METODOLOGA ANALTICA

EN ESTUDIOS
DE BIOEQUIVALENCIA

QFB KARINA RODRGUEZ

 CONTENIDO
1. Tipos de mtodos

2. Desarrollo del mtodo

3. Validacin

4. Revalidacin

5. Aplicacin durante el anlisis

6. Conclusiones
 FACTORES QUE IMPACTAN
EN BIOANLISIS

MATERIALES EQUIPO
Marca Calibrado/Calificado
SR trazables
Grado
Mantenimiento preventivo
Caducidad Pureza
Lote Pruebas de adecuabilidad

RESULTADOS
Exacto Lineal Entrenamiento CONFIABLES
Selectivo Preciso continuo
Sensible Evaluacin contInua
Sensible
Muestra estable
MTODO ANALISTAS
 MTODOS
BIOANALTICOS

Lagerwerf, M. F., et. al.

Pharma Bio-Research International
DESARROLLO DEL MTODO
CONOCER EL ANALITO

1) Propiedades fisicoqumicas
Solubilidad
pka
Coeficiente particin lpido/acuoso (Kp)
Coeficiente particin sangre/plasma, suero (Ks/p)
Peso molecular

2) Propiedades farmacocinticas
Cmx
Metabolitos
Unin a protenas
 INFORMACIN
BIBLIOGRFICA

DEFINICIN
CONDICIONES
PREELIMINARES

PREPARACIN DE LAS
CROMATOGRAFA CUANTIFICACIN
MUESTRAS

MTODO PREELIMINAR

NO
PROMISORIO

SI

VALIDAR

APLICAR
 VARIABLES A
CONTROLAR
1) CUANTIFICACIN
Rango de la curva de calibracin
Concentraciones de los puntos control
2) CROMATOGRFICAS
Separacin
Retencin
Simetra
Coleo
3) PREPARACIN DE LAS MUESTRAS
Tipo de extraccin (precipitacin de protenas, slido-lquido
o lquido-lquido)
 Cmo determinar el
Rango Adecuado?

1. Establecer como 100% el valor mximo esperado de la

Cmx
2. El nivel ms alto del rango puede ser el 200% del valor
mximo de la Cmx esperada
3. El nivel ms bajo del rango debe ser al menos el 10% del
valor mnimo de la Cmx esperada
4. Considerar 5-8 niveles de concentracin distribuidos a lo
largo del rango y que constituirn la curva de calibracin
5. Establecer 3 niveles de concentracin diferentes a los de
la curva de calibracin, pero incluidos dentro del rango, estas
concentraciones sern los puntos de control de calidad
Cmo determinar el Rango?
Ejemplo:
La Cmx reportada de la glibenclamida es: 141.713 46.261 ng/mL

100% 200% 10%

187.974 ng/mL 400 ng/mL 9.545 ng/mL
(200 ng/mL) (10 ng/mL)
Rango: (5) 10, 25, 50, 100, 200, 300 y 400 ng/mL
Puntos de control de calidad: (15), 30, 150 y 350 ng/mL
Cmo determinar los puntos de
control de calidad?
 CROMATOGRAFA
Retener al analito lo suficiente para separarlo del frente del
disolvente (Conocer el volumen muerto)

Supresin inica
Mala retencin Variabilidad en resultados
Pobreza cromatogrfica
Simetra de picos y factor de coleo
- Limitante el uso de aditivos no voltiles en la fase mvil
- Incremento de % de componente acuoso y velocidad de flujo
requiere de incremento de temperatura y presiones de gases,
disminucin de sensibilidad
- Limitante el pH

Tiempos de corrida cortos (columnas cortas, gradientes)

Separar al analito y sus metabolitos. Importante para frmacos

con extenso metabolismo
 CROMATOGRAFA
SELECCIN DE COLUMNA

Utilizar columnas cortas

Menor volmen muerto, los componentes endgenos eluyen en el

frente del disolvente, menor probabilidad de supresin inica

Mayor resolucin

CUIDAR: Las columnas cortas contienen menor cantidad de

material de empaque y debido a la corta retencin del analito en la
fase estacionaria es ms probable que la adecuabilidad
cromatografica se vea afectada (picos partidos, hombreados,
asimtricos, etc) particularmente por la mala eleccin de la solucin
de inyeccin, la fase mvil o el tipo de fase estacionaria
 CROMATOGRAFA
IMPORTANCIA DEL DISOLVENTE DE INYECCIN

Siempre utilizar el disolvente con fuerza inica ms dbil de la fase

mvil

Columna: Hypersil BDS C18 50 x 2 mm2 ID, 5 .

