UNIVERSIDAD JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOLOGIA MICROBIOLOGIA

Obtencin de frmacos a travs de microorganismos genticamente

modificados

Integrantes:
-
-
-

Tacna Per
2017
INTRODUCCION
 Contenido
CAPITULO I ..................................................................................................................................... 4
1. Qu es un microorganismo transgnico (MGM)? ................................................................. 4
2. Antecedentes de microorganismos transgnicos ..................................................................... 4
3. Creacin de microorganismos transgnicos ............................................................................ 5
4. Etapas en la clonacin de genes: ............................................................................................. 6
4.1. Obtencin y modificacin del gen de inters: ................................................................. 6
4.2. Eleccin del vector .......................................................................................................... 8
4.3. Recombinacin ................................................................................................................ 9
4.4. Introduccin del DNA Recombinante ........................................................................... 10
4.5. Deteccin del gen en las colonias (seleccin) ............................................................... 12
5. Aplicaciones de los microorganismos transgnicos en la medicina ...................................... 13
CAPITULO II.................................................................................................................................. 15
1. Produccin de insulina en E. Coli (intro) .............................................................................. 15
2. Insercin del gen de la insulina ............................................................................................. 15
2.1. La insulina: .................................................................................................................... 15
2.2. Gen de la insulina: ......................................................................................................... 18
3. Procedimiento ....................................................................................................................... 19
3.1. Corte del ADN: ............................................................................................................. 19
3.2. Ligamiento de ADN: ..................................................................................................... 20
3.3. Vector recombinante: .................................................................................................... 21
3.4. Formacin de colonias: ................................................................................................. 23
4. Medio de cultivo: .................................................................................................................. 24
5. Cultivo de crecimiento de E. coli.- ........................................................................................ 25
Capitulo III ...................................................................................................................................... 27
Conclusiones .................................................................................................................................... 29
Bibliografa ....................................................................................................................................... 29
 CAPITULO I

1. Qu es un microorganismo transgnico (MGM)?

Es aquel microorganismo al cual se le ha introducido un segmento de ADN de inters.

La mayora de MGM son bacterias unicelulares o levaduras. Las bacterias y levaduras
transgnicas se usan principalmente en la industria alimentaria, en la produccin de
aditivos alimentarios, aminocidos, pptidos, cidos orgnicos, polisacridos y
vitaminas. Tambin se han aplicado en procesos de biorremediacin y en medicina,
se emplean ampliamente para producir protenas de inters como por ejemplo, la
insulina. (Rodriguez, y otros, 2008)

Para producir una bacteria transgnica, se introduce un plsmido que contiene el

transgen y una secuencia que sirve para la seleccin de las bacterias transformadas.
Si la bacteria retiene el plsmido y si la protena que expresa el transgen no es txica
para su desarrollo, se obtiene una bacteria transgnica, con nuevas caractersticas
determinadas por el gen introducido. (Herveg & Barcia, 2006)

2. Antecedentes de microorganismos transgnicos

La modificacin gentica de la estructura microbiana que implica atenuacin de las

cepas salvajes, virulentas, del microorganismo de prueba, es un procedimiento
investigado desde hace aos con el propsito de obtener antgenos ms eficaces y
seguros. (Rodriguez, y otros, 2008)
En 1973 Herbert Boyer y Stanley Cohen crean el primer organismo transgnico,
injertan genes de resistencia a antibiticos a la bacteria E. coli.
Con este experimento demostraron que el gen para el ARN ribosomal de la rana poda
ser trasferido y expresado en una clula bacteriana. En primer lugar desarrollaron un
mtodo de transformacin de la qumica celular para Escherichia coli,despus
construyeron un plsmido, que sera el vector pSC101. Este plsmido contena un
lugar de unin para la Enzima de restriccin EcoRI y un gen de resistencia a la
 Tetraciclina. La enzima de restriccin EcoRI se utiliz para cortar el ADN de la rana
en pequeos segmentos. A continuacin, los fragmentos de ADN de rana se
combinaron con el plsmido, el cual tambin haba sido cortado con EcoRI. Los
extremos complementarios de los segmentos de ADN se alinearon y se unieron
mediante la accin de la ADN ligasa. Los plsmidos fueron trasferidos a un cultivo
de E. coli y puestos a crecer en un medio que contena tetraciclina. Las clulas que
incorporaron el plsmido con el gen de resistencia a la tretraciclina crecieron y
formaron colonias. Algunas de esas colonias estaban formadas por clulas portadoras
del gen de ARN ribosomal de la rana. (Claros, 2007)
El descubrimiento de que el pSC101 poda ser utilizado como un vector para
transportar una porcin de DNA extrao abri el camino para la produccin de
mltiples copias de segmentos especficos de DNA, en cantidades lo suficientemente
grandes para ser analizadas por mtodos bioqumicos. Estas copias mltiples se
conocen como clones, vocablo que desde siempre se ha aplicado a bacterias y otros
organismos genticamente idnticos producidos por reproduccin asexual a partir de
un nico individuo progenitor. Stanley Cohen y Herbert Boyer logran incorporar un
gen especfico en una bacteria y se inicia as la era de la ingeniera gentica. En este
ao se patent por primera vez en los Estados Unidos una tcnica de recombinacin
gentica. (Curtis, Barnes, Schnek, & Flores, 2008)

