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TESIS
Para optar al Grado Acadmico de Magster en Recursos Vegetales y
Terapeticos
AUTOR
Gianinna del Carmen Mrquez Mendoza
ASESOR
Csar Fuertes Ruitn
Lima - Per
2011
INDICE
RESUMEN
ABSTRACT
I. INTRODUCCIN 1
II. MARCO TERICO 3
2.1 Prunus domestica L. 3
Taxonoma 3
Descripcin botnica 4
Propiedades biolgicas 4
2.2 Ficus carica L. 4
Taxonoma 4
Descripcin botnica 5
Propiedades biolgicas 5
2.3 Vitis vinfera L c.v. Red Globe. 5
Taxonoma 5
Descripcin botnica 6
Propiedades biolgicas 7
2.4 Las frutas y el color 7
2.5 Compuestos fenlicos 8
2.6 Antocianinas 11
2.6.1 Generalidades 11
2.6.2 Estructura qumica 12
2.6.3 Biosntesis 16
2.6.4 Distribucin en la naturaleza 17
2.6.5 Estabilidad 18
2.6.6 Ensayos cromatogrficos 20
2.6.7 Propiedades biolgicas 20
2.7 Radicales libres 21
2.7.1 Produccin de radicales libres de oxgeno 21
2.7.2 Reactividad de los radicales libres y estrs oxidativo 21
2.7.3 Dao molecular inducido por radicales libres 22
2.8 Antioxidantes 22
2.8.1 Niveles de accin antioxidante 23
III PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Lugar de ejecucin 24
3.2 Materiales y reactivos 24
3.3 Muestra vegetal 24
Muestra vegetal Prunus domestica L. 25
Muestra vegetal Ficus carica L. 25
Muestra vegetal Vitis vinifera L. c.v. Red Globe 25
3.4 Ensayos qumicos 26
3.4.1 ndice de color 26
3.4.2 Extraccin, purificacin y aislamiento de las 26
antocianinas para anlisis por espectrofotometra.
3.4.3 Extraccin, purificacin, aislamiento e identificacin 27
de las antocianinas por cromatografa HPLC.
3.4.4 Identificacin de los azcares monosacridos. 28
3.4.5 Cuantificacin de las antocianinas monomricas 28
empleando el mtodo de pH diferencial.
3.5 Ensayos biolgicos 30
Actividad antioxidante 30
IV RESULTADOS 32
V DISCUSIN 64
VI CONCLUSIONES 67
VII REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 68
VIII ANEXOS 73
DEDICATORIA
A mi pap, Vctor Juan que junto a mi madre me dieron el mejor hogar, lleno de
amor, comprensin, felicidad, paz y seguridad; que hicieron de mi infancia,
adolescencia y juventud, la ms bella de todas.
A mi hija Leslie Marianne, mi dulce nia, eres la luz que ilumina mi vida.
A Herbert, mi esposo, por hacer de cada da el mejor de todos.
A Violeta y a la memoria de Herbert, quienes sin ser mis padres me hicieron
sentir su hija.
AGRADECIMIENTOS
A mis queridos padrinos de promocin Dra. Nancy Lozano, Dr. Pablo Bonilla y
Dra. Elena Benavides, gracias por su amistad y estmulo.
A mi queridos doctores Miembros del Jurado, Dra. Gloria Gordillo y Dr. Luis
Miguel Felix Veliz, gracias por su cario, palabras de estmulo y por
incrementar mi conocimiento en todo momento.
Palabras clave: Prunus domestica L., Ficus carica L., Vitis vinifera L,
antocianina, actividad antioxidante, ndice de color, HPLC.
ABSTRACT
In this research work, the red fruits phytochemical study of the vegetal species
Prunus domestica L., Ficus carica L. and Vitis vinifera L. c.v. Red
Globe, commonly known as prune, fig and Red Globe grape, respectively
was made. These fruits were harvested in Lima and Ica departments since
November 2010 to March 2011. The study starts with the tree red fruits species
selection and harvest. After washing the fruits, the color index (CI) was set,
found that grape had an 177,22 CI, prune 164,52 CI and fig 53,04 CI. The
anthocyanins extraction was made using methanol as solvent. With the
methanolic extract, chromatographic essays was made using Whatman N 3
paper and BAW as mobile phase where anthocyanins presence was found. The
anthocyanins were isolated cutting the colored bands eluting from these bands
in 0,01% HCl in methanol, to be read in the spectrophotometer. According the
literature, the observed results are not conclusive, therefore it was HPLC
contrasted. The initial results show cyanidin presence in fig, cyanidin and
peonidin in prune; and cyanidin, malvidin and peonidin in grape. The HPLC
chromatography show that in the fig sample was found cyanidin 3-glucoside
and cyanidin 3-rhamnoglucoside; in the prune sample the cyanidin 3-xylose,
cyanidin 3-glucoside, cyanidin 3-rutinoside, peonidin 3-glucoside and peonidin
3-rutinoside; as in the grape was found the delphinidin 3-glucoside, cyanidin 3-
glucoside, petunidin 3-glucoside, peonidin 3-glucoside and malvidin 3-
glucoside. The total monomeric anthocyanins quantification of the three fruits
show that there are a bigger monomeric anthocyanins amount (enunciate in mg
of cyanidin 3-glucoside/100g) in prune 39,92, followed by fig 30,09 and at last
the red globe grape 21,28. Finally, it was determined the anthocyanin biological
activity by means of fruits antioxidant capacity, found that the grape show a
CI50 (g/mL) of 3,87, the fig a CI50 (g/mL) of 8,50 and the prune a CI 50
(g/mL) of 13,25.
