Sunteți pe pagina 1din 17

Descubrimiento estructural del opioide

Analgsicos con efectos secundarios reducidos

La morfina es un alcaloide de la adormidera utilizada para tratar el dolor. Se cree que los efectos
secundarios potencialmente letales de la morfina y los opioides relacionados -que incluyen la
depresin respiratoria mortal- estn mediados por la sealizacin del receptor -opioide (OR) a
travs de la va -arrestina o por acciones en otros receptores. Por el contrario, se cree que la
sealizacin OR de la protena G confiere analgesia. Aqu computacionalmente atracar ms de 3
millones de molculas contra la estructura OR e identificar nuevos andamios no relacionados con
los opioides conocidos. La optimizacin basada en la estructura genera PZM21, un potente
activador de Gi con selectividad excepcional para OR y reclutamiento mnimo de -arrestina-2. A
diferencia de la morfina, la PZM21 es ms eficaz para el componente afectivo de la analgesia frente
al componente reflexivo y est desprovista de depresin respiratoria y de actividad reforzante
similar a la morfina en ratones a dosis equi-analgsicas. PZM21 sirve as tanto como una sonda
para separar la sealizacin de OR y un derivado teraputico que est desprovisto de muchos de
los efectos secundarios de los opioides actuales.

La adiccin a los opiceos, agravada por los potencialmente letales efectos secundarios de los
opiceos, como la depresin respiratoria, ha impulsado campaas de optimizacin para obtener
analgsicos ms seguros y eficaces desde el siglo XIX. Aunque los productos naturales, la morfina y
la codena, y la droga semi-sinttica herona, son analgsicos ms eficaces que el opio en bruto,
conservan sus pasivos. La clasificacin de los receptores opioides en los subtipos , y y
nocicepcin1,2 aument la esperanza de que las molculas especficas del subtipo carezcan de los
pasivos de

Morfinano basado en opiceos. A pesar de la introduccin de potentes agonistas opioides


sintticos como la metadona y el fentanilo y el descubrimiento de pptidos opioides endgenos3,
el desarrollo de analgsicos sin los inconvenientes de los opiceos clsicos ha seguido siendo un
objetivo difcil de alcanzar. Estudios recientes han sugerido que la analgesia inducida por opioides
resulta de la sealizacin de OR a travs de la protena G Gi, mientras que muchos efectos
secundarios, incluyendo depresin respiratoria y estreimiento, se pueden conferir mediante la
sealizacin de la va -arresina corriente abajo de la activacin OR (Figura 1a) 4-6. Por lo tanto,
se buscan agonistas especficos de la OR y sesgada hacia la va de sealizacin Gi tanto como
conductores teraputicos como sondas moleculares para comprender la sealizacin OR. El
progreso reciente ha apoyado la viabilidad y la utilidad clnica potencial de tales agonistas OR
predispuestos7,8.

La determinacin de las estructuras cristalinas de los receptores opioides , , k y nociceptina9-12


(Fig. 1b, c) proporcion la oportunidad de buscar nuevos agonistas OR a travs de enfoques
basados en la estructura. Recientes campaas de descubrimiento han utilizado estructuras
cristalinas de otros receptores G-proteinizados de la familia A (GPCR) para acoplar
computacionalmente grandes bibliotecas de molculas, identificando ligandos con nuevos
andamios y potencias de alcance nanomolar13-17. Por lo tanto, orientado a la OR para la
estructura de base-atado, la bsqueda de ligandos con nuevos quimiotipos. Razonamos que tales
nuevos quimiotipos podran conferir propiedades de sealizacin con nuevos efectos biolgicos,
como ha sido cierto para otras campaas basadas en la estructura.

Base de estructura de acoplamiento a la OR


Anclamos ms de 3 millones de compuestos similares a plomo disponibles en el mercado20 contra
el bolsillo ortostrico de OR9 inactivo, priorizando ligandos que interactan con residuos
determinantes de afinidad conocidos y con residuos de especificidad putativos que difieren entre
los cuatro subtipos de receptores opioides (Figura 1b, d) . Para cada compuesto, se evalu un
promedio de 1,3 millones de configuraciones para la complementariedad al receptor usando la
funcin de energa basada en la fsica21 en DOCK3.6. Como es comn en el acoplamiento22,23 y el
cribado, las molculas de mayor clasificacin fueron inspeccionadas para caractersticas no
capturadas explcitamente en la funcin de puntuacin. Examinamos manualmente las 2.500
molculas acopladas (0.08%) por su novedad, sus interacciones con los principales residuos polares

Tales como Asp1473.32 (los superndices indican la numeracin de Ballesteros-Weinstein24), y


privaron a aquellos que mostraron deformacin conformacional (un trmino ocasionalmente mal
modelado por la funcin de puntuacin).

En ltima instancia, 23 de alto puntaje molculas con rangos que van desde 237 a 2.095 de los ms
de 3 millones de anclados fueron seleccionados para la prueba (Fig. 1e]. En comparacin con los
ligandos de 5,215 OR anotado en ChEMBL1625, estos resultados de acoplamiento tena
Coeficientes de Tanimoto (Tc) basados en la Huella digital de conectividad extendida 4 (ECFP4) que
variaban de 0,28 a 0,31, lo cual es consistente con la exploracin de nuevos andamios26. De los 23
ensayados, siete tenan afinidades de unin a OR (Ki) que oscilaban entre 2,3 M y 14 M (Tabla de
Datos Ampliados 1, Datos Extendidos Figura 1).

Se predice que los nuevos ligandos engarzan el OR de nuevas maneras (Fig. 1f y Datos Extendidos
Fig. 1). La mayora de los ligandos opioides utilizan un par de iones catinicos con Asp1473.32, una
interaccin cannica27 observada en estructuras del receptor OR, OR, OR y nociceptina unido
a ligandos de diferentes andamios9-12,28. Como se anticip, los ligandos acoplados

Recapitul esta interaccin. Mucho menos precedencia existe para la formacin de un enlace de
hidrgeno adicional con este anclaje aspartato, a menudo mediado en el acoplamiento plantea por
una urea amida. En varios de los nuevos ligandos, el carbonilo de urea se modela a enlace de
hidrgeno con Tyr1483.33, mientras que el resto de los ligandos a menudo ocupan sitios
inexplorados por morfinanos (Fig. 1). A nuestro entender, el doble

La coordinacin del enlace de hidrgeno de Asp1473.32 modelado en las posturas de


acoplamiento no se ha anticipado ni observado previamente para los ligandos opioides y slo 50
de los 5.215 ligandos opioides anotados en ChEMBL16 contienen un grupo urea.

A pesar de la novedad estructural de los primeros

Las afinidades eran bajas. Para aumentar la unin y la selectividad, se acoplaron 500 anlogos de
los compuestos 4, 5 y 7 que retenan los grupos clave de reconocimiento pero aadan
sustituyentes de empaquetamiento o se extendan ms hacia el lado extracelular del receptor,
donde los receptores opioides eran ms variables. De los 15 an- lisis de puntuacin ms alta que
se probaron, siete tenan valores de Ki entre 42 nM y 4,7 M (Tabla de datos ampliada 2).

Alentadoramente, varios fueron especficos para el OR sobre OR (compuestos 12-15, Extended


Data Table 2). A continuacin, investigamos los anlogos ms potentes para la potencia de
sealizacin y la eficacia. Aunque la estructura contra la que se acopl fue el estado inactivo del
OR, los compuestos 8 y 12-14 activados Gi / o (Extended Data Table 2). Un enriquecimiento similar
Para los agonistas fue visto previamente en un estudio de acoplamiento contra el estado inactivo
de la OR23, tal vez reflejando los pequeos cambios en el bolsillo ortostrico asociado con la
activacin de los receptores opioides [29].

Alentadoramente, el compuesto ms potente, 12 (Fig. 2a, b), fuertemente activado Gi / o con bajos
niveles de reclutamiento -arresina-2 (Figura 2c, d).

