactobacillus salivarius;
- heterofermentativos facultativos:
fermentam hexoses em cido lctico e,
no caso de algumas espcies e sob
certas condies, em cidos lctico,
actico, frmico e etanol, sendo capazes
de fermentar pentoses em cidos lctico
e cetico, por exemplo, o grupo grupo
Lactobacillus casei no qual est
includo o Lactobacillus rhamnosus,
objeto deste estudo;
- heterofermentativos obrigatrios:
utilizam hexoses para obter cidos
lctico e actico, etanol e dixido de
carbono, e pentoses para obter cidos
lctico e actico; como, o Lactobacillus
fermentum objeto deste estudo.
O grande nmero de espcies neste
gnero e suas similaridades fenotpicas
fizeram com que ocorressem algumas
vezes erros de identificao. Para evitar
25
esses problemas, vrias formas de contm ramnose, e uma das poucas
identificao foram propostas como, por espcies capazes de ferment-la (Klein
exemplo, baseadas em caractersticas et al., 1998).
bioqumicas e fisiolgicas, alm da
identificao molecular comparando a Collins et al. (1989) descreveram
sequncia 16S do rRNA (Hammes & Lactobacillus rhamnosus como
Vogel, 1995). microrganismos com clulas em forma
de bastonetes, que podem ocorrer em
4.3.1. Lactobacillus rhamnosus cadeias ou isolados,
heterofermentativos facultativos e
Lactobacillus rhamnosus faz parte do produtores de cido lctico, ou seja,
grupo Lactobacillus casei, o qual possuem capacidade de fermentar o
tambm compreende Lactobacillus leite.
casei e Lactobacillus paracasei. O
grupo Lactobacillus casei possui grande Amostras de Lactobacillus rhamnosus
relevncia na indstria farmacutica e possuem efeitos protetores
alimentcia, pelo fato de promoverem a comprovados contra infeces por
sade humana. So encontrados em Escherichia coli (Saito, Watanabe &
produtos alimentcios, mas tambm Tado, 1980). Alm disso, o
fazem parte da microbiota humana, Lactobacillus rhamnosus quando
presentes no trato gastrintestinal, boca e ingerido em concentraes adequadas,
vagina (Klein et al., 1998; Buriti & promove benefcios sade da mulher,
Saad, 2007). pois a vagina tem o mesmo em sua
microbiota atuando no combate aos
A diferenciao entre as espcies do microrganismos patognicos, como por
grupo Lactobacillus casei no pode ser exemplo Escherichia coli e Gadnerella
apenas por perfis fermentativos, pois as vaginalis. (Reid et al, 2003).
trs espcies apresentam perfis muito
similares; a mesma pode ser realizada No Quadro 5 esto apresentadas as
por Reao de Polimerase em Cadeia principais linhagens de Lactobacillus
(PCR) (Ward & Timmins, 1999). A rhamnosus utilizadas em alimentos,
identificao de Lactobacillus com benefcios comprovados
rhamnosus ocorreu por identificao cientificamente.
baseada no sistema DNA-DNA, e foi
uma identificao fcil, pois sua clula

26
Quadro 5: Linhagens de Lactobacillus rhamnosus utilizadas na fermentao de
alimentos e seus respectivos benefcios sade humana

Linhagem Produtor Origem Benefcios

L. rhamnosus Valio, Intestino Coloniza temporariamente o intestino,
GG (ATCC Finlndia reduz a diarreia por antibiticos em
3103) crianas, imunomodulao, reduo de
enzimas procarcinognicas
L. rhamnosus Urex Urogenital Restaura a microbiota urogenital,
GR-1 Biotech, reduzindo riscos na UTI e evitando
Canad/ infeces por bactrias e leveduras na
Chr vagina; adere s clulas uroepiteliais
Hansen, inibindo o crescimento e adeso de
Dinamarca uropatgenos.
L. rhamnosus Danisco, - Aumenta a imunidade de idosos
DR20/HN0001 Dinamarca
com B. lactis
DR10
L. rhamnosus Chr - Melhora a sade intestinal e a sade
GR-1 com L. Hansen, urogenital feminina
reuteri RC-14 Dinamarca
Fonte: adapatado de Saarela et al., 2000 e Yeung et al., 2002.

4.3.2. Lactobacillus fermentum Bao et al. (2010) verificaram o

A primeira descrio de Lactobacillus
fermentum realizada por Beijerink em
1901, como uma espcie
heterofermentativa de Lactobacillus que
pode ser isolado de produtos lcteos,
pes, material de fermentao de
plantas, boca e fezes de humanos
(Hammes & Vogel, 1995; Dellaglio,
Torriani & Felis, 2004).
Grande quantidade de Lactobacillus
fermentum isolada de leites
fermentados tradicionais, como por
exemplo, leites fermentados da China,
do Tibete, da Monglia e do Sudo
(Abdelgadir et al., 2001 e Bao et al.,
2010).
potencial probitico in vitro de
Lactobacillus fermentum isolados de
leites fermentados tradicionais, mas
seriam necessrias pesquisas in vivo.
Estes testes in vitro compreendem
tolerncia a condies de baixo pH, ao
transito intestinal, bile; alm da
atividade de agregao, como por
exemplo, habilidade de combater
agentes patognicos, de instalar na
microbiota transitria e atividade
antibacteriana.
Fons et al. (1997) descreveram que
Lactobacillus fermentum so as
principais espcies de Lactobacillus
spp. heterofermentativos existentes no
intestino humano.

27
Martn et al. (2005) descreveram que
amostras de Lactobacillus fermentum
foram isoladas de leite humano e
possuam propriedades probiticas,
como sobrevivncia no trato
gastrintestinal, adeso s clulas
intestinais e atividade antimicrobiana.
Pereira et al. (2003) relataram que
espcies de Lactobacillus fermentum
so microrganismos normalmente
presentes na microbiota humana, com
habilidade de aderir clulas epiteliais.
Segundo Morita et al. (1997),
Lactobacillus fermentum uma das
mais importantes bactrias produtoras
de cido lctico presentes na microbiota
do intestino humano, trazendo
benefcios ao hospedeiro. Alm disso,
um dos microrganismos predominantes
no intestino humano e na vagina,
atuando tambm como regulador da
microbiota (Reid et al., 2003; Park et
al., 2005).
No Quadro 6 esto apresentadas as
principais linhagens de Lactobacillus
fermentum utilizadas em alimentos, com
benefcios comprovados
cientificamente.

Quadro 6: Linhagens de Lactobacillus fermentum utilizadas na fermentao de

alimentos e seus respectivos benefcios sade humana

Linhagem Produtor Origem Benefcios

L. fermentum Urex Biotech, Urogenital Restaura a microbiota urogenital
RC-14 Canad/ Chr
Hansen,
Dinamarca
L. fermentum Universidade de TGI Aumenta a imunidade contra
737/ 104R Gteborg, Sucia Animal colonizao de patgenos no TGI;
coloniza o intestino por diversas
semanas
Fonte: Adapatado de Saarela et al., 2000 e Yeung et al., 2002.