1
La presente investigacin se ha realizado en las especies vegetales Prunus
domestica L., Ficus carica L. y Vitis vinifera L. c.v. Red Globe, conocidas
comnmente como ciruela, higo y uva Red Globe, respectivamente, las cuales
poseen una gran cantidad de metabolitos primarios y secundarios, entre ellos
las antocianinas. Los metabolitos le permiten a la planta crecer, multiplicarse,
defenderse y sobrevivir, evidencindose su actividad antioxidante
2
II. MARCO TEORICO
Reino : Plantae
Divisin : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Subclase : Rosidae
Orden : Rosales
Familia : Rosaceae
Subfamilia : Prunoideae
Gnero : Prunus
Especie : Prunus domestica L.
Nombre vulgar: Ciruela
Reino : Plantae
Clado : Angiospermas
Clado : Eudicotiledneas
Clado : Rsidas
Orden : Rosales
Familia : Rosaceae
Subfamilia : Prunoideae
Gnero : Prunus
Especie : Prunus domestica L. (Anexo 1)
3
Descripcin botnica
Prunus domestica L. es un rbol caducifolio e inerme de hasta 10m. Las hojas
van en disposicin alterna o formando haces en los brotes cortos, son simples,
de forma elptica, con peciolo corto y margen festoneado. Las flores van
provistas de largos cabillos, solitarias o en ramilletes. Son de color blanco o
blanco verdoso y tienen cinco ptalos ovalados, libres de 7 a 15mm;
estambres numerosos, insertos en varias filas junto a los ptalos. El pistilo
produce al madurar una drupa globosa o alargada de color que puede variar
entre prpura oscuro, rojo, verde o amarillento (1).
Propiedades biolgicas
El fruto de Prunus domestica L. es conocido por sus propiedades laxantes,
(2)
siendo usado tambin como excipiente de otros medicamentos .
La bibliografa indica que dos cucharadas de jugo de ciruelas frescas alivian
irritaciones bucales, ulceras en labios y aftas (3).
Reino : Plantae
Divisin : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Subclase : Humamelidae
Orden : Urticales
Familia : Moraceae
Gnero : Ficus
Especie : Ficus carica L.
Nombre vulgar: Higo
4
Sistemtica de la higuera de acuerdo a APG III (2009)
Reino : Plantae
Divisin : Angiospermas
Clase : Eudicotiledneas
Subclase : Rosidas
Orden : Rosales
Familia : Moraceae
Gnero : Ficus
Especie : Ficus carica L.
Descripcin botnica
Propiedades biolgicas
Es jugo del higo es bactericida y favorece la digestin. Durante siglos los higos
han sido recomendados para curar el cncer, estreimiento, hemorroides,
gangrena, afecciones hepticas, erupciones y para recobrar la energa y
vitalidad (5).
5
Sistemtica de la vid, Vitis vinifera L. de acuerdo a Cronquist (1981)
Reino : Plantae
Divisin : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Subclase : Rosidae
Orden : Rhamnales.
Familia : Vitaceae
Gnero : Vitis
Especie : Vitis vinifera L.
Cultivar : Vitis vinifera L. cv. Red Globe
Nombre vulgar: Uva Red Globe
Reino : Plantae
Clado : Angiospermas
Clado : Eudicotiledneas
Clado : Rosidas
Familia : Vitaceae
Gnero : Vitis
Especie : Vitis vinifera L.
Cultivar : Vitis vinifera L. cv. Red Globe
Descripcin botnica
Arbusto trepador de ramas cilndricas, volubles, con zarcillos opuestos a las
hojas. Hojas lobuladas sinuosas, discretamente dentadas de color verde
intenso o verde plido. Flores pequeas con un cliz de cinco segmentos y
cinco ptalos separados por la base y unidos por el extremo. Frutos
denominados uvas casi esfricos y agrupados en racimos. Dichos frutos son
bayas de color rojo con dos celdas y dos a cuatro semillas (6).
6
Propiedades biolgicas
Se le atribuye propiedades desintoxicante, antisptica y cicatrizante. Se
recomienda contra la anemia, estados febriles, nefritis, artritis, reumatismo y
gota. El mosto de uva sin fermentar es laxante. La uva es estimulante, digestiva
y diurtica (7).
7
El proceso de maduracin va acompaado de cambios metablicos, que a su
vez implican cambios de duro a blando, de amargo a dulce y de verde a otros
colores de diversas tonalidades. El cambio de color de frutos durante la
maduracin es muy tpico y suele deberse a la degradacin de la clorofila,
haciendo visibles otros pigmentos que se encontraban encubiertos (12).
ndice de color
El color puede ser evaluado mediante la determinacin del ndice de color IC*
obtenido por la expresin (1) donde l*, a*, y b* son los parmetros del sistema
color CIELAB.
l* x b*
8
forma conjugada con uno o ms residuos de azcar unidos a los grupos
hidroxilos, aunque en algunos casos se pueden producir uniones directas entre
una molcula de azcar y un carbono aromtico. Por ello, la forma ms comn
de encontrarlos en la naturaleza es la forma de glicsidos, siendo solubles en
agua y en solventes orgnicos. Los azcares asociados a los polifenoles
pueden ser monosacridos, disacridos o incluso oligosacridos. Los
compuestos a los que se encuentran unidos con ms frecuencia son: D-
glucosa, D-galactosa, D-arabinosa, L-ramnosa, D-xilosa y cidos D-glucornico
y D-galacturnico. Tambin pueden encontrarse unidos a cidos carboxlicos,
cidos orgnicos, aminas, lpidos, y a otros compuestos fenlicos.
