Metodos Generales de Recuento en Placa

2017623 Metodosgeneralesderecuentoenplaca
Mtodos generales de recuento en placa, clculo y expresin

de los resultados
Apartados de este ejercicio
A. Introduccin
B. Obtencin de diluciones decimales seriadas
C. Siembra de las placas mediante homogeneizacin en masa
D. Siembra de las placas por extensin en superficie
E. Clculo y expresin de los resultados obtenidos, en los mtodos de recuento en placa sin identificacin posterior
F. Entrenamiento
G. Supuestos prcticos
H. Envo al servidor de los resultados del ejercicio
A. Introduccin
Determinacin del nmero de microorganismos
La medida del nmero de microorganismos en una muestra es una determinacin muy utilizada en microbiologa. Para ello se
utilizan varios tipos de tcnicas. Algunas tcnicas son medidas indirectas. Estas miden una propiedad - como la turbidez, el
peso seco, o una concreta actividad metablica - de la masa de clulas de una poblacin. Otras tcnicas son directas. Las
medidas directas incluyen los recuentos directos al microscopio, recuento electrnico y los recuentos de viables.
Determinacin del nmero de microorganismos

Tcnicas (Ver descripcin)
indirectas
Recuentos al microscopio (Ver
descripcin)
Tcnicas Recuento electrnico
directas
Recuentos de viables (Ver
descripcin)
Recuentos de viables
El recuento directo al microscopio y el recuento electrnico proporcionan un recuento de todas las clulas, tanto las vivas como
las muertas. Un recuento de viables mide slo las clulas vivas de una poblacin, es decir, aquellas capaces de reproducirse
(viable significa "que puede vivir").
La tcnica mas utilizada en Microbiologa de los alimentos tanto para el recuento de viables como para la determinacin del
nmero de microorganismos es el recuento en placa objeto de este ejercicio. La filtracin por membrana y la determinacin del
nmero ms probable (NMP) son tambin recuentos de viables, aunque usados con menor frecuencia.
Recuentos de viables
Recuento en placa (Este ejercicio) Filtracin por membrana Nmero ms probable
file:///C:/Users/Sara/Google%20Drive/ALTERACION%20DE%20ALIMENTOS/WebDVD/unidades/labV/RecuentosGeneral/RecuentosGeneral.html 1/14
Mtodos de Recuento en Placa
Consiste en realizar diluciones decimales seriadas de la muestra para despus sembrar cantidades conocidas de las mismas
en placas de Petri (evidentemente, alguna de las diluciones ser tal que al distribuir una parte de ella en la placa originar
colonias separadas).
Posteriormente, conocidos el nmero de colonias, la cantidad sembrada y la dilucin correspondiente, es posible calcular el
nmero de microorganismos viables en la muestra original. Como las colonias pueden originarse tanto de una clula como de
un grupo de clulas, se utiliza el trmino: "unidades formadoras de colonias" (UFC)
Recuentos en placa
Existen dos mtodos de recuento en placa segn la tcnica de siembra empleada:
Siembra incorporada o mediante homogeneizacin en masa Siembra mediante extensin en superficie
Expresin de resultados segn la Norma ISO7218

Expresin de resultados segn la Norma ISO7218 (1996): Microbiologa de Alimentos. Reglas generales para los exmenes
microbiolgicos.
Esta norma ISO define cmo debe hacerse el clculo y expresin de resultados:
A - cuando el mtodo de anlisis utilizado es un mtodo de recuento en placa en el que no se requiere
confirmacin de colonias. Por ejemplo: Recuento de aerobios mesfilos totales, Recuento de hongos filamentosos
y levaduras, etc.
B - cuando el mtodo de anlisis utilizado es un mtodo de recuento en placa en el que si se requiere
confirmacin de colonias. Por ejemplo: Recuento de Enterobacteriaceae totales
En este ejercicio tratamos el primer caso, es decir, calculo y expresin de resultados en los mtodos de recuento en placa
en el que no se requiere confirmacin de colonias
B. Obtencin de diluciones decimales seriadas

La preparacin de las diluciones se realiza utilizando diluyentes adecuados (agua de triptona, generalmente).
A partir de un alimento o muestra slida o muestra lquida
Preparar la dilucin inicial o dilucin 10-1. Para ello, pesar 10 gramos de muestra
en una bolsa de Stomacher, previamente tarada y, mezclar con 90 mL de diluyente
( x gramos de muestra + 9x mL de diluyente).
Si disponemos de un diluidor gravimtrico pesaremos los x gramos de muestra y
el diluidor aadir 9 veces (9x mL) de diluyente sobre la cantidad pesada.
Por ejemplo; si pesamos 10 gramos se aaden 10x9=90 mL de

diluyente y si pesamos 9,45 gramos se aaden 9,45x9=85,1 mL de
diluyente.
Diluidor Gravimtrico
Homogeneizar en un homogenizador de paletas tipo Stomacher.