Optimizacin sinttica guiada por estructura

Para optimizar el compuesto 12, se sintetizaron ismeros estereoquimicamente puros e


introdujeron un hidroxilo fenlico (figura 3a). La sntesis del estereoismero (S, S) de 12 mejor la
afinidad (Ki) a 4,8 nM y tuvo una EC50 de sealizacin de 65 nM; Era el agonista de sealizacin
Gi / o ms potente y eficaz entre los cuatro ismeros (figura 3e). El hidroxilo fenlico, introducido
para preparar el compuesto (S, S) -21, fue diseado para explotar un enlace de hidrgeno mediado
por agua con His2976.52, una interaccin

Observado en la estructura de OR en complejo con -funaltrexamina (-FNA) (Fig. 3b) y en otras


estructuras de la OR28 y OR11. Este hidroxilo se acomod fcilmente en el complejo OR-12
acoplado, mejorando la energa de acoplamiento prevista (Figura 3c). Compuesto (S, S) -

21 tena una CE50 de 4,6 nM en un ensayo de activacin Gi / o, con un 76% de eficacia (figura 3f) y
un Ki de 1,1 nM en ensayos de unin a radioligandos (Tabla de datos ampliada 3), una mejora de
40 veces frente a 12 Los otros tres estereoismeros de (S, S) -21 eran mucho menos potentes o
eficaces (Datos Extendidos Fig. 2a, b), lo que sugiere un requisito estereoqumico especfico tanto
para la potencia como para la eficacia de acuerdo con las posturas acopladas de (S, S ) -21 a las
estructuras inactivas y activas29 de OR(Figura 3c, datos extendidos, figura 2c, d). A continuacin
se hace referencia a (S, S) - 21 como compuesto PZM21.Debido a que PZM21 se descubri contra
la estructura inactiva de OR, su complejo acoplado a activo OR mantiene ambigedades. Para
investigar su receptor de estructura unida ms, ms detallado de acoplamiento y dinmica
molecular simulaciones se llevaron a cabo. El modelo resultante se prob sintetizando molculas
que perturbaron o explotaron Especfico modelado interacciones (Fig. 3c, d, Extended Data Figs 2 y
3].

La neutralizacin de la carga por amidacin (compuesto PZM28) disminuye la potencia en 1.000


veces, soportando una interaccin inica clave entre la amina terciaria PZM21 y Asp1473.32 (Fig.
3d y Datos ampliados Fig. 3). El compuesto PZM27, que aade masa estrica a la amina terciaria,
se sintetiz para interrumpir interacciones hidrofbicas putativas Entre el grupo N-metilo y
Met1513.36 y Trp2936.48, consistente con su prdida de potencia de 30 veces y disminucin de la
eficacia (Fig. 3d y Extended Data, Fig. 3). Los compuestos PZM23, PZM24 y PZM25, que se
sintetizaron para interrumpir las interacciones de enlaces de hidrgeno en el modelo entre la urea
y Asp1473.32, Tyr3267.43 y Gln1242.60,Pierden entre 30 y 230 veces la potencia a pesar de sus
menores penalizaciones de solvatacin (Fig. 3d y Datos ampliados Fig. 3). Estas interacciones clave
inicas y de enlace de hidrgeno se mantienen durante 3 s de la dinmica molecular
simulaciones de PZM21 en complejo con OR activo, as como las interacciones entre el hidroxilo
fenlico y las aguas de puente a His2976.52, apoyando an ms su relevancia para el modelado
(Datos ampliados Fig. 2g). El tiofeno de PZM21, modelado para encajar en la regin de
especificidad ms abierta del OR, puede ser reemplazado con un benzotiofeno mayor sin prdida
de potencia (Datos ampliados Figura 3). Las interacciones de este tiofeno con residuos que difieren
entre el receptor opioide Sub-tipos pueden contribuir a la especificidad PZM21 (Extended Data Fig.
2e). De manera ms convincente, las simulaciones y el acoplamiento predicen que el tiofeno
PZM21 se encuentra dentro de 6 de Asn1272.63 en el Activa OR (Datos ampliados Fig. 2g). Por
consiguiente, se sintetiz una versin irreversible de PZM21 (compuesto PZM29) diseado para
formar un enlace covalente con OR manipulado con una mutacin N127C.El Compuesto PZM29
se une irreversiblemente a este mutante pero no al receptor de tipo salvaje y retiene su eficacia
como agonista (Datos Extendidos Fig. 3), soportando la orientacin general de PZM21 como
modelado y simulado en el sitio OR ortostrico.

PZM21 es un selectivo Gi-sesgado OR agonista

PZM21 no tena detectable OR o agonista del receptor de nociceptina

Es en realidad un antagonista de OR de 18 nM-mientras que es un agonista de OR de 500 veces


ms dbil (Extended Data Fig. 4 y Extended DataTable 3), lo que lo convierte en un agonista
selectivo OR. Para investigar la especificidad ms ampliamente, PZM21 fue contra-seleccionados
para el agonismo contra 316 GPCRs otros [30]. Se observ actividad a 10 M en varios pptidos y
receptores de protenas; Sin embargo, no se confirm actividad potente con un

Completa dosis-respuesta en estos receptores. Por lo tanto, PZM21 tiene alta especificidad
agonista entre GPCRs (Extended Data Fig. 5a-c) .PZM21 tambin se ensay para la inhibicin del
canal de iones hERG y los transportadores de neurotransmisor de dopamina, norepinefrina y
serotonina. En hERG, PZM21 tena una CI50 de entre 2 y 4 M, 500 a 1.000 veces ms dbil que su
potencia como un agonista OR (Extended Data, Fig. 5d). Su inhibicin de los transportadores de
neurotransmisores, que son tambin objetivos de la analgesia, fue an ms dbil con IC50 valores
que van desde 7,8 a 34 M (Extended Data Fig. 5e). Por lo tanto, PZM21 es un potente,

Selectivo, y eficaz agonista opioide.

Un objetivo principal de este estudio fue encontrar nuevos quimiotipos que pudieran mostrar la
sealizacin sesgada y quizs, a diferencia de los frmacos opiceos cannicos, tienen perfiles in
vivo ms favorables. La sealizacin por PZM21 y otros agonistas OR parece estar mediada
principalmente por la protena G heterotrimrica Gi / o, ya que su efecto sobre los niveles de AMPc
fue eliminado por la toxina pertussis y no se observ actividad en un ensayo de liberacin de calcio
(datos ampliados Fig. 6a- re). Una concentracin mxima de PZM21 condujo a un reclutamiento de
-arresina-2 no detectable en el ensayo PathHunter (DiscoverRx) (Fig. 3g y Datos Extendidos Figura
6c) y un nivel mnimo de internalizacin de OR comparado con DAMGO y morfina (Fig. 6e). De
hecho, el reclutamiento de -arresina-2 fue demasiado bajo para permitir incluso un clculo formal
de sesgo31, que cuantifica la preferencia por una va de sealizacin sobre otra. Dado que el
reclutamiento de -arrestin puede

Dependen del nivel de expresin de la protena quinasa 2 acoplada a protena G (GRK2) 32,
tambin se investig la sealizacin Gi / o y el reclutamiento de arrestina en clulas
cotransfectadas con esta quinasa. Incluso en presencia de GRK2 sobreexpresado, PZM21 todava
tiene una eficacia de reclutamiento de arrestina dbil en comparacin con DAMGO e incluso con
morfina (Datos ampliados Fig. 6g-i). De hecho, el sesgo de sealizacin de PZM21 era indistinguible
de TRV130, un agonista de opioides orientado por Gi ahora en ensayos clnicos de fase III (figura 3f,
g), mientras que su sesgo de protena G sustancialmente super el de herkinorina, que tambin ha
sido Supuestamente un agonista agredido por Gi33 (datos ampliados, figura 6). Una distincin
intrigante en estos estudios de sealizacin es la falta de actividad agonista de PZM21 en OR.
Mientras que PZM21 es un antagonista de 18-nM de este receptor, el otro agonista biavado,
TRV130, activa K OR con una potencia similar a la morfina (Extended Data, Fig. 6f). Adicionalmente,
a pesar de tener niveles similares de sesgo de sealizacin, en los estudios de modelado TRV130 y
PZM21 parecen acoplar el OR de maneras distintas (Extended Data, Fig. 2f).

Analgesia con efectos secundarios disminuidos

Consistente con su actividad agonista OR, PZM21 mostr una analgesia dosis-dependiente en un
ensayo de placa de coccin de ratn, con un efecto mximo mximo posible (% MPE) del 87%
alcanzado 15 minutos despus de la administracin de la dosis ms alta de frmaco probada
(Figura 4a). La dosis ms alta de morfina ensayada se estabiliz al 92% despus de 30 min.
Intrigantemente, no se observ ningn analgsico Para el PZM21 en el ensayo de cola-flick (Fig.
4b). Esta distincin no tiene precedentes entre los analgsicos opioides. El experimento de placas
calientes evala la analgesia tanto en el cerebro del sistema nervioso central (SNC) como en los
circuitos nociceptivos espinales, mientras que el experimento de cola es ms especfico para las
respuestas reflexivas espinales34. La subcategorizacin de las respuestas de comportamiento en el
experimento de la placa de coccin como afectiva (mediada por el SNC) o reflexiva (mediada
espinalmente) mostr que, a diferencia de la morfina, PZM21 confiere nicamente analgesia al
componente afectivo del dolor (Fig. . Aunque la separacin de estas dos vas analgsicas es nica
para PZM21 entre los conocidos Analgsicos opioides, se ha observado por activacin
quimiogentica selectiva35 o inactivacin inducida por toxina de neuronas del SNC en roedores36.
De hecho, PZM21 es tambin activo en un ensayo de nocicepcin con inyeccin de formalina,
probablemente por activacin supraspinal de circuitos inhibidores descendentes37 (figura 4d). Si
esta especificidad de circuito refleja la sealizacin sesgada De PZM21, su especificidad para el
OR frente a otros opioides Receptores y otros GPCRs, un fenmeno inusual de distribucin del
SNC, o alguna otra propiedad de sealizacin, es incierta en este momento.