(15)
Segn Harborne (1989) citado por Martnez-Valverde , los compuestos
fenlicos se pueden agrupar en diferentes clases dependiendo de su estructura
qumica bsica, describindose a continuacin aquellas con mayor inters
nutricional (16)(17):
c) Lignanos y neolignanos
Son metabolitos de bajo peso molecular formados por el acoplamiento
oxidativo de unidades de p-hidroxifenilpropano, las cuales se unen
mediante puentes de hidrgeno. Son monmeros y dmeros del cido
hidroxicinmico y tambin del alcohol cinmico, propenilbenceno y
9
alilbenceno. El trmino lignano se aplica cuando el compuesto est
formado a partir de aniones entre el cido y/o el alcohol, mientras que
cuando se unen las molculas de propenilbenceno y/o alilbenceno la
molcula resultante se denomina neolignano (20).
d) Flavonoides
Constituyen el grupo ms importante dentro de esta clasificacin
dividindose en varias subclases con ms de 5,000 compuestos, siendo
los polifenoles mas distribuidos en las plantas. Son sustancias
polifenlicas de bajo peso molecular que comparten el esqueleto comn
de difenilpiranos; dos anillos bencenos unidos a travs de un anillo pirona
o piran heterocclico. Esta estructura bsica presenta o permite una
multitud de sustituciones y variaciones en el anillo pirona dando lugar a
flavonoles, flavonas, flavanonas, flavanololes, isoflavonoides, catequinas,
chalconas, dihidrochalconas, antocianidinas, leucoantocianidinas,
proantocianidinas o taninos condensados. En la figura N 1 se muestra el
ncleo principal flavonoide, y la figura N 2 se muestra la estructura
(21)
principal de los principales flavonoides presentes en la naturaleza .
e) Taninos:
Son compuestos fenlicos hidrosolubles con un peso molecular
comprendido entre 500D y 3000D. Estos compuestos contienen un gran
nmero de grupos hidroxilo, entre otros grupos funcionales (1 a 2 por
100D), siendo por tanto capaces de unirse a protenas y a otras
molculas.
10
Figura N 1: Ncleo principal de la estructura de los flavonoides
(22)
Figura N 2: Principales estructuras bsicas de los flavonoides .
2.6 Antocianinas
2.6.1 Generalidades
La palabra antocianina deriva del griego anthos (flor) y kyanos (azul oscuro).
Las antocianinas son las responsables de los colores rojos, azulados o violetas
de la mayora de los frutos o flores, es el pigmento ms importante, despus de
la clorofila, que es visible al ojo humano.
11
Las antocianidinas son derivados del catin 2-fenilbenzopirilio, y debido a la
poca solubilidad de estas en el agua, no se encuentran de manera libre en la
naturaleza sino en su forma glicosilada, siendo una de las mas abundantes la
cianidina 3-glucsido
12
El color de las antocianinas depende del nmero y orientacin de los grupos
hidroxilo y metoxilo de la molcula. Un incremento en la hidroxilacin produce
desplazamientos hacia tonalidades azules mientras que un incremento en las
metoxilaciones produce coloraciones rojas (27) (28) (29).
13
Tabla N 2: Contenido de antocianinas totales en frutas y vegetales comunes.
Manzana 83-326
Bilberry 300-320
Mora 83-326
Mirtillo 25-495
Col roja 25
Cereza 4-450
Arndano 60-200
Saco 450
Uvas 6-600
Kivi 100
14
Cabollas rojas 7-21
Ciruelas 2-25
Fresas 15-35
15
2.6.3 Biosntesis
Las antocianinas son sintetizadas por varias rutas. Sobresalen dos, la del cido
shikmico y la del cido malnico. En la ruta del acido shikmico se convierten
carbohidratos simples derivados de la gliclisis, de la ruta de las pentosas
fosfato y Ciclo de Clvin en diversos cidos orgnicos como el cinmico, p-
coumrico, cafico, ferlico, clorognico y fenilalanina.
Cabe resaltar que esta ruta sinttica tambin es compartida por otros
compuestos fenlicos. La principal reaccin de biosntesis de los flavonoides
es la condensacin de los acilos provenientes de cumaril-CoA y tres molculas
de malonil CoA catalizada por la enzima chalcona isomerasa que lleva a cabo
la isomerizacin de chalcona a flavona, la misma que es convertida en
flavones o antocianinas. Los pasos finales en la sntesis de antocianinas son
las acilaciones y las glucosilaciones, primero en el C-3, para estabilizar el
catin flavilio (33).
16
Figura N 5: Biosntesis de la cianidina
Fuente: Gauche C. y Col, 2010 33.
17
color como el pH de la clula, el efecto de copigmentacin determinado por la
presencia de otros flavonoides, temperatura, luz, entre otros (34).
2.6.5 Estabilidad
Las antocianinas son compuestos lbiles y su estabilidad es muy frgil en
funcin de su estructura y la composicin de la matriz en la que se encuentran.
18
Efecto del pH (39) (40).
19
Efecto de la temperatura:
20
de electrones o tomos de hidrgeno a los radicales libres. Los agentes
antioxidantes presentes en los alimentos pueden reducir trombosis, activar
macrfagos e inhibir la tendencia a la peroxidacin. Entre los compuestos que
han merecido dichos estudios se encuentran las antocianinas debido a la
presencia de sustituyentes oxidrilo, las cuales son molculas con alto poder
antioxidante (44).
Su vida es muy breve (del orden del milisegundo o menos), aunque los ncleos
asimtricos contribuyen a la formacin de radicales de larga vida (45).
21
se producen reacciones en cadena, por ejemplo, la peroxidacin lipdica.
Aunque el radical libre inicial origina solamente efectos locales, los radicales
secundarios derivados de el y los productos de degradacin formados pueden
tener efectos biolgicos distantes del sitio donde se gener el primer radical.
Cuando dos radicales actan entre si, se puede formar una molcula estable,
con lo cual se terminan las reacciones en cadena.
Los radicales libres ejercen efectos tiles y nocivos. Entre los tiles se puede
mencionar el papel de defensa que cumplen los producidos por los fagocitos en
la destruccin de organismos invasores; adems, algunas reacciones
enzimticas transcurren posiblemente por mecanismos radicales (caso de la
ciclooxigenasa y tromboxano sintetasa).
En cambio, los efectos nocivos son numerosos, por daar lpidos, protenas,
carbohidratos, entre otros (48).