Si se trata de una muestra lquida, no se requiere un Stomacher, aunque puede
utilizarse, ya que la homogeneizacin puede hacerse en una botella o
manualmente.
Esta mezcla constituye la primera dilucin o dilucin inicial (10-1 1/10).

NOTA: En los alimentos lquidos la propia muestra corresponde a la dilucin 100 o
sin diluir.
Homogenizador de paletas tipo Stomacher
A partir de la dilucin 10-1, preparar diluciones decimales sucesivas, tomando 1 mL y descargndolo en un tubo que contenga 9 mL
de diluyente y as, sucesivamente.
A partir de una muestra de agua
Tomar 1 mL directamente de la muestra de agua y aadirlo a un tubo que

contenga 9 mL de diluyente. Tendremos la dilucin 10-1.
A partir de esta, continuar preparando el resto de diluciones decimales, tomando

1 mL de la dilucin 10-1 y descargndolo en 9 mL de diluyente y as
sucesivamente.
Mezclar manualmente cada dilucin agitndola 25 veces en 7 segundos con

movimientos ascendentes y descendentes formando un ngulo de abertura
aproximado de 60 entre brazo y antebrazo.
O mezclar mecnicamente utilizando Vortex.
El nmero de diluciones a realizar depende de:

- Si queremos conocer exactamente el parmetro que estemos analizando, en cuyo caso depender del nmero de microorganismos
que se espera encontrar, cuanto mayor sea el nmero de microorganismos que esperamos ms diluciones decimales deben hacerse
del alimento.
- Si queremos conocer si la muestra que estamos analizando cumple un lmite microbiolgico establecido en la legislacin, en cuyo
caso depender del valor de dicho lmite.
C. Siembra de las placas mediante homogeneizacin en masa

Siembra incorporada o mediante homogeneizacin en masa
Transferir, con una pipeta estril, 1 mL de cada dilucin de la muestra a placas de

Petri vacas y estriles.
Nota: sembrar al menos dos placas por cada dilucin.
Aadir unos 15-20 mL del medio de cultivo adecuado (segn el tipo de

microorganismos de los que queremos hacer el recuento).
En este mtodo el medio ha de ser siempre un medio slido (agar). En el momento

de aadir el agar a las placas ste debe estar estril y encontrarse fundido y a una
temperatura de entre 45-50C.
Homogeneizar el agar con el inculo imprimiendo a la placa suaves movimientos

circulares y de vaivn.
Esperar a que el agar solidifique en las placas.
Dependiendo del microorganismo que queramos contar, incubar las placas a la

temperatura necesaria y durante el tiempo necesario, siempre en posicin
invertida.
D. Siembra de las placas por extensin en superficie

Siembra mediante extensin en superficie
Transferir con una pipeta estril 0,1 mL de cada dilucin de la muestra a
placas de Petri con el medio de cultivo ya solidificado y seco.
Nota: se recomienda sembrar al menos dos placas por cada dilucin.
Extender cuidadosamente el inculo sobre la superficie con la ayuda de una

varilla de vidrio acodada y estril (asa de Drigalski).
Incubar las placas a la temperatura necesaria y durante el tiempo necesario,

siempre en posicin invertida.
E. Clculo y expresin de los resultados obtenidos, en los mtodos de recuento en placa sin identificacin posterior.
En este apartado se explica cmo deben hacerse los clculos en los mtodos de recuento en placa en los casos generales los
que no debemos hacer identificacin/comprobacin de las colonias sospechosas.
Clculo de resultados
Caso general 1 (cuando en dos diluciones sucesivas las placas presentan ms de 15 colonias y menos de 300)
Ejemplo, tenemos los siguientes resultados
Seleccionar las placas de dos diluciones sucesivas Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3 Dilucin 10-4
donde al menos, una placa de las seleccionadas, Nmero >300 235 25 3
contenga un mnimo de 15 colonias. de
Colonias >300 220 28 1

