Determinarea Salmonella

n conformitate cu prevederile EN ISO 6579

Aparatur i sticlrie folosit:

Termostat 35oC; 37o 0,5oC; 42oC pentru dezvoltarea microbian;
Etuv 160 180oC - asigur sterilizarea cu cldur uscat a obiectelor de
sticl, porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180oC
timp de 30-60 minute;
Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune.
Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute;

Lamp U.V. - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului ncperilor i a
suprafeelor de lucru;
Balan analitic - balan electronic cu reglare automat funcie de temperatura camerei;
Sterilizator electric pentru instrumente;
Stomacher 1000 ml, pungi de material plastic pentru stomacher, turmix tip Atomix de nalt
turaie (15-20.000 7/min), cu cupe sterilizabile;
Baie de ap reglabil la temperatur 35oC sau 37oC, 45oC, 55oC i 70oC;
Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm;
Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml;
pH metrucu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la
25o C;

Anse bacteriologice cu bucla cu diam de 3 mm din platin-iridiu sau nichel-crom ;

Eprubete de 16 x 160 mm sterile;
Flacoane pentru medii de cultur;
Eprubete cu diam de 8/160 mm;
Pipete cu scurgere total cu capacitate nominal de 1 ml i 10 ml;
Mojar cu pistil, sterile;
Eprubete gradate;
Baloane erlenmayer cu capacitatea de 90, 150 i 250 ml.
Metodologia de diagnostic
 Detecia Salmonella spp. se efectueaz n conformitate cu standardul ISO 6579/2003
AC/2006 "Microbiologia alimentelor i a hranei pentru animale Metoda orizontal de cercetare
a Salmonella spp.

Detecia Salmonella spp. necesit parcurgerea a patru faze succesive:

1. Prembogirea n medii lichide neselective: apa peptonat tamponat se inoculeaz la

temperatura camerei cu proba pentru analiz, apoi se incubeaz la
37C 1 C timp de 18 h 2 h. Prembogirea este necesar pentru resuscitarea
germenilor distrui subletal.
2. mbogire n medii selective lichide: Mediul Rappaport-Vassiliadis cu soia (bullion

RVS) i bulionul Muller-Kauffmann tetrationat/novobiocin (bullion MKTTn) se

inoculeaz cu cultura obinut n urma inoculrii apei peptonate. Bulionul RVS se
incubeaz la 41,5 C 1 C timp de 24 h 3 h i bulionul MKTTn la 37 C timp de 24 h
3 h. Aceste medii conin substane inhibitorii pentru bacterii non-Salmonella
3. Izolare i identificare: din culturile obinute n urma inoculrii RVS i MKTTn, se
inoculeaz dou medii selective solide: agar xiloz-lizin-dezoxicolat (agar XLD); orice
alt mediu selectiv solid complementar cu agarul XLD i potrivit n special pentru izolarea
Salmonellei lactoz-pozitiv (de exemplu Rambach, MC Conkey sau Rou Fenol). Agarul
XLD i mediul Rambach (recomandat a fi ales) se incubeaz la 37C 1C i se examineaz
dup 24 h 3 h. Acestea permit diferenierea salmonelelor de alte enterobacterii
4. Dup izolarea tulpinilor n cultur pur, confirmarea se face prin diverse teste biochimice
i serologice. Salmonelele posed antigene somatice (O), flagelare (H) i de virulen (VI)
ce pot fi identificate prin serotipizare, iar serovariantele pot fi identificate dup formula lor
antigenic, conform schemei KauffmanWhite. Pentru confirmarea identificrii serologice
complete, tulpinile de Salmonella izolate trebuie s fie trimise la Institutul de Igien i
Sntate Public Veterinar Bucureti
(IISPV).
Teste biochimice

Agar TSI - se nsmneaz coloana agarului TSI prin striere, iar panta prin trasare. Se
incubeaz la temperatura de 35o 37oC timp de 24 h. Se interpreteaz modificrile care se produc
n mediu n modul urmtor:
Baza mediului:

galben glucoz pozitiv (fermentarea glucozei);

roie sau nemodificat glucoz negativ (lipsa fermentrii glucozei);

neagr formare de hidrogen sulfurat;

 bule de gaz sau fisuri-formare de gaz din glucoz:

Panta mediului:
galben lactoz i/sau zaharoz pozitiv;

roie sau nemodificat lactoz i zaharoz negativ (neutilizarea lactozei i a zaharozei

Culturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (roie) cu formare de gaz i a
unei baze acide (galben) cu formarea (90% din cazuri) hidrogenului sulfurat (nnegrirea agarului.
Atunci cnd se izoleaz o Salmonella lactoz pozitiv panta agarului TSI este galben, n consecin
o confirmare preliminar a culturilor de Salmonella nu trebuie s se bazeze doar pe rezultatele
obinute pe agarul TSI.