2.8 Antioxidantes
Los antioxidantes son sustancias que neutralizan los radicales libres o sus
acciones. La naturaleza ha dotado a cada clula con adecuados mecanismos
de proteccin contra cualquier efecto perjudicial de los radicales libres:
superxido dismutasa (SOD), glutatin peroxidasa, tiorredoxina, enlaces tiol y
disulfuro son sistemas amortiguadores de cada clula. La alfa tocoferol
22
(vitamina E) es un nutriente esencial el cual funciona como antioxidante
rompedor de cadenas, el cual previene la propagacin de las reacciones de
radicales libres en todas las membranas celulares. El acido ascrbico (vitamina
C) es tambin parte del mecanismo normal de proteccin. Otros antioxidantes
no enzimticos incluyen a los carotenoides, flavonoides, y polifenoles
relacionados, acido lipoico, el glutatin entre otros (49).
23
III. PARTE EXPERIMENTAL
Materiales
Cuba de desarrollo cromatogrfica, cubetas para espectrofotmetro, papel de
filtro, material de vidrio, Columna C18 Atlantis (Waters, Mildford MA).
Equipos
Balanza analtica Oahus, estufa Memmert, espectrofotmetro ultravioleta
Hewlett Packard, colormetro Konica Minolta Modelo CR410, HPLC en fase
reversa en un Modulo de Separacin 2695 (Waters, Milford, MA) equipado con
un auto inyector, un detector fotodiodo de serie 996 (DAD), y un software
Empower.
Reactivos
Etanol 96, metanol, acido clorhdrico, 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), cido
fosfrico, acetonitrilo, cido actico. Todos ellos fueron grado reactivo.
24
Los frutos rojos de Prunus domestica L. fueron recolectados en Laraos
situado en la zona norte de la provincia de Yauyos, regin Lima, ubicado a una
altitud de 3,310 m.s.n.m.; entre los meses de noviembre 2010 y marzo 2011.
Los frutos rojos de Vitis vinifera L. c.v. Red Globe fueron recolectados en El
Pedregal ubicado en el Distrito de los Aquijes, en el valle de Ica, regin Ica; en
los meses de noviembre 2010 a marzo 2011.
25
A una parte de los frutos frescos se le realiz el ndice de color. A la otra parte
se le someti a liofilizacin previo lavado, licuado y filtrado usando como
solvente HCl 0,1% en agua. La liofilizacin se realiz en el Laboratorio de
Agroindustria de la Universidad Nacional Del Santa, Nuevo Chimbote, en la
ciudad de Ancash; obtenindose un polvo seco de color rojo oscuro,
almacenndose en paquetes al vaco para el aislamiento e identificacin de las
antocianinas.
26
Los valores de Rf y espectrales obtenidos fueron comparados con datos de
literatura.
El uso de eluyentes adicionales permite comparar los diferentes valores de Rf
de acuerdo con su polaridad (54).
Identificacin de antocianinas
Las antocianinas fueron separadas usando HPLC en fase reversa en un
Modulo de Separacin 2695 (Waters, Milford, MA) equipado con un auto
27
inyector, un detector fotodiodo de serie 996 (DAD), y un software Empower. La
data espectroscpica se ley entre 200 y 700 nm. Se emple una columna
C18 Atlantis 150 x 4.6 nm i.d. 5 m (Waters, Milford, MA) y una columna de
4,6 nm x 2,0 nm para la separacin de las antocianinas a 40 C.
La fase mvil estuvo compuesta de: a) agua:cido fosfrico (100:0,85, v/v) a pH
2,17 y b) agua/acetonitrilo/cido actico/cido fosfrico (50,3:49,1:0,4:0,2, v/v a
pH 2,27. La gradiente de solvente fue de 20 a 38 % de B en 13 minutos,
seguido de un incremento a 40% de B en un minuto y un incremento a 50 % de
B en 11 minutos. Una tasa de flujo de 0,7 % mL/min fue usada, y 20L de
muestra fue inyectada.
La elucin de los picos fue monitorizada a 520 nm. Las muestras y las fases
mviles fueron filtradas a travs de un filtro de 0.22 m, tipo GV (Millipore,
Bedford, MA) antes de la inyeccin al HPLC. Las antocianinas y antocianidinas
fueron identificadas mediante comparacin con los tiempos de retencin y
datos espectroscpicos del UV/VIS del arte previo.
28
la forma oxonio es coloreado y predomina a pH 1,0; y la forma hemicetal sin
color a pH 4,5. El mtodo de pH diferencial esta basado en esta reaccin y
permite una rpida medida de las antocianinas totales en presencia de
pigmentos polimerizados degradados y otros compuestos interferentes.
Reactivos:
Buffer de cloruro de potasio 0,025M, pH 1.
Buffer de acetato sdico 0,4M, pH 4,5.
1) Se determin el factor de dilucin apropiado para la muestra mediante
dilucin con buffer de cloruro de potasio, pH 1,0, hasta que la
absorbancia de la muestra a vis-max estuvo dentro del rango linear del
espectrofotmetro (por ejemplo, para la mayora de espectrofotmetros
la absorbancia debera ser menor a 1,2). El volumen final se dividi
entre el volumen inicial de la muestra a fin de obtener el factor de
dilucin (240).
2) El espectrofotmetro se llev a cero con agua destilada hasta los
700nm.
3) Se prepararon dos diluciones de la muestra, una con buffer cloruro de
potasio pH 1,0, y la otra con buffer acetato de sodio pH 4,5, diluyendo
cada una de acuerdo al factor de dilucin. Se dej equilibrar la dilucin
por 15 minutos.
4) Se midi la absorbancia de la dilucin final a la vis-max y a 700 nm, y
se llen la celda blanco con agua destilada.
5) Se calcul la absorbancia de la muestra diluida (A) utilizando la siguiente
frmula:
A = (A vis-max A700)pH 1.0 - (A vis-max A700)pH 4.5
6) Se calcul la concentracin de pigmentos de antocianinas monomricas
en la muestra original empleando la siguiente frmula:
PM es el peso molecular.
FD es el factor de dilucin.
es la absortividad molar.