5. MATERIAL E MTODOS 5.1. Delineamento experimental

O experimento foi realizado nos Foram elaborados dois tipos de leites

Laboratrios do Departamento de
Tecnologia e Inspeo de Produtos de
Origem Animal (DTIPOA) da Escola de
Veterinria (EV) da Universidade
Federal de Minas Gerais (UFMG),
durante o perodo de julho a dezembro
de 2010. Os Laboratrios que foram
utilizados so: laboratrio de anlises
fsico-qumicas, laboratrio de anlises
microbiolgicas e laboratrio de anlise
sensorial.
fermentados, um contendo apenas a
cultura de Lactobacillus rhamnosus e
um segundo contendo Lactobacillus
fermentum.
Aps a produo, os leites fermentados
foram estocados sob refrigerao entre
8 a 10C e submetidos s anlises
fsico-qumicas e microbiolgicas com
1, 15, 30 e 45 dias de estocagem. Dessa
forma, a pesquisa teve um delineamento
fatorial 2x4 (dois tipos de leites

28
fermentados e quatro tempos de
anlise). Os produtos elaborados
tambm foram submetidos anlise
sensorial aos 15 e 60 dias de estocagem
entre 8 e 10C; neste caso, com um
delineamento 2x2 (dois tipos de leites
fermentados e dois momentos de
anlise).
5.2. Controle de qualidade do leite em
p desnatado
A utilizao do leite em p desnatado
pode ser justificada pela associao da
imagem positiva da ingesto de leite
desnatado com as caractersticas
probiticas das culturas utilizadas.
O objetivo da verificao da qualidade
microbiolgica e fsico-qumica dos
lotes de leite em p foi caracterizar o
leite utilizado e garantir,
consequentemente, o controle de
qualidade da produo dos leites
fermentados. Foram utilizados trs lotes
de leite em p desnatado da marca
Molico (Nestl, Araatuba, So Paulo,
Brasil). Todas as anlises foram
realizadas em duplicata.
Para o controle microbiolgico foram
realizadas as anlises de contagem
global de microrganismos mesfilos
aerbios (UFC/ml), contagem global de
microrganismos termodricos
(UFC/ml), pesquisas de coliformes
totais e fecais (NMP/ml),
Staphylococcus spp. e Salmonella spp.
recomendadas pelo Regulamento
Tcnico de Identidade e Qualidade
(RTIQ) de leite em p (Brasil, 1996),
alm da contagem de bolores e
leveduras. Todos os procedimentos
seguiram a metodologia descrita em
Mtodos Analticos Oficiais para
Anlises Microbiolgicas para Controle
de Produtos de Origem Animal e gua
(Brasil, 2003). Para o controle fsico-
qumico, foram feitas as seguintes
anlises: determinaes de pH, acidez
titulvel; e teores percentuais de
gordura, protena, extrato seco total,
extrato seco desengordurado (Brasil,
2006).
5.3 Controle de qualidade do leite em
p desnatado reconstitudo e tratado
termicamente
A reconstituio do leite em p foi
realizada a 10% em gua destilada,
adicionado de sacarose a 8%. Aps
reconstituio o leite foi submetido a
um tratamento trmico a 110C por 10
minutos. Em seguida, foi feito o
plaqueamento em meio MRS
(Acumedia, Lansing, Michigan, United
States), em duplicata, da diluio 100
deste leite em p desnatado
reconstitudo a 10% e adicionado de 8%
de sacarose e tratado termicamente.
5.4. Microrganismos
Foram utilizadas duas amostras de
bactrias produtoras de cido lctico:
Lactobacillus fermentum e
Lactobacillus rhamnosus, isoladas
previamente de queijos de coalho
artesanal e industrializado, produzido
em Pernambuco, Brasil, identificadas
por anlise de restrio enzimtica de
DNA ribossomal e avaliadas quanto a
propriedades probiticas (sensibilidade
a antimicrobianos e atividade
antagonista in vitro) (Guedes Neto,
2004).
Para garantir que as culturas avaliadas
estariam puras, foi realizado o teste de
29
Gram para ambos, e os resultados
podem ser vistos nos anexos 1 e 2,
sendo o primeiro o Lactobacillus
rhamnosus e o segundo o Lactobacillus
fermentum.
5.5. Curvas de fermentao/
crescimento
A curva de fermentao foi obtida por
meio das determinaes do pH, da
acidez titulvel e da enumerao de
bactrias produtoras de cido lctico
(UFC/ml) em meio gar MRS
(Acumedia, Lansing, Michigan, United
States) nos intervalos de tempo de 2
horas desde o tempo zero (adio do
inculo) at a coagulao dos leites
desnatados adicionados de
Lactobacillus fermentum (leite LF) e
Lactobacillus rhamnosus (leite LR).
O tempo de fermentao tambm foi
determinado durante a curva de
fermentao, sendo que o momento
inicial foi a adio do inculo ao leite e
como momento final a formao do
cogulo.
5.6. Preparo dos leites fermentados
Para a elaborao dos leites
fermentados, 100 L das culturas
congeladas de Lactobacillus fermentum
e Lactobacillus rhamnosus foram
transferidos para tubos de ensaio com
tampa contendo 5mL de Caldo MRS
(Difco, Detroit, Michigan, United
States). Estes tubos contendo as culturas
de Lactobacillus fermentum (Anexo 3) e
Lactobacillus rhamnosus (Anexo 4)
foram incubados a 37C 2C por 24
horas, sendo esse procedimento repetido
trs vezes para garantir a ativao das
culturas.
Aps a ativao, 3% de cada cultura
foram inoculados em recipientes
contendo leite desnatado reconstitudo a
10%, acrescido de sacarose a 8%,
tratado termicamente a 110C por 10
minutos e resfriado a 37C. Esses
recipientes contendo leite, sacarose e
adicionados de Lactobacillus fermentum
e Lactobacillus rhamnosus foram
incubados a 37C 2C pelo tempo
necessrio at a coagulao do leite
(Anexo 5 e Anexo 6).
Esses dois produtos fermentados
constituram de inculo para a
elaborao dos respectivos leites
fermentados. Os inculos foram
adicionados em concentrao igual a
3% em recipientes de 200 ml e 500 ml
contendo o leite em p reconstitudo a
10%, adicionado de sacarose a 8%,
tratado termicamente a 110C por 10
minutos e resfriado a 37C. Os leites
adicionados com os inculos foram
incubados a 37C 2C at a
coagulao. Ao trmino da coagulao
os recipientes foram armazenados sob
refrigerao entre 8 e 10C. Os
recipientes menores foram utilizados
para anlises microbiolgicas e fsico-
qumicas e os maiores para as anlises
sensoriais, permitindo, assim, que
contedos de cada frasco fossem
utilizados apenas em seu momento de
anlise.
Esse processo foi feito para produzir
dois leites fermentados a partir das
culturas de Lactobacillus fermentum e
Lactobacillus rhamnosus.
30
5.7. Anlises laboratoriais dos leites
fermentados
5.7.1 Avaliao fsico-qumica dos leites
fermentados
As anlises foram realizadas nos dias 1,
15, 30 e 45 dias de estocagem dos leites
fermentados sob refrigerao a 8-10C
em refrigerador (Ormifrio Ltda GCI004,
Sabar, Minas Gerais, Brasil). A
determinao da acidez titulvel,
expressa em gramas de cido lctico por
100 gramas de produto, foi realizada de
acordo com a norma IDF (1991), de
acordo com o RTIQ de leites
fermentados (Brasil, 2007). A medida
de pH foi determinada por meio do
pHmetro digital de bancada (mPA-210,
Piracicaba, So Paulo, Brasil). O teor
percentual de gordura foi obtido pelo
mtodo de Gerber (Brasil, 2005). Os
teores percentuais de umidade e extrato
seco total (EST) foram determinados na
estufa (Biomatic, Porto Alegre, Rio
Grande do Sul, Brasil) e balana
(SHIMADZU AY220, So Paulo, SP,
37 Brasil) (Brasil, 2006). O teor
percentual de protenas foi determinado
pelo mtodo Micro-Kjedahl, no
equipamento TECNAL (TE012,
Piracicaba, So Paulo, Brasil), segundo
Brasil (2006).
5.7.2. Avaliao microbiolgica dos leites
fermentados
As anlises foram realizadas nos dias
um, 15, 30 e 45 dias de estocagem dos
leites fermentados sob refrigerao a 8
10C.
5.7.2.1. Enumerao dos microrganismos
produtores de cido lctico
As contagens dos microrganismos
foram realizadas a partir de diluies
decimais seriadas de 10-1 a 10-9 dos