Ms seguro es que la analgesia PZM21 resulta de la activacin de OR en vivo, ya que el knockout


gentico de la OR elimina completamente la respuesta analgsica observada en el ensayo de
placa de calentamiento (Figura 4e). Mientras tanto, el PZM21 se metaboliza de forma
relativamente lenta por microsomas hepticos de ratn, con slo un 8% de metabolismo durante
una hora. Los experimentos de sealizacin con el grupo de metabolitos resultante no muestran
evidencia de un metabolito con ms

Potente activacin de la OR , lo que confirma que la actividad analgsica observada resulta


principalmente de la dosis originalmente administrada de PZM21 (Extended Data Fig. 7e, f).

Basados en estudios genticos previos con ratones knockout de arrestina y estudios


farmacolgicos con compuestos sesgados4-7, anticipamos que PZM21 conferira analgesia de
mayor duracin con disminucin de la depresin respiratoria y constipacin, ambos efectos
secundarios clave limitantes de la dosis de agonistas opioides clsicos. La analgesia inducida por
PZM21 dura hasta 180 min, sustancialmente ms larga que la inducida por una dosis mxima

De la morfina (datos ampliados Fig. 7a, b) y el agonista biavado TRV130 (figura 4a). Mientras que
PZM21 reduce la defecacin, su efecto constipador es sustancialmente menor que la morfina (Fig.
4f). La depresin respiratoria se investig mediante dosificacin de ratones sin restriccin con dosis
equi-analgsicas de PZM21, TRV130 y morfina (40 mg kg-1, 1,2 mg kg-1 y 10 mg kg-1,
respectivamente) y midiendo la respiracin mediante pletismografa de todo el cuerpo . Mientras
que la morfina profundamente deprimido frecuencia de respiracin, PZM21 era casi indistinguible
del vehculo (Fig. 4g]. En comparacin, TRV130 deprime significativamente la respiracin A los 15
min, correlacionando con su pico de respuesta analgsica. Aunque la depresin respiratoria por OR
R puede ser mediada parcialmente por la activacin de los canales de potasio rectificados hacia
dentro (GIRKs) acoplados a la protena G, los opioides sistmicamente infundidos pueden disminuir
la frecuencia respiratoria incluso en ratones deficientes en GIRK38, consistente con los
mecanismos de sealizacin independientes de la protena G Primero sugerido por los estudios de
eliminacin de arrestina4-6. La depresin respiratoria rpida observada para la morfina y TRV130
puede reflejar la activacin de GIRK. Sin embargo, en momentos posteriores, PZM21 induce una
depresin respiratoria mnima a pesar de proporcionar analgesia robusta. Por el contrario, la
morfina induce un curso prolongado de depresin respiratoria que no disminuye con la resolucin
de la respuesta analgsica a los 90 min. Esta disociacin en la analgesia y la depresin respiratoria
en puntos posteriores del tiempo puede reflejar reclutamiento diferencial de -arresina-2.
Tomados en conjunto, estos estudios apoyan mnima -arrestina-2 de sealizacin in vivo por
PZM21 (sesgo de sealizacin, Fig. 1a). Una de las principales responsabilidades de los actuales
analgsicos opioides es el refuerzo y la adiccin, los cuales se postulan que deben ser mediados -al
menos en parte- por la activacin de los circuitos dopaminrgicos de recompensa39.

Un biomarcador para tal activacin en ratones es una respuesta hiperlocomotora aguda, que
refleja la activacin dopaminrgica mesolmbica40. Mientras que la morfina induca la
hiperlocomocin del ratn en un ensayo de campo abierto (Figura 4h), una dosis casi equi-
analgsica de PZM21 no tena efecto aparente sobre la locomocin frente al vehculo. La
disminucin de la distancia recorrida no refleja un efecto cataleptico de PZM21 (datos ampliados,
figura 7c). Consistente con la disminucin de la activacin de los circuitos de recompensa, la
administracin de PZM21 tambin no induce una respuesta de preferencia lugar acondicionado
(Figura 4i], a diferencia de la morfina y otros opioides [41]. Aunque TRV130 tiende ms hacia la
induccin de preferencia de lugar, su actividad tampoco es significativa en relacin con el vehculo;
Esta falta de preferencia de lugar condicionado para ambos agonistas sesgados puede apoyar un
papel para el sesgo de la protena G en la falta de comportamiento de refuerzo inducido por
opioides. Las diferencias entre la morfina y PZM21 en el lugar acondicionado preferencia no
reflejan simplemente disimilitudes en la penetracin del SNC entre los dos frmacos, Ya que una
fraccin sustancial de PZM21 atraviesa la barrera hematoenceflica (Extended Data, Fig. 7d). Varias
advertencias merecen ser mencionadas. Aunque el descubrimiento basado en la estructura tuvo
xito en la bsqueda de nuevos andamios y apoy la optimizacin fcil, algunas de las propiedades
de PZM21 eran probablemente fortuitas.

La sealizacin sesgada a travs de la protena G y las vas de arrestina refleja la estabilizacin de


conformaciones a ms de 30 del sitio ortostrico en el que se une PZM21. No se seleccionaron
molculas que estabilizan preferentemente estas conformaciones, sino que se basaron en la
novedad qumica para conferir nuevas propiedades biolgicas. Se logr la selectividad del subtipo
del receptor Simplemente seleccionando molculas que se extienden en regiones variables del
receptor, una estrategia que puede no siempre funcionar. Varios aspectos de la farmacologa
presentados aqu siguen siendo preliminares, incluyendo los estudios de estabilidad metablica y
la farmacocintica, y no est claro en este momento si la actividad in vivo sin precedentes de
PZM21 refleja su agonismo parcial y especfico, o alguna otra caracterstica conferida por su novela
Quimiotipo Por ltimo, no siempre se puede confiar en la identificacin de los agonistas desde el
acoplamiento a una estructura receptora del estado inactivo13,16,42,43, aunque hay precedencia
para hacerlo frente a los receptores opioides23.

Discusin
A pesar de estas advertencias, este estudio apoya un enfoque basado en la estructura para el
descubrimiento de ligandos GPCR. Mientras que este mtodo todava no puede encontrar
confiablemente los plomos con la especificidad adaptada y la eficacia de la sealizacin, puede
identificar confiablemente los andamios y los quimiotipos enteramente nuevos. Estos nuevos
quimiotipos pueden estabilizar las conformaciones de los receptores no explorados previamente y
as generar nuevos efectos biolgicos. Con un nuevo quimiotipo en la mano, la estructura acoplada
proporciona una estrategia directa para la optimizacin. Aqu, hemos optimizado una inicial de
acoplamiento hit, el compuesto 7, 1.000 veces a la molcula de plomo final, PZM21, mediante la
evaluacin de menos de 50 molculas. Aunque esta campaa se inspir en las agonistas OR
predispuestos como TRV1307, el enfoque basado en la estructura llev a un compuesto con
nuevas propiedades; Era estructuralmente distinta en comparacin con ligandos opioides
previamente explorados, con no slo sesgo de sealizacin sustancial, sino tambin con
selectividad inesperada del receptor opioide.

Estas caractersticas han contribuido a efectos biolgicos favorables, con analgesia duradera
acoplada a la eliminacin aparente de depresin respiratoria, especificidad para la analgesia
central refleja, falta de potencia locomotora y preferencia de lugar condicionado, Potencial de
refuerzo inducido por opioides para PZM21 y molculas como sta. La selectividad, la potencia y la
sealizacin polarizada de PZM21 la convierten en una molcula de herramienta de un tipo que no
estaba disponible para interrogar la sealizacin OR. Ms ampliamente, los resultados in vitro de
mltiples campaas de GPCR, Y los resultados in vivo aqu presentados, presentan un enfoque
general para el problema de la nueva herramienta y descubrimiento de plomo para esta familia
farmacolgicamente importante de receptores.