29
A es absorbancia de la muestra diluida.
El de la cianidina 3-glucosido es 26,900, y el PM es 449.2.
(58)
Capacidad antioxidante
Fundamento del mtodo:
El DPPH es un radical libre y acepta un electrn o un radical hidrgeno para
convertirse en una molcula diamagntica estable. Para evaluar la potencia
antioxidante mediante el barrido de radicales en las muestras del anlisis, se
registra la densidad ptica de los radicales DPPH. Por ello, el DPPH se utiliza
habitualmente como sustrato para evaluar la actividad antioxidante. La
actividad antioxidante o antirradical se medir mediante el descenso en la
absorbancia a 517 nm de una solucin metanlica (20 mg/L) de 2,2-difenil-1-
picrilhidrazilo (DPPH).
Procedimiento
Se prepar una solucin de DPPH 2 mg en 100 mL de metanol. Luego se
prepar una solucin de los extractos solubles en solvente previa prueba de
solubilidad, en una concentracin de 600 g/mL. A partir de este se prepararon
diferentes soluciones dando concentraciones de 25, 50, 75, 100 y 200 g/mL.
El blanco de muestra se prepar con 0,4 mL de muestra (solucin de extracto)
y 0,8 mL de metanol. Luego se prepar el patrn de referencia 0,4 mL de
metanol y 0,8 mL de solucin de DPPH. Se procedi a preparar la muestra con
0,4 mL de solucin de los extractos y 0,8 mL de DPPH, se deja por 30 minutos
en la oscuridad y se lee a 517 nm, en el espectrofotmetro. Se midi la
absorbancia del patrn de referencia y del blanco de la muestra. Como
estndar se utiliz acido ascrbico.
30
Las muestras se corren por triplicado
31
IV. RESULTADOS
Ensayos qumicos
l* a* b* ndice de
color (IC*)
Ciruela 164,52
32
TABLA N 4: Lecturas colorimtricas de los valores de l*, a* y b*, e ndice de
color (IC) correspondientes a Vitis vinifera L. c.v. Red Globe, utilizando los
parmetros del sistema CIELAB.
l* a* b* ndice de
color (IC*)
Uva 177,22
33
TABLA N 5: Lecturas colorimtricas de los valores de l*, a* y b*, e ndice de
color (IC) correspondientes a Ficus carica L. utilizando los parmetros del
sistema CIELAB.
l* a* b* ndice de
color (IC*)
Higo 53,04
34
TABLA N 6: En la presente tabla se presenta un resumen del ndice de color
correspondientes a los frutos de Ficus carica L, Prunus domestica L y Vitis
vinifera L c.v. Red Globe utilizando los parmetros del sistema CIELAB.
COLOR IC*
l* a* b*
35
4 3 2 1
(528 nm)
(530 nm)
(530 nm)
(526 nm)
36
4 3 2 1
Figura N 11: Cromatograma de los extractos de Prunus domestica L. sobre
papel Whatman N 3 y como fase mvil BAW. En ella se advierten 4 bandas
coloreadas (1, 2, 3 y 4), las que fueron eludas en HCl 0,01% en metanol y
ledas en el espectrofotmetro.
(522 nm)
(528 nm)
(530 nm)
(530 nm)
37
3 2 1
Figura N 12: Cromatograma de los extractos de Vitis vinifera L. c.v. Red
Globe sobre papel Whatman N 3 y sistema de solvente BAW. En ella se
advierten 3 bandas coloreadas (1, 2 y 3), las que fueron eludas en HCl 0,01%
en metanol y ledas en el espectrofotmetro.
(526 nm)
(528 nm)
(531 nm)
38
Para complementar el estudio se analiz cromatogrficamente las antocianinas
de los frutos de Ficus carica L. usando como fase mvil el AWH (Acido
actico/agua/cido clorhdrico 15/82/3 V/V/V. Se evidenci la presencia de
una antocianina cuyo Rf era 72.
Las antocianinas de los frutos de Vitis vinifera L. c.v. Red Globe tambin
fueron analizadas por CP usando como fase mvil el AWH (cido
actico/agua/cido clorhdrico 15/82/3 V/V/V. Se evidenci la presencia de
dos antocianinas cuyo Rf era 45,1 y 55,3.
39
Los anlisis cromatogrficos del hidrolizado de los extractos de Vitis vinifera
L. c.v. Red Globe, Prunus domestica L. y Ficus carica L. se observan en
las Figuras N 13, 14 y 15.
40
Figura N 14: Cromatograma de los azcares obtenido por la hidrlisis de la
muestra de Prunus domestica L. sobre papel Whatman N 1 usando como
revelador: ftalato acido de anilina y como sistema de solventes n-
butanol/etanol/agua en la proporcin de 4/1/5.
De izquierda a derecha se advierte: La muestra problema, y los estndares D-
xilosa, D-ribosa, D-glucosa y D-galactosa, respectivamente.
Se observa que la muestra de Prunus domestica L. (izquierda) presenta D-
glucosa (Rf 22).
41
Figura N 15: Cromatograma de los azcares obtenido por hidrlisis de la
muestra de Ficus carica L. sobre papel Whatman N 1 usando como
revelador: ftalato acido de anilina y como sistema de solventes n-
butanol/etanol/agua en la proporcin de 4/1/5.
De izquierda a derecha se advierte: La muestra problema, y los estndares D-
xilosa, D-ribosa, D-glucosa y D-galactosa, respectivamente.
Se observa que la muestra de Ficus carica L. (izquierda) presenta D-glucosa
(Rf 22).
42
Estudios en HPLC
43
Figura N 17: Cromatograma HPLC de Ficus carica L. realizado bajo las
siguientes condiciones: HPLC en fase reversa en un Modulo de Separacin
2695 equipado con un auto inyector, un detector fotodiodo y un software. La
data espectroscpica se ley entre 200 y 700 nm, usando una columna C18 y
una columna de 4,6 nm x 2,0 nm para la separacin de las antocianinas a 40
C.