Fase mvil: agua-acetonitrilo-acido frmico (20:80:0.2 v/v/v).
Solucin de Inyeccin agua (izquierda) y fase mvil (derecha)
 CROMATOGRAFA
IMPORTANCIA DEL DISOLVENTE DE INYECCIN

Columna: Hypersil BDS C18 50 x 2 mm2 ID, 5 .

Fase mvil: agua-acetonitrilo-acido frmico (20:80:0.2 v/v/v).
Solucin de Inyeccin fase mvil (izquierda) y acetonitrilo (derecha)
Limitante: solubilidad del analito y evaporacin del acetonitrilo en corridas
muy largas
PREPARACIN DE LAS
MUESTRAS
1) Precipitacin de protenas

Journal of Chromatography B, 785, (2003) 263-275

La metodologa ptima para precipitar protenas en ESI+ es empleando
TCA y fases mviles con disolventes orgnicos puros (metanol:agua,
acetonitrilo:agua)
Journal of Chromatography B, 785, (2003) 263-275
PREPARACIN DE LAS
MUESTRAS
2) Extraccin lquido-lquido

Basada en el pka de la molcula

Coeficiente de particin lpido/agua
Solubilidad en disolventes orgnicos. Comnmente en LC-MS-MS
se emplean:
Metil terbutil eter
Eter anhidro
Diclorometano
Hexano
Acetato de etilo
MTODO DE EXTRACCIN PARA
AMITRIPTILINA
Volmen de plasma

EI (Imipramina)

Alicuota de
Hexano:Eter

Agitar

Centrifugar

Congelar

Decantar

Evaporar

Reconstituir Inyectar LC-MS-MS

PREPARACIN DE LAS
MUESTRAS
3) Extraccin Slido-Lquido

Basada en la adsorcin o particin del analito en el

en un sorbente slido
Slica enlazada con grupos alquilos (C2, C8, C18,
amino, fenilo, intercambio inico, etc)
MTODO DE EXTRACCIN GENERAL
CON CARTUCHOS

Equilibrar cartucho

Agregar buffer si es requerido Cargar muestra de

Plasma (no ionizada)

Lavar con agua

Eluir (MeOH)

Evaporar

Reconstituir

Inyectar
CARACTERSTICAS DE UN MTODO
PARA BIOANLISIS

SELECTIVIDAD
RAPIDEZ
(ALTO DESEMPE
DESEMPEO) SENSIBILIDAD

METODO
RAPIDEZ PRECISICIN

RECOBRO
 VALIDACIN
EFECTOS A CONTROLAR
1. Supresin inica
 VALIDACIN
EFECTOS A CONTROLAR
1. Supresin inica
 VALIDACIN
EFECTOS A CONTROLAR
2. Carry over
Evaluar la posible adsorcin del analito o EI a las superficies
internas, tubera, vlvula de inyeccin. Comparar tubera de
acero VS tubera de Peek.
Optimizar el pH y composicin de la solucin de lavado del
inyector
Evaluar tipos de jeringas
Limpiar con regularidad la vlvula de inyeccin, el rotor o estator
Comparar modos de inyeccin de loop total o parcial
Agregar 0.01 a 0.1% de TFA a la solucin de lavado para
disminuir acarreo
Incrementar el nmero de inyecciones de lavado despus de
cada inyeccin
 VALIDACIN
EFECTOS A CONTROLAR
3. Crosstalk
Deteccin cruzada entre el analito y el estndar interno,
es importante verificar cuando se emplean estndares
deuterados:

1. Inyeccin de una muestra blanco. Monitorear transicin de analito y EI

2. Inyeccin de una muestra del analito a la concentracin ms alta SIN EI.
Monitorear transicin del analito y del EI
3. Inyeccin de una muestra del EI. Monitorear transicin del analito y EI
4. Inyeccin de una muestra blanco. Monitorear la transicin del analito y cualquier
otra transicin con el mismo ion producto que el analito
5. Inyeccin de una muestra del analito a la concentracin ms alta sin EI.
Monitorear la transicin del analito y cualquier otra transicin con el mismo ion
producto que el analito
6. Inyeccin de una muestra blanco. Monitorear la transicin del EI y cualquier otra
transicin con el mismo ion producto que el analito
7. Inyeccin de una muestra del EI. Monitorear la transicin del EI y cualquier otra
transicin con el mismo ion producto que el EI
 VALIDACIN
EFECTOS A CONTROLAR
4. Adecuabilidad del Sistema

