UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO BIOMDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA

APOSTILA
DE
AULAS PRTICAS

- DISCIPLINA -
BACTERIOLOGIA

ORIENTADOR DIDTICO: PROFESSOR ALOYSIO CERQUEIRA

Roteiros de aulas Prticas

Material utilizado nas prticas 1

Tcnicas e Processo de Assepsia
Microscopia

Meios de Cultura e Tcnicas de Semeadura 2

Esterilizao e Desinfeco 4

Diluio 6
Contagem de UFC viveis
Obteno de Cultura pura

Colorao Simples 7
Morfologia

Colorao de Gram 9

Identificao de Cocos Gram positivos 11

Provas Bioqumicas para Idenitifcao de Bacilos Gram Negativos 17

Teste de Sensibilidade a Antibiticos 20

Tcnicas de Colorao
Colorao de Gram 22
Colorao de Zihel-Neelsen (BAAR) 25
Tcnica Para Evidenciao de Espiroquetas 27
Mtodo de Albert-Laybourn 30

Colimetria: Exame microbiolgico da gua

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ASSUNTO:
- Material utilizado nas prticas de Bacteriologia.
- Tcnica e Processos de Assepsia em Bacteriologia.
- Microscopia.

OBJETIVOS:
1- Apresentar a vidraria e outros materiais de uso corrente em um laboratrio de
Microbiologia.
2- Executar tcnicas de preparo de material e montagem para esterilizao.
3- Treinar tcnicas de distribuio assptica.
4- Evidenciar a existncia de bactrias no ar, roupas, etc.
5- Explanao sobre o microscpio.

MATERIAL:

- Vidrarias.
- Outros materiais de uso em um laboratrio de Microbiologia.
- gua peptonada.
- Placas de Petri com Agar simples.
- Pipetas e tubos de ensaio estreis.
- Papel, barbante, algodo cardado, gaze.

PRTICA PARA EXECUTAR:

a. Apresentao da vidraria e outros objetos de uso freqente nos laboratrios de

Microbiologia.
b. Demonstrao, pelo professor, de uma cadeia de assepsia nos trabalhos
microbiolgicos.
c. Cada grupo de alunos treinar, com gua peptonada, as tcnicas de distribuio
assptica, usando pipetas. Deixar os tubos em temperatura ambiente por no mnimo 48
horas.
d. Expor placas de Agar simples (1 por grupo) ao ar por diferentes espaos de tempo.
Deixar temperatura ambiente o mnimo de 48 horas.
e. Evidenciar bactrias da pele, roupa, bancada em meio Agar simples.
f. Montagem de vrios materiais (tubos, placas, pipetas) para esterilizao.
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ASSUNTO:
- Meios de Cultura
- Tcnicas de Semeadura

OBJETIVOS:

1- Explanao sobre os principais meios de cultura empregados em laboratrios de

Microbiologia
2- Identificao das tcnicas de semeadura mais empregadas na rotina
bacteriolgica
3- Cultivo de bactrias com finalidade de obteno de cultura pura, ou seja, uma
populao onde todas as bactrias se originam de uma nica clula bacteriana.

MATERIAL:

- tubos de ensaio com caldo simples, Agar simples e Agar semi-slido.

- Placas de Petri com Agar simples.
- Culturas bacterianas em caldo simples, Agar simples (em placa de Petri).
- Ala e agulha de platina.

PRTICA PARA EXECUTAR:

Definir meio de cultura, cultivo e condies necessrias ao crescimento de

microorganismos (pH, presso osmtica, temperatura de incubao, etc.).
Classificao dos meios de cultura quanto a origem, estado fsico, fora seletiva.
Seqncia da preparao dos meios.

TCNICAS DE SEMEADURA MAIS EMPREGADAS NA ROTINA

I- Semeadura em meios slidos

A. Meio Inclinado

Em estria sinuosa: semear com ala de platina, em ziguezague, partindo da base para a
extremidade da superfcie inclinada do meio
Este tipo de semeadura permite a obteno de melhor massa de microorganismos.

Em estria reta: semear co agulha de platina, em estria reta, partindo da base para a
extremidade da superfcie inclinada do meio, ou em profundidade e superfcie.
Este tipo de semeadura utilizada em provas bioqumicas para identificao bacteriana.

B. Meios em p (camada alta)

Em picada: com agulha de platina fazer o inoculo penetrar de 0,5 a 1,0 cm no

centro do meio de cultura.
Este tipo de semeadura bastante utilizado para conservao de bactrias no
meio de cultura e quando o meio utilizado semi-slido, esta semeadura utilizada para
a verificao da motilidade.

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C. Em Placa de Petri:

C.1. Em superfcie
Estrias mltiplas ou esgotamento: fazer o inoculo em um ponto da superfcie
do meio, flambar a ala, deixar esfriar e da semear em ziguezague em toda a superfcie
do meio.
Este tipo de semeadura empregado para o isolamento bacteriano, obteno de
u.f.c. isoladas.
Denomina-se tcnica se esgotamento.

Por distenso: com pipeta, colocar no centro da superfcie do meio 0,1 mL da

suspenso e espalhar uniformemente com swab ou ala de Drigalski.
Com swab, obteremos crescimento confluente. Com ala de Drigalski,
utilizamos para contagem.
Utiliza-se este tipo de inoculao para realizao de determinados testes, como
por exemplo o antibiograma.

C.2. Em profundidade ou disseminao.

Pour plate: depositar na placa de Petri 0,1/ 1,0 mL da suspenso bacteriana.
Adicionar 10 mL do meio fundido em tubo de ensaio e resfriado a 45-50 C.
Homogeneizar com movimentos giratrios da placa sobre uma superfcie plana.
Utilizado, para isolamento, contagem e identificao bacteriana, conforme o
meio de cultura utilizado.

D. Repique por pescaria: colnia em placa de Petri retirada atravs de uma

agulha para um meio de cultura lquido ou slido
Mtodo empregado para isolamento bacteriano.

II. Semeadura em meios lquidos

Difuso: com ala de platina ou pipeta, introduzir o inoculo ( 0,1 mL) na

massa do meio. Este tipo de semeadura empregada para obteno do crescimento
bacteriano. um repique normal.

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ASSUNTO:
- Esterilizao e Desinfeco
- Ao dos Agentes Fsicos e Qumicos sobre as Bactrias

Objetivos:

1. Verificar a eficincia de agente qumico sobre as bactrias

2. Verificar a eficincia de agente fsico sobre as bactrias

Material:

- Placas de Petri com agar simples ou caldo simples

- Culturas de E. coli e Bacillus sp
- Solues antisspticas
- Gaze
- Trip, tela de amianto e panela

Prtica para executar

a. Definio de alguns termos utilizados no controle da populao microbiana:

- agente antimicrobiano, assepsia, assptico, antissepsia, bactericida,
bacteriosttico, desinfeco, esterilizao, germicida, saneador, sanitizao
- agentes fsicos: radiaes, calor, filtrao
- agentes qumicos

b. Atividade antissptica do sabo, lcool e lcool iodado:

Observao de existncia de bactrias na superfcie do dedo:

1. Pegar uma placa de Agar simples e fazer a semeadura utilizando a ponta do
polegar (fazer a impresso digital suavemente para no ferir a camada do meio
de cultura).
2. Em seguida, lavar o dedo com sabo .
3. Aps 1 minuto, fazer a impresso digital no 2 quadrante da placa.
4. Repita a operao com os demais antisspticos.
5. Incubar a placa a 37 C por 24 horas.

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4 3

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c. Atividade do agente fsico: calor

1. Cultura de E. coli em caldo. Para o primeiro inculo , marcar t = zero, coloc-

lo em gua fervente por 5, 10 e 20 minutos.
2. Aps cada intervalo de tempo retirar um inculo marcando t 5, t10,e t20. Incubar
a 37 C por 24 horas.
3. Repetir a tcnica com a cultura de Bacillus sp.

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d. Atividade de diferentes agentes qumicos:

1.Semear uma cultura bacteriana com swab (para crescimento confluente) em

uma placa de Petri com agar simples.
2.Assepticamente, com pina, embeber discos de papel de filtro com diferentes
agentes qumicos.
3. Colocar os discos eqidistantes na placa semeada.
4. Incubar a 37 C por 24 horas.
5. Leitura e interpretao dos dados obtidos.
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ASSUNTO:
- Diluio
- Contagem de u.f.c.viveis
- Obteno de Cultura Pura

Objetivos:

1. Metodologia de Diluies
2. Plaqueamento para contagem de u.f.c. viveis
3. Contagem de u.f.c. viveis
4. Obteno de cultura pura

Material:

- Tubos com 9mL de salina

- Placas de Petri com Agar simples
- Alas de Drigalski
- Cubas com lcool 70
- Agar inclinado
- Caldo simples
- Cultura bacteriana em caldo
- Pipetas de 1mL

Prtica para executar

a. Diluio
A partir da cultura bacteriana, inocular 1mL em 9mL de salina, homogeneizar, retirar
1mL e transferir para outro tubo com 9mL de salina...
Obtendo assim, as diluies 1/10, 1/100, 1/1000...

b. De cada diluio inocular 0,1mL, em duplicata, na superfcie do meio de Agar

simples. Semear por distenso com ala de Drigalski. Incubar a 37C por 24 horas.

c. Contagem da u.f.c. com diluio n placa 1 + n placa 2 aplicar na frmula:

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u.f.c. = n encontrado x diluio x inoculo

d. Repicar u.f.c. para Agar inclinado e caldo simples.