Seleccionaremos las placas de dos diluciones consecutivas, en este caso las

Contar las colonias de las placas seleccionadas. diluciones 10-2 y 10-3
Calcular el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o mililitro, segn la siguiente expresin:
Donde:
Ejemplo;
Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3 Dilucin 10-4
La suma de todas las colonias contadas en todas las Nmero >300 235 25 3
placas seleccionadas para el recuento, de
Colonias >300 220 28 1
En este ejemplo, selecciono para el recuento las diluciones 10-2 y 10-3
El C, ser: 235 + 220 + 25 + 28 = 508
El volumen del inoculo aplicado a cada placa depende del mtodo de siembra utilizado:
Siembra mediante homogenizacin en masa, volumen inoculado a cada placa: 1mL

Siembra mediante extensin en superficie, volumen inoculado a cada placa: 0,1mL
El nmero de placas seleccionado, siguiendo con el ejemplo, ser n1 = 2 y n2 = 2, porque he seleccionado dos placas de cada
dilucin.
El nivel de dilucin depende de las diluciones que hayamos seleccionado para contar y ser:
d=1, cuando la dilucin menor seleccionada para el recuento se trata de muestra sin diluir (slo para muestras lquidas o muestras de
agua)
d=10-1, cuando la dilucin menor seleccionada para el recuento sea la primera dilucin, dilucin 1/10 10-1
d=10-2, cuando la dilucin menor seleccionada para el recuento sea la segunda dilucin, dilucin 1/100 10-2
Y as sucesivamente.
Siguiendo el ejemplo, d=10-2
Caso general 2 (cuando en una sola dilucin las placas presentan ms de 15 colonias y menos de 300)
Ejemplo;
Dilucin 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Nmero de >300 >300 >300 >300 153
La suma de todas las colonias contadas en todas las
Colonias >300 >300 >300 >300 149
placas seleccionadas para el recuento,
En este ejemplo seleccionaremos las dos placas de la dilucin 10-5
ElC, ser: 153 + 149 = 302

El nmero de placas seleccionado, siguiendo con el ejemplo, ser n1 = 2 y n2 = 0, porque he seleccionado dos placas de una nica
dilucin.
El nivel de dilucin depende de las diluciones que hayamos seleccionado para contar y ser, siguiendo el ejemplo, d=10-5
Estimacin de nmeros pequeos (cuando todas las placas presentan menos de 15 colonias)
Ejemplo;
Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3

La suma de todas las colonias contadas en todas las 12 0 0
placas seleccionadas para el recuento, Nmero de Colonias
13 0 0
En este ejemplo seleccionaremos las dos placas de la dilucin 10-1
El C, ser: 12 + 13 = 25

El nmero de placas seleccionado, siguiendo con el ejemplo, ser n1 = 2 y n2 = 0, porque he seleccionado dos placas de una nica
dilucin.
El nivel de dilucin depende de las diluciones que hayamos seleccionado para contar y ser, siguiendo el ejemplo, d=10-1
En este caso el resultado se expresa como Ne: Nmero estimado de unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro y se
calcula segn la siguiente expresin:
donde
C= Suma de todas las contadas en todas las placas retenidas
V= Volumen del inculo aplicado a cada placa
n= nmero de placas retenidas
d=Nivel de dilucin correspondiente a la dilucin retenida
Caso particular (si en ninguna de las placas sembradas han crecido colonias)
Cuando no se encuentran colonias en ninguna de las
placas sembradas, expresar el recuento como Ejemplo;
inferior a (<) 1 dividido por el volumen del inculo
(V) y por el nivel de dilucin (d). Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3
0 0 0
Nmero de Colonias
0 0 0

El nivel de dilucin ser, siguiendo el ejemplo, d=10-1
Redondeo a dos cifras significativas
Los resultados obtenidos se han de redondear a dos

cifras significativas: Por ejemplo, si el nmero obtenido es:
- Si la ltima cifra es inferior a 5, la cifra precedente 123.756
no se modifica.
- Si la ltima cifra es superior o igual a 5, la cifra Redondeo:
precedente ser aumentada una unidad. 123.760
123.800
Proceder de esta forma secuencialmente con todas 124.000
las cifras del nmero obtenido hasta que se 120.000
obtengan dos cifras significativas.