MTODOS

No se utilizaron mtodos estadsticos para predeterminar el tamao de la muestra. Productos


qumicos, reactivos y lneas celulares. Los productos qumicos y los reactivos utilizados en este
estudio se adquirieron de fuentes comerciales (Sigma, Tocris, Fisher scientific, ZINC Proveedores de
bases de datos) o sintetizados como se indica en la Informacin Complementaria. Las clulas
HEK293 (ATCC CRL-1573; 60113019, certificadas sin micoplasma y autnticas por ATCC) y HEK293-T
(HEK293T; ATCC CRL-11268; 59587035, certificadas sin micoplasma y autnticas por ATCC) fueron
de la ATCC y son Bien validado para estudios de sealizacin. Las clulas tambin fueron validadas
por el anlisis de corto tndem repeticin (STR) perfiles de ADN y estos perfiles mostraron 100%
de coincidencia en la base de datos STR de ATCC. U2OS clulas que expresan humanos se
obtuvieron como Criopreservados de DiscoverX y no se autenticaron ms.

Molecular docking y seleccin analgica. La estructura de los receptores -opiceos del estado
inactivo (PDB: 4DKL) se us como entrada para la preparacin del receptor con DOCK Blaster
(http://blaster.docking.org) 44. Se utilizaron cuarenta y cinco esferas coincidentes basndose en
una versin truncada del ligando cristalizado. El enlace covalente y la regin de unin del
antagonista -funaltrexamina se eliminaron para la generacin de la esfera. Los parmetros de
muestreo del ligando se establecieron con el tamao de la tolva, la superposicin del tamao de la
tolva y las tolerancias de distancia de 0,4 , 0,1 y 1,5 , respectivamente, tanto para las esferas
coincidentes como para las molculas acopladas. Las poses de ligando se puntuaron sumando la
electrosttica del ligando del receptor y la energa de interaccin de van der Waals corregida para
la desolvatacin del ligando. Se utilizaron cargadores parciales de tomos receptores del campo de
fuerza AMBER de tomo unido excepto Lys233 y Tyr326, donde el momento dipolar Se increment
como se describi previamente43. Ms de 3 millones de molculas comercialmente disponibles de
la ZINC20 (http://zinc.docking.org) plomo-como el conjunto fueron atracados En el receptor
usando DOCK3.621 (http://dock.compbio.ucsf.edu). Entre el primer 0,08% de las molculas se
inspeccionaron y 23 se seleccionaron para pruebas experimentales en la pantalla primaria. Un
recurso para realizar estos estudios de acoplamiento est disponible pblicamente
(http://blaster.docking.org). Para una pantalla secundaria, los anlogos de los tres primeros hits de
la primaria (Compuestos 4, 5 y 7) con una similitud de ms de 0,7 (como se define en la bsqueda
ZINC) se identificaron en la base de datos ZINC. Adems, se realizaron bsquedas de subestructura
utilizando los andamios de cada uno de estos tres compuestos. Las bsquedas produjeron 500
compuestos comprados, los cuales fueron entonces acoplados como en la pantalla primaria. Los
analgicos fueron inspeccionados Interacciones y seleccionadas para pruebas experimentales
adicionales. Estudios de unin a radioligandos. Para una pantalla primaria de molculas
seleccionadas, la unin a OR se evalu midiendo la competencia contra el radioligando 3H-
diprenorfina (3H-DPN). Cada compuesto se ensay inicialmente a 20 M y Se incub con 3H-DPN
a una concentracin igual a la Kd (0,4 nM) del radioligando en OR que contena membranas de
clulas de insecto Sf9. La reaccin contena 40 fmol de OR y se incub en un tampn de HEPES
20 mM pH 7,5, 100 mM Cloruro de sodio y albmina de suero bovino al 0,1% durante 1 ha 25 C.
Para separar el radioligando libre de ligado, las reacciones se filtraron rpidamente sobre filtros
Whatman GF / B con la ayuda de una recolectora de Brandel y los recuentos de 3H-DPN se
midieron por Centelleo lquido. Los compuestos con ms del 25% de radioactividad 3H-DPN se
ensayaron adicionalmente en respuesta a la dosis completa para determinar la afinidad (Ki) en
membranas HEK293. Posteriormente, los 15 anlogos se ensayaron en respuesta a la dosis
completa para la afinidad en el OR y el O por el Programa de Pantallas de Medicamentos
Psicoactivos de la National Health Institute (PDSP) 45, as como las afinidades de los compuestos
12, PZM21 y sus Estereoismeros en el OR, OR, OR y el receptor de nocicepcin. Ensayos de
agotamiento de radioligando para probar la unin irreversible del compuesto PZM29 se realizaron
como se describe anteriormente46. Las clulas de rin embrionario humano 293 (HEK 293) se
transfectaron transitoriamente con OR o el mutante de cistena OR: N127C utilizando el
reactivo de transfeccin Mirus TransIT-293 (MoBiTec, Goettingen, Alemania), se cultivaron durante
48 h, se cosecharon y se homogeneizaron segn se describe47. Para los experimentos de
agotamiento del radioligando, los homogenados se preincubaron en tampn TRIS (Tris 50 mM a pH
7,4) a una concentracin de protena de 50-100 g / ml o 70-120 g / ml para OR y OR: N127C,
respectivamente El ligando covalente (a 5 M) para diferentes intervalos de tiempo. La incubacin
se interrumpi por centrifugacin y el ligando unido reversiblemente se lav tres veces
(resuspensin en tampn durante 30 minutos y centrifugacin posterior). Las membranas se
utilizaron entonces para los experimentos de unin a radioligandos con 3H-diprenorfina
(concentracin final: 0,7 nM, actividad especfica: 30 Ci / mmol, adquirida de Biotrend, Colonia,
Alemania) para determinar la unin especfica en el OR (Bmax = 4.000-6.500 fmol Mg Protena,
KD = 0,25 - 0,45 nM) y el receptor OR: N127C (Bmax = 1.300 - 6.000 Mol / mg de protena, KD =
0,18-0,25 nM), respectivamente, como se describi48. Se determin la unin no especfica en
presencia de naloxona 10 M. Para el anlisis de datos, los recuentos de radiactividad se
normalizaron a valores en los que el 100% representan el efecto del tampn y el 0% representa la
unin no especfica. Se realizaron cinco experimentos independientes, cada uno hecho en
cuadruplicado, y los valores resultantes fueron calculados y agrupados a una curva media que se
muestra.

Experimentos de unin a GTPS. El ensayo de unin de [35S] -GTP S se realiz con preparaciones
de membrana a partir de clulas HEK 293 que coexprimen el OR humano y las subunidades Go1
o Gi2 49 de la protena G insensible a PTX. Las clulas se transfectaron transitoriamente usando el
reactivo de transfeccin MirUS TransIT-293 (MoBiTec , Goettingen, Alemania), se cultivaron durante
48 h, se cosecharon y se homogeneizaron Como se describe47. Se determinaron los niveles de
expresin del receptor (Bmax) y KD en experimentos de saturacin con 3H-diprenorfina (actividad
especfica: 30 Ci / mmol, adquirida de Biotrend, Colonia, Alemania) (Bmax = 3.700 980 fmol / mg
Protena, KD = 0,30 0,093 nM para OR + Go1 o Bmax = 5,800 2,000 fmol / mg, KD = 0,46
0,095 nM para OR + Gi2, respectivamente). El ensayo se llev a cabo en placas de 96 pocillos
con un volumen final de 200 \ mu l. En cada pocillo, 10 M del PIB, el (Concentracin final de 0,1
pM a 100 \ mu M) y las membranas (30 \ mu g / ml de concentracin final de protena) durante 30
min a 37C en tampn de incubacin que contena HEPES 20 mM, MgCl _ {2} 6 H _ {2} O 10 mM y
70 mg / L de saponina. Despus de la adicin de 0,1 nM de [35S] -GTP S (actividad especfica
1.250 Ci / mmol, PerkinElmer, Rodgau, Alemania), se continu la incubacin a 37C durante 30 min
o 75 min adicionales para OR + Go1 o OR + Gi2, respectivamente . Se detuvo la incubacin
por filtracin a travs de filtros Whatman GF / B empapados con PBS enfriado con hielo. La
radioactividad unida se midi mediante la medicin de centelleo como se describi
anteriormente48.

El anlisis de los datos se realiz normalizando los recuentos de radiactividad (ccpms) a valores
cuando 0% representa el receptor no estimulado y 100% el efecto mximo de morfina o DAMGO.
Las curvas dosis-respuesta se calcularon

Regresin no lineal en GraphPad Prism 6.0. Valores medios s.e.m. Para valores de EC _ {50} y E _
{max} se obtuvieron de 3 - 12 experimentos individuales cada uno hecho en triplicado.