leites fermentados produzidos, em
salina peptonada (0,85% de NaCl -
Labsynth, Diadema, So Paulo, Brasil -
e 0,1% de peptona bacteriolgica -
HiMedia, Mumbai, India).
Posteriormente, alquotas de 0,1ml das
diluies selecionadas foram espalhadas
sobre o gar MRS (Acumedia, Lasing,
Michigan, United States) e incubadas
sob aerobiose. A temperatura de
incubao para Lactobacillus
fermentum e para Lactobacillus
rhamnosus foi 37C 2C por 48 horas.
Em seguida, e esse perodo, a
enumerao dos microrganismos foi
feita por meio da contagem do nmero
de colnias formadas nas placas, sendo
este nmero multiplicado por 10 e
tambm pelo inverso da diluio
(adaptado de IDF, 1988).
5.7.2.2. Pesquisa de coliformes totais e
termotolerantes
As pesquisas de coliformes totais e
termotolerantes foram realizadas pelo
mtodo do Nmero Mais Provvel
(NMP) (Brasil, 2003). No teste
presuntivo, as diluies 100, 10-1 e 10-2
foram inoculadas em triplicata em tubos
contendo caldo Verde Brilhante
(HiMedia, Mumbai, India) e tubos de
Durhan invertidos. Estes tubos foram
incubados a 36C por 48 horas. A
identificao da presena de gs nos
tubos de Durhan indica resultado
positivo e por isso, requer a realizao
do teste confirmatrio em gar Levine
para coliformes totais (30C) (IDF,
31
1985) e caldo EC para coliformes fecais
(45) (Brasil, 2003).
5.7.2.3. Pesquisa de bolores e leveduras
A pesquisa de bolores e leveduras foi
feita de acordo com a Instruo
Normativa (IN) 62, Mtodos Analticos
Oficiais para Anlises Microbiolgicas
para Controle de Produtos de Origem
Animal (Brasil, 2003).
Em gar batata dextrose (Acumedia,
Lansing, Michigan, United States)
acidificado a pH 3,5, foram inoculados
0,1 ml das diluies 100, 10-1 e 10-2 e
espalhados com o auxilio de alas de
Drigalski.
As placas foram incubadas, sem
inverter, a 25C 1C (temperatura
ambiente), sem inverter por sete dias.
5.8. Avaliao sensorial dos leites
fermentados
A avaliao sensorial pode ser realizada
em diferentes situaes pelas empresas
ou rgos de pesquisa, dentre as quais
destacam a preferncia do consumidor,
classificao dos produtos, correlao inteira, ancorada nos extremos pelos
entre os resultados das anlises fsico-
qumicas e microbiolgicas e da
avaliao sensorial e no
desenvolvimento de novos produtos, o
qual a situao desta pesquisa
(Chaves, 1998).
A anlise sensorial foi realizada em dois
momentos, 15 e 60 dias de estocagem
dos leites fermentados a 8- 10C. Em
cada momento, foram analisados
sensorialmente dois produtos diferentes
(leites fermentados produzidos com as
duas culturas diferentes). A equipe
utilizada em cada momento de anlise
sensorial foi de provadores no
treinados, composta por 30 estudantes,
funcionrios e professores da Escola de
Veterinria da UFMG. Os provadores,
para realizar a avaliao sensorial,
deveriam possuir o hbito de consumir
leites fermentados, sendo potenciais
consumidores e compradores dos
produtos em teste.
A avaliao sensorial desta pesquisa foi
realizada com o objetivo de verificar a
aceitao dos consumidores em relao
ao produto desenvolvido, e se haveria
algum que seria mais aceito.
As amostras receberam codificaes
com sequencias aleatrias de trs
dgitos e servidas aos provadores em
cabines individuais, em pores de
20ml em copos descartveis de plstico
branco, a uma temperatura igual a 8-
10C. E as duas amostras foram
oferecidas simultaneamente ao
provador.
Os provadores receberam uma ficha
(Anexo 7) contendo uma escala no
estruturada formada por uma linha
nmeros 0 e 10 sobre a qual marcaram
um X, expressando o grau de aceitao
do produto. A interpretao destes
resultados foi realizada com uma rgua
de 10cm colocada sobre a linha para
quantificar o grau de aceitao
(Anzaldua-Morales, 1994). A ficha
tambm continha, alm disso, uma
escala hednica de cinco pontos, que
permitia que os provadores
qualificassem o quanto gostaram ou
desgostaram, em relao avaliao
global do produto. Foram atribudos
pontos para os graus de aceitao (1 =
32
Detestei, 2 = No gostei, 3 = No gostei
nem desgostei, 4 = Gostei, 5 = Adorei)
para que os dados fossem tratados
estatisticamente. Alm da ficha
recebiam tambm duas cpias do Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido
(Anexo 8), na qual assinavam as cpias
e ficavam com uma, para garantir que o
provador tomasse conhecimento da
pesquisa.
O teste de escala hednica um teste
afetivo, no qual a pessoa indica sua
aceitao em relao ao produto e, em Para a comparao de mdias dos
geral, realizado com potenciais
consumidores (Chaves, 1998).
Anzaldua-Morales (1994) define a
escala hednica como uma forma de
mensurar o nvel de satisfao do
consumidor em relao ao produto
avaliado, e a mesma pode ser de 3, 5 ou
9 pontos, sempre variando entre o
gostar e o no gostar, passando pelo no
gostei nem desgostei, em seu ponto
mdio. A escala hednica tambm pode
ser representada por meios grficos,
assim como nesta pesquisa.
A realizao das anlises sensoriais
deste trabalho foi aprovada no dia 02 de
junho de 2010 pelo Comit de tica em
Pesquisa (COEP) da UFMG, parecer
nmero ETIC 155-2010.
5.9. Anlise Estatstica
A anlise estatstica do experimento foi
o delineamento em blocos ao acaso com
arranjo em parcelas subdivididas, na
qual cada lote de leite em p desnatado
representou um bloco, os dois
tratamento (Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum) foram
considerados parcelas, sendo as
subparcelas os tempos (um, 15, 30 e 45
dias de estocagem sob refrigerao) em
que foram realizadas as anlises fsico-
qumicas e microbiologias e os dois
tempos das anlises sensoriais (15 e 60
dias de estocagem sob refrigerao).
Foram realizadas trs repeties do
experimento.
tratamentos, considerando a
enumerao de bactrias produtoras de
cido lctico (UFC/g) e anlises fsico-
qumicas utilizou-se a anlise estatstica
paramtrica e foi aplicado o teste de
Student-Newman-Keuls, em nvel de
significncia de 5% (Sampaio, 2002).
Os resultados da avaliao sensorial
foram submetidos s anlises
estatsticas no paramtricas, pelos
testes de Wilcoxon em nvel de
significncia de 5% (Sampaio, 2002).
6. RESULTADOS E DISCUSSO
6.1. Controle de qualidade do leite em
p desnatado
Os dados de acidez titulvel e da
composio fsico-qumica dos trs
lotes de leite em p desnatados
utilizados durante as trs repeties do
experimento esto apresentados na
Tabela 1.
33
Tabela 1: Teores percentuais mdios de acidez titulvel e componentes fsico-qumicos
dos trs lotes de leite em p desnatado
Parmetro (%) Lote 1
Gordura 0 0
Umidade 3,77
Protena 32,87
Extrato Seco Total 96,23
Acidez* 1,50
* g de cido lctico/100g
Os resultados encontrados para o teor
de gordura demonstram que todos os
trs lotes de leite em p encontram-se
dentro dos padres estabelecidos no
RTIQ de leite em p (Brasil, 1996),
tendo em vista que apresentaram
valores inferiores a 1,5%. A partir
destes resultados, tem-se a indicao de
que o processamento industrial e a
padronizao dos trs lotes de leite em
p foram realizados corretamente,
garantindo que os mesmos sejam
considerados ideais para a produo de
leites fermentados desnatados.
Como pode ser verificado na Tabela 1,
os resultados percentuais de umidade
tambm se encontram dentro dos
padres preconizados pela legislao
brasileira para leite em p (Brasil,
2006), a qual estabelece o limite de
4,0% de umidade. Apesar de o RTIQ de
leites fermentados no mencionar
diretamente os parmetros para Extrato
Seco Total (EST), o mesmo pode ser
discutido com base no parmetro de
umidade, tendo em vista que o teor
percentual de EST igual todos os