En la figura se observan los tiempos de retencin de dos antocianinas que
segn la literatura se refieren a 1) Cianidina 3-glucsido y 2) Cianidina 3-
ramnoglucsido.
44
16.683 Peak 6
214.7
228.8
0.030 518.6
280.8
0.020
0.010
331.9
AU
0.000
-0.010
-0.020
-0.030
17.750 Peak 8
212.3
519. 8
0.10
231.1
0.08
280.8
0.06
AU
0.04
0.02
330.7
0.00
300.00 400.00 500.00
nm
45
Figura N 20: Cromatograma HPLC de las antocianinas de Prunus domestica
L. realizada bajo las siguientes condiciones: HPLC en fase reversa en un
Modulo de Separacin 2695 equipado con un auto inyector, un detector
fotodiodo y un software. La data espectroscpica se ley entre 200 y 700 nm,
usando una columna C18 y una columna de 4,6 nm x 2,0 nm para la
separacin de las antocianinas a 40 C.
En la figura se observan los tiempos de retencin de seis antocianinas que
segn la literatura se refieren a 1) no identificado, 2) Cianidina 3-xilosido, 3)
cianidina 3-glucsido, 4) Cianidina 3-rutinsido, 5) Peonidina 3-glucsido y 6)
Peonidina 3-rutinsido.
46
15.233 Peak 5
221.7
0.080
0.070
516.1
0.060
0.050 280.8
239.4
0.040
AU
0.030
0.020
0.010 328.3
0.000
-0.010
16.117 Peak 6
0.24 516.1
0.22
0.20
0.18
280.8
0.16
0.14
218.2
AU
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
327.1
0.02
0.00
300.00 400.00 500.00
nm
47
16.383 Peak 7
516.1
0.25
218.2
0.20
280.8
0.15
235.8
AU
0.10
0.05
328.3
0.00
300.00 400.00 500.00
nm
17.183 Peak 8
1.20
516.1
1.00
0.80 280.8
218.2
0.60
AU
235.8
0.40
0.20
328.3
0.00
300.00 400.00 500.00
nm
48
17.667 Peak 9
0.18 517.4
0.16
0.14
0.12 280.8
0.10 232.3
AU
0.08
0.06
0.04
0.02 328.3
0.00
300.00 400.00 500.00
nm
18.117 Peak 10
218.2
0.060
0.050
0.040
0.030
0.020
517.4
AU
280.8
0.010
333. 1
0.000
-0.010
-0.020
-0.030
49
Figura N 27: Cromatograma HPLC de las antocianinas de Vitis vinifera L.
c.v. Red Globe realizada bajo las siguientes condiciones: HPLC en fase
reversa en un Modulo de Separacin 2695 equipado con un auto inyector, un
detector fotodiodo, y un software. La data espectroscpica se ley entre 200 y
700 nm, usando una columna C18 y una columna de 4.6 nm x 2.0 nm para la
separacin de las antocianinas a 40 C.
En la figura se observan los tiempos de retencin de seis antocianinas que
segn la literatura corresponden a 1) Delfinidina 3-glucsido, 2) Cianidina 3-
glucsido, 3) Petunidina 3-glucsido, 4) Peonidina 3-glucsido, 5) Malvidina 3-
glucsido y 6) Antocianina no identificada.
50
15.917 Peak 5
211.2
0.050
0.040
0.030
237.0
0.020 518.6
AU
281.9
0.010
330.7
0.000
-0.010
17.083 Peak 6
211.2 518.6
228.8
0.08
0.06 280.8
0.04
AU
0.02
330.7
0.00
-0.02
300.00 400.0 0 500.00
nm
51
18.817 Peak 8
518.6
0.10
0.08 280.8
237.0
0.06
AU
0.04
0.02
329.5
0.00
19.800 Peak 9
518.6
0.50
211.2
0.40
280.8
0.30
AU
237.0
0.20
0.10
329.5
0.00
300.00 400.00 500.00
nm
52
20.483 Peak 10
221.7
0.06
237.0 528.3
0.04
277.2
0.02
343.8
AU
0.00
-0.02
-0.04
-0.06
300.00 400.0 0 500.00
nm
29.900 Peak 15
213.5
0.070
0.060
283.1
0.050 521.0
0.040
315.2
AU
0.030
0.020
0.010 368.7
0.000
-0.010
53
Cuantificacin de las antocianinas monomricas totales por el mtodo del
pH diferencial
PM es el peso molecular.
FD es el factor de dilucin que es 240.
es la absortividad molar.
El de la cianidina 3-glucsido es 26,900 y el PM es 449.2.
Higo
0,088 0,003 0,011 0,001 29,64
54
Tabla N 11: Concentracin de las antocianinas monomricas de Prunus
domestica L. por el mtodo del pH diferencial.
Ciruela
0,348 0,002 0,018 0,002 39,92
Uva
0,178 0,002 0,007 0,002 20,56
55
Tabla N 13: Tabla comparativa de la concentracin de las antocianinas
monomricas expresadas en Cy 3-glu (mg/100g) por el mtodo del pH
diferencial.
Concentracin de antocianinas
monomricas Cy 3-glu (mg/100g)
56
Ensayos biolgicos
57
Figura N 34: En la presente figura se muestra los porcentajes de capacidad
antioxidante expresado en porcentaje de captacin de radicales libres de la muestra
de Prunus domestica L.
58
Tabla N 17: Porcentaje de captacin de radicales libres e IC50 ug/mL de la especie
vegetal Ficus carica L.
59
Tabla N 18: Resultados de las lecturas espectrofotomtricas y captacin de
radicales libres de la especie vegetal Vitis vinifera L c.v. Red Globe.
60
Figura 36: En la presente figura se muestra los porcentajes de capacidad
antioxidante expresado en porcentaje de captacin de radicales libres de la
muestra de Vitis vinifera L c.v. Red Globe.
