Pontificia Universidad Catlica de Valparaso

Facultad de Ciencias
Instituto de Biologa

EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE PROTENAS SOLUBLES

Los tejidos son ricos en protenas que cumplen diferentes funciones y por lo tanto, con
diferentes caractersticas , y segn stas es posible solubilizarlas, separarlas y purificarlas mediante
diversos mtodos.

El primer paso en la extraccin de la mayora de las protenas y estructuras subcelulares es la

rotura de los tejidos o de las clulas para obtener un lisado celular en el que la protena, el complejo
multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condiciones que permitan su aislamiento. Esto
se consigue empleando procedimientos mecnicos suaves conocidos generalmente como
homogenizacin. Estos mtodos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo
que se libera el contenido celular, dentro de los que se encuentran: shock osmtico, mortero (friccin)
y sonicacin.
Las protenas obtenidas deben ser solubilizadas en buffer para ayudar a extraerlas de las
clulas y adems mantenerlas para su posterior utilizacin.

El objetivo de este prctico es realizar un protocolo para la homogenizacin de tejido y

obtencin de protenas totales, para su posterior cuantificacin y caracterizacin

Objetivos

Establecer criterios para la elaboracin de un protocolo

Conocer la funcin de los componentes de los buffer
Aplicar los conocimientos de los componentes para la elaboracin de los buffer

Actividades

Realizacin de un protocolo para la homogenizacin de tejido y solubilizacin de protenas

Preparacin de buffer a utilizar y determinar la funcin de sus componentes
Homogenizacin de tejido

Materiales:
Mortero de porcelana Tris
Tubos Falcon 15 y 50 ml. Triton.
Tubos eppendorff. Vortex
Esptula. Centrifuga
Inhibidor de proteasas (PMSF)

Buffer Lisis (para 20 ml)

18 ml. de Tris HCl (20 mM)

2 ml. de NaCl (1 M)
10 l Tritn x-100
Cada un ml. de la preparacin anterior:

10 l de EDTA (0,5M).
50 l de PMSF (100 mM)

Procedimiento:

1) Pese y prepare el buffer de lisis en la cantidad necesaria y molaridad indicada

2) Poner su muestra en un mortero y homogenizar
3) Mezclar con el buffer en un tubo falcn en una relacin 1:5
4) Homogenizar con vortex de forma horizontal
5) Centrifugar a 11000 rpm por 30 minutos
6) Rescatar sobrenadante.
7) Conservar a -20C

CUANTIFICACIN DE PROTENAS
MTODO DE BRADFORD
Se han descrito muchos mtodos diferentes para la determinacin cuantitativa de
protenas. Estos mtodos difieren entre s en cuanto a su sensibilidad, exactitud, precisin,
interferentes, estabilidad y sencillez. La seleccin del mtodo a utilizar se realiza considerando las
caractersticas de las muestras que se desean analizar, las cuales pueden ser desde extractos crudos de
tejidos animales o vegetales, fluidos biolgicos de inters en bioqumica clnica (suero, plasma u
orina), muestras obtenidas desde la purificacin de protenas, fracciones cromatogrficas hasta
muestras de una protena pura. En general, los mtodos utilizados para la determinacin cuantitativa
de protenas consisten en la determinacin absorciomtrica directa o ensayos de tipo colorimtrico,
turbidimtrico o fluoromtrico

La mayora de las protenas presentan un mximo de absorbancia a 280 nm

aproximadamente, debido principalmente a la presencia de residuos de triptfano y tirosina, y en
mucha menor proporcin fenilalanina. Los residuos de histidina, cistena y cistina, tambin presentan
bandas de absorbancia en el ultravioleta cercano, pero se encuentran a menores longitudes de onda y
son de menor intensidad.

Mtodo de Bradford
Este mtodo utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G-250 de unirse a las
protenas. El colorante libre presenta un mximo de absorcin a 465 nm mientras que cuando est
unido a protenas ste se encuentra a 595 nm. El ensayo estndar posee una sensibilidad desde 0,1 a
1,4 mg/ml. Esta unin se debe a la estabilizacin de la forma aninica del colorante mediante
interacciones hidrofbicas e inicas, causando un cambio visible de color.