constituintes do alimento (representado
pelo nmero 100) exceto a umidade.
Portanto, para leite em p desnatado,
esse valor seria de no mnimo 96%.
Com base nessa hiptese, pode-se dizer
Lote 2 Lote 3
0
3,66 3,95
33,44 33,12
96,34 96,05
1,45 1,49
que o leite em p utilizado para a
formulao dos leites fermentados
estava de acordo com o RTIQ de leite
em p, pois todos os lotes analisados
apresentam valores de EST superiores a
96% (Brasil, 2006).
Em relao acidez titulvel, os valores
encontrados esto expressos de forma
diferente da estabelecida na legislao
brasileira (Brasil, 1996), devido
diferena de tcnicas utilizadas (Brasil,
2006). Apesar dessa diferena, todos os
leites apresentaram resultados dentro
dos padres, pois a legislao estabelece
que sejam utilizados no mximo 18ml
de NaOH 0,1N para cada 10 gramas de
amostra e, na anlise realizada, foram
utilizados no mximo 9 ml para cada 5
gramas de amostra.
Os parmetros de protena no podem
ser discutidos com base no RTIQ de
leite em p (Brasil, 1996), pois no
possuem padres estabelecidos.
Entretanto, os resultados desse
parmetro em conjunto com os demais
(extrato seco total, acidez titulvel,
umidade e gordura) proporciona a
verificao de que a composio fsico-
qumica dos trs lotes de leite em p
analisados semelhante, indicando
padronizao do leite em p desnatado
que foi utilizado no experimento. Uma
possvel falta de padronizao poderia
alterar o metabolismo dos
microrganismos, os resultados fsico-
qumicos, sensoriais e microbiolgicos
dos leites fermentados produzidos a
partir dos mesmos.
Nas anlises microbiolgicas realizadas
para os trs lotes de leite em p, foi
verificado ausncia de bolores e
leveduras, microrganismos mesfilos
aerbios; microrganismos termodricos,
Salmonella spp., Staphylococcus spp.
Para coliformes totais e fecais o
resultado foi menor que 3,0 NMP/ml.
Estes resultados superam os padres
estabelecidos pela legislao brasileira
para leite em p (Brasil, 1996) e,
portanto, apresentaram qualidade
microbiolgica adequada.
6.2. Controle de qualidade do leite em
p desnatado reconstitudo
O crescimento de colnias de
microrganismos em meio MRS
(Acumedia, Lansing, Michigan, United
States) plaqueado na diluio 100 no
foi observado, demonstrando que o
tratamento trmico aplicado (110C por
10 minutos, seguido de resfriamento a
37C) foi adequado para garantir a
esterilidade dos leites em p desnatados
reconstitudos a 10%, adoado a 8%.
6.3. Curva de Fermentao /
Crescimento
6.3.1. pH
A Figura 1 apresenta os resultados
mdios de duas repeties da medida
dos valores de pH a cada duas horas,
partindo do tempo zero (adio do
inculo) at a coagulao completa,
durante a incubao a 37C do leites
desnatados esterilizados adicionados de
Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum.
35
Figura 1: Mdias de duas repeties de pH durante a fermentao de leites fermentados
esterilizados adicionados de Lactobacillus rhamnosus (LR) e Lactobacillus fermentum
(LF).
O final da fermentao foi baseado na
formao do cogulo, com o
desprendimento do mesmo, como pode
ser observado nos Anexos 5 e 6. Pode-
se verificar que a formao do cogulo
coincidiu com o ponto isoeltrico da
casena, ou seja, pH em torno de 4,6
(Fennema, 1996).
Avaliando as variaes de pH (Figura
1), percebe-se que at o tempo de quatro
horas o decrscimo foi pequeno e, a
partir deste tempo, houve uma queda
brusca no pH para o leite fermentado
por Lactobacillus fermentum. Para o
leite fermentado por Lactobacillus
rhamnosus, o pH comeou a reduzir
bastante a partir das seis horas de
incubao 37 2C.
Observa-se tambm, que o pH inicial e
final de ambos os leites fermentados
foram prximos, o pH mdio inicial do
leite fermentado por Lactobacillus
fermentum foi de 6,39 e o final 4,58;
enquanto que para o leite fermentado
por Lactobacillus rhamnosus, o pH
mdio inicial de 6,44 e o final 4,63.
Em relao ao tempo de fermentao
(Anexo 9), leite fermentado por
Lactobacillus fermentum apresentou
duas horas a menos de fermentao
quando comparado ao leite fermentado
por Lactobacillus rhamnosus.
Considerando a escassez de trabalhos
avaliando a fermentao do leite com
ambos os microrganismos, esses
resultados possuem grande relevncia
para avaliar o comportamento de tais
microrganismos durante todo o tempo
de fermentao em leites desnatados.
O baixo tempo de fermentao possui
alto valor para a indstria de
processamento de leites fermentados,
uma vez que um menor tempo de
fermentao poder resultar em um
maior volume de produo; portanto
esses dados apresentam grande
36
relevncia para a indstria de laticnios
e derivados.
6.3.2. Acidez Titulvel
Figura 2: Mdias de duas repeties de acidez titulvel (%) durante a fermentao de
leites fermentados esterilizados adicionados de Lactobacillus rhamnosus (LR) e
Lactobacillus fermentum (LF).
A Figura 2 demonstra que, assim como
o pH apresentou-se inicialmente estvel,
a acidez tambm. Isso demonstra que os
dois parmetros esto relacionados na
produo de leites fermentados, pois
esperado que com a reduo do pH
ocorresse um aumento da acidez.
Os valores iniciais e finais de acidez
titulvel de ambos os leites fermentados
foram prximos, sendo para o leite
fermentado por Lactobacillus
fermentum 0,19g de cido lctico/100 g
de produto inicialmente e 0,58 g de
cido lctico/100 g de produto no final
da fermentao, e para o Lactobacillus
rhamnosus a acidez titulvel inicial foi
de 0,20 g de cido lctico/100 g de
A Figura 2 apresenta os resultados de
acidez titulvel durante a fermentao
de leites desnatados esterilizados
adicionados de Lactobacillus
rhamnosus e Lactobacillus fermentum.
produto e a final, 0,55 g de cido
lctico/100 g de produto.
Na Figura 2, verifica-se que todos os
leites fermentados apresentaram valores
acidez titulvel inferiores a 0,60%, que
o valor mnimo oficial estabelecido
pela legislao brasileira para leites
fermentados (Brasil, 2007). Apesar de
os valores serem menores que 0,60%,
pode-se dizer que os mesmos esto bem
prximos da referncia, pois para o leite
fermentado por Lactobacillus
fermentum, a diferena foi de 0,02% e
para o leite fermentado por
Lactobacillus rhamnosus a diferena foi
de 0,05%. Vale ressaltar que os valores
estabelecidos no RTIQ de leites
fermentados (Brasil, 2007) so baseados
37
em culturas comerciais, as quais no acrescidos ou no de concentrado
foram utilizadas neste trabalho, pois proteico de soro.
conforme j mencionado anteriormente,
as culturas foram isoladas de produtos Oliveira et al. (2009) verificaram que
lcteos artesanais brasileiros. durante a fermentao de leites
fermentados contendo Lactobacillus
Viegas et al. (2010) verificou em sua rhamnosus em associao com
pesquisa com bactrias tambm isoladas Streptococcus thermophilus a acidez
de queijos de coalho artesanais, tambm teve um aumento com o passar
diferena semelhante entre a acidez do tempo.
titulvel durante a fermentao. Os
valores encontrados foram mais baixos 6.3.3. Enumerao das bactrias
que aqueles postulados pela legislao produtoras de cido lctico
brasileira (Brasil, 2007), variando entre
0,32% e 0,47%, entre os leites Na Figura 3 podem ser observados
fermentados elaborados com os valores que permitem acompanhar o
microrganismos testados. Os crescimento dos microrganismos
microrganismos utilizados foram Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus acidophilus, Weissella Lactobacillus fermentum durante o
confusa, isolados ou em associao, processo de fermentao de leites
desnatados esterilizados.

