Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
La morfina es un alcaloide de la adormidera utilizada para tratar el dolor. Se cree que los efectos
secundarios potencialmente letales de la morfina y los opioides relacionados -que incluyen la
depresin respiratoria mortal- estn mediados por la sealizacin del receptor -opioide (OR) a
travs de la va -arrestina o por acciones en otros receptores. Por el contrario, se cree que la
sealizacin OR de la protena G confiere analgesia. Aqu computacionalmente atracar ms de 3
millones de molculas contra la estructura OR e identificar nuevos andamios no relacionados con
los opioides conocidos. La optimizacin basada en la estructura genera PZM21, un potente
activador de Gi con selectividad excepcional para OR y reclutamiento mnimo de -arrestina-2. A
diferencia de la morfina, la PZM21 es ms eficaz para el componente afectivo de la analgesia frente
al componente reflexivo y est desprovista de depresin respiratoria y de actividad reforzante
similar a la morfina en ratones a dosis equi-analgsicas. PZM21 sirve as tanto como una sonda
para separar la sealizacin de OR y un derivado teraputico que est desprovisto de muchos de
los efectos secundarios de los opioides actuales.
La adiccin a los opiceos, agravada por los potencialmente letales efectos secundarios de los
opiceos, como la depresin respiratoria, ha impulsado campaas de optimizacin para obtener
analgsicos ms seguros y eficaces desde el siglo XIX. Aunque los productos naturales, la morfina y
la codena, y la droga semi-sinttica herona, son analgsicos ms eficaces que el opio en bruto,
conservan sus pasivos. La clasificacin de los receptores opioides en los subtipos , y y
nocicepcin1,2 aument la esperanza de que las molculas especficas del subtipo carezcan de los
pasivos de
En ltima instancia, 23 de alto puntaje molculas con rangos que van desde 237 a 2.095 de los ms
de 3 millones de anclados fueron seleccionados para la prueba (Fig. 1e]. En comparacin con los
ligandos de 5,215 OR anotado en ChEMBL1625, estos resultados de acoplamiento tena
Coeficientes de Tanimoto (Tc) basados en la Huella digital de conectividad extendida 4 (ECFP4) que
variaban de 0,28 a 0,31, lo cual es consistente con la exploracin de nuevos andamios26. De los 23
ensayados, siete tenan afinidades de unin a OR (Ki) que oscilaban entre 2,3 M y 14 M (Tabla de
Datos Ampliados 1, Datos Extendidos Figura 1).
Se predice que los nuevos ligandos engarzan el OR de nuevas maneras (Fig. 1f y Datos Extendidos
Fig. 1). La mayora de los ligandos opioides utilizan un par de iones catinicos con Asp1473.32, una
interaccin cannica27 observada en estructuras del receptor OR, OR, OR y nociceptina unido
a ligandos de diferentes andamios9-12,28. Como se anticip, los ligandos acoplados
Recapitul esta interaccin. Mucho menos precedencia existe para la formacin de un enlace de
hidrgeno adicional con este anclaje aspartato, a menudo mediado en el acoplamiento plantea por
una urea amida. En varios de los nuevos ligandos, el carbonilo de urea se modela a enlace de
hidrgeno con Tyr1483.33, mientras que el resto de los ligandos a menudo ocupan sitios
inexplorados por morfinanos (Fig. 1). A nuestro entender, el doble
Las afinidades eran bajas. Para aumentar la unin y la selectividad, se acoplaron 500 anlogos de
los compuestos 4, 5 y 7 que retenan los grupos clave de reconocimiento pero aadan
sustituyentes de empaquetamiento o se extendan ms hacia el lado extracelular del receptor,
donde los receptores opioides eran ms variables. De los 15 an- lisis de puntuacin ms alta que
se probaron, siete tenan valores de Ki entre 42 nM y 4,7 M (Tabla de datos ampliada 2).
Alentadoramente, el compuesto ms potente, 12 (Fig. 2a, b), fuertemente activado Gi / o con bajos
niveles de reclutamiento -arresina-2 (Figura 2c, d).
21 tena una CE50 de 4,6 nM en un ensayo de activacin Gi / o, con un 76% de eficacia (figura 3f) y
un Ki de 1,1 nM en ensayos de unin a radioligandos (Tabla de datos ampliada 3), una mejora de
40 veces frente a 12 Los otros tres estereoismeros de (S, S) -21 eran mucho menos potentes o
eficaces (Datos Extendidos Fig. 2a, b), lo que sugiere un requisito estereoqumico especfico tanto
para la potencia como para la eficacia de acuerdo con las posturas acopladas de (S, S ) -21 a las
estructuras inactivas y activas29 de OR(Figura 3c, datos extendidos, figura 2c, d). A continuacin
se hace referencia a (S, S) - 21 como compuesto PZM21.Debido a que PZM21 se descubri contra
la estructura inactiva de OR, su complejo acoplado a activo OR mantiene ambigedades. Para
investigar su receptor de estructura unida ms, ms detallado de acoplamiento y dinmica
molecular simulaciones se llevaron a cabo. El modelo resultante se prob sintetizando molculas
que perturbaron o explotaron Especfico modelado interacciones (Fig. 3c, d, Extended Data Figs 2 y
3].