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ASSUNTO:
- Colorao Simples
- Morfologia
Objetivos:

1. Identificao dos vrios tipos de corantes de acordo com os diversos mtodos de

colorao empregados em Bacteriologia.
2. Preparao de esfregaos partindo de meio lquido e de meio slido.
3. Fixao de esfregao por meios fsicos e qumicos.
4.Colorao simples.
5. Observar formas e arranjos bacterianos atravs de preparaes fixadas e coradas.

Material:

- Azul de metileno ou fucsina

- Soluo salina
- Lminas
- Culturas em meios lquido e slido
- Ala e agulha de platina

Prtica para executar

1. Introduo da tcnica sobre corantes, sua classificao (naturais, artificiais, bsicos e

neutros) e quanto ao veculo. Tcnicas de colorao simples, duplas e mistas.
2. Preparo de esfregaos e fixao por meios fsicos e qumicos.

a) Preparo das lminas

As lminas novas oferecem maior garantia para a confeco de boas preparaes
coradas, no obstante as mesmas possam ser recuperadas depois de usadas. O processo
de limpeza e esterilizao dessas lminas implica numa srie de medidas que
passaremos a enumerar: lavar com gua e sabo, mergulhar em soluo detergente e
deixar em ebulio por cerca de 1 a 2 horas, lavar novamente em gua corrente, escorrer
e rinsar com gua destilada, escorrer e secar. As lminas devem ser colocadas em
frascos fechados contendo lcool.

As preparaes coradas so feitas em 3 tempos:

1 esfregao
2 fixao
3 colorao

b) Esfregao
- Tirar do frasco uma lmina esterilizada e enxugar bem
- Flambar, rapidamente, nos dois lados da lmina
- Flambar a ala de platina ao rubro e deix-la esfriar prximo chama
- Tomar o tubo de cultura (em caldo) com a mo esquerda e com os dedos mdio e
anular da mo direita remover o tampo de algodo da boca do tubo
-Flambar a boca do tubo de cultura
- A ala de platina, segura entre o polegar e o indicador da mo direita, ser introduzida
no interior do tubo at tocar no meio de cultura

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- Flambar novamente a boca do tubo
- Fechar o tubo com o tampo de algodo e coloc-lo na estante
- Tomar a lmina com a mo esquerda e depositar no centro da mesma uma gotcula
(uma alada``) da suspenso bacteriana
- Com movimentos de rotao da ala de platina, o material deve ser bem espalhado a
fim de se obter um esfregao de forma oval, bem fino e uniforme
- Deixar secar ao ar e marcar com lpis dermatogrfico do lado oposto onde se situa a
preparao

Em se tratando de material de cultura em meio slido, deve ser observado o seguinte:

- Depositar uma pequena gota de gua destilada ou soluo fisiolgica estril no centro
da lmina
- Tocar a colnia com uma agulha de platina esterilizada e suspender a mesma na
gotcula d`gua, de forma a obter um esfregao fino e uniforme

c) Fixao do material
A fixao evita que o material se desprenda no decurso das manipulaes posteriores.
Pode ser feita por:

# Agentes Fsicos (calor) consiste em passar a lmina, com a face onde se acha o
esfregao para cima, na chama do bico de Bunsen 2 a 3 vezes rapidamente

# Agentes Qumicos utiliza-se uma substncia qumica como lcool metlico, lcool
etlico, lcool-acetona, ter-acetona, formol etc., deixando-se em contato com os
esfregaos dessecados durante alguns minutos (2 a 10 minutos).
O fixador pode ser posto sobre o esfregao convenientemente protegido contra a
evaporao rpida, ou ento o preparado ser mergulhado no fixador contido em
recipientes apropriados.

3. Colorao Simples , Mtodo fixado e corado

a. Preparo do esfregao
b. Fixao
c. Colorao
Cobrir o esfregao com a soluo de azul de metileno ou fucsina diluda durante 5
minutos . Lavar, secar com papel de filtro e observar com objetiva de imerso.
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ASSUNTO:
- Colorao de Gram

OBJETIVOS:

1. Observar e interpretar o mecanismo de reao de Gram como um mtodo de

colorao diferencial.
2. Discutir as vrias etapas da metodologia e a importncia taxonmica do mtodo na
Bacteriologia.

MATERIAL:

- Lminas.
- Culturas em meios lquido e slido.
- Ala e agulha de platina.
- Cristal violeta.
- Lugol.
- lcool etlico.
- Fucsina de Ziehl.

PRTICA PARA EXECUTAR

COLORAO DE GRAM (MTODO CLSSICO)

a. Preparar um esfregao fino, secar a temperatura ambiente e fixar pelo calor.

b. Cobrir o esfregao seco e fixado com a soluo de cristal violeta (corante) durante 1
minuto.
c. Esgotar a lmina e cobrir com lugol (mordente) durante 1 minuto.
d. Inclinar a lmina 45 e lavar em gua corrente.
e. Mantendo-a inclinada, diferenciar (lavar) com lcool 95 GL (diferenciador).
f. Lavar e depois cobrir a preparao com soluo diluda de fucsina de Ziehl (contra-
corante) (15 a 30 segundos).
g. Lavar e secar entre duas fitas de papel de filtro, delicadamente.
h. Colocar uma gota de leo de cedro no centro do esfregao.
i. Observar com a objetiva de imerso.

Vi Lulu Ali A Fumar Algo

Violeta
Cristal

Fucsin
lcool
Lugol

gua

gua
a

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Notas:

1. O etanol poder ser usado como agente descorante fraco.

2. O material dos corantes empregados na tcnica, principalmente sedimento do cristal
violeta poder aparecer como artefato.
3. O descoramento para mais ou para menos resultante de incorreta diferenciao pelo
lcool.
4. A idade da cultura bacteriana tem importncia fundamental na colorao de Gram.
Em culturas envelhecidas, clulas Gram-positivas freqentemente se tornam Gram-
negativas. Enzimas lticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem
causar danos membrana da clula, como por exemplo, alterando a permeabilidade dos
solventes. Conseqentemente, o complexo iodo-cristal violeta poder ser retirado da
clula.
5. Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou Gram-negatividade da
cultura, uma colorao de Gram paralela aconselhvel. Para isto, deve-se usar culturas
bacterianas conhecidas como G+ (Staphylococcus aureus) e G- (Escherichia coli) como
controle.

Interpretao: Bactrias G+ coradas em roxo.

Bactrias G- coradas em vermelho.

O mecanismo da colorao de Gram se refere a composio da parede celular,

sendo que as G+ possuem uma espessa camada de peptideoglicano e cido teicico, e as
G-, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada
composta por lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas e lipopolissacardeos. Durante o
processo de colorao, o tratamento com lcool (ou lcool-acetona) extrai os lipdeos,
da resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das G-.
Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as G- so descoradas.
A parede celular das bactrias G+, em virtude da sua composio diferente, torna-se
desidratada durante o tratamento com lcool, a porosidade diminui, a permeabilidade
reduzida e o complexo CV-I no pode ser extrado.
Outra explicao baseia-se tambm em diferenas de permeabilidade entre os dois
grupos de bactrias. Nas bactrias G+, o complexo CV-I retido na parede aps o
tratamento pelo lcool, o que causa, provavelmente, uma diminuio do dimetro dos
poros da camada de glicopeptdeo ou peptideoglicano da parede celular. Os poros da
parede das bactrias G- permanecem suficientemente grandes, mesmo depois do
tratamento pelo lcool, possibilitando a extrao do complexo CV-I.
Segundo Trabulsi, na etapa diferencial com o lcool, as bactrias G- devido
pequena espessura da camada basal e s descontinuidades existentes nesta camada, em
pontos de aderncia entre a membrana externa e a membrana celular, tm o complexo
corado extrado pelo lcool que deixa as clulas descoradas.
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ASSUNTO:
- Cocos Gram-positivos

OBJETIVOS:

1. Isolamento de bactrias das vias areas superiores.

2. Identificao bioqumica atravs da interpretao do metabolismo microbiano.

MATERIAL:

- cultura de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis

- Placas de Chapman
- Tubos de caldo simples
- Tubos com plasma citratado
- Tubos com Agar simples
- Tubos com gua destilada estril
- Placas DNAse

- Bateria de Gram
- gua oxigenada a 30%
- Swabs
- Soluo salina estril
- Lminas, alas...
- Microscpio

PRTICA PARA EXECUTAR

1 DIA:

a. inocular swab de orofaringe em Caldo Hitchens-Pike

b. inocular swab de nasofaringe em Agar Chapman pela tcnica de esgotamento

2 DIA:

semear material do crescimento em Hitchens Pike em placa de Agar Sangue, pela

tcnica de esgotamento
inocular a UFC tpica de Staphylococcus nas provas bioqumicas (catalase,
coagulase e DNAse)
realizar a colorao de Gram

3 DIA:

a. leitura e einterpretao da placa de Agar Sangue

leitura e interpretao das provas bioqumicas

Identificao das bactrias de importncia mdica

material de colheita: secrees, lquidos biolgicos e outros

Cocos Gram positivos aerbios

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Dentre as duas famlias conhecidas (Microcacceae e Streptococcaceae), trataremos dos
gneros e das espcies de interesse patognese das infeces.