Figura 3: Mdias de duas repeties das contagens (log UFC/g) durante a fermentao
de leites fermentados esterilizados adicionados de Lactobacillus rhamnosus (LR) e
Lactobacillus fermentum (LF).

Segundo Shah (2000) e Hassan e Frank mesmos esto em culturas puras, como
(2001), o crescimento de espcies o caso deste trabalho, lento. Por isso,
probiticas de Lactobacillus e outros at o tempo de oito horas aps a adio
microrganismos em leites, quando os do inculo inicial, a curva para a

38
fermentao por Lactobacillus
rhamnosus se manteve mais constante e
depois desse tempo ocorreu um pico de
crescimento. No caso da fermentao
por Lactobacillus fermentum, o
crescimento praticamente constante
em todo o tempo at a coagulao.
Ao comparar os resultados de acidez
titulvel e da enumerao dos
microrganismos produtores de cido
lctico, verifica-se que Lactobacillus
rhamnosus foi mais resistente ao
ambiente mais cido em relao a
Lactobacillus fermentum, pois seu
crescimento possuiu um pico em uma
acidez mais alta.
produtos finais so desejadas no intuito
de garantir que quantidades de bactrias
viveis sejam mantidas durante todo o
tempo de estocagem. Segundo Hekmat,
Soltani e Reid (2009), Lactobacillus
rhamnosus apresentou contagens entre
107 e 1010 UFC/g na fermentao de
leite, garantindo a contagem adequada
durante todo o tempo de estocagem.
Para Lactobacillus fermentum, h uma
escassez de trabalhos, no sendo
possvel uma comparao, tornando os
dados deste trabalho bastante relevantes
para pesquisas futuras.
6.4. Avaliao fsico-qumica dos
leites fermentados

Os dois leites fermentados apresentaram 6.4.1. pH

aps o fim da fermentao contagens de
bactrias em valores superiores ao A Tabela 2 apresenta os resultados de
mnimo estabelecido no RTIQ de leites pH nos tempos um, 15, 30 e 45 dias de
fermentados (Brasil, 2007). Essa estocagem sob refrigerao a 8-10C
legislao estabelece como valor elaborados com as culturas
mnimo de 106 UFC/g para leites Lactobacillus rhamnosus e
fermentados. Contagens mais elevadas Lactobacillus fermentum.
de microrganismos probiticos nos

Tabela 2: Resultados mdios percentuais de trs repeties pH de leites desnatados

esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus fermentum,
armazenados sob refrigerao entre 8 a 10 C, durante 45 dias de estocagem

Leite Dias Mdias

fermentado 1 15 30 45
LR 4,68 4,43 4,13 4,14 4,35
LF 4,63 4,49 4,19 4,18 4,37
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Dados da Tabela 2 demonstram que no tipo de leite fermentado no foram

houve diferena significativa (P>0,05) diferentes durante os 45 dias de
para os valores de pH, ou seja, as estocagem sob refrigerao entre 8 e
variaes encontradas nas medies de 10C.
pH a cada tempo de anlise e para cada

39
No possvel discutir os resultados de
pH com base na legislao brasileira,
pois o RTIQ de leites fermentados
(Brasil, 2007) no estabelece
parmetros para essa anlise.
Donkor et al. (2006) verificaram que
com a estocagem, mesmo em
refrigerao controlada, o pH de leites
fermentados sofre um declnio, devido a
maior produo de cido lctico pelos
microrganismos adicionados ao leite e
que essa reduo de pH pode afetar ou
no a viabilidade das bactrias
probiticas produtoras de cido lctico.
Viegas et al. (2010) observaram que
durante 40 dias de estocagem de leites
Tabela 3: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de acidez titulvel
de leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10C, durante 45 dias
de estocagem
Leite Dias
fermentado 1 15
LR 0,65 0,69
LF 0,60 0,66
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum
Os valores de acidez titulvel estavam
de acordo com o preconizado no RTIQ
de leites fermentados (Brasil, 2007), o
qual estabelece que os limites mximo e
mnimo sejam 0,6 e 2,0g de cido
lctico por 100g de produto. Apesar de
haver diferenas entre os valores
encontrados, a mesma no
significativa estatisticamente.
O comportamento da acidez tambm
est dentro do esperado, ou seja, com o
passar dos dias, a mesma aumenta, pois
fermentados produzidos com diferentes
microrganismos produtores de cido
lctico, o pH tambm decresceu.
Entre os dois leites fermentados
avaliados o que apresentou a menor
mdia de pH foi o leite fermentado por
Lactobacillus rhamnosus.
6.4.2. Acidez Titulvel
A Tabela 3 apresenta os resultados de
acidez titulvel nos tempos 1, 15, 30 e
45 dias de estocagem sob refrigerao
entre 8 e 10C elaborados com as
culturas Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum.
Mdias
30 45
0,93 1,03 0,82
0,91 1,06 0,81
mesmo aps o trmino da coagulao os
microrganismos no pararam de
fermentar o leite. Isso foi observado
pelo fato de que entre os tempos de
anlise sempre havia nova coagulao.
Alm disso, o comportamento
relacionado com o pH, pois conforme j
foi observado, o pH diminuiu com os
dias, o que indica que o leite ficou mais
cido.
Na anlise de acidez titulvel, o leite
fermentado por Lactobacillus
40
rhamnosus apresentou maior mdia,
confirmando o que foi mencionado
anteriormente na anlise de pH; e o leite
fermentado por Lactobacillus
fermentum apresentou menor mdia,
tambm em acordo com a anlise de
pH.
Donkor (2006) e Viegas et al.(2010)
tambm verificaram aumento na acidez
titulvel durante os 40 dias de
estocagem de leites fermentados
elaborados com Bifidobacterium lactis,
Lactobacillus paracasei, Lactobacillus
acidophilus, Weissella confusa, com ou
sem CPS, assim como foi verificado no
presente trabalho.
6.4.3. Teor de protena
A Tabela 4 apresenta os resultados de
teor de protena nos tempos 1, 15, 30 e
45 dias de estocagem sob refrigerao
entre 8 e10C elaborados com as
culturas Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum.