Completa dosis-respuesta en estos receptores. Por lo tanto, PZM21 tiene alta especificidad
agonista entre GPCRs (Extended Data Fig. 5a-c) .PZM21 tambin se ensay para la inhibicin del
canal de iones hERG y los transportadores de neurotransmisor de dopamina, norepinefrina y
serotonina. En hERG, PZM21 tena una CI50 de entre 2 y 4 M, 500 a 1.000 veces ms dbil que su
potencia como un agonista OR (Extended Data, Fig. 5d). Su inhibicin de los transportadores de
neurotransmisores, que son tambin objetivos de la analgesia, fue an ms dbil con IC50 valores
que van desde 7,8 a 34 M (Extended Data Fig. 5e). Por lo tanto, PZM21 es un potente,
Un objetivo principal de este estudio fue encontrar nuevos quimiotipos que pudieran mostrar la
sealizacin sesgada y quizs, a diferencia de los frmacos opiceos cannicos, tienen perfiles in
vivo ms favorables. La sealizacin por PZM21 y otros agonistas OR parece estar mediada
principalmente por la protena G heterotrimrica Gi / o, ya que su efecto sobre los niveles de AMPc
fue eliminado por la toxina pertussis y no se observ actividad en un ensayo de liberacin de calcio
(datos ampliados Fig. 6a- re). Una concentracin mxima de PZM21 condujo a un reclutamiento de
-arresina-2 no detectable en el ensayo PathHunter (DiscoverRx) (Fig. 3g y Datos Extendidos Figura
6c) y un nivel mnimo de internalizacin de OR comparado con DAMGO y morfina (Fig. 6e). De
hecho, el reclutamiento de -arresina-2 fue demasiado bajo para permitir incluso un clculo formal
de sesgo31, que cuantifica la preferencia por una va de sealizacin sobre otra. Dado que el
reclutamiento de -arrestin puede
Dependen del nivel de expresin de la protena quinasa 2 acoplada a protena G (GRK2) 32,
tambin se investig la sealizacin Gi / o y el reclutamiento de arrestina en clulas
cotransfectadas con esta quinasa. Incluso en presencia de GRK2 sobreexpresado, PZM21 todava
tiene una eficacia de reclutamiento de arrestina dbil en comparacin con DAMGO e incluso con
morfina (Datos ampliados Fig. 6g-i). De hecho, el sesgo de sealizacin de PZM21 era indistinguible
de TRV130, un agonista de opioides orientado por Gi ahora en ensayos clnicos de fase III (figura 3f,
g), mientras que su sesgo de protena G sustancialmente super el de herkinorina, que tambin ha
sido Supuestamente un agonista agredido por Gi33 (datos ampliados, figura 6). Una distincin
intrigante en estos estudios de sealizacin es la falta de actividad agonista de PZM21 en OR.
Mientras que PZM21 es un antagonista de 18-nM de este receptor, el otro agonista biavado,
TRV130, activa K OR con una potencia similar a la morfina (Extended Data, Fig. 6f). Adicionalmente,
a pesar de tener niveles similares de sesgo de sealizacin, en los estudios de modelado TRV130 y
PZM21 parecen acoplar el OR de maneras distintas (Extended Data, Fig. 2f).
Consistente con su actividad agonista OR, PZM21 mostr una analgesia dosis-dependiente en un
ensayo de placa de coccin de ratn, con un efecto mximo mximo posible (% MPE) del 87%
alcanzado 15 minutos despus de la administracin de la dosis ms alta de frmaco probada
(Figura 4a). La dosis ms alta de morfina ensayada se estabiliz al 92% despus de 30 min.
Intrigantemente, no se observ ningn analgsico Para el PZM21 en el ensayo de cola-flick (Fig.
4b). Esta distincin no tiene precedentes entre los analgsicos opioides. El experimento de placas
calientes evala la analgesia tanto en el cerebro del sistema nervioso central (SNC) como en los
circuitos nociceptivos espinales, mientras que el experimento de cola es ms especfico para las
respuestas reflexivas espinales34. La subcategorizacin de las respuestas de comportamiento en el
experimento de la placa de coccin como afectiva (mediada por el SNC) o reflexiva (mediada
espinalmente) mostr que, a diferencia de la morfina, PZM21 confiere nicamente analgesia al
componente afectivo del dolor (Fig. . Aunque la separacin de estas dos vas analgsicas es nica
para PZM21 entre los conocidos Analgsicos opioides, se ha observado por activacin
quimiogentica selectiva35 o inactivacin inducida por toxina de neuronas del SNC en roedores36.