I. Staphylococcus

Este gnero, membro da famlia Micrococcaceae, constitudo de vrias espcies,

sendo trs de maior interesse humano (S. aureus, S. epidermidis, S, saprophyticcus). So
microorganismos esfricos, imveis, gram positivos, que crescem em cachos. Causam
diferentes doenas supurativas tais como: furnculo, impetigo, osteomielite, abcessos de
tecidos, pneumonia, meningite, artrite purulenta, etc. Algumas amostras (S. aureus)
produzem uma enterotoxina que provoca um quadro agudo de intoxicao alimentar,
enquanto outros (S. aureus e S. saprophyticcus) causam infeces do trato urinrio. So
membros normais da microbiota anfibintica da pele e membranas mucosas.
A colheita do material deve ser realizada com o mximo de assepsia: swab de
nasofaringe, fezes, urina. Em se tratando de sangue, este dever ser colhido com
heparina, ou ser desfibrinado, nunca utilizar citrato de sdio, pois o sdio inibe G +,
principalmente em pH prximo a 6.
So inibidos pela presena de corantes do tipos Azul de Metileno e Violeta de
Genciana. Crescem em meio de Agar Simples, Agar Sangue e Chapman. Suas colnias
so redondas, elevadas, opacas e de colorao amarelo-dourado a branco. Cresce em
presena de altas concentraes de NaCl, sendo este um fator de estimulao da
produo da enzima coagulase.
O meio Chapman seletivo, porque contm 7,5% de NaCl; indicador porque
possui manitol e o indicador Vermelho de Fenol, as UFCs fermentadoras do manitol
apresentam-se com colorao amarelas aps 24 48 horas de incubao a 37C. Aps o
crescimento de colnias tpicas fazemos a colorao de Gram para observarmos a
presena de cocos Gram + dispostos em grupos (cachos) ou isolados.
Diferenciamos o gnero Staphylococcus do gnero Streptococcus atravs da prova
da catalase. A diferenciao das espcies do gnero se d atravs das provas de
fermentao do manitol, da coagulase, da DNAse, da sensibilidade a novobiocina e da
reduo de nitratos.

Provas bioqumicas

- Prova da Catalase:
A catalase uma enzima responsvel pela neutralizao de formas txicas do
oxignio ao microorganismo (perxidos e superxidos).
Na prova, utilizado o perxido de hidrognio (H2O2). Se o microorganismo
produzir catalase, o H2O2 (gua oxigenada) ser degradado em H2O e O2 (oxignio
molecular). A reao observada atravs do desprendimento de bolhas gasosas (O 2) da
cultura aps a adio de gua oxigenada a 30%.
A prova pode ser realizada com o microorganismo obtido em qualquer meio de
cultura.

- Fermentao do Manitol:
O manitol um acar que alguns microorganismos so capazes de utilizar como
fonte de energia,a travs da fermentao. A prova se baseia na alterao do pH do meio,
graas a produo de cidos durante o processo de fermentao. Essa mudana de pH
pode ser observada pela viragem de cor do meio devido a presena do indicador de pH

12
Vermelho de Fenol. A prova pode ser realizada em meios de cultura lquidos ou slidos.
Aps a semeadura, o meio deve ser incubado a 37C por 18 24 horas.

Interpretao:
positivo: amarelo
negativo: no h alterao da cor

- Prova da coagulase:
A coagulase estafiloccica se apresenta em duas formas: coagulase ligada e
coagulase livre.
A coagulase ligada, presente na parede da clula bacteriana, converte o
fibrinognio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulao, e
pode ser detectado em teste direto em lmina, utilizando-se da suspenso de
Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos
circulares e observando-se a formao de cogulo no tempo de 1-2 minutos. Pode-se
tornar mais sensvel o teste em tubo, por este detectar tanto a coagulase livre quanto a
ligada, sendo a prova de escolha.
A coagulase livre produzida e liberada pelo microorganismo, reagindo com o
fator de coagulao do plasma, CRF, formando uma substncia semelhante, mas no
idntica, trombina, que converte fibrinognio em fibrina. Para o teste, utiliza-se
plasma citratado humano ou de coelho, estril, diludo em soluo salina na proporo
de 1:5. a reao ocorre volume a volume a 37C.
Estudos recentes demonstraram que a produo da enzima coagulase se intensifica
quando o microorganismo crescido e meio contendo alta concentrao de NaCl. Desta
forma, aconselha-se a utilizao de colnias para a prova, crescidas em Agar Manita
(Agar Manitol Salgado) contendo NaCl e Vermelho de Fenol. Este procedimento
aumentaria a sensibilidade do teste.
A prova consiste da semeadura de uma alada do microorganismo em estudo em
tubo contendo o plasma diludo e incubao a 37XC. A menor coagulao
considerada positiva. Devem ser feitas leituras peridicas a cada 2 horas, por at 24
horas, pois algumas espcies produzem fibrinognio, que dissolve o cogulo formado.
Aconselha-se tambm utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S.
aureus.

- Prova da DNAse:
Alguns microorganismos so capazes de utilizar o DNA presente no meio como
fonte de energia, atravs da produo da enzima DNAse.
No meio com DNA deve ser feita uma estria simples (reta) ou um spot (ponto de
semadura) central com o microorganismo em estudo. Incubar a 37C por 24 horas e
adicionar ao meio HCl 1N e aguardar a turvao do meio.
Lembrando que o DNA material protico e que o HCl, como cido, tem poder
desnaturante sobre as protenas, a turvao do meio apenas a precipitao do DNA
desnaturado. Se a bactria produzir DNAse, todo o DNA ao seu redor ter sido
degradado, ento ao adicionar o HCL no haver turvao nesta rea. Portanto, se
houver um halo claro ao redor do crescimento bacteriano, o resultado positivo.

- Sensibilidade a Novobiocina
Semear o microorganismo suspeito em placa de Agar simples ou Mueller Hinton
com swab, para obteno de crescimento confluente, e adicionar o disco de novobiocina

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(5g/ml). Incubar a 37C por 24 horas. As bactrias resistentes no apresentaro halo de
inibio, enquanto as sensveis sim.

Interpretao das provas bioqumicas

Provas bioqumicas S. aureus S. epidermidis S. sapophyticus

Catalase + + +
Fermentao do manitol + - -
Coagulase +/- - -
DNAse + - -
Sensibilidade a novobicina R S R
Reduo de nitratos + -

I. Streptococcus

O gnero apresenta espcies de interesse mdico, como: Streptococcus viridans e

Streptococcus pneumoniae. Apresentam-se em forma de cadeia ou em pares, e so Gram
positivos.
Os Streptococcus foram descritos em 1874 por Billroth, causando exsudato
purulento em leses de erisiplela e em feridas infectadas. Em seguida, foram isolados do
sangue de pacientes em estado febril, e da garganta de crianas com escarlatina.
Em 1903, Schottmuller props que os estreptococos fossem classificados
conforme a capacidade de lisar hemcias in vitro. Em 1919, Brown chamou de , e
as lises observadas nas hemcias em placas de Agar sangue.
Os estreptococos hemolticos apresentam zonas de hemlise parciais, com
hemcias integras na parte mais interna (junto colnia) e hemlise maior na parte mais
externa. Frequentemente aparece uma colorao esverdeada na rea de hemlise
(devido a alterao da hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da clula bacteriana), que
originou a qualificao estreptococos do grupo esverdecente ou Streptococcus
viridans. O Streptococcus pneumoniae apresentam hemlise e colnia puntiforme
com aprofundamento no pice da colnia (parecendo um pequeno vulco)
Os estreptococos hemolticos produzem uma zona de hemlise total,, no se
observando hemcias ntegras (microscpio ptico com objetiva de 10x). O
Streptococcus pyogenes apresenta dois tipos de hemolisinas: O e S a hemolisina O
destruda pela ao do oxignio atmosfrico, e, portanto, s demonstrada em colnias
crescidas em profundidade no Agar Sangue. A hemolisina S estvel ao oxignio do ar
e produz hemlise mesmo nas colnias crescidas na superfcie do meio de cultura.
Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam hemolisina O, se torna necessria a
semeadura do microorganismo pela tcnica do pour-plate.
Os estreptococos so anemolticos, ou seja, no produzem hemlise nomeio.

Cultura (pour plate)

Fazer uma suspenso do material colhido em um tubo contendo 1 ml de soluo

fisiolgica estril e adicionar a uma placa de Petri estril. Juntar o Agar Sangue fundido
e resfriado e promover a difuso do inculo no meio atravs de movimentos circulares.
Incubar a 37C por 18 horas em atmosfera de microaerofilia ara melhor rendimento, ou
jarra com vela.