Expresin de resultados
Expresar el nmero de unidades formadoras de

colonias (UFC) por mililitro o por gramo, expresado
como un nmero comprendido entre 1,0 y 9,9 Por ejemplo, si el redondeo obtenido es:
multiplicado por la potencia de 10 adecuada, es decir 120.000
un entero y un decimal multiplicado por la potencia
de 10. Expresin de resultados:
1,2 x 105
F. Entrenamiento en el clculo de resultados

Le aconsejamos que se ejercite en el clculo y expresin de resultados, comprobando su correcta interpretacin haciendo clic en cada
pregunta en la letra roja que antecede a la opcin que le parezca correcta.
Ejemplo 1; Clculo y expresin de resultados en un recuento en placa mediante siembra por homogenizacin en masa de
microorganismos en una muestra de carne picada.
El nmero de colonias contadas en cada una de las diluciones sembradas es:

Nmero de >300 168 14 3
Colonias >300 215 13 1
Preguntas
1. En este caso, qu diluciones utilizara para calcular el nmero de UFC/g o mL:

a) Dilucin 10-2 y 10-3
b) Dilucin 10-3 y 10-4
2. Utilizando la siguiente expresin y tras el redondeo, el resultado obtenido es:
a) N = 1,9 x 104 UFC/g o mL:

b) N = 1,4 x 104 UFC/g o mL:
Ejemplo 2; Clculo y expresin de resultados en un recuento en placa mediante siembra por extensin en superficie en una
muestra de agua de lavado

Nmero de >300 >300 >300 63
Colonias >300 >300 >300 59

b) Solamente la dilucin 10-4

Preguntas
a) N = 6,1 x 106 UFC/g o mL

b) N = 6,1 x 105 UFC/g o mL
Ejemplo 3; Clculo y expresin de resultados en un recuento en placa mediante siembra por extensin en superficie de
microorganismos en una muestra de agua de la red de distribucin
Sin diluir Dilucin 10-1 Dilucin 10-2

Nmero de 8 0 0
Colonias 10 0 0
1. En este caso, qu diluciones utilizara para calcular el nmero de UFC/mL:
a) Muestra sin diluir

b) Es imposible hacer el recuento, ni siquiera un recuento estimado
Preguntas

a) Ne = 9 x 10 UFC/mL
b) Ne = 9 UFC/mL
G. Supuestos prcticos
Supuesto prctico#1; Clculo y expresin de resultados en un recuento en placa mediante siembra por extensin en
superficie de microorganismos en una muestra de queso fresco.
Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3

Nmero de 45 8 1
Colonias 46 6 0
Contestacin a las preguntas

c) Dilucin 10-2
2. Utilizando el clculo adecuado, el resultado obtenido es:
a) 4772,7 UFC/g o mL
b) 477,2 UFC/g o mL
c) 700 UFC/g o mL
3. El informe en este supuesto prctico, despus de redondear, debe ser:

El nmero de unidades formadoras de colonia por gramo o mL de muestra ha sido de
a) Recuento de microorganismos (tipo) N = 7 x 103 UFC/g o mL

b) Recuento de microorganismos (tipo): N = 4,8 x 103 UFC/g o mL
c) Recuento de microorganismos (tipo): N = 4,8 x 102 UFC/g o mL
Supuesto prctico#2; Clculo y expresin de resultados en un recuento en placa mediante siembra por homogenizacin
en masa de una muestra de agua embotellada.
Sin diluir Dilucin 10-1 Dilucin 10-2

Nmero de >300 155 12
Colonias >300 163 16
4. En este caso, qu diluciones utilizara para calcular el nmero de UFC/mL:

b) Dilucin 10-2
c) Sin diluir y Dilucin 10-1
a) 1.600 UFC/mL
b) 1.572 UFC/mL
c) 15.900 UFC/mL

a) Recuento de microorganismos (tipo): N = 1,5 x 103 UFC/mL

b) Recuento de microorganismos (tipo): N = 1,6 x 103 UFC/mL
c) Recuento de microorganismos (tipo): N = 2 x 104 UFC/mL
Supuesto prctico#3; Clculo y expresin de resultados en un recuento en placa mediante siembra por homogenizacin
en masa de una muestra de queso fresco.
Hacer clic sobre las imgenes de las placas para ampliarlas
Duplicado A Duplicado B
Dilucin 10-1
Dilucin 10-2
Dilucin 10-3


c) Dilucin 10-3
8. Siguiendo el ejemplo anterior, el nivel de dilucin (d) es de:
a) 1/10 10-1
b) 1/100 10-2
c) 1/1000 10-3
a) 3.363,6 UFC/g o mL
b) 33.636,3 UFC/g o mL
c) 3.400 UFC/g o mL

a) Recuento de microorganismos (tipo): N = 3 X 104 UFC /g o mL

b) Recuento de microorganismos (tipo): N = 3,4 X 103 UFC /g o mL
c) Recuento de microorganismos (tipo): N = 3,4 X 102 UFC /g o mL
H.- Envo al servidor de los resultados del ejercicio