Desempeo ptimo al
inicio de la corrida
(estabilidad de la respuesta
y carry over)

Desempeo ptimo
durante la corrida

En caso de falla del equipo

el sistema muestra el
mismo desempeo que el
inicial
 RECOBRO
Recuperacin absoluta: Comparacin de los
resultados de tres concentraciones conocidas en
plasma estos resultados con las respuestas de
soluciones del mismo compuesto en las mismas
concentraciones y en los mismos disolventes.

VERIFICAR: El porcentaje de esta(s) razn(es)

no necesariamente es del 100%, pero debe ser
reproducible en cada nivel de concentracin
dentro del rango.
 Ejemplo
El porcentaje no
CONCENTRACIN
NOMINAL (g/mL)
REAS EN
SOLUCIN
REAS EN
PLASMA
%
RECOBRO
debe ser
MUESTRAS CONTROL BAJO necesariamente
0.75 265000 154000 58.113 del 100%
0.75 248000 144000 58.065
0.75
PROMEDIO
245000 150000 61.224
3.062
252667 149333 59.103
C. V.% 4.269 3.370 3.062
MUESTRAS CONTROL MEDIO
5 2010000 972000 48.358
5
5
2070000
2020000
1050000
968000
50.725
47.921
3.078
PROMEDIO 2033333 996667 49.016
C. V.% 1.581 4.639 3.078
MUESTRAS CONTROL ALTO
12.5 4510000 2600000 57.650
12.5 4630000 2350000 50.756
12.5 4380000 2480000 56.621 6.761
PROMEDIO 4506667 2476667 54.916
C. V.% 2.774 5.048 6.761
RECOBRO ABSOLUTO PROMEDIO 54.381
C. V.% 9.068
 Ejemplo
REAS EN REAS EN
RESPUESTA % DE RECOBRO
SOLUCIN PLASMA

MUESTRAS CONTROL BAJO

0.75 14800 18000 121.622
0.75 14500 18345 126.517
0.75 13600 17356 127.618
CV>15%
0.75 13100 18457 140.893
PROMEDIO 14000 18956 129.162
CV 5.624 2.614 6.382 6.382
MUESTRAS CONTROL MEDIO
5 154000 137000 88.961
5 153000 136000 88.889
5 162000 142000 87.654
5 166000 146000 87.952
PROMEDIO 158750 140250 88.364
CV 3.963 3.313 0.747 0.747
MUESTRAS CONTROL ALTO
12.5 1700000 1467890 86.346
12.5 1750000 1568750 89.643
12.5 1710000 1596745 93.377
12.5 1710000 1590098 92.988
PROMEDIO 1717500 1555871 90.589 3.629
CV 1.291 3.847 3.629
PROM. 98.976
CV(%) 19.858 Recobro
cercano a 100%
 Linealidad

Linealidad: definir un modelo que describa la relacin

matemtica entre concentracin y respuesta. Esta
relacin debe ser continua y reproducible a lo largo del
rango. Determinar la bondad de ajuste
 Cmo determinar la
Bondad de Ajuste?
1. Calcular el porciento de recobro de cada uno de los datos de
concentracin.
2. Graficar los valores de porciento de recobro vs concentracin (Grfico de
residuales) y observar la tendencia de los puntos.
3. Determinar el Error Relativo de las 3 curvas empleadas para evaluar la
linealidad del mtodo.
4. Calcular la suma del porciento de los errores relativos ( %ER).
5. Llevar a cabo las ponderaciones empleando los modelos 1/x, 1/x2, ln x, etc.
6. Elaborar una tabla con los valores de ( %ER) y r2 de cada uno de los
modelos.

VERIFICAR:
El modelo ms adecuado ser aquel que presente el error relativo
ms pequeo y el coeficiente de correlacin ms alto.
Si la dispersin es semejante en todo el rango de concentraciones, la
curva cumple con el criterio de homosedasticidad.
Si la dispersin a concentraciones bajas es alta y a concentraciones
altas es menor, el comportamiento de la curva es heterosedstico,
por lo que es necesario seleccionar otro modelo.
Cmo determinar la
Bondad de Ajuste?