3. Creacin de microorganismos transgnicos

De manera general en el caso de una bacteria, el gen de inters se incorpora en un

plsmido (ADN circular extracromosmico capaz de autoreplicarse) y se incuba junto
con la bacteria bajo condiciones especficas que favorecen la entrada del plsmido en
el interior de la bacteria. Si la bacteria retiene el plsmido y la protena que expresa
el gen de inters no resulta txica para su desarrollo, se obtiene una bacteria
transgnica, con nuevas caractersticas determinadas por el gen introducido. La
bacteria ms utilizada es la Escherichia Coli ( E. Coli).
No obstante y a pesar que su fcil manipulacin, las bacterias no es siempre la mejor
eleccin para producir protenas humanas. Algunas de stas no son funcionales si no
estn glicosiladas, es decir, si no se aaden azcares a la cadena de aminocidos, y
 este proceso no lo pueden llevar a cabo las bacterias. En estos casos se utilizan
levaduras transgnicas, que s son capaces de glicosilar. La produccin de levaduras
transgnicas implica tambin el empleo de plsmidos, siendo la levadura
Saccharomyces cerevisiae (responsable, entre otros procesos, de la fermentacin del
pan) la especie ms empleada.

4. Etapas en la clonacin de genes:

Se describen 6 etapas a continuacin:

4.1. Obtencin y modificacin del gen de inters:

Se integra el gen en una composicin gnica en ambos extremos de ese gen

de inters tiene que tener un promotor que permita que la ARN polimerasa
haga la transferencia correcta, al final tiene que haber una secuencia que
controle hasta donde ser copiado el gen. (IES-Manuel Romero, 2012)

4.1.1. Mtodos de aislamiento del gen:

Mtodo directo:
Se localiza la clula requerida, se aisla el ADN completo y este es
roto mediante endonucleasas de restriccin. Cada fragmento es
clonado en un vector e introducido en una clula compatible.
Finalmente se obtendr una genoteca, que contendr todo el
genoma de la clula. De todas las clulas que contienen plsmidos
con fragmentos del genoma donador, slo una tiene el gen de
inters. Dado que las endonucleasas de restriccin cortan al azar,
es probable que el fragmento este el gen de inters. (IES-Manuel
Romero, 2012)

Retrotranscripcion:
Se usa una enzima sobre el RNAm que est en el citoplasma y ya
ha sido modificado, se eliminan las secuencias no codificantes;
este primer transcrito ya es completo, una vez que sale del ncleo
solo tenemos la secuencia modificada, flanqueado por el promotor
y el terminador; al obtener este RNAm maduro solo se obtiene el
material gentico que codifica; solo es de inters la secuencia a
traducir.
El RNAm maduro al entrar en contacto con la RT
(Del retrovirus) produce el DNA, primero una cadena y luego se
copia a s misma y destruye el RNA; as se obtendr como una U,
una cadena nica de DNA con dos cadenas complementarias y una
cadena sencilla, esta se romper con una nucleasa de cadena
sencilla. (IES-Manuel Romero, 2012)
PCR
Esta tcnica "in vitro" imita la habilidad natural de la clula de
duplicar el ADN.
Usada para crear un gran nmero de copias de un segmento de
ADN, que utiliza ciclos de desnaturalizacin, apareamiento
con cebadores y extensin por una ADN polimerasa
termoresistente.
Tcnica enzimtica tambin, en la que necesitamos saber solo
para conocer un gen un primer (Secuencia de inicio) y la
secuencia final
Se necesita una mezcla de reaccin que contenga Taq
polimerasa, cebadores o primers (marcan que se va a
seleccionar) y los nucletidos trifosfato. El aparato usado es el
termociclador. (Future-Medicos, 210)
 Figura 01: Corte de ADN cromosmico con una
endonucleasa de restriccin

