ndice:

Introduccin--------------------------------------------------1
Objetivos y justificacin-----------------------------------2
Marco terico------------------------------------------------3
Metodologa--------------------------------------------------4
Materiales y reactivos--------------------------------------5
Procedimientos-----------------------------------------------6
Observaciones------------------------------------------------7
Resultados-----------------------------------------------------8
Cuestionario de prctica-----------------------------------9
Conclusiones-------------------------------------------------10
Bibliografa---------------------------------------------------11
Introduccin:
El estudio de los compuestos biolgicos implica su extraccin y separacin del material
(clula, tejido, rgano, etc.) en que se encuentren. Uno de los abordajes ms utilizados
para este propsito consiste en el uso de tcnicas de cromatografa (propsito de
separacin de mezclas complejas mediante particiones entre una fase fluida mvil y
una fase estacionaria). Otra tcnica es la de separacin por reparto entre disolventes
inmiscible, que permite separar una mezcla de sustancias en funcin de su solubilidad
en distintos compuestos inmiscibles.

Esta propiedad permite su separacin y su distinto color su identificacin. Su color

permite tambin su cuantificacin por tcnicas espectrofotomtricas.

Los pigmentos fotosintticos, clorofila a y b, carotenoides y xantofilas, tienen

capacidad de absorber distintas longitudes de onda dentro del espectro de luz blanca,
todos ellos tienen carcter apolar, aunque su grado de polaridad vara en funcin de su
composicin qumica. De esta forma, existe un gradiente de polaridad desde el ms
apolar al menos apolar. Cada pigmento tiene un mximo de absorbancia caracterstico
en una longitud de onda correspondiente a un pigmento determinado, se podr
calcular la cantidad del mismo en dicha mezcla.

La clorofila es un pigmento de las plantas, que

les proporciona su color verde y que absorbe la luznecesaria para la fotosntesis. La clo
rofila absorbe principalmente luz violeta roja y azul y refleja luz verde. La abundancia
de clorofila en hojas y su ocasional presencia en otros tejidos vegetales es la causa de
que esas partes de las plantas aparezcan verdes, pero en algunas hojas la clorofila es
enmascarada por otros pigmentos. La extraccin y reconocimiento de
estos pigmentos es interesante para ese estudio y conocimiento de sus propiedades.
Los Pigmentos vegetales, que se encuentran en los cloroplastos, son molculas
qumicas que reflejan o transmiten la luz visible, o hacen ambas cosas a la vez.
El color de un pigmento depende de la absorcin selectiva de ciertas longitudes de
onda de la luz y de la reflexin de otras. Constituyen el sustrato fisicoqumico donde se
asienta el proceso fotosinttico.

(extraccion y separacion de pigmentos vegetales, 2008)

Objetivo general
Extraer los pigmentos vegetales de la hoja de espinaca y del jitomate as como conocer
la absorbancia de los pigmentos.

Objetivos especficos:
Extraer y cuantificar cuatro tipos de pigmentos vegetales: clorofilas a y b,
carotenos y xantofilas en medio lquido (metanol) con calor.
Separar los pigmentos fotosintticos.
Realizar los espectros adecuadamente para conocer la absorcin de dichos
pigmentos.

Justificacin:
La justificacin de llevar a cabo esta prctica de anlisis instrumental es conocer el
mtodo de extraccin de los pigmentos vegetales y del manejo adecuado del
espectrofotmetro de la universidad politcnica de penjamo para conocer la absorcin
de cada uno de los vegetales requeridos.

Marco terico:
Pigmentos fotosintticos son fundamentales para transformar la energa lumnica en
energa qumica, por medio de la fotosntesis.