Agar cu uree

Se nsmneaz panta agarului n striuri. Se incubeaz la 35o sau 37oC (conform acordului)
timp de 24 h i se examineaz din cnd n cnd. n cazul reaciei pozitive descompunerea ureei
produce degajarea amoniacului, fcnd s vireze rou de fenol la roz apoi la rou nchis Reacia
este deseori vizibil dup 2 pn la 4 h.
Mediu pentru decarboxilarea L-lizinei

Se nsmneaz mediul lichid sub suprafa. Se incubeaz la 35o sau 37oC timp de 24 h.
O culoare violet aprut dup incubare indic o reacie pozitiv. O culoare galben indic o reacie
negativ.
Evidenierea betagalactozidazei
Se disperseaz o ans din colonia suspect ntr-o eprubet ce conine 0,25 ml soluie salin,
se adaug o pictur de toluen i se agit eprubeta. Se introduce eprubeta n baie de ap reglat la
35o sau 37oC (conform acordului) i se las s stea cteva minute. Se adaug 0,25 ml Reactiv
pentru evidenierea betagalactozidazei i se amestec. Se reintroduc eprubetele n baia de ap la
35o sau 37oC (conform acordului) i se las 24 examinndu-le din timp n timp. O culoare galben
indic o reacie pozitiv, deseori reacia este vizibil n 20 minute. n cazul folosirii discurilor de
hrtie gata preparate se respect instruciunile fabricantului.
Mediu pentru reacia VP

Se disperseaz o ans din colonia suspect ntr-o eprubet coninnd 0,2 ml VP, se
incubeaz la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. Dup incubare se adaug 2 picturi
din soluia de creatin, 3 picturi din soluia alcoolic de l-naftol i apoi 2 picturi din soluia de
hidroxid de potasiu agitnd dup adugarea fiecrui reactiv. Formarea unei coloraii roz pn la
rou aprins ntr-un interval de 15 minute indic o reacie pozitiv

Mediu pentru evidenierea indolului

Se nsmneaz o eprubet ce conine 5 ml mediu tripton-triptofan cu
colonia suspect Se incubeaz la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. Dup
 incubare se adaug 1 ml reactiv Kovacs. Formarea unui inel rou indic o reacie
pozitiv. Formarea unui inel galben brun indic o reacie negative
Reacia de aglutinare rapid, pe lam cu ser polivalent anti-Salmonella

Cercetarea prezenei antigenelor O Vi sau H de Salmonella se efectueaz prin aglutinare

pe lam cu seruri adecvate din colonii pure i dup eliminarea tulpinilor autoaglutinabile.

Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Se depune pe o lam de sticl curat o pictur de

soluie salin, se disperseaz n aceast pictur o fraciune din colonia de testat aa fel nct s se
obin o suspensie omogen i tulbure prin micarea lamei timp de 30-60 secunde. Dac bacteriile
se adun n grmezi, tulpina este considerat autoaglutinabil i nu mai trebuie supus
examinrilor ulterioare. Examinarea se face cu ajutorul unei lupe pe fond negru

Evidenierea antigenelor O. Dintr-o colonie pur cunoscut ca neaglutinabil se

procedeaz ca mai sus, dar n locul soluiei saline se folosete o pictur de antiser O. Dac se
produce aglutinarea reacia este considerat pozitiv. Se utilizeaz serurile poli i monovalente
unul dup altul.

Evidenierea antigenelor Vi. Se procedeaz ca mai sus utiliznd o pictur de antiser Vi.
Dac se produce aglutinarea reacia este pozitiv.
Evidenierea antigenelor H. Se nsmneaz un agar nutritiv semisolid cu o colinie pur
neautoaglutinabil, se incubeaz la 35o 37oC timp de 24 h, se utilizeaz aceast cultur pentru
examenul antigenelor H procedmd ca mai sus, dar folosind o pictur antiser H.Dac se produce
aglutinarea reacia este considerat pozitiv.
Fermentarea biochimic a zaharurilor

Confirmarea identificrii prin teste biochimice, cu zaharuri n ap peptonat, sisteme API

(Analitical Profile Index). Se recomand utilizarea unor teste biochimice suplimentare care ajut
la identificarea unor serovariante tipizate: maltoza i dulcitolul pentru diferenierea S. pullorum de
S. gallinarum.
Alte posibiliti de diagnostic
Teste de biologie molecular

n ultimii ani au fost utilizate cu bune rezultate analizele genotipice ale germenilor

(profil plasmidic i ADN cromozomial). Analiza profilului plasmidic este o metod rapid i
relativ simpl de amprentare a tulpinilor i a fost aplicat n medicina uman i veterinar pentru
studiul distribuiei germenilor. Nu toate tulpinile de Salmonella posed plasmide, motiv pentru
care s-au utilizat i tehnici genetice alternative pentru genotiparea tulpinilor lipsite de plasmide.
n ultimii ani, genotipia a cptat amploare, creandu-se multe noi tehnici.