4.2. Eleccin del vector

Este vector permite que entre el ADN en la clula y que el ADN que se ha
construido se mantenga estable y que se reproduzca de manera sincrnica con
el material celular. Si no existiera el vector, al dividirse de forma no sincrnica
solo una clula Heredar el fragmento de DNA introducido y al avanzar las
generaciones se habr perdido.
Los plsmidos actan como replicones, y no existen plsmidos naturales que
nos sirvan como vectores, luego se construyeron los vectores, cogiendo
fragmentos de distintas partes de plsmidos o de transposones para montar
uno con las caractersticas interesantes
Los vectores deben portar genes marcadores (de resistencia a antibiticos o de
bioluminiscencia), que rpida y fcilmente identifiquen las clulas que
contienen el vector.
Para insertar el gen en el vector, primero se corta el ADN (que suele ser
circular) por medio de enzimas de restriccin. ADN ligasas unen el ADN con
el gen que se desea clonar al vector de clonacin.
Se obtiene una molcula de ADN recombinante, con fragmentos de ADN de
distinta procedencia. (Future-Medicos, 210) (IES-Manuel Romero, 2012)
4.3. Recombinacin

Uso de la misma endonucleasa de restriccin:

Basado en las endonucleasas de restriccin, hay tres tipos, I, II, III. El I y
el III no sirven en el laboratorio ya que estn integradas en un complejo
multiproteico
Este sistema tiene una endonucleasa (rompen) y una metilasa (colocan
metilos en ciertas posiciones), si no est el DNA metilado de forma
parecida, las endonucleasas lo rompen. Pueden generan extremos romos
(cortan al segundo nivel), o extremos con colas cohesivas (no al mismo
nivel, sino en diferentes pares- corte asimtrico, quedan colas
monocatenarias complementarias) esto ltimo es lo que permiti la
recombinacin.
Usar plsmidos con un coli linker
En esos vectores de clonacin les voy a meter un fragmento de ADN
conocido con el nombre de coli linker, que contiene en un espacio muy
pequeo de ADN una secuencia muy corta, contiene secuencias de
reconocimiento para decenas de endonucleasas de restriccin, con esto
garantizo poder cortar el vector en el punto que a m me interesa, por tanto
va a ser muy difcil que no pueda utilizar la endonucleasa de restriccin
en el vector y en el pasajero
Para unir los fragmentos de DNA al vector utilizamos las DNA ligasas:
Para ello hay que tener en cuenta los extremos que se nos han originado
a partir de la accin de los enzimas de restriccin. Como hemos dicho
antes los extremos pueden ser cohesivos y romos (en donde la eficacia es
menor), ya que la unin de los extremos cohesivos se ve facilitada por las
secuencias complementarias que se van a poder aparear. (IES-Manuel
Romero, 2012)
 Figura 02: Accin de la endonucleasa de restriccin

4.4. Introduccin del DNA Recombinante

Una vez que se encuentre unido el DNA recombinante y el vector e se utilizan
distintas tcnicas, entre ellas estn:
Choque osmtico y choque trmico:
La poblacin de clulas pasa a un medio con una concentracin salina alta
y las enfro, de manera que se permeabilice la clula y en ese estado se
podr introducir el material gentico.
Electrooracin:
Consiste en la accin de un breve pulso elctrico, que permeabiliza las
membranas, al hacer que se formen poros en las mismas, permitiendo la
entrada en la clula de molculas de DNA grandes e incluso de partculas
vricas.
 Es un mtodo bastante ineficaz puesto que de cada 1000 clulas, slo una
de ellas recibe el DNA. Segn el tamao de la clula se necesita mayor o
menor voltaje de modo que cuanto ms pequea es la clula, mayor
voltaje se necesita para que se formen los poros en la membrana. Cuando
cesa el pulso elctrico, los poros se cierran.
Mtodo basado en la transduccin:
Se utiliza un virin como un sistema de transporte e inyeccin de ADN.
Esto se consigue teniendo virus efectivos (dos o tres tipos), que ninguno
de ellos sean capaces de formar una partcula viral completa porque le
faltan protenas necesarias, pero que la suma de todos ellos formen la
suma de las protenas necesarias. Las protenas una vez completas se
autoensamblan y adems introducen dentro de la cabeza ese material
gentico, obteniendo as pseudoviriones. Ese virin se va a comportar
idnticamente igual que uno normal, se une a la clula y va a inyectar el
ADN, esta tcnica es muy eficiente, pero es costosa de realizar por ese
motivo ha cado en desuso.
Can de genes:
Consiste en disparar bolitas de oro recubiertas de ADN a clulas. Se
utiliza con mucha frecuencia en biologa vegetal.
Este material gentico impulsado por la mquina mediante
recombinacin (no muy bien conocido) introduce los genes en las clulas
diana. (Brizzi, 2013)
 Figura 03: Can de genes

4.5. Deteccin del gen en las colonias (seleccin)

Es fcil si hay genes reporteros. Se utilizan metodologas que nos permiten
detectar el gen sin necesidad de marcadores o de reporteros