Interferencias: Detergentes y lcalis reducen el color. Se recomienda medir en el tiempo

asignado, debido a que el color no es estable en el tiempo, ya que la protena y el complejo colorante-
protena comienza a precipitar debido al medio cido. Este efecto es especialmente significativo a las
concentraciones de protenas mayores. Por otra parte, el complejo protena colorante tiende a unirse a
las cubetas tindolas, por lo cual se recomienda un lavado final con etanol.

Este ensayo requiere adems la realizacin de una curva de calibracin para la determinacin de
la concentracin de protenas de una muestra, utilizndose comnmente BSA como protena patrn.
OBJETIVOS

Realizar una curva de calibrado utilizando BSA como protena patrn.

Calcular la concentracin de protenas de una muestra problema mediante el mtodo de
Bradford.
Determinar la concentracin de protena total en una muestra considerando los factores de
dilucin.

ACTIVIDAD PRCTICA

Construccin de la curva de calibrado con BSA

Se preparan 100 l de cada dilucin de acuerdo a la siguiente tabla.

El stock de BSA utilizado est a 1 g/l.

Tubo BSA l H2O l Concentracin BSA g/ l

6 25 75 0.25
5 30 70 0.30
4 35 65 0.35
3 40 60 0.40
2 45 55 0.45
1 50 50 0.50
B ---- 100 0 (Blanco)

Se transfieren las soluciones a cubetas espectrofotomtricas.

Se agregan 1000 l de reactivo de Bradford a cada cubeta.
Se sellan las cubetas con parafilm, se homogeniza la solucin y se deja reaccionar por 3 minutos.
Se mide la absorbancia de cada cubeta a 595 nm. En un espectofotmetro.
Se construye una regresin lineal graficando Absorbancia v/s Concentracin de BSA.

Determinacin de la concentracin de protena total en la muestra :

Se pueden realizar diluciones de la muestra problema (Extracto proteico)

Tubo Extracto proteico H2O l

1 100 0
2 75 25
3 50 50
4 25 75
5 10 90
6 0 100

Se agregan 1000 l de reactivo de Bradford.

Se sellan las cubetas con parafilm, se homogeniza la solucin y se deja reaccionar por 3 minutos.
Se mide la absorbancia de cada cubeta a 595 nm.
Se calcula la concentracin total de protena, interpolando la absorbancia de la muestra en la curva
estndar.

Donde: y= absorbancia y = mx + n
 x= concentracin de protena.

Complete la siguiente tabla:

Reactivo Absorbancia Concentracin Factor de Concentracin

Muestra
H2O de dilucin de protenas
Tubo Problema
l Bradford real.
l
l
1 100 0 1000
2 75 25 1000
3 50 50 1000
4 25 75 1000
5 10 90 1000
6 0 100 1000

Preparacin del Reactivo de Bradford

50 mg de Azul de Comassie G 250 se disuelven en 25 ml de etanol al 95%
Se agrega 50 ml de cido orto-fosfrico al 85%
Se lleva la solucin a un matraz de aforo de 500 ml y se afora con agua destilada.
Se filtra la solucin a travs del papel filtro Whatman N1

REFERENCIAS
H. Lodish, A. Berk, L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore , J. Darnerll, 2002. Biologa
Celular y Molecular. Editorial Mdica Panamericana. Madrid-Espaa.
B. Albert, D. Bray, J. Lewis, 2000. Biologa Molecular de la Clula. Ediciones Omega S.A.,
Barcelona.
Farmacologa Molecular: Receptores, transduccin de seales y activacin de genes, 2000.
Marcelo Kazanietz. Ed. Universidad Nacional de Quilmes Argentina.
J. Kurjan y B. Taylor, 1993. Signal Transduction. Academic Press Inc. N.Y.
Abbas Abul K., A. H. Lichtman & Pober J. Inmunologa Celular y Molecular. 4 Edicin, 2002.
Ed. McGraw-Hill-Interamericana, Madrid, Espaa