De hecho, PZM21 es tambin activo en un ensayo de nocicepcin con inyeccin de formalina,
probablemente por activacin supraspinal de circuitos inhibidores descendentes37 (figura 4d). Si
esta especificidad de circuito refleja la sealizacin sesgada De PZM21, su especificidad para el
OR frente a otros opioides Receptores y otros GPCRs, un fenmeno inusual de distribucin del
SNC, o alguna otra propiedad de sealizacin, es incierta en este momento.
De la morfina (datos ampliados Fig. 7a, b) y el agonista biavado TRV130 (figura 4a). Mientras que
PZM21 reduce la defecacin, su efecto constipador es sustancialmente menor que la morfina (Fig.
4f). La depresin respiratoria se investig mediante dosificacin de ratones sin restriccin con dosis
equi-analgsicas de PZM21, TRV130 y morfina (40 mg kg-1, 1,2 mg kg-1 y 10 mg kg-1,
respectivamente) y midiendo la respiracin mediante pletismografa de todo el cuerpo . Mientras
que la morfina profundamente deprimido frecuencia de respiracin, PZM21 era casi indistinguible
del vehculo (Fig. 4g]. En comparacin, TRV130 deprime significativamente la respiracin A los 15
min, correlacionando con su pico de respuesta analgsica. Aunque la depresin respiratoria por OR
R puede ser mediada parcialmente por la activacin de los canales de potasio rectificados hacia
dentro (GIRKs) acoplados a la protena G, los opioides sistmicamente infundidos pueden disminuir
la frecuencia respiratoria incluso en ratones deficientes en GIRK38, consistente con los
mecanismos de sealizacin independientes de la protena G Primero sugerido por los estudios de
eliminacin de arrestina4-6. La depresin respiratoria rpida observada para la morfina y TRV130
puede reflejar la activacin de GIRK. Sin embargo, en momentos posteriores, PZM21 induce una
depresin respiratoria mnima a pesar de proporcionar analgesia robusta. Por el contrario, la
morfina induce un curso prolongado de depresin respiratoria que no disminuye con la resolucin
de la respuesta analgsica a los 90 min. Esta disociacin en la analgesia y la depresin respiratoria
en puntos posteriores del tiempo puede reflejar reclutamiento diferencial de -arresina-2.
Tomados en conjunto, estos estudios apoyan mnima -arrestina-2 de sealizacin in vivo por
PZM21 (sesgo de sealizacin, Fig. 1a). Una de las principales responsabilidades de los actuales
analgsicos opioides es el refuerzo y la adiccin, los cuales se postulan que deben ser mediados -al
menos en parte- por la activacin de los circuitos dopaminrgicos de recompensa39.
Un biomarcador para tal activacin en ratones es una respuesta hiperlocomotora aguda, que
refleja la activacin dopaminrgica mesolmbica40. Mientras que la morfina induca la
hiperlocomocin del ratn en un ensayo de campo abierto (Figura 4h), una dosis casi equi-
analgsica de PZM21 no tena efecto aparente sobre la locomocin frente al vehculo. La
disminucin de la distancia recorrida no refleja un efecto cataleptico de PZM21 (datos ampliados,
figura 7c). Consistente con la disminucin de la activacin de los circuitos de recompensa, la
administracin de PZM21 tambin no induce una respuesta de preferencia lugar acondicionado
(Figura 4i], a diferencia de la morfina y otros opioides [41]. Aunque TRV130 tiende ms hacia la
induccin de preferencia de lugar, su actividad tampoco es significativa en relacin con el vehculo;
Esta falta de preferencia de lugar condicionado para ambos agonistas sesgados puede apoyar un
papel para el sesgo de la protena G en la falta de comportamiento de refuerzo inducido por
opioides. Las diferencias entre la morfina y PZM21 en el lugar acondicionado preferencia no
reflejan simplemente disimilitudes en la penetracin del SNC entre los dos frmacos, Ya que una
fraccin sustancial de PZM21 atraviesa la barrera hematoenceflica (Extended Data, Fig. 7d). Varias
advertencias merecen ser mencionadas. Aunque el descubrimiento basado en la estructura tuvo
xito en la bsqueda de nuevos andamios y apoy la optimizacin fcil, algunas de las propiedades
de PZM21 eran probablemente fortuitas.