61
Tabla N 20: Tabla comparativa de la capacidad antioxidante IC50 de los
frutos de Ficus carica L, Vitis vinifera L c.v. Red Globe y Prunus
domestica L.
Ficus carica L.
Higo 8,50
Prunus domestica L.
Ciruela 13,25
62
Tabla N 21: Tabla comparativa resumen de las pruebas qumicas y biolgicas
de los frutos de Ficus carica L, Vitis vinifera L c.v. Red Globe y Prunus
domestica L.
63
V. DISCUSIN
64
31
Al respecto, Burin B y Col, 2010 indican que las ciruelas presentan un
contenido de antocianinas totales (mg/100g) de 2 a 25; mientras que las uvas
entre 6 y 600.
De los resultados proporcionados por Burin se advierte que los frutos de uva
estudiados se encuentran en el mencionado rango de concentracin; mientras
que la ciruela presenta un rendimiento ligeramente mayor posiblemente debido
a la calidad del suelo, el periodo de cosecha, el clima, entre otros.
65
Por lo tanto, las antocianinas son consideradas potencialmente beneficiosas
como integrantes de la dieta humana.
66
VI. CONCLUSIONES
4. El ndice de color (IC) de Vitis vinifera L. c.v. Red Globe fue de 177,22,
de Ficus carica L. de 53,04 y Prunus domestica L. de 164,52.
67
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
68
14. Vignoni L., Cesari R., Forte M., Mirabile M. Determinacin de ndice de
color en ajo picado. Inf. Tecnol. 2006; 17(6): 63-67.
15. Cook N., Samman S. Flavonoids: Chemistry, Metabolism, Cardioprotective
effects, and Dietary Sources. J. Nutr. Biochem. 2006;7:66-67.
16. Martinez-Valverde I., Periago M., ROS, G. Significado nutricional de los
compuestos fenlicos de la dieta. Arch. Latin. Nutric. 2007;50:5-18.
17. Muoz O. Contenido de flavonoides y compuestos fenlicos en mieles
chilenas e ndice antioxidante. Quim. Nova. 2007; 30(4): 848-851.
18. Avello M., Suwalsky M. Radicales libres, antioxidantes naturales y
mecanismos de proteccin. Atenea. 2006; 4(1):161-172.
19. Mesa A., Actividad antioxidante y contenido de fenoles totales en algunas
especies del gnero Calophyllum. Rev. Cub. Plant. Med. 2010; 15(2):13-26.
20. Puertas M., Gomez L., Saenz J. Capacidad antioxidante in vitro de
fracciones de hojas de Piper peltatum L. Rev Cubana Plant Med. 2009; 14(2):1-
5
21. Murillo E., Lombo O., Tique M., Mendez J. potencial antioxidante de
Bauhinia Kalbreyeri Harms. Inf.tecnol. 2007;18(6):65-74.
22. Duran D., Trujillo Y. Estudio comparativo del contenido fenlico de vinos
tintos colombianos e importados. Vitae. 2008; 15(1):1-9.
23. Malacrida C., Da Mota S. Compuestos fenlicos totales y antocianinas en
jugo de uvas. Cienc. Tecnol. Aliment. 2005. 25(4):659-664.
69
29. Remesy C., Manach C., Demogne C., Texier O., Regerat F. Intereret
nutritionnal des flavonoides. Med. Et Nutr. 2006; 32(1):17-27.
30. Wang H., Cao G., Prior R. Oxigen radical absorbing capacity of
anthocyanins. J. Agric. Food Chem. 1997; 45(2):304-309.
31. Burin B., Falcao L., Valdemoro L. Color, contenido fenlico y actividad
antioxidante del jugo de uva. Cinc. Tecnol. Aliment. 2010; 30 (4):1-6.
32. Fredes C. Antioxidantes en berries nativos chilenos. Boletn
Latinoamericano y del Caribe de plantas medicinales y aromticas. 2009;
8(6):469-478.
33. Gauche C., Da Silva E., Bordignon M. Effect of pH on the copigmentation of
anthocyanins from Cabernet Sauvignon grape extracts with organic acids. Sci.
Agric. 2010; 67 (1):1-4.
34. Jimenez M., Zambrano M., Aguilar M. Estabilidad de Pigmentos en Frutas
Sometidas a Tratamiento con Energa de Microondas. Inf. Tecnol. 2004; 15(3).
35. Mrquez L., Torres F., Pretell C. Antocianinas totales, fenoles totales y
actividad antioxidante en pulpa de frutas. Puebl. Cont. 2007; 18(2):209-214.
36. Ferreira E., Stringheta P., Cano M. Stability of anthocyanin in spinach vine
Basella rubra fruits. Cienc. Inv. Agr. 2007; 34(2):115-120.
37. Gutierrez A., Ledesma L., Garcia I., Grajales O. Capacidad antioxidante
total en alimentos convencionales y regionales de Chiapas, Mxico. Rev
Cubana Salud Pblica. 2007; 33(1): 1-6.
38. Gonzalez K. Efecto antioxidante y contenido polifenlico de Syringodium
filiforme. Rev. Biol. Trop. 2011; 59(1): 465-472.
39. Villanueva J., Condezo L., Ramirez E. Antocianinas, cido ascrbico,
polifenoles totales y actividad antioxidante, en la cscara de camu-camu
Myrciaria dubia (H.B.K) McVaugh. Cienc. Tec. Alim. 2010; 30(11):1-10
40. Ramos F., Muoz A., Alvarado C., Yaez J. Antocianinas, polifenoles,
actividad anti-oxidante de sachapapa morada Dioscorea trifida L. y evaluacin
de lipoperoxidacin en suero humano. Rev. Soc. Quim. Per. 2010; 76(1):61-
72.
41. Lima L., Melo E., Lima D. Efeito da luz e da temperatura de congelamento
sobre a estabilidad de das antocianinas da pitanga roxa. Cinc. Tecnol.
Aliment. 2005; 25(1): 92-94.