Gi / o indujo la inhibicin de AMPc. Para medir la inhibicin de AMPc mediada por o Gi o / o, las
clulas HEK-293T fueron co-transfectadas usando fosfato de calcio en una relacin 1: 1 con OR
humano y un biosensor de AMPc basado en luciferasa dividida (pGloSensorTM-22F, Promega). Para
experimentos que incluyeron la coexpresin de GRK2, las clulas se transfectaron con un plato de 1
g / 15 cm de GRK2. Despus de al menos 24 h, las clulas transfectadas se lavaron con solucin
salina tamponada con fosfato (PBS) y se us tripsina para disociar las clulas.

Las clulas se centrifugaron, se resuspendieron en medio de recubrimiento (1% de FBS dializado en


DMEM), se plaquearon a una densidad de 15.000-20.000 clulas por 40 l por pocillo en placas de
cultivo de clulas blanqueadas blanqueadas de 384 pocillos revestidas con poli-lisina y se
incubaron a 37C con CO2 al 5% durante la noche. Para la inactivacin de experimentos Gi / o de
toxina de tos ferina (PTX), las clulas se sembraron con 100 ng / ml de concentracin final PTX. Al
da siguiente, se prepararon diluciones de frmaco en tampn de ensayo nuevo (HEPES 20 mM, 1 x
HBSS, albumina de suero bovino al 0,1% (BSA) y cido ascrbico 0,01%, pH 7,4) a una
concentracin de frmaco 3X. Las placas se decantaron y se aadieron a cada pocillo 20 l por
pocillo de tampn de frmaco (HEPES 20 mM, 1 HBSS, pH 7,4). La adicin de frmacos a placas
de 384 pocillos se realiz mediante FLIPR aadiendo 10 l de frmaco por pocillo para un volumen
total de 30 l. Las placas se dejaron incubar durante exactamente 15 minutos en la oscuridad a
temperatura ambiente. Para estimular el cAMP endgeno mediante la activacin de -
adrenrgicos-Gs, 10 l de 4 isoproterenol (200 nM concentracin final) diluido en tampn de
frmaco suplementado con el sustrato de ensayo GloSensor Por pocillo. Las clulas se incubaron
nuevamente en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min, y se cuantific la intensidad
de la luminiscencia usando un contador de luminiscencia Wallab TriLux microbeta (Perkin Elmer).
Los datos se normalizaron a la inhibicin de cAMP inducida por DAMGO y se analizaron usando
regresin no lineal en GraphPad Prism 6.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA). La
determinacin de la actividad funcional de PZM21-29 para los estudios SAR se realiz utilizando un
ensayo de acumulacin de cAMP basado en BRET50. HEK-293T clulas Fueron co-transfectadas
transitoriamente con pcDNA3L-His-CAMYEL42 (adquirido de ATCC a travs de LCG Standards,
Wesel, Alemania) y OR humano, logrando una proporcin de cDNA de 2: 2 usando el reactivo de
transfeccin Mirus TransIT-293. 24 h despus de la transfeccin, Las clulas se sembraron en placas
de 96 pocillos de medio rea blancas a 20 x 104 clulas / pocillo y se cultivaron durante la noche.
Al da siguiente, se elimin el medio libre de fenol-rojo y se reemplaz por PBS y las clulas se
privaron de suero durante 1 h antes del tratamiento. El ensayo se inici aadiendo 10 l de
coelenterazina h (Progmega, Mannheim, Alemania) a cada pocillo para producir una concentracin
final de 5 M. Despus de 5 minutos de incubacin, los compuestos Se aadieron en PBS que
contena forskolina (concentracin final 10 M). Las lecturas de las placas comenzaron 15 minutos
despus de la adicin del agonista. Las lecturas de BRET se recolectaron Lector de placas
CLARIOstar (BMG LabTech, Ortenberg, Alemania). Las seales de emisin de Renilla Luciferase y
YFP se midieron simultneamente usando un conjunto de filtros BRET1 (475-30 nm / 535-30 nm).
Se calcularon las relaciones BRET (emisin a 535-30 nm / emisin a 475-30 nm) y se ajustaron las
curvas dosis-respuesta mediante regresin no lineal Utilizando GraphPad Prism 6.0. Las curvas se
normalizaron a la relacin BRET basal obtenida de dPBS y el efecto mximo de morfina y DAMGO.
Cada curva se deriva de tres a cinco experimentos independientes cada uno hecho en duplicado.
Liberacin de calcio. La liberacin de calcio se midi usando un lector de placas de fluorescencia
FLIPRTETRA (Molecular Devices). Los experimentos de liberacin de calcio se realizaron en paralelo
con los experimentos Gi / o Glosensor con las mismas clulas HEK-293T transfectadas con OR,
excepto que las clulas para FLIPR se sembraron en placas de cultivo de clulas de fondo negro
transparente de 384 pocillos revestidas con poli-lisina. Las clulas se incubaron a 37C con CO2 al
5% durante la noche y el medio del da siguiente se decant y se reemplaz con Fluo - 4Colorante
de calcio directo (Life Technologies) compuesto en HBSS con HEPES 20 mM, pH 7,4. El colorante se
incub durante 1 ha 37 C. Posteriormente, las clulas se equilibraron a temperatura ambiente, y
la fluorescencia en cada pocillo se ley para los 10 s iniciales para establecer una lnea de base.
Posteriormente, se aadieron 10 \ mu l de frmaco (3 x) por pocillo y se determin el incremento
mximo en la fluorescencia como punto de partida sobre la lnea de base.

Las soluciones de frmaco usadas para el ensayo FLIPR fueron exactamente las mismas que las
usadas para los experimentos Gi / o Glosensor. Para activar los receptores endgenos acoplados a
Gq como control positivo para la liberacin de calcio, se utiliz TFLLR-NH2 (10 M, agonista
selectivo PAR-1).

Internalizacin del receptor. La internalizacin se midi utilizando el eXpress DiscoveRx PathHunter


GPCR internalizacin ensayo utilizando split -galactosidasa complementacin. En resumen, las
clulas U2OS crioconservadas que expresan el OR humano se descongelaron rpidamente y se
plaquearon en placas de cultivo de medio y 96 pocillos suministradas. Al da siguiente, las clulas
se estimularon con frmacos (10x) y se dejaron incubar durante 90 minutos a 37C con CO2 al 5%.
Posteriormente, se aadi substrato a las clulas y se midi la quimioluminiscencia en un contador
de placas TriLux (Perkin Elmer). Los datos se normalizaron a DAMGO y se analizaron utilizando
Graphpad Prism 6.0. Ensayos de reclutamiento de -Arrestin. El reclutamiento de -ARN se midi
mediante el ensayo de complementacin de la enzima PathHunter (DiscoveRx) o por Descritos
mtodos de transferencia de energa de resonancia de bioluminiscencia (BRET). Ensayos utilizando
DiscoveRx PathHunter eXpress OPRM1 Los ensayos de GPCR de -ARresina CHO-K1 se realizaron
exactamente segn las indicaciones del fabricante. Brevemente, las clulas criopreservadas
suministradas se descongelaron y resuspendieron en el medio suministrado, y se sembraron en
placas de 96 pocillos amuebladas. Al da siguiente, se aadieron a las clulas 10x de diluciones de
agonista (preparadas en HBSS y HEPES 20 mM, pH 7,4) y se incubaron durante 90 min. A
continuacin, los reactivos de deteccin se reconstituyeron, se mezclaron en la proporcin
apropiada y se aadieron a las clulas. Despus de 60 min, la luminiscencia por pocillo se midi en
un contador de placas TriLux (Perkin-Elmer). Los datos se normalizaron a DAMGO y se analizaron
utilizando la funcin sigmoidal dosis-respuesta incorporada en GraphPad Prism 6.0. Para medir el
reclutamiento de -arresina mediada por OR por BRET en presencia

O la ausencia de co-expresin de GRK2, las clulas HEK-293T fueron co-transfectadas en una


relacin 1: 1: 15 con \ alpha R humana que contiene luciferasa de renilla C-terminal (RLuc8), GRK2
y -arresina N-terminal marcada con venus -2, respectivamente. En el caso de Experimentos donde
se vari la expresin de GRK2, pcDNA3.1 se sustituy por GRK2 para mantener la misma
concentracin de ADN transfectado. Al cabo de al menos 24 h, las clulas transfectadas se
sembraron en una celda de fondo transparente blanco de 96 pocillos revestida con poli-lisina
Placas de cultivo en medios de revestimiento a una densidad de 125.000-250.000 clulas por 200
l por pocillo y se incubaron durante la noche. Al da siguiente, los medios se decantaron y las
clulas se lavaron dos veces con 60 \ mu l de tampn de frmaco y se incubaron a temperatura
ambiente durante al menos 10 minutos antes de la estimulacin del frmaco. Se aadieron 30 l
de frmaco (3x) por pocillo y se incubaron durante al menos 30 minutos en la oscuridad. A
continuacin, se aadieron 10 l del sustrato RLuc, coelenterazina H (Promega, concentracin final
5 M) por pocillo y se leyeron placas tanto para la luminiscencia a 485 nm como para la emisin
fluorescente de eYFP a 530 nm durante 1 s por pocillo usando una Lector de microplacas Mithras
LB940. La relacin de eYFP / RLuc se calcul por pocillo y la relacin BRET neto se calcul
substrayendo el eYFP / RLuc por pocillo de la relacin eYFP / RLuc sin venus-arrestina presente.