Discusin
A pesar de estas advertencias, este estudio apoya un enfoque basado en la estructura para el
descubrimiento de ligandos GPCR. Mientras que este mtodo todava no puede encontrar
confiablemente los plomos con la especificidad adaptada y la eficacia de la sealizacin, puede
identificar confiablemente los andamios y los quimiotipos enteramente nuevos. Estos nuevos
quimiotipos pueden estabilizar las conformaciones de los receptores no explorados previamente y
as generar nuevos efectos biolgicos. Con un nuevo quimiotipo en la mano, la estructura acoplada
proporciona una estrategia directa para la optimizacin. Aqu, hemos optimizado una inicial de
acoplamiento hit, el compuesto 7, 1.000 veces a la molcula de plomo final, PZM21, mediante la
evaluacin de menos de 50 molculas. Aunque esta campaa se inspir en las agonistas OR
predispuestos como TRV1307, el enfoque basado en la estructura llev a un compuesto con
nuevas propiedades; Era estructuralmente distinta en comparacin con ligandos opioides
previamente explorados, con no slo sesgo de sealizacin sustancial, sino tambin con
selectividad inesperada del receptor opioide.
Estas caractersticas han contribuido a efectos biolgicos favorables, con analgesia duradera
acoplada a la eliminacin aparente de depresin respiratoria, especificidad para la analgesia
central refleja, falta de potencia locomotora y preferencia de lugar condicionado, Potencial de
refuerzo inducido por opioides para PZM21 y molculas como sta. La selectividad, la potencia y la
sealizacin polarizada de PZM21 la convierten en una molcula de herramienta de un tipo que no
estaba disponible para interrogar la sealizacin OR. Ms ampliamente, los resultados in vitro de
mltiples campaas de GPCR, Y los resultados in vivo aqu presentados, presentan un enfoque
general para el problema de la nueva herramienta y descubrimiento de plomo para esta familia
farmacolgicamente importante de receptores.
MTODOS
Molecular docking y seleccin analgica. La estructura de los receptores -opiceos del estado
inactivo (PDB: 4DKL) se us como entrada para la preparacin del receptor con DOCK Blaster
(http://blaster.docking.org) 44. Se utilizaron cuarenta y cinco esferas coincidentes basndose en
una versin truncada del ligando cristalizado. El enlace covalente y la regin de unin del
antagonista -funaltrexamina se eliminaron para la generacin de la esfera. Los parmetros de
muestreo del ligando se establecieron con el tamao de la tolva, la superposicin del tamao de la
tolva y las tolerancias de distancia de 0,4 , 0,1 y 1,5 , respectivamente, tanto para las esferas
coincidentes como para las molculas acopladas. Las poses de ligando se puntuaron sumando la
electrosttica del ligando del receptor y la energa de interaccin de van der Waals corregida para
la desolvatacin del ligando. Se utilizaron cargadores parciales de tomos receptores del campo de
fuerza AMBER de tomo unido excepto Lys233 y Tyr326, donde el momento dipolar Se increment
como se describi previamente43. Ms de 3 millones de molculas comercialmente disponibles de
la ZINC20 (http://zinc.docking.org) plomo-como el conjunto fueron atracados En el receptor
usando DOCK3.621 (http://dock.compbio.ucsf.edu). Entre el primer 0,08% de las molculas se
inspeccionaron y 23 se seleccionaron para pruebas experimentales en la pantalla primaria. Un
recurso para realizar estos estudios de acoplamiento est disponible pblicamente
(http://blaster.docking.org). Para una pantalla secundaria, los anlogos de los tres primeros hits de
la primaria (Compuestos 4, 5 y 7) con una similitud de ms de 0,7 (como se define en la bsqueda
ZINC) se identificaron en la base de datos ZINC. Adems, se realizaron bsquedas de subestructura
utilizando los andamios de cada uno de estos tres compuestos. Las bsquedas produjeron 500
compuestos comprados, los cuales fueron entonces acoplados como en la pantalla primaria. Los
analgicos fueron inspeccionados Interacciones y seleccionadas para pruebas experimentales
adicionales. Estudios de unin a radioligandos. Para una pantalla primaria de molculas
seleccionadas, la unin a OR se evalu midiendo la competencia contra el radioligando 3H-
diprenorfina (3H-DPN). Cada compuesto se ensay inicialmente a 20 M y Se incub con 3H-DPN
a una concentracin igual a la Kd (0,4 nM) del radioligando en OR que contena membranas de
clulas de insecto Sf9. La reaccin contena 40 fmol de OR y se incub en un tampn de HEPES
20 mM pH 7,5, 100 mM Cloruro de sodio y albmina de suero bovino al 0,1% durante 1 ha 25 C.