Se cultivan clulas que hemos sometidas a los procesos de transformacin y

sobre ellas se coloca un papel de nitrocelulosa para que se adhieran todas las
colonias que han crecido en la placa. A continuacin sobre este papel liso las
clulas con lisozimas y detergente, solo es de inters el ADN, lo que se quiere
es detectar un fragmento de ADN (el de inters), les por eso que procedemos
desnaturalizar el ADN, es decir, calentarlo, para que se deshaga la doble
hlice. Se utiliza nitrocelulosa porque a esta se adhiere muy bien el ADN y as
se puede lavar y eliminar lo que no es de inters. (Future-Medicos, 210)

Por tanto tenemos ADN de cadena sencilla adherido a la nitrocelulosa

procedente de cada una de las colonias. Se vierte sobre el papel de
nitrocelulosa el nuevo ADN sinttico, para que se hibride el gen que
queremos, este se tie, por tanto ya se en que colonia esta mi gen. Se puede
hacer mediante tcnicas inmunolgicas detectando el producto del gen, con
una base diferente para pegar protenas y en vez de introducir ADN hbrido
tendra que introducir anticuerpos de protenas. Este sistema dura das, pero
 nos permite identificar las colonias que tienen el gen que se ha trabajado (el
de inters).

Es de importancia que la bacteria sea capaz de producir y exportar el producto

del gen de forma activa, esto ocurre con la insulina porque es una molcula
sencilla. (Future-Medicos, 210)

Figura 04: Seleccin de las colonias

5. Aplicaciones de los microorganismos transgnicos en la medicina

La industria farmacutica ha optado por el camino de la ingeniera gentica o
metodologa del ADN recombinante. Mediante esta metodologa es posible obtener
enormes cantidades de una protena, aislada de todos los componentes celulares del
organismo de origen. Esto se consigue por introduccin y expresin del gen de inters
en un organismo hospedador fcil de cultivar. (PQBio-Programa educativo de
ArgenBio, 2007)
 Los microorganismos transgnicos se pueden utilizar para obtener protenas
teraputicas humanas, como es el caso de la Insulina humana producida en bacterias
de E. Coli. Tambin se utiliza esta bacteria para producir Hormona de crecimiento
humana, empleada para tratar nios con enanismo. Los microorganismos
transgnicos tambin se utilizan en medicina para la produccin de vacunas y
anticuerpos. (Brizzi, 2013)
Se obtienen con preparaciones de agentes patgenos muertos y atenuados, para
inducir inmunidad frente al germen activo.
Actualmente se obtienen mediante ingeniera gentica, clonando los genes que
codifican la protena que acta como antgeno.
Esa protena se introduce en bacterias no patgenas, que, al incorporar ese gen a su
cromosoma, fabrican grandes cantidades del antgeno.
ste se aisla y purifica, utilizndose directamente como una vacuna que desarrollar
la respuesta inmune, sin problemas de posibles infecciones, como sucede con las
vacunas tradicionales en algunas ocasiones.

PRODUCTO INDICACIN TERAPUTICA

Factores de coagulacin Hemofilia
Insulina Diabetes mellitus
Hormona de crecimiento Deficiencia de la hormona en nios
Eritropoyetina (EPO) Anemia
Interfern alfa Hepatitis B y C, cncer
Vacuna anti-hepatitis B Inmunizacin contra hepatitis B
Anticuerpos monoclonales recombinantes Asma, artritis reumatoidea
Protena C Sepsis severa
Beta-glucocerebrosidasa Enfermedad de Gaucher
DNAsa Fibrosis qustica

Cuadro 01: Indicacin teraputica de cada producto transgnico

 CAPITULO II

Los medicamentos que se venden en la farmacia se producen de diversas maneras. Las

molculas simples se producen por sntesis qumica, mientras que las molculas complejas
generalmente deben ser purificadas a partir de microbios, plantas o animales. Los
inconvenientes de esta estrategia son los bajos rendimientos de produccin y el riesgo de
contaminacin del frmaco con toxinas o patgenos, como los virus.
Es por eso que en el caso de medicamentos proteicos, la industria farmacutica ha optado por
el camino de la ingeniera gentica o metodologa del ADN recombinante. Mediante esta
tecnologa se pueden obtener grandes cantidades de una protena, completamente aislada de
los componentes celulares del organismo de origen.
Esto se consigue por introduccin de un gen en un organismo hospedador fcil de cultivar,
este organismo se denomina entonces "organismo genticamente modificado" y la protena
obtenida, "protena recombinante".