14
Leitura

Observao do tipo de hemlise em Agar Sangue.

Provas bioqumicas

- Prova da optoquina:
Colocar um disco de optoquina na superfcie do Agar Sangue (pode-se incluir no
antibiograma). Havendo impedimento do crescimento das colnias ao redor do disco de
optoquina (2 cm de dimetro), trata-se de teste positivo.

- Bile solubilidade:
A prova realizada conforme esquema que se segue:
a 1,0 ml de cultura em calo, adicionar uma gota de vermelho de fenol
acertar o pH em aproximadamente 7,5 com NaOH 0,1N (cor rsea)
adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sdio ou blis
incubar juntamente com o tubo sem blis a 37C por 3 horas

* clareamento: positivo
* inalterado: negativo

- Bacitracina:
Utilizar discos impregnados com bacitracina (0,04 U) colocados na superfcie do
meio de cultura semeado com o microorganismo em estudo (pode-se incluir no
antibiograma) e incubar a 37C por 24 horas em microaerofilia.

* Grupo A: sensvel a bacitracina

* demais grupos: resistentes

- Crescimento a 56C:
Para evitar dvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus faecalis),
submeter a cultura a um aquecimento a 56C por 30 minutos. Somente os enterococos
resistem a este tratamento.

15
- Crescimento em Agar Chapman:
Os enterococos toleram altas concentraes de NaCl, como acontecem com
Staphylococcus.

- Crescimento em Agar EMB:

Os enterococos suportam a presena de corantes, como o azul de metileno

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ASSUNTO:
- Provas Bioqumicas para a Identificao de Bacilos Gram-negativos

OBJETIVO

Identificar enterobactria em gneros ou espcies, utilizando-se para isso vrios

meios de cultura especiais, de acordo co o esquema a seguir:

1. Plaqueamento Seletivo
Etapa de isolamento bacteriano a partir de espcies clnico, utilizando meios
seletivo-indicadores como o Agar EMB. Neste meio as bactrias Gram positivas so
inibidas pela presena de eosina e azul de metileno. As bactrias Gram negativas
fermentadoras de lactose ( LAC + ) apresentam-se como colnias rosa-avermelhadas
com ou sem centro negro, enquanto as no-fermentadoras ( LAC - ) formam colnias
transparentes.

2. Triagem

Conjunto de provas bioqumicas realizadas simultaneamente em 1 ou 2 meios,

permitindo uma diferenciao inicial dos isolamentos e direcionamento da
contaminao bioqumica. Quando realizada em meio TSI, podemos observar:
- Fermentao de glicose e produo de gs
- fermentao de lactose e/ou sacarose
- produo de H2S
Bactrias que utilizam apenas glicose provocam acidificao (de colorao
amarela) apenas na base, permanecendo o pice alcalino (de cor avermelhada).
Bactrias fermentadoras de lactose e/ou sacarose acidificam todo o meio. A formao de
gs evidenciada pelo rompimento ou descolamento do meio. A produo de H 2S se
manifesta pelo escurecimento do meio.

3. Confirmao Bioqumica

Conjunto de provas necessrias para a identificao bioqumica das colnias

suspeitas. Algumas dessas provas esto descritas abaixo:

a. Fermentao de Carboidratos: glicose, lactose, manitol, sacarose.

A utilizao dos carboidratos leva formao de cidos, com viragem do indicador
(vermelho de fenol) para cor amarela. A partir da glicose podemos observar tambm a
produo ou no de gs (CO2, H2) no interior do tubo de Durha.
A inoculao realizada a partir de cultura bacteriana overnight (+/- 18h) em
Agar. Incubar por 24 horas a 37C.
Leitura: cor amarelada = + (positivo)
sem alterao

b. VM: Verifica a ocorrncia de fermentao cido-mista ( glicose cidos

estveis).

Meio: Clark & Lubs.

Inoculao: idem ao item a. Aps incubao ( 48 h ), adicionar 3 5 gotas do
reativo de VM ( vermelho de metila alcalino = amarelo plido / cido = vermelho).

17
 Leitura: Cor vermelha = +
Cor amarela = -

c. VP ( Voges & Proskauer ): verifica a ocorrncia de fermentao acetonica

(glicoseacetona).
Meio: Clark & Lubs (meio glicosado e tamponado).
Inoculao: idem ao item a. Aps inoculao (48 h), adicionar os reativos:
VP I (Barrit I): alfa-naftol (0,6 mL)
VP II ( Barrit II): KOH 40% (0,2 mL)
Leitura (aps 10 15 minutos):
*observar o aparecimento de anel vermelhos na superfcie do tubo
(resultado positivo)
*sem alterao: resultado negativo

d. Citrato: verifica a utilizao do citrato como nica fonte de carbono.

Meio: Citrato de Simmon.
Inoculao: idem ao item a.
Leitura:
meio azulado = -
sem crescimento = -

e. Indol: verifica a produo de triptofane, que quebra triptofano, liberando indol,

este revelado com o reativo de Kovacs, observa-se a formao de um anel
escarlate na superfcie do meio.

Meio: Caldo semi-slido (SIM).

Inoculao: idem ao item a. aps a inoculao, adicionar 5 gotas do Reativo de
Kovacs.
Leitura: cor rosa = +
sem alterao = -

f. Mobilidade: verifica se a bactria mvel ou imvel.

meio: Agar semi-slido (SIM).

Inoculao: utilizar agulha bacteriolgica, fazendo uma picada central at da
profundidade do tubo.
Leitura: crescimento fora do local da picada = + (mvel)
crescimento somente ao redor da picada = - (imvel)

g. Nitrato: verifica a capacidade de reduo do nitrato ( NO3) nitrito (NO2).

Inoculao: idem ao item a. Aps incubao, adicionar 3 a 5 gotas dos reativos:

Nitrato A: alfa naftilamina
Nitrato B: cido sulfanlico
Leitura: cor vermelha (violcea, escarlate) = + (liberao de NH3)
sem alterao = -

h. Uria: meio contendo uria para verificar a produo da enzima urase.

Inoculao : idem ao item a.

18
 Leitura: cor vermelha (violcea, escarlate) = + (liberao de NH#)
sem alterao = -

RESULTADO ESPERADOS NOS TESTES BIOQUMICOS

CARACTERSTICA E. coli Salmonella Klebsiella Proteus

EMB Lac + Lac - Lac + Lac

TSI c/c alc/c ac/ac lc/c ou ac/ac
H2S - + - +
Glicose + + + +
Gs + + + +
Lactose + - + -
Sacarose V - + V
Manitol + + + V
VM + + + +
VP - - - -
Citrato - V + (5 dias) -
Indol + - - V
Mobilidade V + - +
Nitrato + + + +
Uria - - V +
Tabela 1 Identificao bioqumica de alguns gneros de enterobactrias.

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ASSUNTO:
- Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA)
Mtodo de Kirby-Bauer

OBJETIVOS:

1. Determinar a sensibilidade de uma bactria frente a antimicrobianos, para a escolha

da droga mais adequada no tratamento de uma doena.
2. Interpretar um antibiograma.

MATERIAL:

- cultura recente do microorganismo em teste

- discos com antimicrobianos
- placas com Agar Mueller-Hinton
- swabs estreis
- pinas, rgua graduada

PRTICA PARA EXECUTAR:

1. Inculo:
Cultura pura, em fase log, padronizado, diluda at obteno de turvao semelhante ao
tubo n 0,5 da escala de McFarlnd (1,0x108)

2. Meio
Mueller-Hinton, recente, em camada de 4 5 mm, pH = 7,2 7,4, com umidade
adequada. Em alguns casos pode ser enriquecido com 5% de sangue, etc.

3. Semeadura
Inocular a cultura a ser testada na superfcie do agar, com o auxlio de um swab, para
um crescimento confluente.

4. Antimicrobianos
Com o auxlio de uma pina flambada, aplicar os discos com antimicrobianos sobre o
meio recm-semeado de modo eqidistante.
Identificar a placa e incubar a 37C por 18 24 horas em posio invertida.
Ocorrer difuso das substncias e suas concentraes diminuem gradativamente a
medida que se afastam do disco.
A eficincia de uma droga demonstrada pelo aparecimento de um halo de inibio do
crescimento do microorganismo.

5. Leitura
Com o auxlio de uma rgua graduada, medir o dimetro dos halos de inibio,
incluindo o dimetro do disco.

6. Interpretao
Interpretar a sensibilidade aos antimicrobianos de acordo com o dimetro do halo de
inibio encontrado em tabelas padronizadas que contm os valores em mm, para as
drogas disponveis comercialmente.

20
7. Controle
Usar como controles os seguintes microorganismos, de acordo com as drogas utilizadas:
- Staphylococcus aureus ATCC 25923
- Escherichia coli ATCC 25922
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Antimicrobiano Potncia Dimetro do halo de inibio

R I S
Ampicilina (AM) 0,01 mg 11 12 13 14
cido Nalidxico (NA) 0,03 mg 13 14 18 19
Cloranfenicol (C) 0,03 mg 12 13 17 18
Sulfa-Trimetropim (STX) 0,03 mg 10 11 15 16
Cefoxitina (CT) 14 15 17 18
Eritromicina (ERI) 13 14 22 23
Estreptomicina 11 12 14 15
Cefalotina 14 15 17 18
Polimixina 8 09 11 12
Sulfazotrim 10 11 15 16

Notas:

1. leituras de 4 e 6 horas podero ser feitas em caso de emergncia, mas leituras

definitivas devero ser feitas somente aps o tempo estipulado (18 24 horas)

2. No usar sinais para expressar os resultados. Usar as letras S para os

microorganismos sensveis e R para os microorganismos resistentes.