Para separar el radioligando libre de ligado, las reacciones se filtraron rpidamente sobre filtros
Whatman GF / B con la ayuda de una recolectora de Brandel y los recuentos de 3H-DPN se
midieron por Centelleo lquido. Los compuestos con ms del 25% de radioactividad 3H-DPN se
ensayaron adicionalmente en respuesta a la dosis completa para determinar la afinidad (Ki) en
membranas HEK293. Posteriormente, los 15 anlogos se ensayaron en respuesta a la dosis
completa para la afinidad en el OR y el O por el Programa de Pantallas de Medicamentos
Psicoactivos de la National Health Institute (PDSP) 45, as como las afinidades de los compuestos
12, PZM21 y sus Estereoismeros en el OR, OR, OR y el receptor de nocicepcin. Ensayos de
agotamiento de radioligando para probar la unin irreversible del compuesto PZM29 se realizaron
como se describe anteriormente46. Las clulas de rin embrionario humano 293 (HEK 293) se
transfectaron transitoriamente con OR o el mutante de cistena OR: N127C utilizando el
reactivo de transfeccin Mirus TransIT-293 (MoBiTec, Goettingen, Alemania), se cultivaron durante
48 h, se cosecharon y se homogeneizaron segn se describe47. Para los experimentos de
agotamiento del radioligando, los homogenados se preincubaron en tampn TRIS (Tris 50 mM a pH
7,4) a una concentracin de protena de 50-100 g / ml o 70-120 g / ml para OR y OR: N127C,
respectivamente El ligando covalente (a 5 M) para diferentes intervalos de tiempo. La incubacin
se interrumpi por centrifugacin y el ligando unido reversiblemente se lav tres veces
(resuspensin en tampn durante 30 minutos y centrifugacin posterior). Las membranas se
utilizaron entonces para los experimentos de unin a radioligandos con 3H-diprenorfina
(concentracin final: 0,7 nM, actividad especfica: 30 Ci / mmol, adquirida de Biotrend, Colonia,
Alemania) para determinar la unin especfica en el OR (Bmax = 4.000-6.500 fmol Mg Protena,
KD = 0,25 - 0,45 nM) y el receptor OR: N127C (Bmax = 1.300 - 6.000 Mol / mg de protena, KD =
0,18-0,25 nM), respectivamente, como se describi48. Se determin la unin no especfica en
presencia de naloxona 10 M. Para el anlisis de datos, los recuentos de radiactividad se
normalizaron a valores en los que el 100% representan el efecto del tampn y el 0% representa la
unin no especfica. Se realizaron cinco experimentos independientes, cada uno hecho en
cuadruplicado, y los valores resultantes fueron calculados y agrupados a una curva media que se
muestra.
Experimentos de unin a GTPS. El ensayo de unin de [35S] -GTP S se realiz con preparaciones
de membrana a partir de clulas HEK 293 que coexprimen el OR humano y las subunidades Go1
o Gi2 49 de la protena G insensible a PTX. Las clulas se transfectaron transitoriamente usando el
reactivo de transfeccin MirUS TransIT-293 (MoBiTec , Goettingen, Alemania), se cultivaron durante
48 h, se cosecharon y se homogeneizaron Como se describe47. Se determinaron los niveles de
expresin del receptor (Bmax) y KD en experimentos de saturacin con 3H-diprenorfina (actividad
especfica: 30 Ci / mmol, adquirida de Biotrend, Colonia, Alemania) (Bmax = 3.700 980 fmol / mg
Protena, KD = 0,30 0,093 nM para OR + Go1 o Bmax = 5,800 2,000 fmol / mg, KD = 0,46
0,095 nM para OR + Gi2, respectivamente). El ensayo se llev a cabo en placas de 96 pocillos
con un volumen final de 200 \ mu l. En cada pocillo, 10 M del PIB, el (Concentracin final de 0,1
pM a 100 \ mu M) y las membranas (30 \ mu g / ml de concentracin final de protena) durante 30
min a 37C en tampn de incubacin que contena HEPES 20 mM, MgCl _ {2} 6 H _ {2} O 10 mM y
70 mg / L de saponina. Despus de la adicin de 0,1 nM de [35S] -GTP S (actividad especfica
1.250 Ci / mmol, PerkinElmer, Rodgau, Alemania), se continu la incubacin a 37C durante 30 min
o 75 min adicionales para OR + Go1 o OR + Gi2, respectivamente . Se detuvo la incubacin
por filtracin a travs de filtros Whatman GF / B empapados con PBS enfriado con hielo. La
radioactividad unida se midi mediante la medicin de centelleo como se describi
anteriormente48.
El anlisis de los datos se realiz normalizando los recuentos de radiactividad (ccpms) a valores
cuando 0% representa el receptor no estimulado y 100% el efecto mximo de morfina o DAMGO.
Las curvas dosis-respuesta se calcularon
Regresin no lineal en GraphPad Prism 6.0. Valores medios s.e.m. Para valores de EC _ {50} y E _
{max} se obtuvieron de 3 - 12 experimentos individuales cada uno hecho en triplicado.