1. Produccin de insulina en E. Coli (intro)

El uso de la bacteria ms comnmente empleada en la elaboracin de insulina por varios
aos atrs fue con la insercin de vectores que se empleaban con secuencias de ADN que
codificaban la pro-insulina que es la forma de la insulina antes que esta se active perdiendo
su pptido C y hacindole funcional para el organismo destinado en forma de inyecciones
con una determinada concentracin en ampollas comerciales para los casos de diabetes
mellitus de clase II. (Figura 01)

2. Insercin del gen de la insulina

2.1.La insulina:
Es un poli pptido producido y secretado por las clulas beta del pncreas, es una
hormona esencial para el crecimiento somtico y desarrollo motriz; desempea un
papel muy importante en la regulacin del metabolismo de carbohidratos, grasas y
protenas. Se sintetiza a partir de una pre-hormona de 81 residuos de aminocidos que
se denomina proinsulina (Figura 02).
(Figura 1)

La liberacin de insulina por la clula beta se presenta en dos fases. La primera fase
o fase temprana se inicia al primer minuto posterior a la estimulacin por glucosa, su
pico mximo es entre 3 a 5 minutos, tiene una duracin mxima de 10 minutos y
representa la insulina almacenada en los grnulos de la clula beta. La segunda fase
o fase tarda inicia en forma lenta (a los 10 minutos), tiene una duracin de 4 horas (o
mientras persista la hiperglucemia), tiene una produccin continua en forma de
meseta con descenso lento y representa la insulina de nueva sntesis y produccin.

La insulina se produce en el Pncreas en los Islotes de Langerhans, mediante unas

clulas llamadas Beta, cuyo gen responsable de la sntesis est en el brazo corto del
cromosoma 11.
Las clulas beta fabrican insulina en diferentes etapas.
La primera es que la insulina se sintetiza en los ribosomas del retculo endoplsmico
rugoso de las clulas beta de los islotes, como pre-pro-insulina, que tiene 109
aminocidos. Este precursor pierde enzimticamente algunos aminocidos, y se
transforma en proinsulina de 83 aminocidos de cadena nica en espiral.

La segunda es que la proinsulina, se transforma en insulina en el aparato de Golgi de

las clulas beta, por un proceso enzimtico que genera cantidades equimolares, de
insulina y un pptido conector o pptido C. Este pptido C est formado de 32
aminocidos distribuidos en dos cadenas poli peptdicas A y B, una de 21
aminocidos y otra de 30, unidas por dos puentes de disulfuro.
(Contretas Sanchez, 2008)

Adicionalmente, existe captacin de zinc, formndose molculas de zinc-insulina.

Siguiente el pptido C se acumula en grnulos secretorios ligados al aparato Golgi,

en el citoplasma celular, la progresin de estos grnulos hacia la membrana
plasmtica, se hace a travs de micro tbulos impulsados por filamentos ciliares
contrctiles y gradientes de potencial electroqumico.

Para que finalmente los grnulos se fusionan a la membrana celular y son secretados
por exocitosis con participacin del calcio como activador de los microtbulos, K, y
Zn. La insulina en forma de monmeros, junto al pptido C, estos son difundidos
hacia los capilares en forma equimolar.

(Figura 03)
 2.2.Gen de la insulina:
Ubicacin del gen de la insulina se encuentra en el gen 11 del cromosoma humano,
la proinsulina, precursora de la insulina, es codificada por el gen INS, localizado
en el cromosoma 11p15.5. (Figura 04)

Figura 04

1 agccctccag gacaggctgc atcagaagag gccatcaagc agatcactgt ccttctgcca

61 tggccctgtg gatgcgcctc ctgcccctgc tggcgctgct ggccctctgg ggacctgacc
121 cagccgcagc ctttgtgaac caacacctgt gcggctcaca cctggtggaa gctctctacc
181 tagtgtgcgg ggaacgaggc ttcttctaca cacccaagac ccgccgggag gcagaggacc
241 tgcaggtggg gcaggtggag ctgggcgggg gccctggtgc aggcagcctg cagcccttgg
301 ccctggaggg gtccctgcag aagcgtggca ttgtggaaca atgctgtacc agcatctgct
361 ccctctacca gctggagaac tactgcaact agacgcagcc cgcaggcagc cccacacccg
421 ccgcctcctg caccgagaga gatggaataa agcccttgaa ccagcaaaa
3. Procedimiento
Si se utiliza un plsmido como vector, el procedimiento precisan varios pasos:

3.1.Corte del ADN:

Corte del ADN que se va a clonar se asla y se trata con una enzima de restriccin
para crear fragmentos que acaben en secuencias especficas.
Se utilizan enzimas especiales para insertar genes del ADN de las bacterias. Los genes
humanos hacen que las bacterias elaboren un nuevo material, que no eran capaces de
producir con anterioridad. En condiciones adecuadas los microbios se multiplican
rpidamente, de modo que se puede producir una gran cantidad de la nueva sustancia
en corto periodo de tiempo. De esta manera los genes que controlan la produccin de
insulina humana, se pueden colocar en una clula bacteriana, con el fin de que los
microbios produzcan la insulina humana. Despus esta sustancia es extrada del
cultico de bacterias y preparada para su posterior uso en medicamentos.
(Contretas Sanchez, 2008)