70
42. Marco P., Poppi R., ScarminoI. Procedimentos analticos para identifio de
antocianinas presentes em extratos naturais. Qum. Nova. 2008; 31(5):1218-
1223.
43. Vargas G., Soto R., Rodrguez M. Anlisis preliminar de antocianinas en
frutos de icacao Chrysobalanus icacao L. Rev. Fitotec. Mex. 2002; 25(3):261-
264.
44. Repo R., Encina C. Determinacin de la capacidad antioxidante y
compuestos fenlicos de cereales andinos: quinua Chenopodium quinoa,
kaiwa Chenopodium pallidicaule y kiwicha Amaranthus caudatus. Rev.
Soc. Quim. Per. 2008; 74(2):1-8.
45. Organizacin Panamericana de la Salud. Enfermedades producidas por
radicales libres. Rev. Panam. Salu. Public. 1997; 1(5):399-400.
46. Ferramola A., Sancovich H. Interacciones de las radiaciones
electromagnticas y especies reactivas del oxigeno sobre la piel. Rev. Argent.
Dermatol. 2006; 87(2):113-120.
47. Ferrer Y., Martinez G., Leroy D. El estrs oxidativo y su impacto en las
cataratas. Rev. Cub. Farm. 2009; 43(3):1-5.
48. Zorrilla A. El envejecimiento y el estrs oxidativo. Rev. Cub. Invest. Biomed.
2002; 21(3):234-237.
49. Venero J. Dao oxidativo, radicales libres y antioxidantes. Rev. Cub. Med.
Milit. 2002; 31(2):126-136.
50. Gutierrez A., Ledesma L., Garca I., Grajales O. Capacidad antioxidante
total en alimentos convencionales y regionales de Chiapas, Mxico. Rev. Cub.
Salu. Public. 2007; 33(1):1-4.
51. Santamara F., Daz R., Sauri E., Espadas y Gil F., Santamara J., Larque
A. Caractersticas de calidad de frutos de papaya maradol en la madurez de
consumo. Agric. Tecn. Mex. 2009; 35(3):347-353.
52. Quintero C. Efecto de la copigmentacin sobre el color y la estabilidad del
pigmento en un sistema modelo (bebida), usando antocianina de rbano.
Editorial Universidad de la Ameritas. Puebla. 2004.
53. Daz L., Padilla C., Seplveda C. Identificacin del principal pigmento
presente en la cscara del maracuy prpura Pasiflora edulis. Inf. Tec.
2006;17(6):75-84.
71
54. Muoz C., Maihua R., Peralta F., Tereschuk M., Gonzalez M., Albarracin P.
Anlisis de antocianinas en arndanos del Noa Vaccinium corymbosum L.
Facultad de Ciencias Exactas y Tecnologa. Universidad Nacional de Tucuman;
2007.
55. Chirinos R., Campos D., Betalleluz I., Giusti M., Schwartz S., Pedreschi R.
High-performance liquid chromatography with photodiode array detection
(HPLC-DAD)/HPLC-mass spectrometry (MS) profiling of anthocyanins from
Andean Mashua Tubers (Tropaeolum tuberosum Ruz and Pavn) and their
contribution to the overall antioxidant activity. J. Agric. Food. Chem. 2006;
54(19):7089-7097.
56. Pasto D., Johnson C. Determinacin de estructuras orgnicas. Editorial
Revert S.A. Barcelona. 2003.
57. Del Carpio C., Serrano C., Giusti M. Caracterizacin de las antocianinas de
los frutos de Berberis boliviana Lechler. Rev. Soc. Quim. Per. 2009; 75(1):
76-86.
58. Ramos E., Castaeda B., Ibaez L. Evaluacin de la capacidad
antioxidante de plantas medicinales peruanas nativas e introducidas. Red.
Acad. Per. Salud. 2008; 15(1):42-46.
59. Del Caro A., Piga A. Polyphenol composition of peel and pulp of two italian
fresh fig fruits cultivars Ficus carica L. Eur. Food. Res. Technol. 2008; 226:
715-719.
60. Usenik V., Stampar F., Veberic R. Anthocyanins and fruti colour in plums
(Prunus domestica L) during ripening. Food Chemistry. 2009; 114:529-534.
61. Del Valle G., Gonzalez A., Baez R. Antocianinas en uva Vitis vinifera L. y
su relacin con el color. Rev. Fitot. Mex. 2005; 28(4):359-368.
72
VIII. ANEXOS
Nmero 1: Clasificacin realizada en la UNALM1
73
74
75
Nmero 2: Espectros UV-visible de la antocianinas de los frutos Ficus carica
L., Prunus domestica L. y Vitis vinifera L. c.v. Red Globe.
76
Figura N 38: Espectro UV-visible de la antocianina de la banda 2 de Ficus
carica L. (Tabla 7).
Presenta un pico de absorcin caracterstico de una antocianina, posiblemente
la cianidina.
77
Figura N 40: Espectro UV-visible de la banda 4 de Ficus carica L. (Tabla 7).
No presenta el E440/Emax caracterstico de una antocianina conocida.
78
Figura N 41: Espectro UV-visible de la banda 1 de Prunus domestica L.
(Tabla 8).
No presenta el E440/Emax caracterstico de una antocianina conocida.
79
Figura N 43: Espectro UV-visible de la antocianina de la banda 3 de Prunus
domestica L. (Tabla 8).
Presenta un pico de absorcin caracterstico de una antocianina, posiblemente
la cianidina.
80
Figura N 45: Espectro UV-visible de la antocianina de la banda 1 de Vitis
vinifera L c.v. Red Globe (Tabla 9).
Presenta un pico de absorcin caracterstico de una antocianina, posiblemente
la peonidina.
81
Figura N 47: Espectro UV-visible de la antocianina de la banda 3 de Vitis
vinifera L c.v. Red Globe (Tabla 9).
Presenta un pico de absorcin caracterstico de una antocianina, posiblemente
la malvidina.
82