En este apartado le pedimos que haga un comentario del ejercicio para darnos su opinin sobre el mismo (nivel de dificultad
que le ha parecido que presenta la realizacin y la interpretacin, as como el grado de utilidad).
NOTA IMPORTANTE: Las dudas que hayan surgido durante la realizacin del ejercicio no las incluya en este apartado; dirjase a
nosotros a travs del correo electrnico: tutoralteracion@universitas.usal.es
Introduzca sus datos en las casillas y posteriormente pulse sobre el botn 'ENVIAR'. Espere unos segundos hasta que el servidor
conteste con los aciertos y fallos.
Apellidos:
Nombre:
DNI (slo
nmeros):
Botn Enviar
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Mtodos generales de recuento en placa, clculo y expresin

Determinacin del nmero de microorganismos

Siembra incorporada o mediante homogeneizacin en masa Siembra mediante extensin en superficie

Expresin de resultados segn la Norma ISO7218

B. Obtencin de diluciones decimales seriadas

Por ejemplo; si pesamos 10 gramos se aaden 10x9=90 mL de

Homogeneizar en un homogenizador de paletas tipo Stomacher.

Esta mezcla constituye la primera dilucin o dilucin inicial (10-1 1/10).

Homogenizador de paletas tipo Stomacher

A partir de una muestra de agua

Tomar 1 mL directamente de la muestra de agua y aadirlo a un tubo que

A partir de esta, continuar preparando el resto de diluciones decimales, tomando

Mezclar manualmente cada dilucin agitndola 25 veces en 7 segundos con

O mezclar mecnicamente utilizando Vortex.

El nmero de diluciones a realizar depende de:

C. Siembra de las placas mediante homogeneizacin en masa

Transferir, con una pipeta estril, 1 mL de cada dilucin de la muestra a placas de

Nota: sembrar al menos dos placas por cada dilucin.

Aadir unos 15-20 mL del medio de cultivo adecuado (segn el tipo de

En este mtodo el medio ha de ser siempre un medio slido (agar). En el momento

Homogeneizar el agar con el inculo imprimiendo a la placa suaves movimientos

Esperar a que el agar solidifique en las placas.

Dependiendo del microorganismo que queramos contar, incubar las placas a la

D. Siembra de las placas por extensin en superficie

Nota: se recomienda sembrar al menos dos placas por cada dilucin.

Extender cuidadosamente el inculo sobre la superficie con la ayuda de una

Incubar las placas a la temperatura necesaria y durante el tiempo necesario,

Seleccionaremos las placas de dos diluciones consecutivas, en este caso las

Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3 Dilucin 10-4

En este ejemplo, selecciono para el recuento las diluciones 10-2 y 10-3

El C, ser: 235 + 220 + 25 + 28 = 508

Siembra mediante homogenizacin en masa, volumen inoculado a cada placa: 1mL

Siguiendo el ejemplo, d=10-2

Dilucin 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

En este ejemplo seleccionaremos las dos placas de la dilucin 10-5

ElC, ser: 153 + 149 = 302

Siembra mediante homogenizacin en masa, volumen inoculado a cada placa: 1mL

Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3

En este ejemplo seleccionaremos las dos placas de la dilucin 10-1

Siembra mediante homogenizacin en masa, volumen inoculado a cada placa: 1mL

C= Suma de todas las contadas en todas las placas retenidas

V= Volumen del inculo aplicado a cada placa

n= nmero de placas retenidas

d=Nivel de dilucin correspondiente a la dilucin retenida

Siembra mediante homogenizacin en masa, volumen inoculado a cada placa: 1mL

El nivel de dilucin ser, siguiendo el ejemplo, d=10-1

Redondeo a dos cifras significativas

Los resultados obtenidos se han de redondear a dos

Expresar el nmero de unidades formadoras de

F. Entrenamiento en el clculo de resultados

Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3 Dilucin 10-4

2. Utilizando la siguiente expresin y tras el redondeo, el resultado obtenido es:

a) N = 1,9 x 104 UFC/g o mL:

Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3 Dilucin 10-4

1. En este caso, qu diluciones utilizara para calcular el nmero de UFC/g o mL:

a) Dilucin 10-3 y 10-4

2. Utilizando la siguiente expresin y tras el redondeo, el resultado obtenido es:

a) N = 6,1 x 106 UFC/g o mL

Sin diluir Dilucin 10-1 Dilucin 10-2

1. En este caso, qu diluciones utilizara para calcular el nmero de UFC/mL:

a) Muestra sin diluir

Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3

Contestacin a las preguntas