La piedra angular de la tecnologa del DNA recombinante es un tipo de enzimas

denominadas endonucleasas de restriccin. Estas enzimas, aisladas en bacterias,
reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones vricas
degradando el cido nucleico invasor. Las enzimas de restriccin reconocen una
secuencia especfica de nucletidos (denominada sitio de restriccin) de una molcula
de DNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia.(Figura 05)
 (Figura 05)
La enzima de restriccin
EcoRI reconoce y se une
a la secuencia
palindrmica GAATTC.
El corte del DNA en este
sitio produce colas de
cadena sencilla
complementarias. La
colas de cadena sencilla
resultantes pueden unirse
con colas
complementarias de otros
fragmentos de DNA para
formar molculas de
DNA recombinante.

3.2.Ligamiento de ADN:
Estos fragmentos se ligan a molculas de plsmido que han sido cortadas con la
misma enzima de restriccin, obtenindose un vector recombinante.
La enzima EcoRI corta las cadenas de manera escalonada dentro del sitio de
reconocimiento, dejando extremos de cadena sencilla. Estas colas, que tienen
secuencias nucleotdicas idnticas, son pegajosas (cohesivas), ya que pueden unirse
a colas complementarias de otros fragmentos de DNA mediante puentes de hidrgeno
(Figura 06). Si molculas de DNA de diferente origen comparten los mismos sitios
de reconocimiento palindrmicos, ambas tendrn colas complementarias de cadena
sencilla cuando se traten con una endonucleasa de restriccin. Si estos fragmentos se
ponen juntos bajo determinadas condiciones, los fragmentos de DNA de distinto
origen pueden formar molculas recombinantes estableciendo puentes de hidrgeno
entre los extremos cohesivos. Luego se utiliza la enzima DNA ligasa para unir
covalentemente los esqueletos azcar-fosfato de los dos fragmentos, producindose
as una molcula de DNA recombinante.
 (Figura 06)

Los fragmentos de ADN

recombinantes permiten
formar nucletidos
complementarios unindose
los enlaces gap compuestos
por enlaces fosfodiester

DNA ligasa une los

segmentos pegajosos.

Figura 06.- Para formar molculas de DNA recombinante, se corta DNA de distintas fuentes con
EcoRI y se mezcla para que se unan formando molculas recombinantes. Despus se utiliza la
enzima DNA ligasa para unirlos covalentemente en molculas de DNA recombinante.

3.3.Vector recombinante:
El vector recombinante se transfiere a clulas husped bacteriano, generalmente por
transformacin, un proceso en el que las molculas de DNA cruzan la membrana de
la clula husped transfirindose a su interior.
 (Figura 07)

(Figura 08)
3.4.Formacin de colonias:
La clula husped se hace crecer en una placa de cultivo, donde formar colonias.
Puesto que las clulas de cada una de las colonias provienen de una sola clula
inicial, todas las clulas de la colonia, y los plsmidos que contienen, son
genticamente idnticas, o clones. Se rastrean las colonias para identificar las que
han incorporado el plsmido recombinante. Los vectores plasmdicos penetran en
las clulas de E. coli mediante un proceso de transformacin inducido por cloruro
clcico o mediante electroporacin a 3-24 kV /cm, que es eficaz en bacterias tanto
Gram-positivas como Gram-negativas.
Un paso importante para alcanzar altas productividades consiste en la seleccin de la
cepa de produccin adecuada. Para ello deben considerarse aspectos cinticos, el
genotipo y el fenotipo de las cepas. En general se buscan cepas con baja tasa de
mutacin o de insercin de secuencias provenientes del plsmido. Las cepas derivadas
de E. coli K-12 y E. coli B son las mas empleadas. Los avances en el conocimiento
de la fisiologa de E. coli y en el desarrollo de herramientas moleculares han permitido
la obtencin de cepas diseadas especficamente para la produccin de protena
recombinante. En particular, la cepa BL21 es preferida en el mbito industrial. (Phue
y col., 2005).
 (R. Murray, S, Rothensal, & A,
Pfaller, 2013)
Despus de asegurarse de que el
gen transferido se expresa, se
producen grandes cantidades de la
bacteria transformada, y la
protena humana se recupera y se
purifica.
(Contretas Sanchez, 2008) (L.
Lara, 2011)