Ponderacin 1/x Ponderacin 1/x2

Menor %RE
Buena correlacin
 Cmo determinar la
Linealidad del mtodo?
1. Preparar tres curvas de calibracin
2. Calcular la concentracin recuperada
3. Graficar los datos de concentracin adicionada vs concentracin
recuperada. Determinar m, r y b

VERIFICAR: El mtodo es lineal si el coeficiente de

correlacin (r) de cada una de las curvas y de todos los datos
(global) es igual o mayor que el 0.98 para la relacin respuesta
contra concentracin. Para los datos de concentracin
recuperada contra adicionada, la desviacin absoluta en cada
nivel de concentracin debe ser menor al 15%, excepto para el
LQ (20%).
 SI ALGN PUNTO NO CUMPLE CON EL
CRITERIO DE 15% CON RESPECTO AL
VALOR NOMINAL

Los puntos de la curva de calibracin, exceptuando los

extremos (punto ms alto y ms bajo) que no cumplan
con el criterio de la desviacin absoluta menor o igual al
15% pueden excluirse del clculo aceptando como
vlida la curva de calibracin cuando el 75% del total de
los puntos cumplan con una desviacin absoluta menor
o igual al 15%,o el punto ms bajo menor o igual al
20%. Los puntos excluidos no deben ser consecutivos.
La exclusin no debe modificar el modelo utilizado.
 Ejemplo Dos puntos
consecutivos
LS y LQ
>15% fuera del 15%

CURVA 1 CURVA 2 CURVA 3

Conc.
Punto No. Concentracin Concentracin Concentracin
Adicionada %D.ABS %D.ABS %D.ABS
Recuperada Recuperada Recuperada

C1 10.0 12.0 19.5 9.8 1.9 12.5 25.0

C2 20.0 21.6 8.0 24.5 22.5 18.5 7.5
C3 30.0 35.4 18.0 35.6 18.7 31.8 6.2
C4 75.0 73.0 2.7 74.4 0.8 73.2 2.5
C5 150.0 168.5 12.3 147.2 1.9 155.5 3.7
C6 300.0 308.9 3.0 307.2 2.4 298.0 0.7
C7 600.0 500.5 16.6 606.5 1.1 605.6 0.9
C8 1200.0 1120.4 6.6 1160.8 3.3 1450.1 20.8
m 0.91182 0.97059 1.18704
b 8.18139 6.39029 -23.24801
r 0.99768 0.99974 0.99653
 PRECISIN

Determinacin del impacto de las

variables del mtodo en la
REPETIBILIDAD
PRECISIN

variabilidad de los resultados de

concentracin recuperada cuando se
aplica el mtodo en el mismo da de
anlisis o en la misma corrida

Determinacin del impacto de las

variables del mtodo en la
variabilidad de los resultados cuando
REPRODUCIBILIDAD se aplica el mtodo en diferentes das
de anlisis, por diferentes analistas o
en diferentes corridas
 Cmo determinar la
Repetibilidad del mtodo?

1. Preparar cinco series de puntos control de calidad

2. Determinar la concentracin recuperada a cada nivel
de concentracin
3. Calcular el promedio, desviacin estndar, coeficiente
de variacin y desviacin absoluta.
4. Determinar la validez de la prueba aplicando el
criterio de aceptacin
 Ejemplo

MUESTRA CONCENTRACIN RECUPERADA

Control bajo Control medio Control alto
3.0 ng/mL 60 ng/mL 400 ng/mL
1 2.780 63.300 393.000
2 3.330 61.600 388.000
3 2.900 60.300 373.000
4 2.830 60.600 396.000
5 2.740 61.800 405.000
Promedio 2.916 61.520 391.000
D. E. 0.239 1.182 11.811
C. V. % 8.197 0.668 3.021
Concentracin
3.0 60 400
adicionada (ng/mL)
Desv. Abs. % 2.800 2.533 2.250

CUMPLE EL CRITERIO DE ACEPTACIN?