Gi / o indujo la inhibicin de AMPc. Para medir la inhibicin de AMPc mediada por o Gi o / o, las
clulas HEK-293T fueron co-transfectadas usando fosfato de calcio en una relacin 1: 1 con OR
humano y un biosensor de AMPc basado en luciferasa dividida (pGloSensorTM-22F, Promega). Para
experimentos que incluyeron la coexpresin de GRK2, las clulas se transfectaron con un plato de 1
g / 15 cm de GRK2. Despus de al menos 24 h, las clulas transfectadas se lavaron con solucin
salina tamponada con fosfato (PBS) y se us tripsina para disociar las clulas.
Las soluciones de frmaco usadas para el ensayo FLIPR fueron exactamente las mismas que las
usadas para los experimentos Gi / o Glosensor. Para activar los receptores endgenos acoplados a
Gq como control positivo para la liberacin de calcio, se utiliz TFLLR-NH2 (10 M, agonista
selectivo PAR-1).
(10 mg / kg, n = 5 para ambos genotipos) o PZM21 (20 mg / kg, n = 6 para Oprm1 - / - y n = 5 para
el tipo salvaje).
Patas traseras Los animales fueron devueltos a su jaula de origen y las respuestas de
comportamiento se registraron durante una hora. La nocicepcin se estim midiendo el valor
acumulativo
Tiempo pasado por los animales lamiendo la pata inyectada con formalina. Como los opioides
presentan clsicamente dos fases de accin analgsica, se midi el comportamiento nociceptivo
durante
Tanto en la fase temprana (0 a 5 min) como en la fase tarda (20 a 30 min). En la Fig. 4, un asterisco
indica una diferencia significativa entre frmaco y vehculo (P <0,05 calculado usando un ANOVA
unidireccional con correccin de Bonferroni).
Pletismografa del ratn. Los datos de respiracin se recogieron utilizando un sistema de
pletismografa de cuerpo entero (Buxco Electronics Inc., Wilmington, Carolina del Norte) como se
describe66. Este mtodo mide la frecuencia respiratoria, el volumen tidal, los flujos mximos,
Se mantuvo un caudal constante para todas las cmaras. Cada cmara se calibr a su transductor
unido antes del experimento. Los animales se habituaron primero a
Cmaras de plexigls durante 10 min. Los parmetros respiratorios se registraron durante 10 min
para establecer una lnea base antes de la inyeccin del vehculo (n = 8), morfina (10 mg / kg, n =
8), TRV130 (1,2 mg / kg, n = 8) o PZM21 (40 mg / Kg, n = 8). Despus se recogieron los parmetros
respiratorios en ratones sin restriccin durante 100 minutos despus de la inyeccin de frmaco.
Para disminuir la variabilidad respiratoria inducida por la ansiedad, los ratones fueron protegidos
de la vista de otros animales y experimentador. En la Fig. 4, un asterisco indica una diferencia
significativa entre frmaco y vehculo (P <0,05 calculado usando un ANOVA de medidas repetidas
con correccin de Bonferroni).
Cuantificacin acumulada de bolos fecales. Para medir los efectos constipatorios de la morfina y
PZM21, se evalu el total acumulado fecal boli como se describe6. Brevemente, se inyectaron
ratones con vehculo (n = 10), morfina (10 mg / kg, n = 16) o
PZM21 (20 mg / kg, n = 16) y se coloc en una cmara de plexigls (5 cm x 8 cm x 8 cm) colocada
sobre un tamiz de malla. Los ratones se mantuvieron sin alimento ni agua durante 6 h. Los bolos
fecales se recogieron por debajo de la malla sobre una toalla de papel y la masa acumulada se
midi cada hora durante seis horas. En la Fig. 4, un asterisco indica una diferencia significativa
entre frmaco y vehculo (P <0,05 calculado usando un ANOVA de medidas repetidas con
correccin de Bonferroni).
Respuesta locomotora de campo abierto. Para evaluar la actividad locomotora se utiliz una
cmara de campo abierto automatizada equipada con fotoclula (40 cm x 40 cm x 30 cm),
contenida en cajas de atenuacin acstica. La migracin basal de los ratones que se mueven
libremente se monitoriz durante 30 minutos, seguido de inyeccin con vehculo (n = 7), morfina
(10 mg / kg, n = 5) o PZM21 (20 mg / kg, n = 6). La actividad locomotora se monitoriz durante
otros 150 min. En la Fig. 4, un asterisco indica una diferencia significativa entre frmaco y vehculo
(P <0,05 calculado usando un ANOVA de medidas repetidas con correccin de Bonferroni).
Y se separ por una cmara central neutra (7,2 x 12,7 x 12,7 cm) para la prueba de preferencia de
lugar acondicionado. El da 1 (da de preacondicionamiento), los ratones se colocaron en la cmara
central y se dejaron explorar libremente durante 30 min.