3. Lembrar que um halo de inibio maior que outro no indica propriamente uma
maior atividade do antibacteriano sobre o microorganismo em teste. Outros fatores,
como carga antibitica, difusibilidade, etc., intervm na formao dos halos. Portanto,
deve ser utilizada a tabela na interpretao dos resultados.

4. Atualmente, no intuito de minimizar erros de interpretao, considera-se a

sensibilidade intermediria como resistente.

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21
ANEXO I

TCNICAS DE COLORAO

A utilizao de corantes em microbiologia atribuda a Goeppert e Cohn (1849).

Os corantes empregados, geralmente derivados da anilina, tm frmula
quimicamente complexa, e so obtidos por sntese; quase sempre so sais de potssio ou
de sdio, sendo classificados em: naturais, entre os quais podemos citar o carmim e a
hematoxilina, e artificiais, que se dividem em: bsicos ou nucleares, cidos ou
citoplasmticos e neutros.

As clulas bacterianas so ricas em cido nuclico, conduzindo cargas negativas

sob a forma de grupamentos fosfato, e estes se combinam com os corantes bsicos, que
so carregados positivamente. Os corantes cidos no coram as clulas bacterianas, e
por isso podem ser utilizados para corar o material de fundo com uma cor contrastante.

As solues corantes so classificadas quanto ao veculo nos seguintes grupos:

solues aquosas, solues hidroalcolicas e solues hidroalcolicas mordentes.
Utilizam-se as solues aquosas quando se quer preservar a vitalidade dos
microorganismos. A adio de substncias mordentes tem a vantagem de preserv-las da
contaminao mais ou menos estvel entre ambas, como exemplos de substncias que
funcionam como mordentes citamos o fenol, iodo, formol e tanino.
As coloraes podem ser simples, quando utilizamos um s corante, duplas e
mistas. Assim podemos ter uma noo da morfologia dos germes utilizando uma
colorao simples, e de outras informaes com o emprego de tcnicas especiais de
colorao, como por exemplo para diferenciar flagelos, cpsulas, paredes celulares,
membranas celulares, grnulos, ncleos e esporos.

I. MTODO DE GRAM (DIFERENCIAL)

Esse mtodo de colorao importante em taxonomia bacteriana.

Desde sua descoberta (1884) foi intensamente estudado e muitas modificaes
propostas sem, contudo, modificar a idia original.

A reao de Gram depende do estado fisiolgico da clula, enquanto que as culturas

jovens respondem melhor a diferenciao tintorial, as culturas velhas tendem a perder a
capacidade de reteno do corante, levando um Gram positivo a se apresentar como
Gram varivel.
A explicao do mecanismo de colorao de Gram baseia-se em diferenas existentes na
composio da parede celular das bactrias Gram positivas e Gram negativas.
As bactrias Gram positivas contm, na parede celular, glicopeptdeos e cido teicico,
enquanto que as bactrias Gram negativas possuem glicopeptdeos e
lipopolissacardeos, lipoprotenas e fosfolipdeos.

A colorao de Gram inicia-se com a aplicao de cristal violeta, a seguir aplica-se

lugol (soluo de iodo), que sendo um mordente, fixa o cristal violeta a clula formando
com ele um complexo denominado iodopararosanilina. At esta etapa, todas as bactrias
esto roxas.

22
Ao lavarmos as clulas com a soluo de lcool-acetona, lcool-ter ou ainda lcool
puro, as bactrias G- so descoradas, enquanto que as G+ retm o complexo
iodopararosanilina, devido a sua parede celular funcionar como uma barreira a eluio
do complexo corante pelo lcool.

Aparentemente, o lcool dissolve os lipdeos da parede das bactrias G- aumentando a

sua permeabilidade e facilitando a sada do complexo iodopararosanilina, enquanto que
nas bactrias G+ o lcool age como desidratante, diminuindo a porosidade e a
permeabilidade e, consequentemente, retendo o complexo.
Essa explicao apoiada na observao de que protoplastos obtidos no tratamento de
bactrias G+ por lisozima no retm o complexo corante. A menor espessura da parede
celular das bactrias G- tambm pode facilitar; porm importante a observncia do
tempo de uso do diferenciador neste mtodo, pois um descoramento de tempo superior a
15 segundos acarreta o descoramento, inclusive, das bactrias G+.

Em geral, todos os cocos so G+, com exceo do gnero Neisseria e todos os

bastonetes so G-, exceto o gnero Bacillus (aerbio, esporulado), Clostridium
(anaerbio), Corynebacterium, Listeria e Lactobacillus.
O gnero Mycobacteriaceae, embora sendo considerado G+ por alguns autotes, cora-se
irregularmente.
Os vibries so G- e as leveduras coram-se como as bactrias G+.

O mtodo de Gram no se aplica as bactrias espiraladas.

Este mtodo de grande importncia na sistemtica bacteriana, pois atravs dele

podemos classificar as bactrias em dois grupos: bactrias Gram positivas (roxas) e
bactrias Gram negativas (rosas).

OBJETIVOS

1. Avaliao da importncia taxonmica do mtodo de Gram;

2. Interpretao da ao e funo dos reagentes.

Tcnica:

A. Preparao do esfregao:
Lmina nova ou estocada em lcool.
Flambar no bico de Bunsen.
Deixar esfriar.

Cultivo em meio lquido

Transferir assepticamente com ala os microorganismos, colocando o inoculo no
centro da lmina e espalhar (aproximadamente 1,0 a 1,5 cm);
Secar ao ar livre at evaporao total (ou na chama sem aquecer em demasia);
Fixar a preparao passando a lmina na chama do bico de Bunsen 3 vezes
(repetir esta etapa quantas vezes forem necessrias, sem aquecer a lmina em
demasia);
Deixar a lmina esfriar antes de iniciar a tcnica de colorao.

23
 Cultivo em meio slido
Colocar uma gota de gua destilada estril, soluo salina ou meio lquido
estril no centro da lmina;
Tocar, assepticamente, com agulha estril uma colnia.
Homogeneizar o material colhido no lquido da lmina, espalhando a
suspenso;
Secar, fixar e esfriar como citado acima.

B. Colorao Simples:

1. Fazer um esfregao com suspenso bacteriana;

2. Cobrir o esfregao com qualquer corante por 1 minuto (fucsina, azul de
metileno, violeta de genciana e cristal violeta);
3. Lavar com gua;
4. Secar com papel de filtro (sem esfregar);
5. Observar ao microscpio ptico com objetiva de imerso e iluminao forte.

C. Colorao Dupla: Mtodo de Gram:

1. Fazer um esfregao fino como descrito anteriormente;

2. Fixar a lmina pelo calor o calor provoca a termocoagulao das protenas,
com aderncia do material lmina e morte do microorganismo. Esfriar;
3. Corar cobrindo a lmina com soluo de cristal violeta ou violeta de genciana
durante 1 minuto;
4. Desprezar o excesso de corante e adicionar lugol por 1 minuto (mordente);
5. Lavar com gua;
6. Diferenciar rapidamente com lcool-acetona por aproximadamente 10 a 15
segundos (diferenciador);
7. Lavar com gua imediatamente, para evitar que o diferenciador continue agindo;
8. Corar com fucsina diluda por 30 segundos (2 corante);
9. Lavar com gua;
10. Secar entre 2 folhas de papel de filtro (sem esfregar);
11. Examinar utilizando objetiva de imerso, leo de cedro e iluminao forte.

D. Interpretao de resultados:

Microorganismos Gram positivos: azuis-arroxeados (com parede celular mais

espessa e sem lipdeos).
Microorganismos Gram negativos: vermelhos/rosas (com parede celular mais
fina e com lipdeos).

Solues reagentes:

1. Cristal violeta:
- Cristal violeta 1,0g
- lcool a 95 10mL
- gua 100mL

24
2. Lugol:
- Iodo 1,0g
- Iodeto de potssio 10mL
- gua 300mL

3. Fucsina:
- Fucsina bsica 0,3g
- Fenol 5,0g
- lcool a 95 10mL
- gua 100mL

Dever ser diluda 1:10 para ser utilizada no mtodo de Gram. Existem vrias
modificaes introduzidas no mtodo visando melhora-lo, uma das utilizadas a de
Kopeloff-Beermann. Com adio de bicarbonato de sdio soluo de cristal violeta e a
substituio da soluo de fucsina por safranina. As principais vantagens deste mtodo
modificado: no iro sofrer interferncia de pH (como a acidez do pus) e, preservar as
bactrias G+ que se descoram facilmente (Gram lbeis).

4. lcool-acetona proporo 1:1.