 Cmo determinar la
Reproducibilidad del mtodo?
1. Cada analista que intervenga en la preparacin de las
muestras, debe preparar dos o tres series de puntos
control de calidad durante al menos tres das diferentes de
trabajo.
2. Determinar la concentracin recuperada a cada nivel de
concentracin
3. Calcular el promedio, desviacin estndar, coeficiente de
variacin y desviacin absoluta.
4. Determinar la validez de la prueba aplicando el criterio de
aceptacin
 Ejemplo

CONCENTRACIN RECUPERADA
REPLICA
ANALISTA DA Control bajo Control medio Control alto
NUMERO
25 ng/mL 225 ng/mL 900 ng/mL
1 24.823 223.314 816.933
1
2 23.629 205.665 793.083
1 1 23.513 221.812 785.555
2
2 22.595 200.302 770.223
1 26.524 235.374 785.516
3
2 25.249 213.258 794.089
1 28.301 234.116 845.197
1
2 26.434 212.579 969.003
2 1 22.810 218.924 842.262
2
2 21.664 209.226 898.473
1 26.774 222.770 872.394
3
2 24.211 205.531 844.936
1 22.240 255.873 807.698
1
2 24.290 215.412 980.936
3 1 24.845 257.492 885.451
2
2 21.493 243.817 941.250
1 22.467 232.997 799.105
3
2 27.656 234.723 793.382
Promedio 24.418 224.621 845.860
D. E. 2.069 16.734 65.646
C. V. % 8.472 7.450 7.761
Concentracin adicionada (ng/mL) 25.000 225.000 900.000
Desv. Abs. % 2.329 0.168 6.016
 EXACTITUD

Determinacin del impacto de las variables del mtodo

sobre la desviacin de los resultados con respecto a
un valor terico.

Verificar: el valor promedio de las

determinaciones en cada nivel de
concentracin de los datos de repetibilidad y
reproducibilidad deben estar dentro del 15%
del valor nominal de concentracin, excepto
los mtodos por RIA que deben estar dentro
del 20%.
 SELECTIVIDAD

Evaluar el mtodo contra posibles interferencias

(p. ej. metabolitos, productos de degradacin del
compuesto de inters y cualquier otro frmaco
administrado de manera concomitante).

Verificar: No deben existir

interferencias en la cuantificacin del
compuesto por analizar.
 Cmo determinar la
Selectividad del mtodo?
EVALUAR LAS SIGUIENTES MUESTRAS:

Muestra blanco de la matriz biolgica de cada uno de

los 6 donadores (sin adicin de frmaco, ni estndar
interno).
Muestra blanco de la mezcla de matriz biolgica de los
6 donadores (sin adicin de frmaco, ni estndar
interno).
Muestra blanco de la mezcla de la matriz biolgica
adicionada del frmaco a la concentracin ms baja de
la curva y del estndar interno.
Muestra cero (sin adicin de frmaco) de la mezcla de
la matriz biolgica, adicionada del estndar interno.
 Cmo determinar la
Selectividad del
mtodo?
EVALUAR LAS SIGUIENTES MUESTRAS:

Muestra blanco de la mezcla de la matriz biolgica

adicionada de los posibles metabolitos, en su caso.
Muestra blanco de la mezcla de la matriz biolgica
adicionada de los posibles frmacos que pudieran estar
presentes, aplicndose a HPLC con deteccin
ultravioleta.
Muestra blanco de un plasma hemolizado y lipmico
(con adicin y sin adicin de frmaco a la concentracin
ms baja y estndar interno).
 Ejemplo

Muestra blanco de la mezcla de 6 Muestra blanco a la

donadores concentracin ms baja y el
estndar interno.

Muestra blanco de plasma Muestra blanco adicionada del

proveniente de sangre hemolizada estndar interno
 LMITE DE
CUANTIFICACIN
Lmite de cuantificacin: analizar por quintuplicado la
concentracin ms baja del rango de trabajo. Se considera que
el punto tiene validez como lmite de cuantificacin, si su valor
promedio cae dentro del 20% del valor nominal con un
coeficiente de variacin no mayor que 20%.