Tabela 4: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de protena de

leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10C, durante 45 dias
de estocagem

Leite Dias Mdias

fermentado 1 15 30 45
LR 3,56 3,45 3,29 3,22 3,38
LF 3,52 3,43 3,30 3,25 3,38
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Dados da Tabela 4 mostram que no produzidos atendem tal legislao em

houve diferena entre os tempos de
anlise e os tipos de microrganismo
utilizado para a fermentao em relao
ao valor proteico. Assim como no h
diferena (P>0,05) entre as mdias dos
45 dias. Isso demonstra que, embora
haja diferena entre os percentuais de
protena entre os leites fermentados
produzidos, essas variaes no so
significativas.
Com base nos requisitos estabelecidos
pela legislao brasileira para leites
fermentados, RTIQ de leites
fermentados (Brasil, 2007), a qual
determina que o mnimo de protena
de 2,9%. Os leites fermentados
todos os tempos de anlise, durante os
45 dias de estocagem sob refrigerao
entre 8 e 10C.
Viegas et al. (2010) verificaram que os
leites fermentados sem o acrscimo de
CPS apresentaram variaes em seus
teores proteicos, no tendo sempre um
aumento ou reduo do mesmo,
havendo picos de protena precedidos
de aumento com posterior reduo no
teor.
6.4.4. Teor de gordura
Nas trs repeties de teor de gordura
nos leites fermentados, os mesmos

41
apresentaram zero por cento de gordura
durante os tempos de estocagem (45
dias) sob refrigerao a 8-10C. Esses
resultados esto em consonncia com o
tipo de leite em p utilizado no processo
de fabricao dos leites fermentados, o
leite em p desnatado, que tambm
apresentou zero por cento de gordura
em sua anlise. Alm disso, os
resultados esto de acordo com os
padres estabelecidos no RTIQ de leites
fermentados (Brasil, 2007), o qual
determina que a porcentagem mxima
de gordura em leites fermentados
desnatados no mximo 0,5% ou 0,5g
de gordura por 100g de produto.
6.4.5. Teor de umidade e extrato seco
total
Dados da Tabela 5 apresenta os
resultados de umidade nos tempos 1,
15, 30 e 45 dias de estocagem sob
refrigerao entre 8 e 10C elaborados
com as culturas Lactobacillus
rhamnosus e Lactobacillus fermentum.

Tabela 5: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de umidade de

leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao a 8-10 C, durante 45 dias de
estocagem

Leite Dias Mdias

fermentado 1 15 30 45
LR 82,60 83,26 83,90 84,85 83,65
LF 83,19 81,84 83,05 82,94 82,76
Letras minsculas diferentes na mesma linha e maisculas na mesma coluna indicam
diferena estatstica significativa (p<0,05)
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Os valores de umidade apresentados na reduzem a umidade e aumentam a

Tabela 5 indicam que no houve quantidade de extrato seco total. Para
diferena (P>0,05) entre os 45 dias de garantir maior qualidade a esses
estocagem sob refrigerao a 8-10C, produtos, seria necessrio o
isso significa que apesar das variaes estabelecimento de parmetros pela
entre as porcentagens de umidade as legislao, de modo a garantir a
mesmas foram similares durante toda a uniformidade dos mesmos, facilitando a
estocagem. inspeo.

O RTIQ de leites fermentados (Brasil, A Tabela 6 apresenta os resultados de

2007) no estabelece padres para as
anlises de umidade, no sendo
possvel, portanto, comparar os
resultados. Observa-se que alguns
laticnios fazem uso de aditivos que
extrato seco total nos tempos um, 15, 30
e 45 dias de estocagem sob refrigerao
entre 8 a 10C elaborados com as
culturas Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum.

42
Tabela 6: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de extrato seco
total de leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10 C, durante 45 dias
de estocagem
Leite Dias Mdias
fermentado 1 15 30 45
LR 17,40 16,74 16,10 15,15 16,35
LF 16,81 18,16 16,95 17,06 17,24
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Assim como nas anlises umidade, no 6.5. Avaliao microbiolgica dos

houve diferena (P>0,05) entre os 45
dias de estocagem sob refrigerao a 8-
10C e os leites fermentados,
demonstrando que mesmo com
variaes de porcentagens essas no
foram suficientemente significativas.
Alm disso, o RTIQ de leites
fermentados (Brasil, 2007) no
estabelece padres para o extrato seco
total, impossibilitando a comparao
com valores oficiais.
leites fermentados
6.5.1. Enumerao dos microrganismos
produtores de cido lctico
A Tabela 7 apresenta as contagens totais
das bactrias produtoras de cido lctico
nos tempos 1, 15, 30 e 45 dias de
estocagem a 8-10C de leites
fermentados elaborados com as culturas
Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum.

Tabela 7: Contagens mdias (UFC/g) em gar MRS, de trs repeties de leites

desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus
fermentum, armazenados sob refrigerao a 8-10 C, durante 45 dias de estocagem

Leite Dias Mdias

fermentado 1 15 30 45
LR 1,0x1010 2,2x1011 1,9x109 1,5x1011 9,6x1010
LF 5,4x109 1,7x1010 8,3x108 6,5x1010 2,2x1010
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Comparando os valores mdios das trs dessas contagens durante os 45 dias de

repeties das contagens (UFC/g) de
bactrias produtoras de cido lctico
totais presentes nos leites fermentados
no foi observado entre eles diferena
significativa (P> 0,05). Tambm no
houve diferena (P>0,05) entre os
valores mdios das trs repeties
armazenamento e estocagem sob
refrigerao entre 8 e 10C (Tabela 7).
A legislao brasileira determina as
contagens mnimas para
microrganismos especficos em leites
fermentados, as quais devem ser