Los datos se normalizaron a la estimulacin inducida por DAMGO y se analizaron mediante


regresin no lineal en GraphPad Prism 6.0. Clculo del sesgo de ligandos. Se han descrito mltiples
enfoques para cuantificar el sesgo del ligando, incluyendo modelos operacionales, modelos de
actividad relativa intrnseca y modelos alostricos31,52. En ausencia de GRK2, no se observan
reclutamiento de -arresina-2 para PZM21 y TRV130. Esto impide una evaluacin cuantitativa del
sesgo por el modelo operativo. En el caso de GRK2 se sobreexpresa, observamos el reclutamiento
de arrestina para PZM21 y TRV130. En este caso, utilizamos el modelo operativo para calcular el
sesgo de ligando y mostrar parcelas de sesgo equiactivas para la comparacin de la eficacia del
ligando para distintas vas de sealizacin31,53. El Glosensor Gi o, DiscoverX PathHunter -
arresina, o NET BRET curva de respuesta de la concentracin se ajustaron a la Black-Leff modelo
operativo para determinar los coeficientes de transduccin ( / KA). Los factores de sesgo de
compuesto se expresan despus de la normalizacin frente al agonista opioide prototpico DAMGO
utilizado como referencia. Los factores de sesgo se expresan como el valor de log [ / KA].
Evaluacin de la actividad PZM21 fuera de destino. Para identificar la potencial actividad fuera del
objetivo de PZM21, usamos el Programa de Institutos Nacionales de Salud Mental Psicofrmacos.
El compuesto PZM21 se prob por primera vez en cuanto a su actividad contra 320 GPCR no
olfativos usando el ensayo de reclutamiento de -arrestina de PRESTO-Tango GPCRome30. Se
utilizaron 10 M PZM21 y la actividad en cada uno Eceptor se midi en cuadruplicado. Se
definieron receptores positivos positivos como los que aumentan el valor relativo de la
luminiscencia dos veces. Los golpes positivos se volvieron a probar nuevamente en el modo de
dosis-respuesta completa para determinar si la seal de luminescencia titula con concentraciones
crecientes de PZM21. Un nmero de xitos positivos falsos fueron descontados por este enfoque.
La inhibicin de PZM21 de hERGchannel se realiz como se describi previamente54 y se
determinaron los transportermensers de neurotransmisores usados en el Molecular Devices
Neurotransmitter Assay Kit (Dispositivos Moleculares). Estudios in vivo. Se utilizaron machos
adultos C57BL / 6J (de 3 a 5 meses) obtenidos de JacksonLaboratories (Bar Harbor, Maine) para
investigar las respuestas conductuales, los efectos respiratorios y la hiperlocomocin inducida por
PZM21 y comparadas con morfina o vehculo (cloruro de sodio al 0,9%). Para los animales
knockout OR, se obtuvieron ratones Oprm1 - / - (B6.129S2 - Oprm1tm1Kff / J) de
JacksonLaboratories. Todos los frmacos se disolvieron en vehculo y se inyectaron
subcutneamente. Se llevaron a cabo estudios de comportamiento en la Universidad de Carolina
del Norte y en la Universidad de Stanford siguiendo las directrices del National Institutes of Health
para el cuidado y uso de animales y con protocolos de ratn aprobados por los comits
institucionales de cuidado y uso de animales. Los tamaos de las muestras (nmero de animales)
no fueron predeterminados por un mtodo estadstico y los animales fueron asignados a grupos de
forma aleatoria. Los grupos de tratamiento con frmacos slo fueron cegados para la medicin de
la analgesia reflexiva afectiva; Otros experimentos no fueron cegados a los investigadores. Se
establecieron criterios de exclusin definidos para la analgesia y los experimentos de preferencia
condicionada. No se excluyeron animales del anlisis estadstico. Los anlisis estadsticos se
realizaron despus de evaluar primero la normalidad de las distribuciones de los conjuntos de
datos y la prueba de Leven se utiliz para evaluar la igualdad de las varianzas. Medicin de la
analgesia. Se midieron las respuestas similares a la analgesia como se ha descrito anteriormente55
usando un medidor de analgesia de placa de coccin con dimensiones de 29,2 x 26,7 cm con
ratones restringidos a un cilindro de 8,9 cm de dimetro y 15,2 cm de alto (IITC Life Sciences,
Woodland Hills, California). La respuesta se midi registrando la latencia para lamer, agitar o estirar
las patas traseras, o un intento de saltar fuera del aparato a 55 C, con un tiempo de corte mximo
de 30 s. Una vez que se observ una respuesta o se haba transcurrido el tiempo de corte, el sujeto
se retir inmediatamente de la placa caliente y se coloc de nuevo en su jaula domstica. Los
animales se aclimataron a la placa caliente, mientras que se enfri, y se obtuvo un tiempo de
respuesta analgsico basal varias horas antes del tratamiento con frmacos y de la prueba. Se
inyectaron ratones con vehculo (n = 8), morfina (5 mg / kg, n = 8 10 mg / kg, n = 8), TRV130 (1,2
mg / kg, n = 9) o PZM21 (10 mg / kg , N = 8, 20 mg / kg, n = 11, o 40 mg / kg, n = 8). Despus de la
inyeccin del frmaco, se midi el efecto analgsico expresado como porcentaje del efecto mximo
posible (% MPE) a los 15, 30, 60, 90 y 120 minutos despus del tratamiento con frmacos. Si los
animales no mostraron la pata trasera, lamer, esparcir o aletear, se retiraron del ensayo. Adems, si
los animales intentaban saltar de la placa o orinar en la placa de coccin, se retiraron del ensayo.
Para evaluar la analgesia por el ensayo de la cola-flick, un medidor de la analgesia de la cola-golpe
(Columbus Instruments, Columbus, Ohio). Los ratones se inmovilizaron suavemente con una toalla
de algodn y la base de la cola se coloc sobre una fuente de luz radiante que emiti una
temperatura constante de 56C. La latencia de retirada de la cola se midi en puntos de tiempo
similares al ensayo de la placa caliente despus de la administracin del vehculo (n = Morfina (5
mg / kg, n = 4, 10 mg / kg, n = 8) o PZM21 (10 mg / kg, n = 8, 20 mg / kg, n = 14). El tiempo de corte
para la fuente de calor se fij en 10 s para evitar el dao tisular. Los tiempos de respuesta
analgsicos fueron medidos de forma similar al ensayo de la placa de calentamiento. La analgesia
en ratones knockout OR y la subcategorizacin de dolor afectivo / reflexivo. Se aclimataron
ratones C57Bl / 6J de Oprm1 - / - y de tipo salvaje (macho, 8-11 semanas) al ambiente de ensayo y
al equipo de placa trmica durante tres no consecutivos entre las 11:00 y las 13:00 antes de
cualquier estudio farmacolgico. La aclimatacin se logr por confinamiento individual de ratones
dentro de un cilindro de redplstico semitransparente cerrado (10 cm de profundidad x 15 cm de
altura) sobre un estante de malla de metal elevado (61 cm de altura) durante 30 min y luego
exponiendo cada ratn al equipo de placa trmica (16 cm de largo x 16 cm de ancho 30 cm de
altura), en el interior de una cmara aclarada (16 cm x 16 cm). La exposicin a la temperatura de la
placa trmica dur 30 s, y la exposicin se repiti despus de 30 min para imitar las condiciones
del da de la prueba. El entorno de ensayo tena una temperatura ambiente media de 22,6 C y
una iluminacin de 309 lx a partir de la fluorescencia area. El mismo experimentador masculino
(G.C.) estuvo presente a lo largo de toda la duracin de la habituacin y de las pruebas para excluir
posibles alteraciones inducidas por el olfato en los umbrales sensoriales56. La aplicacin
simultnea de un estmulo nocivo o el tiempo empleado en una placa caliente Aparato puede
provocar ampliamente varias respuestas de comportamiento distintas: 1) reflejos de retirada:
retraccin rpida o reflexiva de la pata; 2) respuestas afectivo-motivacionales: lamiendo y
mordiendo la pata, y / o una respuesta motivacional caracterizada por alejarse de la placa de suelo
calentada. Los reflejos de retirada de la pata se miden clsicamente en estudios de
hipersensibilidad e implican circuitos simples de la mdula espinal y del tronco enceflico57. Por el
contrario, las respuestas afectivas son complejas, no estereotipadas, que requieren procesamiento
por circuitos lmbicos y corticales en el cerebro, cuya aparicin indica la motivacin y la excitacin
del sujeto para dejar de sentir la sensacin desagradable lamer el tejido afectado o buscar una va
de observacin36,57-64. Para distinguir entre los potenciales efectos analgsicos diferenciales de
PZM21, los ratones se colocaron sobre el aparato calentado (52,5C), y se registr la latencia para
la exposicin del primer signo de un reflejo de la pata trasera, y se registr el primer signo de una
respuesta afectiva. Se fij un lmite mximo de exposicin de 30 s para reducir el dao tisular. Los
ratones se inyectaron con vehculo (n = 6), morfina (10 mg / kg, n = 10), o PZM21 (20 mg / kg, n =
13). Despus de la inyeccin del frmaco, el El efecto analgsico en las respuestas reflejo o
asistentes se expres como porcentaje de efecto mximo posible (% MPE), y se midi a - 30 (lnea
de base), 15, 30, 60, 90, 120 y 180 min con respecto al tratamiento con frmaco. Para estudios que
compararon ratones C57B1 / 6J de Oprm1 - / - y salvajes, se midi la respuesta analgsica en el
ensayo de la placa de calentamiento 30 min despus de la inyeccin del vehculo (n = 5 para ambos
genotipos), morfina