4. Medio de cultivo:
El medio de cultivo debe estar balanceado para la produccin de biomasa y PR. Para ello,
debe tomarse en cuenta la composicin de la biomasa.
Los principales componentes incluyen la fuente de carbono, nitrgeno, fosforo, azufre,
potasio, y magnesio. Es necesario tambin incluir cofactores enzimticos como Mb, Co,
Ni, Fe, Ca, Cu, Mn, entre otros. Los factores de crecimiento como la tiamina son
necesarios para un adecuado crecimiento. Aunque en cultivos en matraz agitado se
agregan mono y di fosfato de potasio para formar un amortiguador de pH, esto no es
necesario en cultivos en biorreactor, en los que el pH es controlado mediante la adicin
de acido o base. Tambin debe observarse que varios de los componentes del medio
pueden resultar txicos a ciertas concentraciones; por ejemplo, el amonio es toxico a partir
de 3 g/L (Shiloach y Fass, 2005). Esta cantidad de amonio puede ser limitante para cultivos
de alta densidad celular si se agrega en su totalidad al inicio del cultivo. Sin embargo, el
pH puede controlarse con hidrxido de amonio, que adems de servir como base es una
fuente de amonio fcilmente asimilable, reduciendo con ello la acumulacin de iones
amonio. El medio de cultivo puede contener fuentes complejas de nitrgeno, como
 extracto de levadura o casaminoacidos. No obstante, existe una clara tendencia a eliminar
el uso de componentes complejos, ya que no permiten un control adecuado de la fisiologa,
y reducen la reproducibilidad del cultivo.
Tomando en cuenta un rendimiento de biomasa tpico de 0.5 g biomasa/g glucosa, se
requeriran al menos 200 g/L de glucosa para llegar a una concentracin celular de 100
g/L. La glucosa es toxica a concentraciones superiores a los 50 g/L, por lo que no puede
emplearse una concentracin de glucosa inicial tan alta (Shiloach y Fass, 2005; Lara y
col., 2008).

5. Cultivo de crecimiento de E. coli.-

Agar nutritivo (AN). Es un medio slido complejo de uso general para el cultivo de
bacterias.

El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo
de bacteria. Es muy util porque permanece solido incluso a relativas altas temperaturas.
Adems, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se
distinguen mejor las colonias pequeas. En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el
lquido, y aparece como una sustancia espesa, con colonias difcilmente observables. El
agar nutritivo contiene normalmente (w/v).

0.5 % Peptona
0.3 % extracto de carne/extracto de levadura
1.5 % agar 0.5% NaCl
Agua destilada
pH casi neutro (6.8) a 25 C.

La biotecnologa est presente en la vida cotidiana, y ofrece sus beneficios. La salud

humana es uno de los aspectos que se ha visto favorecido a partir de los avances cientficos
logrados en las ltimas dcadas.
En la actualidad, varios laboratorios farmacuticos producen insulina humana, tanto a
partir de levaduras, como de bacterias (Escherichia coli); y sin ningn riesgo para la salud,
es decir que la vida de millones de diabticos en el mundo depende de la insulina humana
recombinante.

Hoy en da, prcticamente todos los diabticos son tratados con algn tipo de insulina
recombinante, pues se han conseguido numerosos anlogos con diferentes cualidades (de
efecto retardado, ms potente).

(Figura 10)

No obstante, la investigacin no termina aqu. En los ltimos aos se est consiguiendo

que otros organismos genticamente modificados produzcan insulina humana, con
numerosas ventajas. Por ejemplo, cientficos argentinos han obtenido vacas transgnicas
que producen leche enriquecida en pro-insulina humana5, que evitaran tener que purificar
la protena, pues nicamente habra que consumir la leche. Lo mismo ocurre con el
crtamo (Carthamus tinctorius L., azafrn bastardo), que se ha modificado para que
produzca insulina humana en sus semillas6.
 Capitulo III

Insulina

Hormona de crecimiento

Desde 1997, aplicando la tecnologa de ADN recombinante, BioSidus produce hGH (hormonas
decrecimiento) a partir de la fermentacin de bacterias que poseen el gen humano para
dichaprotena. (Castro, Vera, & Paez, 2013)

El segundo producto recombinante que entr en el mercado farmacutico fue la hormona de

crecimiento humana (hGH). Debido a un fallo de diseo la primera hGH fue sintetizada en 1985
por Genentech en E. coli con una metionina adicional en posicin N-terminal, por lo que no era
exactamente igual a la hormona natural, que comienza por una fenilalanina.

Esto motiv que, con posterioridad, otras compaas farmacuticas pudieran comercializar sin
problemas de patentes la verdadera hGH que se produca en E. coli mediante un nuevo proceso
que implicaba la secrecin de la hormona al periplasma bacteriano y evitaba la presencia de la
metionina N-terminal.