43
cumpridas durante todo o perodo de
validade do produto. Para leites
fermentados, cuja fermentao ocorre a
partir de uma ou vrias bactrias
produtoras de cido lctico, a contagem
mnima definida. Portanto, esse valor
de contagem, segundo a legislao de
106 UFC/g.
Comparando os dados da Tabela 7 com
a legislao, verifica-se que tanto o leite
fermentado produzido pela fermentao
de Lactobacillus rhamnosus quanto por
Lactobacillus fermentum esto de
acordo com a mesma, tendo em vista
que as mdias das contagens foram de
9,6x1010UFC/g para o Lactobacillus
rhamnosus e 2,2x1010UFC/g para o
Lactobacillus fermentum.
Ainda sobre essas contagens, elas no
s esto cumprindo a legislao vigente
para leites fermentados como superam a
mesma, garantindo assim um produto
de qualidade para o consumidor, com
todos seus efeitos benficos
sustentados. Pois para que um produto
seja considerado probitico ele deve ter
seus microrganismos em nmeros
viveis durante todo o seu prazo de
validade. Vrios estudos vm sendo
realizados para determinar qual essa
quantidade ideal de microrganismos
para garantir o seu efeito benfico, com
isso alguns autores sugerem que a
quantidade mnima de bactrias por
grama de leite fermentado deva ser de
106UFC/g, sendo que a dose ingerida
recomendada est em torno de 108-
109UFC (Rasic e Kurmann, 1983
citados por Gomes e Malcata, 1999).
Alm disso, pode-se verificar que
Lactobacillus rhamnosus sempre
apresentou contagem maior durante os
45 dias quando comparado a
Lactobacillus fermentum. Essa
diferena na contagem pode ter ocorrido
pelo fato de que a cultura de
Lactobacillus fermentum estava h mais
tempo sem ser ativada; enquanto a
cultura de Lactobacillus rhamnosus
havia sido ativada recentemente, h
menos de seis meses de seu uso para
este trabalho.
Realizando um paralelo comparativo
entre os valores de acidez titulvel e a
enumerao dos microrganismos
produtores de cido lctico, verifica-se
que, mesmo com o aumento da acidez,
o nmero de microrganismos no
reduziu significativamente, eles se
mantiveram constantes durante o tempo
de estocagem, demonstrando potencial
tolerncia dos mesmos aos nveis de
acidez encontrados nos produtos
durante a fermentao.
Hekmat, Soltani e Reid (2009)
verificaram que durante a estocagem
refrigerada de leites fermentados
produzidos com Lactobacillus
rhamnosus e Lactobacillus reuteri
associados, Lactobacillus rhamnosus se
manteve mais vivel durante o perodo,
mantendo sempre contagens entre 107 e
108 UFC/g, resistindo sempre elevao
da acidez e reduo do pH.
6.5.2. Pesquisa de coliformes totais e
termotolerantes
Nas trs repeties de pesquisa de
coliformes totais e termotolerantes nos
leites fermentados, no foi observada a
presena de gs em nenhum dos tubos
contendo Caldo Verde Brilhante e tubos
de Durhan invertidos. Portanto apenas a
prova presuntiva foi realizada nesta
44
anlise. Esses resultados garantem que
houve condies higinicas sanitrias
adequadas durante o processo de
elaborao e armazenamento dos leites
fermentados produzidos.
Alm disso, esses resultados indicam
ausncia de coliformes totais e
termotolerantes durante os 45 dias de
estocagem sob refrigerao entre 8 e
10C, garantindo qualidade
microbiolgica dentro do exigido pelo
RTIQ de leites fermentados, o qual
permite at duas amostras com
contagens entre 10 e 100 UFC/g para
coliformes totais, e at duas amostras
com contagens menores que 3 at 10
UFC/g (Brasil, 2007).
6.5.3. Pesquisa de bolores e leveduras
No se observou crescimento de
colnias de bolores e leveduras nas
placas, portanto os resultados indicam
ausncia dos mesmos em todos os leites
fermentados durante os 45 dias
estocados sob refrigerao entre 8 e
10C. Isso demonstra que no houve
contaminao ambiental ou por
manipulao com esses
microrganismos, garantindo qualidade
microbiolgica superior ao exigido pelo
RTIQ de leites fermentados, o qual
permite no mximo duas mostras com
contagens entre 50 e 200 UFC/g (Brasil,
2007).
6.6. Avaliao sensorial dos leites
fermentados
6.6.1. Teste de aceitao pela escala
hednica de cinco pontos
As medianas apresentadas na Tabela 8
representam os resultados das anlises
sensoriais dos leites fermentados por
Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum representados
em forma de pontos atribudos a cada
degrau de aceitao (adorei, gostei, no
gostei nem desgostei, no gostei,
detestei) presente na escala hednica de
cinco pontos da ficha de anlise
sensorial.

Tabela 8: Medianas dos resultados do teste de aceitao (escala hednica de cinco

pontos) de leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 a 10 C, durante 60 dias
de estocagem
Leite Dias
fermentado 15 60
LR 4,0a 3,0b
LF 4,0a 3,0b
Letras minsculas diferentes na mesma linha indicam diferena estatstica significativa
(P<0,05).
1- Detestei, 2- No gostei, 3-No gostei nem desgostei, 4-Gostei, 5-Adorei
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Os dados da Tabela 8 demonstram que significativa entre os dois tipos de leites

no houve diferena (P>0,05) fermentados produzidos, havendo

45
diferena (P<0,05) apenas entre cada
leite a cada momento de anlise.
As notas atribudas pelos provadores no
dia 15 tiveram como mediana, em
ambos os leites, 4, o que significa
gostei; j no dia 60, as notas foram 3,
significando no gostei nem desgostei.
Essa diferena entre as notas pode ser
explicada pelo fato de que com o passar
do tempo os leites foram acidificando e
o consumidor tem preferncia por
sabores mais suaves e menos cidos de
leites fermentados.
Alm disso, verificou-se que a maior
parte dos provadores associou o termo
leite fermentado marca comercial que
utiliza a cultura Lactobacillus casei,
indicando que os mesmos
provavelmente utilizam esses produtos
como referncia na avaliao sensorial.
Isso foi observado nos comentrios
realizados pelos provadores durante a
anlise sensorial.
Com relao anlise sensorial, pode-se
verificar que 60 dias pode ser um tempo
longo para o prazo de validade, pois
apesar dos provadores no gostaram
nem desgostaram do leite neste prazo.
6.6.2. Teste de aceitao pela escala no
estruturada
As medianas apresentadas na tabela 9
representam os resultados das anlises
sensoriais dos leites fermentados por
Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum representados
em forma de escala no estruturada
ancorada nos nmeros 0 e 10.

Tabela 9: Medianas dos resultados do teste de aceitao (escala no estruturada) dos

leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10 C, durante 60 dias
de estocagem
Leite Dias
fermentado 15 60
LR 6,87Aa 4,90Ab
LF 6,43Aa 5,94Ba
Letras minsculas diferentes na mesma linha e maisculas na mesma coluna indicam
diferena estatstica significativa (P<0,05).
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Os dados apresentados pela Tabela 9 no houve diferena (P>0,05) entre os

demonstram que houve diferena mesmos; entretanto, aos 60 dias h
(P<0,05) entre os dois tempos de anlise diferena (P<0,05).
para o leite fermentado por
Lactobacillus rhamnosus, sendo que o Esses resultados no demonstram muita
mesmo comportamento no pde ser semelhana com a os apresentados na
observado para o Lactobacillus tabela anterior (Tabela 8), pois o leite
fermentum. Comparando os dois leites fermentado por Lactobacillus
em cada tempo de anlise, aos 15 dias rhamnosus apresentou diferena

46
(P<0,05) entre os tempos de anlise,
assim como na tabela anterior; por outro
lado, o leite fermentado por
Lactobacillus fermentum apresentou
outro comportamento, mantendo-se sem
diferena (P>0,05) entre os tempos de
anlise.
As notas atribudas pelos provadores
apresentaram perfis diferentes com o
tempo, pois aos 15 dias houve
preferncia pelo leite fermentado por
Lactobacillus rhamnosus, em termos de
valores numricos de notas; entretanto,
aos 60 dias a preferncia foi pelo
Lactobacillus fermentum.
Durante a anlise das fichas sensoriais,
verificou-se que os provadores
referiam-se ao leite fermentado por
Lactobacillus rhamnosus aos 15 dias
como um excelente leite, muito gostoso,
muito similar ao de uma famosa marca,
enquanto que aos 60 esse mesmo leite
era referenciado como muito cido, de
sabor desagradvel. Portanto, verifica-
se que esse leite acidificou mais que o
produzido por fermentao por
Lactobacillus fermentum.
7. RESUMO DOS RESULTADOS
Todos os leites fermentados
apresentaram contagens de
microrganismos com valores superiores
ao mnimo estabelecido no RTIQ de
leites fermentados por Lactobacillus
spp. (Brasil, 2007) e adequadas do
ponto de vista probitico.
Os leites fermentados por Lactobacillus
rhamnosus apresentaram valores mais
baixos de pH e, consequentemente, de
acidez titulvel (%) mais altos ao final
da fermentao.
Todos os parmetros fsico-qumicos
no apresentaram diferenas (P>0,05)
entre os tempos de anlise e os leites
fermentados.
Em todos os leites fermentados, as
concentraes de bactrias produtoras
de cido lctico foram suficientes
(mdias acima de 108 UFC/g) para
garantir provveis efeitos probiticos,
durante os 45 dias de estocagem sob
refrigerao entre 8 e 10C, sugerindo,
tambm, que este tempo pode ser
utilizado como prazo de validade para
tais produtos.
Os resultados das anlises
microbiolgicas, principalmente da
pesquisa de coliformes totais e
termotolerantes e bolores e leveduras,
que indicaram valores adequados dos
mesmos durante os 45 dias de
refrigerao, garantindo a qualidade dos
leites fermentados, possuindo a mesma
superior ao exigido na legislao
(Brasil, 2007).
Durante as anlises sensoriais, os
provadores sempre se referiam a um
produto comercial fermentado por
Lactobacillus casei ao avaliar o leite
fermentado por Lactobacillus
rhamnosus e, no teste de escala
hednica, no verificaram diferenas
entre os dois leites. Como a segunda
anlise sensorial ocorreu aos 60 dias de
estocagem, verificou-se que o mesmo
um prazo muito longo para estocagem,
tendo em vista que a maioria dos
avaliadores comentou sobre a alta
acidez de ambos os leites.
47
8. CONCLUSES