(10 mg / kg, n = 5 para ambos genotipos) o PZM21 (20 mg / kg, n = 6 para Oprm1 - / - y n = 5 para
el tipo salvaje).

Ensayo de inyeccin de formalina. Se realiz analgesia a la inyeccin de formalina como se


describi previamente65. Los ratones se habituaron por primera vez durante 20 minutos al
entorno de ensayo que inclua una jaula domstica sin ropa de cama, comida y agua.

Despus de la habituacin, se inyect subcutneamente el vehculo (n = 6), morfina (10 mg / kg, n


= 7) o PZM21 (40 mg / kg, n = 7). A esto sigui la inyeccin de 20 l de formalina al 1% en solucin
salina al 0,9% bajo la piel de la superficie dorsal del extremo derecho

Patas traseras Los animales fueron devueltos a su jaula de origen y las respuestas de
comportamiento se registraron durante una hora. La nocicepcin se estim midiendo el valor
acumulativo

Tiempo pasado por los animales lamiendo la pata inyectada con formalina. Como los opioides
presentan clsicamente dos fases de accin analgsica, se midi el comportamiento nociceptivo
durante

Tanto en la fase temprana (0 a 5 min) como en la fase tarda (20 a 30 min). En la Fig. 4, un asterisco
indica una diferencia significativa entre frmaco y vehculo (P <0,05 calculado usando un ANOVA
unidireccional con correccin de Bonferroni).
Pletismografa del ratn. Los datos de respiracin se recogieron utilizando un sistema de
pletismografa de cuerpo entero (Buxco Electronics Inc., Wilmington, Carolina del Norte) como se
describe66. Este mtodo mide la frecuencia respiratoria, el volumen tidal, los flujos mximos,

Tiempo inspiratorio y tiempo de expiracin en ratones conscientes y sin restricciones. Brevemente,


los transductores de flujo de aire Buxco se unieron a cada cmara de pletismografa y se

Se mantuvo un caudal constante para todas las cmaras. Cada cmara se calibr a su transductor
unido antes del experimento. Los animales se habituaron primero a

Cmaras de plexigls durante 10 min. Los parmetros respiratorios se registraron durante 10 min
para establecer una lnea base antes de la inyeccin del vehculo (n = 8), morfina (10 mg / kg, n =
8), TRV130 (1,2 mg / kg, n = 8) o PZM21 (40 mg / Kg, n = 8). Despus se recogieron los parmetros
respiratorios en ratones sin restriccin durante 100 minutos despus de la inyeccin de frmaco.
Para disminuir la variabilidad respiratoria inducida por la ansiedad, los ratones fueron protegidos
de la vista de otros animales y experimentador. En la Fig. 4, un asterisco indica una diferencia
significativa entre frmaco y vehculo (P <0,05 calculado usando un ANOVA de medidas repetidas
con correccin de Bonferroni).

Cuantificacin acumulada de bolos fecales. Para medir los efectos constipatorios de la morfina y
PZM21, se evalu el total acumulado fecal boli como se describe6. Brevemente, se inyectaron
ratones con vehculo (n = 10), morfina (10 mg / kg, n = 16) o

PZM21 (20 mg / kg, n = 16) y se coloc en una cmara de plexigls (5 cm x 8 cm x 8 cm) colocada
sobre un tamiz de malla. Los ratones se mantuvieron sin alimento ni agua durante 6 h. Los bolos
fecales se recogieron por debajo de la malla sobre una toalla de papel y la masa acumulada se
midi cada hora durante seis horas. En la Fig. 4, un asterisco indica una diferencia significativa
entre frmaco y vehculo (P <0,05 calculado usando un ANOVA de medidas repetidas con
correccin de Bonferroni).

Respuesta locomotora de campo abierto. Para evaluar la actividad locomotora se utiliz una
cmara de campo abierto automatizada equipada con fotoclula (40 cm x 40 cm x 30 cm),
contenida en cajas de atenuacin acstica. La migracin basal de los ratones que se mueven
libremente se monitoriz durante 30 minutos, seguido de inyeccin con vehculo (n = 7), morfina
(10 mg / kg, n = 5) o PZM21 (20 mg / kg, n = 6). La actividad locomotora se monitoriz durante
otros 150 min. En la Fig. 4, un asterisco indica una diferencia significativa entre frmaco y vehculo
(P <0,05 calculado usando un ANOVA de medidas repetidas con correccin de Bonferroni).

Preferencia de lugar condicionada. Un aparato de preferencia de lugar acondicionado de tres


cmaras (Med-Associates, St. Albans, Vermont) consistente en cmaras blancas o negras (16.8
12.7 12.7 cm cada una) con malla blanca de textura nica o negro

Y se separ por una cmara central neutra (7,2 x 12,7 x 12,7 cm) para la prueba de preferencia de
lugar acondicionado. El da 1 (da de preacondicionamiento), los ratones se colocaron en la cmara
central y se dejaron explorar libremente durante 30 min.