El tiempo empleado en cada compartimento se utiliz para estimar las preferencias de la cmara
base y los ratones que mostraban un sesgo de cmara especfico ms del 70% no se estudiaron
ms. Los das 2-9 (das de acondicionamiento) se inyectaron ratones con vehculo o frmaco y se
emparejaron con la malla blanca o las cmaras de varilla negra. Todos los ratones recibieron el
vehculo los das 2, 4, 6, 8 y frmaco los das 3, 5, 7, 9. El da 10 (da de prueba), los ratones se
colocaron de nuevo en la cmara central como el da 1 y se les permiti explorar libremente
Durante 30 min. Tiempo empleado en cada camara Se expres como porcentaje de preferencia. La
preferencia de lugar se prob con morfina (10 mg / kg, n = 16), PZM21 (20 mg / kg, n = 8) o TRV130
(1,2 mg / kg, n = 7). En la Fig. 4, un asterisco indica una diferencia significativa entre las cmaras del
vehculo y del frmaco (P <0,05 por una prueba de muestreo con un valor hipottico de 50),
mientras que NS indica no significancia (P> 0,05). La catalepsia inducida por frmacos se midi en
ratones utilizando el bartest67, que incluye una barra de madera colocada horizontalmente de 3
mm de dimetro fijada a 4 cm del suelo. Los ratones se habituaron con la barra y el medio
ambiente durante 20 minutos antes de la inyeccin subcutnea de haloperidol (2 mg / kg, n = 8),
morfina (10 mg / kg, n = 8) o PZM21 (20 mg / kg, n = 8). Para medir la catalepsia, ambas patas
delanteras se colocaron suavemente sobre la barra y se midi el tiempo durante el cual cada
manguito permaneci en la posicin inicial. El efecto se midi a los 15, 30 y 90 minutos despus de
la inyeccin de frmaco. El tiempo de corte mximo para cada desafo fue de 90 s. Farmacocintica
de PZM21. Los estudios fueron realizados por el PreclinicalTherapeutics Core y la Unidad de
Estudios sobre Drogas de la Universidad de California en San Francisco. Se inyectaron 10 ratones
por va subcutnea con 20 mg / kg de PZM21. En cada punto de tiempo, se recogi 1 ml de sangre
de tres ratones y la concentracin de PZM21 en suero se determin por cromatografa lquida-
espectrometra de masas (LC / MS). Los ratones se sacrificaron posteriormente y se
homogeneizaron cerebros enteros para la determinacin de las concentraciones de PZM21 por
LC / MS. Todos los estudios se realizaron con protocolos de ratn aprobados de los comits
institucionales de cuidado de los animales y el uso. Metabolismo de PZM21. Los experimentos de
metabolismo se realizaron como se describe anteriormente68. En resumen, los microsomas
agrupados de hgado de ratn macho (CD-1) fueron adquiridos (Sigma Aldrich) y almacenados a
-75 C hasta que se requiera. Se adquiri NADPH (Carl Roth) y se almacen a -8C. Las reacciones
de incubacin se llevaron a cabo en tapas de polietileno (Eppendorf, 1,5 ml) a 37C. La mezcla de
incubacin contena PZM21 (80 M) o controles positivos (imipramina androtigotina), se
mezclaron microsomas hepticos (0,5 mg de protena microsmica / ml de mezcla de incubacin) y
tampn Tris-MgCl2 (Tris 48 mM, MgCl2 4,8 mM, pH 7,4). El volumen de incubacin final fue de 0,5
ml. Las reacciones microsmicas se iniciaron por adicin de 50 l de la solucin de cofactor de
enzima NADPH (concentracin final de 1 mM). A 0, 15, 30 y 60 min, las reacciones enzimticas se
terminaron por adicin de 500 l de acetonitrilo enfriado con hielo (que contena 8 M de patrn
interno), y la protena precipitada se elimin por centrifugacin (15.000 rcf durante 3 min). El
sobrenadante se analiz por HPLC / MS (sistema de disolventes binarios, eluyente acetonitrilo al
0,1% de cido frmico acuoso, 10-40% de acetonitrilo en 8 min, 40-95% de acetonitrilina 1 min,
95% de acetonitrilo durante 1 min, Min). Los experimentos se repitieron en tres experimentos
independientes. Las incubaciones de control paralelo se llevaron a cabo en ausencia de una
solucin de cofactor para determinar la tomatriz de unin inespecfica. El substrato restante y la
formacin de metabolitos se calcul como un valor medio s.e.m. De tres experimentos
independientes comparando AUC de metabolitos y sustrato despus de un tiempo de incubacin
predeterminado con AUC de sustrato en el tiempo 0, estimando una tasa de ionizacin similar,
corregida por un factor calculado a partir del AUC de patrn interno en cada punto de tiempo. Los