possvel produzir leites fermentados

com qualidade a partir de
microrganismos isolados de produtos
lcteos artesanais brasileiros, ou seja, as
culturas lcticas Lactobacillus
rhamnosus e Lactobacillus fermentum
podem ser utilizadas para a produo de
novos leites fermentados, os quais
poderiam ter prazo de validade de 45
dias, quando armazenados a 8-10C.

Leites fermentados por Lactobacillus

rhamnosus e Lactobacillus fermentum
isolados de queijo de coalho artesanal
apresentaram caractersticas fsico-
qumicas e microbiolgicas (incluindo
contagens de microrganismos)
adequadas e de acordo com a legislao
vigente para os produtos disponveis
para o consumo, atualmente. No
entanto, os mesmos leites fermentados
apresentaram aceitaes distintas nos
dois tempos de anlise avaliados,.

Comparando os dois tipos de leites

fermentados, verifica-se uma maior
aceitao do leite fermentado por
Lactobacillus fermentum teve uma
maior aceitao aos 60 dias de anlise,
possivelmente por apresentar menor
acidez e maior pH. Isso ainda pode ter
influenciado a viabilidade do
microrganismo, pois o mesmo
apresentou menor contagem quando
comparado com o leite fermentado por
Lactobacillus rhamnosus, apesar de no
haver diferena significativa entre os
valores na enumerao de bactrias
cido lctica.

48
9. REFERNCIAS
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10. ANEXOS

Anexo 1: Teste de Gram Lactobacillus rhamnosus (100x de aumento Microscpio

ptico)

55
Anexo 2: Teste de Gram Lactobacillus fermentum (100x de aumento Microscpio
ptico)

56
Anexo 3: Crescimento em caldo MRS do Lactobacillus fermentum aps 72 horas de
incubao

57
Anexo 4: Crescimento em Caldo MRS do Lactobacillus rhamnosus aps 72 horas de
incubao

58
Anexo 5: Fotografia do cogulo formado por Lactobacillus rhamnosus

59
Anexo 6: Fotografia do cogulo formado por Lactobacillus fermentum

60
Anexo 7: Modelo da Ficha de Anlise Sensorial utilizada nas anlises sensoriais dos
leites fermentados estocados por 15 e 60 dias sob refrigerao 8-10C.

FICHA DE ANLISE SENSORIAL

Nome: ________________________________________ Data: ________

Por favor, prove com ateno as amostras.

Identifique o nmero de cada amostra e marque um x na linha abaixo, como se
estivesse dando uma nota para o produto numa escala de 0 (zero) a 10 (dez). Marque
tambm uma das opes a seguir, dando sua opinio sobre cada amostra.

Amostra: __________
0 _______________________________________________ 10

Amostra: __________
0 _______________________________________________ 10

61
Anexo 8: Modelo do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para a Anlise
Sensorial
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Ttulo da Pesquisa: Caractersticas fsico-qumicas, microbiolgicas e sensoriais de leites fermentados

probiticos produzidos com bactrias produtoras de cido lctico isoladas de queijo coalho de
Pernambuco
Nome dos Pesquisadores: Marcelo Resende de Souza e Debora Pinheiro Guimares Mendes
O senhor (senhora) est sendo convidado (a) a participar desta pesquisa que tem a finalidade de avaliar as
caractersticas sensoriais de leites fermentados produzidos a partir de bactrias produtoras de cido lctico
isoladas de queijo coalho de Pernambuco.
Essa pesquisa contar com 30 pessoas, que tenham o hbito de consumir leites fermentados, sendo que o
sexo e a idade no interferem na mesma.
O senhor (senhora) tem a liberdade de recusar a participar e ainda se recusar a continuar participando em
qualquer fase da pesquisa.
O senhor (senhora) ir avaliar os leites fermentados produzidos nessa pesquisa atravs de formulrios
prprios, no laboratrio de anlise sensorial do Departamento de Tecnologia e Inspeo de Produtos de
Origem Animal, localizado na Escola de Veterinria da Universidade Federal de Minas Gerais.
A participao nesta pesquisa no traz complicaes legais, pois os produtos passaro por anlises
microbiolgicas antes da anlise sensorial, garantindo segurana ao senhor (senhora). Os procedimentos
adotados nesta pesquisa obedecem aos Critrios da tica em Pesquisa com Seres Humanos conforme
Resoluo no. 196/96 do Conselho Nacional de Sade. Nenhum dos procedimentos usados oferece riscos
sua dignidade.
Todas as informaes coletadas nesse estudo so confidenciais e somente os pesquisadores tero acesso
aos dados individualmente e os mesmos sero divulgados de forma conjunta, sem citar nomes de
participante.
Ao participar desta pesquisa o senhor (senhora) no ter benefcio direto, mas esperamos que este estudo
traga informaes importantes sobre a produo de leites fermentados, de forma que esse conhecimento
os pesquisadores se comprometem a divulgar os resultados obtidos.
O senhor (senhora) no ter nenhum tipo de despesa para participar da mesma.
Aps estes esclarecimentos, solicitamos o seu consentimento de forma livre para participar desta
pesquisa. Portanto preencha, por favor, os itens que se seguem: Confiro que recebi cpia deste termo de
consentimento, e autorizo a execuo do trabalho de pesquisa e a divulgao dos dados obtidos neste
estudo.
Obs: No assine esse termo se ainda tiver dvida a respeito.
Consentimento Livre e Esclarecido
Tendo em vista os itens acima apresentados, eu, de forma livre e esclarecida, manifesto meu
consentimento em participar da pesquisa
_____________________________________________________________
Nome do Participante da Pesquisa
_____________________________________________________________
Assinatura do Participante da Pesquisa
_____________________________________________________________
Assinatura do Pesquisador 1
______________________________________________________________
Assinatura do Pesquisador 2

Pesquisadores: Marcelo Resende de Souza, Debora Pinheiro Guimares Mendes

Cmite de tica em Pesquisa - Av. Antnio Carlos, 6627 Unidade Administrativa II 2 andar
Sala 2005 Campus Pampulha Belo Horizonte MG Brasil CEP: 31270-901 Tel: (31)
3409-4592 - Email: coep@prpg.ufmg.br

62
Anexo 9: Mdia das duas repeties do tempo de fermentao dos leites desnatados
adoados esterilizados adicionados de Lactobacillus fermentum e Lactobacillus
rhamnosus

LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

63