II. TCNICAS DE COLORAO ZIEHL-NEELSEN

As micobactrias constituem um grupo que causa doenas no homem e nos

animais superiores. No homem essas doenas variam de infeces superficiais at a
tuberculose. Atualmente, constituem um dos maiores problemas em pases
desenvolvidos, podendo causar, alm da tuberculose bovina, a Doena de Johne e
doenas em roedores, rpteis, peixes e galinhas.

As micobactrias so microorganismos encontrados com facilidade no meio ambiente,

com exceo do Mycobacterium tuberculosis e M. leprae. Pertencem ao gnero
Mycobacterium e se apresentam como bacilos longos, delgados, retos ou ligeiramente
encurvados, imveis e aerbios. So bacilos lcool-cido resistentes (BAARs)
apresentam crescimento lento e alto contedo lipdico na parede celular. Algumas
espcies podem crescer em meios simples, mas em geral, os meios so complexos,
como o de Lowenstein Jensen, apresentando crescimento macroscpico aps 3 a 4
semanas de incubao 37 C. Neste gnero, duas espcies produzem doenas
importantes: Mycobacterium tuberculosis e M. leprae, as demais so denominadas
atpicas e divididas em 4 grupos (grupos de Runyon I, II, III e IV).

M. tuberculosis o agente etiolgico da tuberculose, esta pode se apresentar em

diversas formas clnicas, sendo a mais comum a pulmonar (cerca de 80%), a nica
forma clnica contagiosa. O teste confirmativo para diagnstico da tuberculose a
demonstrao do M. tuberculosis em material clnico colhido do paciente suspeito,
atravs de baciloscopia pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen ou cultura em meios apropriados
(diagnstico bacteriolgico).

M. leprae o agente etiolgico da hansenase, uma doena que se caracteriza por

leses da pele, mucosas e nervos perifricos. So BAARs semelhantes ao M.
tuberculosis e caracterizam-se pela disposio em feixes ou globias. At o momento no

25
se obteve xito para o seu cultivo em laboratrio, sendo considerado parasita
intracelular obrigatrio.

A colorao de Ziehl-Neelsen uma tcnica de fcil execuo, muito til e

importante para o diagnstico clnico das micobacterioses e se fundamenta na
propriedade tintorial que tm as micobactrias de quando coradas resistirem ao
descoramento por solues lcool-cido. A evidenciao direta de BAARs no material
clnico suspeito (escarro, urina, lquor, fezes, leses de pele e lavado gstrico) apenas
presuntiva, pois no identifica a espcie observada.

OBJETIVOS:

1. Evidenciar as caractersticas morfotintoriais de M. tuberculosis e M. leprae e

micobactrias em geral.
2. Diagnstico e avaliao do tratamento de tuberculose pulmonar.
3. Diagnstico e avaliao das formas multibacilares da hansenase.

Tcnica:

1. No material suspeito, observar o aspecto, colorao e presena ou no de

sangue.
2. Na lmina limpa e desengordurada, fazer o esfregao do material com bastante
assepsia, retirando a alada da poro mais densa.
3. Flambar a ala.
4. Deixar o esfregao secar ao ar.
5. Fixar na chama do Bico de Bunsen.
6. Cobrir a lmina com fucsina de Ziehl concentrada, aquecendo a lmina at a
emisso de vapores (5 minutos).
7. Escorrer o corante e lavar com a soluo lcool-cido clordrico 3%
(diferenciador) tempo delicado.
8. Lavar com gua
9. Cobrir a lmina com soluo de azul de metileno (1 minuto)
10. Lavar, secar e observar ao microscpio com objetiva de imerso, leo de cedro e
iluminao forte.

As micobactrias se coram mal pelo mtodo de Gram. No mtodo de Ziehl-Neelsen elas

permanecem coradas, por serem BAARs, com tonalidade vermelha, enquanto as outras
estruturas e bactrias se mostram azuis.

Pelas normas estabelecidas pela Campanha Nacional contra a Tuberculose, a

interpretao da lmina pode ser:

Negativo (-) ausncia de BAARs em 100 campos microscpicos

Positivo (+) menos de 1 bacilo/campo em 100 campos
Positivo (++) 1 a 10 bacilos/campo em 50 campos
Positivo (+++) mais de 10 bacilos/campo em 20 campos

Colorao de Ziehl Neelsen para M. leprae

a. Material de leso cutnea, lbulo da orelha e cotovelo, mesmo sem leses.

26
 b. Tcnica de colorao idntica a descrita anteriormente, com exceo do
cido clordrico (1%)
c. Observar ao microscpio o agrupamento tpico.

Material necessrio:

Escarro de pacientes com tuberculose pulmonar ou

Lminas preparadas com M. leprae de linfa de leses coradas pelo Ziehl-
Neelsen
Bateria de corantes de Ziehl-Neelsen

1. Azul de metileno
Azul de metileno 1g
lcool etlico 95 GL 100 ml
gua q.s.p. 1000 ml

Triturar o corante em um gral. Adicionar o lcool aos poucos. Homogeneizar, completar

o volume com gua. Deixar em repouso por 24 horas. Filtra em papel ou algodo e
estocar em frasco mbar com tampa de rosca esmerilhada.

2. Sol. lcool-cido
Obs: deixar o cido escorrer lentamente pelas paredes do recipiente contendo lcool,
agitar suavemente.

III. TCNICA PARA EVIDENCIAO DE ESPIROQUETAS

Os organismos espiralados de significado mdico, os Treponemataceae, incluem

trs grupos patognicos para o homem e vrios outros animais: Leptospira, que causa a
leptospirose humana; Borrelia, incluindo B. recurrentis e B. vicemii, que causam febre
recorrente e a angina de Vicent, respectivamente e Treponema, responsvel pelas
doenas conhecidas como treponematoses, destacando-se T. pallidum, T. pertenue e T.
carateum, organismos que causam a sfilis, a bouba e a pinta, respectivamente e o T.
cuniculi, que causa a sfilis em coelhos. Outros treponemas incluem espcies no
patognicas encontradas na boca e genitais do homem. Nenhum dos quatro treponemas
patognicos foi ainda cultivado in vitro e nenhuma diferena morfolgica, antignica
ou metablica convincente foi observada entre eles. Os hospedeiros naturais so o
homem, os macacos superiores e os coelhos, mas todos de sangue quente at agora
testados podem ser infectados.

Atualmente, quase todos os casos de sfilis so adquiridos por contato sexual com leses
infecciosas. Meios incomuns de transmisso incluem o contato pessoal no sexual, com
fmites contaminados, transfuses sanguneas ou a infeco em tero. Uma grande
proporo das infeces extra genitais ocorre nas proximidades da boca, como resultado
da disseminao dos microorganismos pela cavidade oral durante o beijo. At o
momento, no h nenhum agente imunizante ativo como profilaxia para a infeco
siflica.

Leptospirose um termo aplicado doena causada por todas as leptospiras,

sem considerar o sorotipo especfico. A doena ocorre em uma grande variedade de

27
hospedeiros animais, domsticos e selvagens e nos seres humanos uma ocorrncia
acidental.

Por febre recorrente, entende-se um grupo de doenas infecciosas agudas

clinicamente caracterizadas por perodos de febre e aperexia. Estas doenas so
causadas por espiroquetas do gnero Borrelia e ocorrem em duas variedades
epidemiolgicas, uma transmitida pelo piolho (urbana) e outra pelo carrapato (rural). As
borrelias so tambm importantes como agentes de doenas periodontais.

A famlia Spirochaetaceae compreende bactrias de formas espiraladas, espessas

ou delgadas, tamanho varivel, rgidas ou flexveis, possuindo cinco gneros. A
intensidade de colorao varia quando so empregadas a colorao simples ou o mtodo
de Gram; sendo assim utilizadas, para a sua visualizao, tcnicas especiais de
impregnao, imunofluorescncia e campo escuro.

T. pallidum o agente causal da sfilis. No doente, pode ser observado no sangue

durante o perodo de incubao da doena, nas secrees de cancro no estgio primrio
e no material de leses de pele e membranas mucosas no estgio secundrio. O
diagnstico laboratorial da sfilis pode ser feito por pesquisa Direta do treponema por
testes sorolgicos e pesquisa de anticorpos especficos, mas o nico exame que tem
valor absoluto para os diagnsticos da sfilis a pesquisa direta do treponema em leses
sinfilticas. A colheita deve ser feita em leses midas, e o material observado
preferencialmente em microscopia de campo escuro, ou na impossibilidade, atravs do
mtodo de impregnao pela prata, devendo ser lembrado, no entanto, que nem sempre
possvel evidenciar a espiro que ta nas leses.

Para as leptospiroses e infeces por Borrelia esses mtodos no devem ser feitos,
atravs do mtodo em campo escuro, para as leptospiroses e, no sangue, durante um
episdio febril, para as espiroquetas do gnero Borrelia.

Objetivo:

Evidenciao de espiroquetas atravs da microscopia de campo escuro e/ou

impregnao pela prata.