Lmite de deteccin: determinar la concentracin a la cual la

seal del compuesto por analizar en la matriz biolgica puede
distinguirse de los niveles de ruido o de una muestra libre del
compuesto de inters. Se debe sustentar cientficamente el
criterio empleado para establecerlo.
 Ejemplo
CONCENTRACIN
RPLICA RECUPERADA
ng/mL
1 0.108
2 0.104
3 0.117
4 0.106
5 0.114
6 0.096
Promedio 0.108
Desv. Est. 0.007
C. V. % 6.955
Concentracin
0.1
Adicionada
Desv. Abs. % 7.500
 ESTABILIDAD
Determinar las condiciones de temperatura y tiempo
entre otros, en las que el compuesto permanezca
estable en la matriz biolgica, durante su manejo,
almacenamiento y procesamiento, al evaluar la
respuesta de la concentracin del compuesto por
analizar en la matriz biolgica, en muestras
preparadas al menos por duplicado, a tres niveles de
concentracin dentro del rango, considerando al
menos lo siguiente:

Condiciones de almacenamiento
Ciclos de congelacin-descongelacin
Otros
Cmo realizar las pruebas de
Estabilidad?
1. Preparar los puntos control en plasma en cantidad suficiente para
realizar todos los anlisis
2. Definir las condiciones de temperatura a las cuales se sometern
las muestras:
Largo plazo
Corto plazo (temperatura ambiente, en refrigeracin , etc)
Ciclos de congelacin-descongelacin
Estabilidad de la muestra procesada en el autosampler
3. Definir el periodo en el que permanecern las muestras bajo estas
condiciones
Largo plazo: al menos el periodo que transcurre desde la
obtencin de las muestras hasta su anlisis.
Corto plazo: al menos el periodo que cubra el tiempo
necesario para su procesamiento. Sugerencia: 8 y 12 horas.
Cmo realizar las pruebas de
Estabilidad?
Ciclos de congelacin-descongelacin: Almacenar a la temperatura en
que estarn las muestras reales por 24 horas, descongelarlas
completamente a temperatura ambiente y volver a congelar por 24
horas bajo las mismas condiciones. Repetir el ciclo de congelacin-
descongelacin dos veces ms y analizar las muestras al menos en el
tercer ciclo.
Estabilidad de la muestra en el autosampler: al menos el tiempo que
dura una corrida analtica. Sugerencia: 12 a 24 horas.

4. Definir el criterio de comparacin:

Concentracin nominal, puntos frescos

CRITERIO DE ACEPTACIN: El valor promedio de cada nivel de

concentracin en las diferentes condiciones y tiempos evaluados debe
estar dentro del 15% de la concentracin nominal, puntos de control
frescos o de la concentracin inicial de acuerdo al criterio de
comparacin establecido.
 Ejemplo
CICLO 3
Muestras de Control bajo Control medio Control alto
comparacin 0.3 ng/mL 4 ng/mL 40 ng/mL
Rplica 1 0.301 4.092 44.886
Rplica 2 0.318 4.135 45.538
Rplica 3 0.290 4.187 44.574
Promedio 0.303 4.138 44.999
Desv. Est. 0.014 0.048 0.492
% CV 4.656 1.150 1.093
Muestras de Control bajo Control medio Control alto
Determinacin 0.3 ng/mL 4 ng/mL 40 ng/mL
Rplica 1 0.268 3.989 42.276
Rplica 2 0.263 4.144 42.282
Rplica 3 0.265 3.955 41.030
Promedio 0.265 4.029 41.863
Desv. Est. 0.003 0.101 0.721
% CV 0.948 2.500 1.723
% Desv. Abs. 12.431 2.626 6.970
EFECTO DE LA DILUCIN

Efecto de la dilucin. Preparar seis puntos

control al doble de la concentracin ms alta
para ser diluidos 1:2 y seis puntos control con la
concentracin normal, analizar e interpolaron en
una curva de calibracin preparada el da del
anlisis. Comparar los resultados de las
muestras diluidas 1:2 se con los resultados de la
concentracin ms alta.
 Ejemplo
EFECTO DE LA DILUCIN
CONCENTRACIN
MUESTRAS CONTROL ALTAS
40 ng/mL
1 40.779