El tiempo empleado en cada compartimento se utiliz para estimar las preferencias de la cmara
base y los ratones que mostraban un sesgo de cmara especfico ms del 70% no se estudiaron
ms. Los das 2-9 (das de acondicionamiento) se inyectaron ratones con vehculo o frmaco y se
emparejaron con la malla blanca o las cmaras de varilla negra. Todos los ratones recibieron el
vehculo los das 2, 4, 6, 8 y frmaco los das 3, 5, 7, 9. El da 10 (da de prueba), los ratones se
colocaron de nuevo en la cmara central como el da 1 y se les permiti explorar libremente
Durante 30 min. Tiempo empleado en cada camara Se expres como porcentaje de preferencia. La
preferencia de lugar se prob con morfina (10 mg / kg, n = 16), PZM21 (20 mg / kg, n = 8) o TRV130
(1,2 mg / kg, n = 7). En la Fig. 4, un asterisco indica una diferencia significativa entre las cmaras del
vehculo y del frmaco (P <0,05 por una prueba de muestreo con un valor hipottico de 50),
mientras que NS indica no significancia (P> 0,05). La catalepsia inducida por frmacos se midi en
ratones utilizando el bartest67, que incluye una barra de madera colocada horizontalmente de 3
mm de dimetro fijada a 4 cm del suelo. Los ratones se habituaron con la barra y el medio
ambiente durante 20 minutos antes de la inyeccin subcutnea de haloperidol (2 mg / kg, n = 8),
morfina (10 mg / kg, n = 8) o PZM21 (20 mg / kg, n = 8). Para medir la catalepsia, ambas patas
delanteras se colocaron suavemente sobre la barra y se midi el tiempo durante el cual cada
manguito permaneci en la posicin inicial. El efecto se midi a los 15, 30 y 90 minutos despus de
la inyeccin de frmaco. El tiempo de corte mximo para cada desafo fue de 90 s. Farmacocintica
de PZM21. Los estudios fueron realizados por el PreclinicalTherapeutics Core y la Unidad de
Estudios sobre Drogas de la Universidad de California en San Francisco. Se inyectaron 10 ratones
por va subcutnea con 20 mg / kg de PZM21. En cada punto de tiempo, se recogi 1 ml de sangre
de tres ratones y la concentracin de PZM21 en suero se determin por cromatografa lquida-
espectrometra de masas (LC / MS). Los ratones se sacrificaron posteriormente y se
homogeneizaron cerebros enteros para la determinacin de las concentraciones de PZM21 por
LC / MS. Todos los estudios se realizaron con protocolos de ratn aprobados de los comits
institucionales de cuidado de los animales y el uso. Metabolismo de PZM21. Los experimentos de
metabolismo se realizaron como se describe anteriormente68. En resumen, los microsomas
agrupados de hgado de ratn macho (CD-1) fueron adquiridos (Sigma Aldrich) y almacenados a
-75 C hasta que se requiera. Se adquiri NADPH (Carl Roth) y se almacen a -8C. Las reacciones
de incubacin se llevaron a cabo en tapas de polietileno (Eppendorf, 1,5 ml) a 37C. La mezcla de
incubacin contena PZM21 (80 M) o controles positivos (imipramina androtigotina), se
mezclaron microsomas hepticos (0,5 mg de protena microsmica / ml de mezcla de incubacin) y
tampn Tris-MgCl2 (Tris 48 mM, MgCl2 4,8 mM, pH 7,4). El volumen de incubacin final fue de 0,5
ml. Las reacciones microsmicas se iniciaron por adicin de 50 l de la solucin de cofactor de
enzima NADPH (concentracin final de 1 mM). A 0, 15, 30 y 60 min, las reacciones enzimticas se
terminaron por adicin de 500 l de acetonitrilo enfriado con hielo (que contena 8 M de patrn
interno), y la protena precipitada se elimin por centrifugacin (15.000 rcf durante 3 min). El
sobrenadante se analiz por HPLC / MS (sistema de disolventes binarios, eluyente acetonitrilo al
0,1% de cido frmico acuoso, 10-40% de acetonitrilo en 8 min, 40-95% de acetonitrilina 1 min,
95% de acetonitrilo durante 1 min, Min). Los experimentos se repitieron en tres experimentos
independientes. Las incubaciones de control paralelo se llevaron a cabo en ausencia de una
solucin de cofactor para determinar la tomatriz de unin inespecfica. El substrato restante y la
formacin de metabolitos se calcul como un valor medio s.e.m. De tres experimentos
independientes comparando AUC de metabolitos y sustrato despus de un tiempo de incubacin
predeterminado con AUC de sustrato en el tiempo 0, estimando una tasa de ionizacin similar,
corregida por un factor calculado a partir del AUC de patrn interno en cada punto de tiempo. Los
ismeros estereoqumicamente puros de 12 y PZM21 se sintetizaron a partir de las
correspondientes amidas de (R) y (S) -aminocido, que estaban disponibles comercialmente o se
preparaban fcilmente a partir del cido o ster correspondiente (vase informacin
complementaria). El grupo amino primario se someti a dimetilacin utilizando un exceso de
formaldehdo acuoso y acetonitrilo acuoso de triacetoxiborohidruro de sodio. Las carboxamidas
16a, b se convirtieron en aminas primarias por tratamiento con complejo de borano-
tetrahidrofurano bajo reflujo de las diaminas 17a, b. Enrique con tiofeno-3-carbaldehdo con
nitroetano dio el derivado de nitropropeno 18, que se convirti en alquilamina teracmica 19. La
activacin con cloroformiato de 4-nitrofenilo proporcion los carbamatos 20 que se acoplaron con
las aminas primarias enantiopuradas 17a, para conseguir mezclas diastereomricas del
correspondiente Ureas 12 y 21. La separacin por HPLC utilizando una columna semi-preparativa
Chiralpak AS-H dio los estereoismeros totales de ocho pzas de 12 y 21 incluyendo PZM21. Para
determinar la configuracin absoluta de los productos finales y preparar eficientemente PZM21, se
sintetiz carbamato enantiomricamente enriquecido 20, Con las correspondientes aminas
primarias. Para el enriquecimiento enantiomrico, se realiz la resolucin quiral de la amina
primaria racmica 19 mediante cristalizacin repetitiva con cido di-p-anisoil- (S) -tartrico.
Despus de la cristalizacin triple, se obtuvo 19 enriquecido dextrgiro enriquecido ([\ alpha] D25
= + 20,5). La (R) -acetamida correspondiente se ha caracterizado previamente como dextrgiro
([] D20 = + 49,8), de modo que enantiomricamente enriquecido 19 se trat con anhdrido
actico D] trietilamina, y se midi la rotacin especfica del producto. Basndose en el valor de
rotacin especfica de la acetamida resultante ([\ alpha] D21 = - 46,6), se asign la configuracin
absoluta del ismero mayoritario a (S). (S) -enriquecido20 se utiliz para la sntesis de los derivados
de urea finales y se asign la configuracin absoluta de diasteremeros en pares sobre la base de
la igualdad de tiempo de retencin en HPLC quiral. Una descripcin completa de las rutas sintticas
y los datos analticos de los compuestos 12, PZM21 y sus anlogos PZM22-29 se presentan en la
informacin complementaria. Modelado detallado de PZM21 y TRV130 vinculante plantea. PZM21
se acopl a la estructura de OR de estado inactivo utilizando DOCK3.6 (referencia 21) como se
describe para la pantalla primaria, con la excepcin de que las 45 esferas de coincidencia utilizadas
se generaron basndose en la postura acoplada del compuesto 12. El complejo de ligando-receptor
resultante fue adicionalmente Optimizado a travs de minimizacin con el campo de la fuerza de la
protena AMBER69 y el campo de fuerza del ligando de GAFF suplementado con AM1-BCC Cargos
El acoplamiento de PZM21 y TRV130 a la estructura de OR de estado activo (PDB: 5C1M) se
realiz tambin con DOCK3.6 con parmetros como se describi anteriormente.

El extremo amino del estado activo OR, que forma una tapa sobre el sitio de unin ortostrico
(residuos Gly52-Met65) se elimin antes de la preparacin del receptor.

Las esferas coincidentes se generaron basndose en la postura de PZM21 en el estado inactivo.

Los complejos resultantes se minimizaron a continuacin con AMBER. La postura de PZM21 en el


estado activo OR estructura se perfeccion ms utilizando Glide (Schrdinger) en el modo XP.

Las simulaciones de dinmica molecular se basaron en estructuras cristalinas de OR en la


conformacin de estado activo y inactivo (PDB: 4DKL y 5CM1, respectivamente). En

Ambos casos, se eliminaron todos los residuos no receptores (lisozima T4 en estado inactivo y
Nb39 en estado activo). Para el estado activo, los residuos amino-terminales se eliminaron como
en los estudios de acoplamiento. Las coordenadas iniciales de PZM21 se generaron mediante
acoplamiento molecular como se ha descrito anteriormente. El receptor se simul con dos
tautmeros de His2976.52, ya sea en el estado N $ $ neutral o en el estado N $ $. El OR-
PZM21

Se incrust en una bicapa lipdica que consiste en molculas de dioleoilfosfatidilcolina (DOPC)


como se ha descrito anteriormente47. Las cargas de los sistemas de simulacin de estado inactivo
y activo se neutralizaron aadiendo 11 y 14 iones cloruro, respectivamente. Para llevar a cabo
simulaciones MD, se utiliz el paquete GROMACS como se describe anteriormente70. En pocas
palabras, el campo de fuerza AMBER general (GAFF) 71 se utiliz para PZM21 y los lpidos y el
campo de fuerza AMBER ff99SB72 para el receptor. Los parmetros para PZM21 se asignaron
utilizando antecmara, y los cargos se calcularon utilizando Gaussian09 (Gaussian, Inc.) en el nivel
HF / 6-31 (d, p) y el procedimiento de RESP segn la literatura73. Durante las simulaciones, PZM21
se proton en su amina terciaria y se simul como un catin. Se utiliz el modelo de agua SPC /
E74 y las simulaciones se realizaron a 310 K. El anlisis de las trayectorias se realiz utilizando
GROMACS. Cada simulacin en una condicin dada se inici a partir de coordenadas idnticas,
pero con velocidades de tomo inicial asignado de forma independiente y aleatoria. Un resumen
de los sistemas de simulacin y sus tiempos de simulacin se muestra en la informacin
complementaria.

Anlisis de datos e informes. Aparte de los estudios in vivo, no se aplic ningn anlisis estadstico
basado en clulas in vitro o in vitro. El tamao de la muestra (nmero de ensayos para cada
compuesto o receptor) se predetermin para estar en triplicado O cuadruplicar para los ensayos de
seleccin primaria en una sola concentracin. Para los ensayos de concentracin-respuesta, el
tamao de la muestra (nmero de ensayos para cada compuesto en receptores seleccionados)
tambin se predetermin para ser probado para un ensayo Mnimo de tres ensayos, cada uno por
triplicado o por cuadruplicado. Ninguno de los ensayos funcionales fueron cegados a los
investigadores.

S-ar putea să vă placă și