3.1 Microscopia em campo escuro

Partculas cujas dimenses so inferiores a 0,2m ou objetos cujos ndices de refrao

so muito prximos daquele do meio em que esto suspensos no so visveis ao
microscpio ptico, ao exame em campo claro. Para v-los, recorre-se ao artifcio do
campo escuro, que consiste em adaptar ao microscpio ptico comum um dispositivo
que impede a penetrao dos raios diretos provenientes de uma fonte luminosa intensa,
de tal maneira que s penetram na objetiva os raios refratados e refletidos pelo objeto
observado. Utilizam-se com esta finalidade condensadores especiais, sendo o mais
usado o condensador cardiide.

Soluo impregnadora (nitrato de prata amoniacal):

Dissolver 5 g de nitrato de prata em 100 ml de gua

Retira alguns mL

28
 Ao restante, adicionar gota a gota soluo concentrada de amnia ata que o
precipitado castanho que se forma dissolva-se totalmente
Adicionar gota a gota a soluo de nitrato que foi retirada at que aparea uma
fraca turvao persistente.

Material

a. Microscpio ptico(M.O.)
b. M.O. + condensador
c. Lminas
d. Reagentes Fontana-Tribondeau
e. SWAB
f. lcool
g. leo de cedro
h. Soluo salina
i. Culturas em meios lquidos e slidos
j. Exsudato positivo

Resultado: num campo escuro as espiroquetas aparecem claras.

3.2. Mtodo de Fontana-Tribondeau (Impregnao pela Prata)

a. Preparar o esfregao numa lmina limpa e desengordurada

Secar ao ar
Fixar o esfregao com lquido de Ruge durante 1 minuto
Lavar com gua destilada
Cobrir a preparao com cido tnico(mordente) e com chama de um swab
embebido em lcool, aquecer a lmina com soluo de nitrato de prata
amoniacal aquec-la at a emisso de vapores (30 segundos)
Lavrar com gua destilada
Cobrir a lmina com soluo de nitrato de prata amoniacal e aquec-la at a
emisso de vapore (30 segundos)
Lavar com gua destilada
Secar ao ar
Examinar ao microscpio com objetiva de imerso.

Resultado: As formas espiraladas aparecem em marrom escuro em um campo

marrom claro. Os espiralados possuem uma parede delgada que no
evidenciada pelos mtodos habituais, o nitrato de prata impregna na parede.

Reagentes de Fontana-Tribondeau:

1. Lquido de Ruge
- cido actico 1,0 mL
- Formalina 2,0 mL
- gua 100 mL

2. Mordente
- fenol 1,0 g
- cido tnico 5,0 g

29
 - gua 100 ml

IV. MTODO DE ALBERT-LAYBOURN

O mtodo de Albert-Laybourn baseia-se no fato de algumas bactrias apresentarem

corpsculos citoplasmticos localizados nas regies polares (corpsculos
metacromticos ou corpsculos de Babes Emst) da clula bacilar, que se coram pelo
Lugol forte (de cor marrom), se evidenciando em contraste com o corpo bacilar, que se
cora em verde-azulado pela soluo de Laybourn. Tais caractersticas encontramos nas
corinebactrias e difterides, e tal metodologia descria, associada aos sintomas clnicos
caractersticos da difteria, possibilita um diagnstico presuntivo da doena pela
microscopia tica.

Tcnica:

1. Preparao do esfregao

a. Preparar um esfregao homogneo, delgado e fixado.

Cobrir o esfregao por + ou 5 minutos com a soluo de Albert-Laybourn
Escorrer (sem lavar)
Cobrir com soluo de Lugol forte por + ou 2 minutos
Lavar e secar
Observar em objetiva de imerso (100x)

Solues reagentes:

1. Soluo de Albert-Laybourn
- azul de toluidina 0,15g
- verde malaquita 0,20g
- cido actico glacial 1,00ml
- lcool 95% 2,00ml
- gua destilada 100ml

2. Soluo de lugol Forte

- iodo metlico 2,0g
- iodeto de potssio 3,0g
- gua destilada 300ml

Obs: guardar em frasco mbar ao abrigo da luz.

30
ASSUNTO:
- Colimetria.

INTRODUO
A gua elemento fundamental para a sobrevivncia humana. Sua grande
utilizao no abastecimento pblico, na recreao, na industria, no uso domestico atesta
essa importncia vital.
As guas para abastecimento podem ser poludas por servir de reservatrio para
espcies microbianas patognicas e permitir a sobrevivncia das mesmas, e
reconhecida desde os primrdios da civilizao. Vrias doenas podem ser veiculadas
pela gua, tais como clera, febre tifide, disenterias, leptospirose, tuberculose, hepatite,
poliomielite, doenas parasitrias e fngicas. Essas doenas so resultantes da ingesto
de gua e alimentos contaminados ou do emprego de gua poluda pela irrigao, pesca,
lazer, piscicultura, cultura de marisco.
Em cidades onde existe um sistema eficiente de esgotamento sanitrio, o esgoto
domstico um dos principais responsveis pela poluio das guas, estimulando o
crescimento de microrganismo. A assimilao destes contaminantes orgnicos
biodegradveis realizada com o concurso de bactrias presentes, por meio de um
processo, que consome o oxignio dissolvido na gua dos rios ou reservatrios. Quando
a carga de matria orgnica biodegradvel presente na gua, e o OD (Oxignio
Dissolvido), que mede a concentrao de oxignio disperso na gua (Soares, 1999).
Alm dos esgotos domsticos, os efluentes industriais e o escoamento superficial
urbano contribuem grandemente na poluio dos corpos dgua. Os efluentes industriais
contem grandes nmeros ou metais pesados. O escoamento superficial urbano contm
todos os poluentes que se depositam na superfcie do solo na ausncia de chuvas, como
lixo e matria orgnica. Estes acumulados no solo, valas e bueiros so arrastos quando
da estao chuvosa para os cursos dgua superficiais, constituindo-se numa outra fonte
de poluio (Soares, 1999).
Os microrganismos dotados de potencial patognico chegam s extenses
hdricas procedentes das excrees intestinais do homem e de outros animais. Embora j
existam mtodos desenvolvidos para a deteco de vrios organismos patognicos de
veiculao hdrica, os mesmos no so aplicveis na rotina devido ao alto custo e
necessidade de pessoal especializado (CETESB, 1993).
Uma alternativa para a avaliao da qualidade sanitria da gua a pesquisa de
organismo no patognicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de
sangue quente, que quando encontrados indicam a ocorrncia de contaminao fecal,
evidenciando o risco da presena de patgenos. Fezes humanas contm de 20-30 % de
resduos alimentares no digeridos, sendo o restante constitudo de gua e bactrias. NO
indivduo saudvel essas bactrias constituem os habitantes normais do intestinos onde
a Escherichia coli a representante caracterstica. O nmero desses microrganismos
pode atingir XXXXclulas/g de fezes. Assim a presena da Escherichia coli em
alimentos e gua indicativo de contaminao fecal e possibilidade de presena de
patgenos entricos.
Microrganismos indicadores de poluio de gua so utilizados para monitorar,
classificar e restringir o uso das guas. Um indicador ideal deveria preencher os
seguintes critrios: 1. Ser aplicvel a todo tipo de gua; 2. Estar presente
simultaneamente com os microrganismos patognicos, com um tempo de sobrevivncia
igual quele patgeno entrico mais resistente; 3. No se reproduzir em guas
contaminadas, para no resultar em valores aumentados ( HAGLER E MENDONA-
HAGLER, 1998 ).

31
 No se conhece nenhum microrganismo ou grupo de microrganismo que atenda
a todos esses requisitos, mas h vrios que se aproximam das exigncias referidas e que
so muito teis.
As bactrias empregadas como indicadores de poluio fecal em guas so: os
coliformes totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfringens.
Contagens de Salmonella e de bactrias do gnero Bifidobactrias tm sido propostas. O
Indicador microbiolgico mais empregado o grupo dos coliformes. Este e outros
indicadores de poluio orientam a margem de segurana sanitria de gua potvel, da
gua utilizada para fins recreativos e dos cultivos de organismos marinhos comestveis.
A Organizao Mundial de Sade (OMS) recomenda para guas recreacionais
um mximo de 100 coliformes fecais por 100ml de gua.

COLETA DE AMOSTRAS

A coleta de amostras para exame microbilgico deve ser feita em garrafas

esterilizada que tenham sofrido tratamento prvio de limpeza e rinsagem com gua
destilada.
gua clorada: adiciona-se 0,1 ml de tiossulfato de sdio 10% para cada
250ml de gua para neutralizar-se o cloro livre presente, impedindo que continue com
propriedades desinfetantes entre o perodo da coleta e o momento da inoculao,
impedindo que continue com propriedades desinfectantes entre o perodo da coleta e o
momento da inoculao.
gua com alto teor de cobre e zinco: coleta na presena de um agente
quelante, de forma a reduzir a toxicidade provocada pelos metais ( 0,3 ml de EDTA a
15%, ph = 6,5para cada 120mL de gua ).

Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espao livre na garrafa
(cerca de 2,5 cm) para facilitar a homogeneizao antes da inoculao. As garrafas
devem ser mantidas vedadas at o momento da coleta da amostra e devem ser tomados
todos os cuidados de assepsia no momento da coleta, de forma a evitar contaminaes
secundrias.