ismeros estereoqumicamente puros de 12 y PZM21 se sintetizaron a partir de las
correspondientes amidas de (R) y (S) -aminocido, que estaban disponibles comercialmente o se
preparaban fcilmente a partir del cido o ster correspondiente (vase informacin
complementaria). El grupo amino primario se someti a dimetilacin utilizando un exceso de
formaldehdo acuoso y acetonitrilo acuoso de triacetoxiborohidruro de sodio. Las carboxamidas
16a, b se convirtieron en aminas primarias por tratamiento con complejo de borano-
tetrahidrofurano bajo reflujo de las diaminas 17a, b. Enrique con tiofeno-3-carbaldehdo con
nitroetano dio el derivado de nitropropeno 18, que se convirti en alquilamina teracmica 19. La
activacin con cloroformiato de 4-nitrofenilo proporcion los carbamatos 20 que se acoplaron con
las aminas primarias enantiopuradas 17a, para conseguir mezclas diastereomricas del
correspondiente Ureas 12 y 21. La separacin por HPLC utilizando una columna semi-preparativa
Chiralpak AS-H dio los estereoismeros totales de ocho pzas de 12 y 21 incluyendo PZM21. Para
determinar la configuracin absoluta de los productos finales y preparar eficientemente PZM21, se
sintetiz carbamato enantiomricamente enriquecido 20, Con las correspondientes aminas
primarias. Para el enriquecimiento enantiomrico, se realiz la resolucin quiral de la amina
primaria racmica 19 mediante cristalizacin repetitiva con cido di-p-anisoil- (S) -tartrico.
Despus de la cristalizacin triple, se obtuvo 19 enriquecido dextrgiro enriquecido ([\ alpha] D25
= + 20,5). La (R) -acetamida correspondiente se ha caracterizado previamente como dextrgiro
([] D20 = + 49,8), de modo que enantiomricamente enriquecido 19 se trat con anhdrido
actico D] trietilamina, y se midi la rotacin especfica del producto. Basndose en el valor de
rotacin especfica de la acetamida resultante ([\ alpha] D21 = - 46,6), se asign la configuracin
absoluta del ismero mayoritario a (S). (S) -enriquecido20 se utiliz para la sntesis de los derivados
de urea finales y se asign la configuracin absoluta de diasteremeros en pares sobre la base de
la igualdad de tiempo de retencin en HPLC quiral. Una descripcin completa de las rutas sintticas
y los datos analticos de los compuestos 12, PZM21 y sus anlogos PZM22-29 se presentan en la
informacin complementaria. Modelado detallado de PZM21 y TRV130 vinculante plantea. PZM21
se acopl a la estructura de OR de estado inactivo utilizando DOCK3.6 (referencia 21) como se
describe para la pantalla primaria, con la excepcin de que las 45 esferas de coincidencia utilizadas
se generaron basndose en la postura acoplada del compuesto 12. El complejo de ligando-receptor
resultante fue adicionalmente Optimizado a travs de minimizacin con el campo de la fuerza de la
protena AMBER69 y el campo de fuerza del ligando de GAFF suplementado con AM1-BCC Cargos
El acoplamiento de PZM21 y TRV130 a la estructura de OR de estado activo (PDB: 5C1M) se
realiz tambin con DOCK3.6 con parmetros como se describi anteriormente.
El extremo amino del estado activo OR, que forma una tapa sobre el sitio de unin ortostrico
(residuos Gly52-Met65) se elimin antes de la preparacin del receptor.
Ambos casos, se eliminaron todos los residuos no receptores (lisozima T4 en estado inactivo y
Nb39 en estado activo). Para el estado activo, los residuos amino-terminales se eliminaron como
en los estudios de acoplamiento. Las coordenadas iniciales de PZM21 se generaron mediante
acoplamiento molecular como se ha descrito anteriormente. El receptor se simul con dos
tautmeros de His2976.52, ya sea en el estado N $ $ neutral o en el estado N $ $. El OR-
PZM21
Anlisis de datos e informes. Aparte de los estudios in vivo, no se aplic ningn anlisis estadstico
basado en clulas in vitro o in vitro. El tamao de la muestra (nmero de ensayos para cada
compuesto o receptor) se predetermin para estar en triplicado O cuadruplicar para los ensayos de
seleccin primaria en una sola concentracin. Para los ensayos de concentracin-respuesta, el
tamao de la muestra (nmero de ensayos para cada compuesto en receptores seleccionados)
tambin se predetermin para ser probado para un ensayo Mnimo de tres ensayos, cada uno por
triplicado o por cuadruplicado. Ninguno de los ensayos funcionales fueron cegados a los
investigadores.