2 39.216

3 38.55

4 38.953

5 39.241

6 39.691

Promedio 39.405

Desv. Est. 0.770

C. V. % 1.955

FACTOR DE DILUCIN = 2
CONCENTRACIN MUESTRAS DILUIDAS
1 38.747

2 39.18

3 38.613

4 41.446

5 39.081

6 39.863

Promedio 39.488

Desv. Est. 1.054

C. V. % 2.668

Desv. Abs. % 0.211

 REVALIDACIN O
VALIDACIN PARCIAL
Cambios que ameritan una validacin parcial

Transferencia de mtodos entre laboratorios o entre

analistas
Metodologa analtica (cambio en sistemas de
deteccin)
Tipo de anticoagulantes
Tipo de matriz biolgica
Cambio de matriz biolgica entre especies
Cambio en el rango de concentracin
Procesamiento de muestras
Cambios a instrumentos o plataformas
 REVALIDACIN O
VALIDACIN PARCIAL
Cambio de Equipo Cambio en el mtodo
Selectividad Selectividad
Lmite de cuantificacin Lmite de cuantificacin
Linealidad Linealidad
Precisin y exactitud Precisin y exactitud
Supresin inica Recobro
Supresin inica

Cambio de analista Cambio en el rango

Linealidad de trabajo
Precisin y exactitud Selectividad
Lmite de cuantificacin
Linealidad
Precisin y exactitud
Recobro
 Cmx AUC Cv Cv
PARMETRO Interindividual Intraindividual

RANGO
LINEALIDAD
LMITE DE
CUANTIFICACIN
RECOBRO
REPETIBILIDAD
REPRODUCIBILIDAD
EXACTITUD
ESTABILIDAD
SELECTIVIDAD
 APLICACIN DEL MTODO
DURANTE EL ANLISIS

1. Realizar antes del anlisis qumico de muestras biolgicas un

plan de trabajo donde se indique: el responsable del anlisis, las
actividades asignadas a cada persona, el orden de anlisis de
las muestras, los criterios de aceptacin, rechazo y reanlisis.
2. Realizar el anlisis qumico del estudio en las mismas
condiciones analticas establecidas en la validacin del mtodo
analtico.
3. Preparar y conservar muestras control en la misma matriz
biolgica, por lo menos a tres concentraciones: alta, media y
baja, dentro del rango y por duplicado, que se distribuirn y
analizarn a lo largo de cada corrida analtica.
 APLICACIN DEL MTODO
DURANTE EL ANLISIS

3. Analizar las muestras control bajo el mismo

procedimiento y al mismo tiempo que las muestras
problema. Las muestras control deben cumplir con
los criterios de precisin y exactitud establecidos
durante la validacin del mtodo.

4. Para cada da de anlisis se debe procesar la curva

de calibracin de manera idntica a lo establecido en
la validacin y debe cumplir con los criterios
establecidos durante la validacin.
APLICACIN DEL MTODO
DURANTE EL ANLISIS
Las muestras control sirven como criterio de aceptacin o
rechazo de una corrida analtica: 2 de 6 muestras control,
que no sean de la misma concentracin, pueden estar
fuera de 20 % de la concentracin nominal respectiva.

El 75% de los puntos de la curva de calibracin deben

estar dentro del 15% del valor nominal, excepto el de la
concentracin ms baja que debe ser del 20%. El 25%
restante puede estar fuera de 15% del valor nominal y
podrn excluirse siempre y cuando los puntos no sean
consecutivos. Al hacerlo el modelo matemtico no debe
alterarse.
 APLICACIN DEL MTODO
DURANTE EL ANLISIS
Comprobar la adecuabilidad cromatogrfica
Verificar la estabilidad de la respuesta cromatogrfica
del analito y EI (aplicar grficos de control)
Verificar que no exista efecto de carry over (inicio,
mitad y trmino de la corrida analtica)
Verificar criterios de aceptacin/rechazo de corrida
analtica
Verificar los niveles plasmticos obtenidos y
determinar si es necesario ajustar el rango de la curva
de calibracin
Reinyeccin de corrida analtica?
 CONCLUSIONES

Los mtodos bioanalticos deben desarrollarse pensando

en su facilidad de operacin, alta eficiencia y bajo costo
Deben generar resultados altamente confiables y repetibles
El laboratorio debe garantizar condiciones adecuadas de
operacin del mtodo (calificacin de equipos, personal
entrenado y calificado, reas calificadas)
Garantizar planes de contingencia frente a fallas de equipo,
ausencia de personal, etc.
Garantizar resguardo y confidencialidad de los resultados
obtenidos
Mejorar continuamente la tecnologa analtica disponible en
el laboratorio atravs de tcnicas ms precisas, exactas,
especficas, sensibles, rpidas, rentables y buscar la
automatizacin para mejorar la eficiencia del proceso.
GRACIAS POR SU
ATENCIN