En plantas superiores se encuentra en su mayora la clorofila (chl) a (PM=9893.4) y en

menor proporcin la chl b (PM=907.4) la relacin entre ambas depende de la
condiciones ambientales. Una relacin (a/b) de 3-4 se espera en plantas que han
crecido bajo altas intensidades de luz y una relacin de 2.5-3 se espera en plantas que
han crecido con poca luz. Los carotenoides por su parte pueden dividirse en dos
grupos: 1) carotenoides sin oxigeno denominaos xantofilias. Entre las xantofilias se
encuentran la violaxantina, anteraxantina, zeaxantina. Los pigmentos fotosintticos
son componentes solubles en grasas por lo que su extraccin se puede realizar con
solventes orgnico como acetona, etanol o metanol. En las extracciones de pigmentos,
hay que tomar en cuenta la alta sensibilidad de los pigmentos fotosintticos a la luz.
Por esto la extraccin debe realizarse en condiciones de luz tenue.
En 1987 lichtenthaler propuso ecuaciones para diferentes solventes con las que
adems se poda determinar la concentracin de carotenoides totales. Utilizando
acetona 100% se puede obtener la concentracin en g/ml segn las siguientes
ecuaciones

Ch a= 11.24 E661.6- 2.04 E664.8

Ch b= 20.13 E644.8- 4.19 E661.6

CAOTENOIDES= (1000 e470- 1.90 Ch a-63.14 chl b)/ 214

Materiales y mtodos.
Materiales Reactivos Muestras
6 Tubos para medio de cultivo 100 ml de metanol 100 mg de hojas de
con tapa espinaca
1 Bao mara 100 ml de agua destilada o 100 mg de fruto de
potable jitomate
1 Termmetro
Papel aluminio
1 Espectrofotmetro
Nota: De cada especie vegetal se tomarn 20 mg para cada repeticin, como mnimo
tres repeticiones para cada especie.

Mtodo
1. lavar material de manera que estn libres de sales y secos.
2. Limpiar de forma asptica la mesa de trabajo.
3. Adquirir hojas de espinaca (1 por persona), limpia y fresca.
4. En la mesa de laboratorio se encontrar la hoja de espinaca y fruto de jitomate,
los tubos de ensayo y los solventes para separar las fases inmiscibles.

Procedimiento
Para la extraccin de pigmentos vegetales:

1. Se tomar una muestra de 20mg de hoja de tejido vegetal y fruto de

jitomate.
2. Previamente estas muestras se colocarn en tubos de ensayo cubiertos con
papel aluminio.
3. En seguida se les colocar 3 ml de metanol al 80%, al bao mara a 80C
hasta que el tejido quede completamente blanco, durante 10 min. (Se
considerarn tres repeticiones para cada vegetal) (hoja de espinaca y
jitomate).
 Nota: Las muestras debern mantenerse cubiertas de su exposicin al sol, ya
que la exposicin a la luz del sol puede arrojar falsos negativos sobre el
contenido cloroflico. (Realizar tres repeticiones en cada una de las muestras
puestas en metanol al 80%.)

Transcurrido el tiempo de extraccin de pigmentos:

1. Se har la cuantificacin de clorofila en espectrofotmetro, para lo cual,

se colocar el extracto en las cubetas de plstico.
2. Se realizarn las lecturas en el espectrofotmetro y se tomar las
correspondientes lecturas (clorofila a 666 nm, clorofila b 653 nm y
carotenoides 470 nm). Utilizar un blanco para la lectura.

Una vez obtenidos las densidades pticas:

1. Se utilizar la frmula propuesta por Lichtentaler y Welburn (1985) para

calcular

Observaciones:
Usamos .05 gr en cada muestra de espinaca y jitomate

Para obtener un mejor resultado agregamos 2 ml de disolucin de metanol

80%, para continuar de nuevo con el bao mara, as que se obtuvieron 5 ml
por muestra.

El metanol es un compuesto bastante voltil, as que las muestras se tienen que

manejar con cuidado, cometimos este error y se volatizaron dos muestras de
espinaca as que procedimos a unirlas y obtuvimos solo 2 muestras para
calcular su absorbancia, esta muestra presento una absorbancia mucho mayor.

Una tercera muestra de jitomate fue colocada en un tubo contaminado por

pintura azul, as que este creo una interferencia, teniendo como resultado una
absorbancia mayor. Esta no se tom en cuenta en la grfica representativa de
la muestra del espectro.
Resultados:

Absorbancia 666 Absorbancia 653 Absorbancia 470

1 2.9 1.066 .192
2 1.531 2.812 .264
3 .367

Resultados de la lectura del espectro

3.5

2.5

1.5

0.5

0
abs 666 abs 653 abs 470

1 2

Grafica representativa de la absorbancia de la muestra en el espectro.