*PONTO DE COLETA

1. gua da torneira

a. Abrir a torneira e deixar correr por 5 minutos, para eliminar as impurezas e a gua na
acumulada nas tubulaes.
b. Com algodo embebido em lcool, passar na abertura e internamente e em seguida
flambar.
c. Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos.
d. Abrir o frasco esterilizado e coletar a gua. Introduzir gua no frasco at cerca de
trs quartos do seu volume.
e. Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratrio.

2. Poos e Cisternas
a. Preparao do frasco amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com um
barbante para facilitar a descida no poo.
b. Descer o frasco dentro do poo sem permitir que o mesmo toque nos lados.
c. Submergir o frasco completamente na gua.

32
d. Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da gua para criar um
espao de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente.

3. Rios, Lagoas e Mares

a. Coleta da amostra de gua de rios e lagoas nestes casos deve-se mergulhar o frasco
at uma profundidade de 20cm, com abertura voltada em direo contrria a corrente, a
fim de evitar a contaminao da gua com as mos.
b. Coleta da gua do mar a coleta deve ser feita na regio onde as pessoas costumam
banhar-se, que corresponde profundidade aproximadamente de 1,0 m, que a regio
das praias mais utilizada para a recreao de contato primrio, na mar baixa e 24 horas
sem chuvas.

ACONDICIONAMENTO E TRANSPORTE DA AMOSTRA PARA O

LABORATORIO

O ideal a anlise iniciar-se at 1 hora aps a coleta. Caso isto seja impossvel, a
amostra deve ser transportada sob refrigerao. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10
graus Celsius no prazo mximo de at 30 horas aps a coleta.
Amostras presumivelmente poludas tm de ser inoculadas no mximo aps 6
horas da coleta.
Entre o recebimento da amostra e o inicio da inoculao, a mesma deve ser mantida em
geladeira (cerca de 5 graus Celsius).

EXAMES BACTERIOLGICOS DA GUA

O exame bacteriolgico da gua feito atravs de dois processos: Contagem de

bactrias heterotrficas viveis na gua e determinao ou estimativa do nmero de
bactrias coliformes.
A metodologia padro empregada no exame bacteriolgico da gua, para medida
do grupo coliforme, inclui dois procedimentos: a tcnica dos tubos mltiplos e a tcnica
da membrana filtrante (Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater -APHA, 1980).

A. Determinao de coliformes pela tcnica dos tubos mltiplos

NMERO MAIS PROVVEL (NMP)

A tcnica do nmero mais provvel consiste no exame de uma srie de tubos

onde foram inoculados volumes diferentes de amostra.
O valor obtido resulta da consulta da tabela que foram estimuladas com base em
frmulas de probabilidade. Consideraes tericas e determinaes repetidas em grande
escala indicam que este tipo de tcnica tende a fornecer valores mais elevados do que o
nmero real. As disparidades tendem a diminuir quando se adota sries com maior
nmero de tubos em cada diluio. Portanto, a sensibilidade do teste depende do
nmero de tubos adotados.
Existem vrias tabelas de NMP e a escolha da srie a ser adotada funo das
caractersticas microbiolgicas da amostra.

33
 Tabelas de NMP/100 ml de amostra:

a. 5 X 10 ml ----- 2,2 > NMP 16

b. 5 X 10 ml ----- 2,2 > NMP > ou = 240

1 X 1 ml
1 X 0,1 ml

3) 3 X 10 ml ----- 3 > NMP > ou = 2400

3 X 1 ml
3 X 0,1 ml

4) 1 X 50 ml ------ 1 > NMP > ou = 240

5 X 10 ml
5 X 1 ml

5) 5 X 10 ml ----- 2 > NMP > ou = 2400

5X 1
5 X 0,1 ml

6) 5 X 50ml ----- 1 > NMP > ou = 240

OBS: nos tubos onde o inoculo de 10 ou 50 ml, usar concentrao dupla do

meio e volume igual ao inoculo.

TABELA DOS PADRES MICROBIOLGICOS DE PROBABILIDADE VIGENTES

TUBOS POSITIVOS POR: Nmp PARA 100 ml

10 ml 1 ml 0,1 ml 3 tubos
0 0 0 <3
0 0 1 3
0 1 0 3
0 2 0 6
1 0 0 4
1 0 1 7
1 1 0 7
1 1 1 11
1 2 0 11
2 0 0 9
2 0 1 14
2 1 0 15
2 1 1 20
2 2 0 21
2 2 1 28
2 3 0 30
3 0 0 23
3 0 1 39
3 0 2 64
3 1 0 43

34
 3 1
3 1
3 2
3 2
3 2
3 3
3 3
3 3
3 3
1 75
2 120
0 93
1 150
2 210
0 240
1 460
2 1100
3 2400

gua potvel: Ausncia de coliformes totais

Ausncia de coliformes fecais

Teste Presuntivo

Inocular, aps a escolha da tabela, dem tubos contendo caldo lauril sulfato triptose
ou caldo de lacose em concentraes dupla ou simples. Os tubos devem conter tubinhos
de Durham.
Ocriscimento com formao de gs significa teste presuntivo positivo para
coliformes totais. Os tubos que no apresentarem formao de gs com 24 horas de
incubao devem ser incubados at 48 horas.
Os tubos positivos com 24 horas devem ser imdiatamente inoculados nos meios de
confirmao para se evitar que um crescimento muito abundante provoque o
abaixamento do pH, o que pode provocar resultados falsamente negativos.

Teste de Confirmao

Coliformes Totais

A partir dos tubos dom formao de gs, semear por alada (dimetro=3 mm) em
tubos contendo caldo de blis para igual nmero de tubos contendo caldo EC. Incubar os
tubos a 35 0,5 por 48 3 horas.
A formao de qualquer quantidade de gs constitui teste positivo para coliformes
totais.

Coliforems Fecais

Dos tubos positivos do teste presuntivo, transferir com uma ala de platina uma
pequena poro do meio para igual nmero de tubos contendo caldo EC. Incubar os
tubos a 44,5 0,2 C por 24 horas.
A presena de gs no interior dos tubinhos de Durhan considerada reao
positiva, indicando contaminao de origem fecal.
A ausncia de gs mesmo com evidncia de crescimento indica a presena de
coliformes de outra fonte que no seja de intestinos de animais de sangue quente.

Teste complemento

35
 A partir dos tubos positivos de caldo blis verde brilhante, semear por estrias em
placa contendo endo agar ou azul de metileno agar (agar EMB). Incubar a 35 0,5C
por 24 2 horas.

Colnias tpicas: Meio endo agar - colnias vermelhas

Meio agar BEM - colonias verdes com centro escuro.

De cada placa, escolher uma ou mais colnias tpicas e bem isoladas; transferir
cada colnia para tubos contendo caldo de lactose ou caldo lauril triptose e para um
tubo inclinado de agar nutriente. Incubar a 35 0,5C por 24 horas, prosseguindo a
incubao at 48 3 horas caso no tenha ocorrido formao de gs aps a primeira
incubao.

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B. TCNICA DE FILTRAO EM MEMBRANA

A tcnica de filtrao na membrana para anlise da gua passou a ser recomendada

pelo "Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater", ao lado da tnica de NMP,
aps a 13 edio . A recomendao afirma que a tcnica popde ser adotada para
determinar a potabilidade de qualquer gua, desde que, aps uma srie de exames
paralelos, obtenha-se com as duas tcnicas, resultados compatveis.
Entretanto, deve ser observado, quanto a tcnica de filtrao em membrana:

Vantagens:
- Os resultados so obtidos aps 22-24 horas.
- Podem ser analizados volumes maiores e mais representativos das amostras.
- Os resultados em membrana tm maior grau de preciso, em relao tcnica
dos tubos mtiplos, proporcionado tambm maior reprodutibilidade.
- Um maior nmero de amostras pode ser processado com um mnimo de
espao e equipamentos.

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 Limitaes:
- As amostras com alta densidade de bactrias no coliformes, porm capazes de
se desenvolverer sobre o meio de cultura, pois os coliformes podero ser impedidos de
se desenvolverem ou seno a densidade de coliformes podero ser impedidos de se
desenvolverem ou seno a densidade de coliformes pode ser menor do que a obtida pela
tcnica do NMP.
- guas com alta turbidez devido as alfgas ou substncias em suspenso, pois
estas podem formar uma pelcula na superfcie da membrana e interferir no
desenvolvimento de colnias caracterstica de coliformes.

Tcnica

Um volume de 100 ml de amostra filtrada a vcuo atravs de uma membrana de

0,45 de dimetro de poro.
As bactrias ficam retidas na membrana e esta transferida para placas
apropriadas contendo almofadas de papel absorventes embebidas nos meios adequados.

Meio para coliformes totais: Endo (caldo ou agar)

Incubao 35 0,5 C por 22-24 horas.
Colnisa Tpicas: cor rosa ou vermelha escura com brilho metlico caracterstico.

Meio para coliformes fecais: M-FC-Broth

Incubao: 44,5 0,2 por 24 horas.
Colnias Tpicas: or azul.
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