La HGHr ha sido tambin producida en otros hospederos de tipo bacteriano, as como en

levaduras, hongos y clulas de mamfero. Los rendimientos obtenidos y los niveles de expresin
encontrados han sido muy variables. La HGHr ha sido producida en S. cerevisiae en donde
Tokunaga report en 1985 de 1.4 a 4.7 molculas por clula (2.5 a 8.5 mg/L) y en Pichiapastoris se
obtuvo la HGHr secretada al medio de cultivo con niveles de produccin de 12.3 mg/L . En 1991,
Franchi y col. report una produccin de HGHr hacia el medio de cultivo en Bacillus subtilis de 35
mg/L. (Garcia, 2010)

Vacuna anti-hepatitis B

La primera vacuna recombinante que se aprob para su uso farmacutico fue la vacuna contra el
virus de la hepatitis B. Hasta entonces la vacunacin contra esta enfermedad se haca con virus
atenuados. La vacuna recombinante se produce en levaduras recombinantes que portan un gen
que codifica una protena de la cubierta del virus. Algunas toxinas que se utilizan para vacunas
tambin se obtienen actualmente mediante Ingeniera Gentica. La categora ms importante de
los productos biofarmacuticos que estn actualmente en desarrollo es el de las vacunas, con casi
100 productos diferentes. La mayora se estn desarrollando para tratar o prevenir el cncer. El
resto se estn desarrollando contra el SIDA y diferentes infecciones, fundamentalmente del
aparato respiratorio. (Garcia, 2010)

Anticuerpos monoclonales recombinantes

Los anticuerpos se producen en organismos transgnicos y en biorreactores tanto con bacterias

como con clulas de mamfero.

Los organismos transgnicos (ratn, cabra, pollo, plantas) y las clulas recombinantes de mamfero
(CHO, NS0) son los ms adecuados para producir anticuerpos completos. Las bacterias slo
permiten obtener de forma muy eficiente fragmentos de anticuerpos. Una alternativa para
producir anticuerpos humanos completos es utilizar lo que se denomina presentacin en
bacterifagos (phage display). El producto inicial es un fragmento Fv de cadena simple (scFv) en el
que un pequeo polipptido se utiliza para unir las regiones variables de las cadenas ligera y
pesada del anticuerpo, o un fragmento Fab a partir de los cuales se debe reconstruir un anticuerpo
completo y producirlo mediante un sistema de expresin idneo. (Garcia, 2010)

TNF-

El Factor de Necrosis Tumoral alfa (FNT-) es una citoquina pro-inflamatoria y de defensa del
husped, cuya produccin exagerada lleva a enfermedades inflamatorias crnicas.

El FNT- fue nombrado as por su habilidad para destruir clulas tumorales y causar necrosis
hemorrgica en tumores en ratones. (Vargas, 2009)

Son muchas las protenas de inters teraputico que se estn produciendo por tecnologas
recombinantes y que no son fciles de clasificar entre los anteriores epgrafes. Un caso tpico es el
TNF (factor de necrosis tumoral) que es una citotoxina producida de forma natural por macrfagos
activados que es capaz de provocar la muerte de los tumores.

Actualmente, se comercializa gracias a que se produce de forma recombinante en E. coli y se

utiliza como anticancergeno (Garcia, 2010)

Uricasa

Conocida con el nombre de Fasturtec es un enzima recombinante urato-oxidasa obtenida a partir

de una cepa de Saccharomyces cerevisiae genticamente modificada. Rasburicasa es una protena
tetramrica con subunidades idnticas con un peso molecular de aproximadamente 34 kDa. La
rasburicasa se produce por ingeniera gentica en una cepa de Saccharomyces cerevisiae, regula el
cido rico en plasma (Agencia Europea de medicamento, 2006)

Albmina humana recombinante Hipovolemia, Hemodilisis Albagen (New Century

Pharmaceutical) S. cerevisiae Desarrollo

El papel de albmina como una molcula portadora y su naturaleza inerte son las propiedades
deseables para ser usado como un estabilizador y transportador de polipptidos. El uso de
albmina como un componente de una protena de fusin para otras protenas estabilizadoras ha
sido descubierto en WO 93/15199, WO 93/15200, y EP 413 622. El uso de fragmentos N - terminal
de HSA para fusiones de polipptidos tambin ha sido descubierto (EP 399 666).

La fusin para dichos polipptidos es lograda por manipulacin gentica, de forma que el ADN que
codifica para HSA, o un fragmento de ella, es unido al ADN que codifica para dicho polipptido. Un
hospedero apropiado es luego transformado o transfectado con la secuencia del nucletido
fusionado, tal arreglo sobre un plsmido apropiado para expresar un polipptido de fusin.
Nomura y col. (1995) intent expresar la apolipoprotena E humana en S. cerevisiae como una
protena de fusin con HSA o fragmentos de HSA, usando una pre-secuencia de HSA por secrecin
directa

http://www.espatentes.com/pdf/2264146_t3.pdf

PEG-L-asparaginasa Leucemia linfoblastoide Oncaspar (Enzon, Inc., Rhone- Poulenc Rorer) E. coli
1994

Conclusiones

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