ehnici speciale utilizate in biologia celulara si moleculara CULTURI CELULARE

Ce sunt culturile celulare? Culturile celulare reprezinta cultivarea in vitro a

unor fragmente de tesut sau a unor suspensii celulare;naturale sau
obtinute prin tehnici de laborator ,in scopul muliplicarii celulare.
Tipuri de culturi de celule Dupa felul substratului Dupa modul de initiere
a culturii Dupa tipul de material biologic cultivat
A.Dupa felul substratului Pe suport organic nutritiv Pe suport
organic nenutritiv Pe suport anorganic In suspensie in mediul lichid
B.Dupa modul de initiere al culturii Culturi initiate cu fragmente de tesut
a)pe suport nutritiv: -culturi in picatura suspendata -culturi in flacoane
-culturi in tuburi rotate b)pe suport nenutritiv c)in suspensie in mediu
lichid(dar in acestcaz se obtine numai supravietuirea celulelor)
B.Dupa modul de initiere al culturii Culturi initiate cu celule dispersate
Culturi de celule libere in mod natural(culturi de leucocite din sangele
periferic,de elemente hematopoietice din maduva osoasa sau de celule
recoltate din exudat) Culturi de celule obtinute prin dispersia celulelor din
fragmente de tesut
C.Dupa tipul de material biologic cultivat Culturi de organe -reprezinta
scoaterea din organism a unui fragment de organ si introducerea acestuia
intr-un mediu nutritiv Culturi de celule -cultura de tesuturi -cultura celulara
propriu-zisa(asocierea factorilor chimici-enzime etc)
MATERIALE DE LUCRU Cultrile celulare se prepara intr-un spatiu de
lucru steril,amenajat special ce include: -instalatie de apa curenta -gaze
-electricitate
Nevoile de baze: Arie de lucru sterila Sticlarie ,instrumente fine
Dispozitive de curatat si sterilizat Recipiente de stocare pentru
mediu,ser,sticlarie Incubator si hota cu flux laminar Sursa de apa
Mocroscop,agitator magnetic, balanta analitica Substante chimice
Regulile tehnicilor aseptice Accesul limitat in zona de culturi celulare
Suprafetele se decontamineaza cu etanol 70%inainte si dupa utilizare Nu
se pipeteaza cu gura, nu se mananca,fumeaza in zona de lucru Hainele
de protectie se folosesc numai in cadrul incintei,fiind interzisa purtatrea lor
si in afara ei Se spala mainile inainte si dupa peratii,iar parul se leaga
Se controleaza emisiile de aer, se sterilizeaza incinta cu lampi UV
MEDIILE DE CULTURA CELULARA Aceste medii trebuie sa asigure:
Echilibru ionic(obtinut cu substante izotone) pH optim(mentinut cu
substante tampon) Temperatura optima Elemente nutritive indispensabile
metabolismului (proteine animale ,aminoacizi esentialai si grasimi)
Evitarea contaminarii cu germeni patogeni prin adaugarea de antibiotice si
antifungice Stimularea multiplicarii si cresterii celulelor prin adaugare de
extracte embrionare
Medii de cultura celulara CLASIFICARE: Dupa consistenta: -lichide
-semilichide Dupa compozitie: -naturale -semisintetice -sintetice Dupa
valoarea urmarita si dupa scopul nutritiv: -medii de crestere -medii de
mentinere
Medii de cultura celulara CONTINUT: O solutie salina -solutie tampon +
indicator Elemente proteice -ser,plasma,lichid amniotic,aminoacizi
Elemente stimulatoare ale cresterii Vitamine Antibiotice
Tehnica culturii celulare Recoltarea se face din variate tesuturi provenite de
la om,animal,insecte,plante;in functie de aceasta provenienta se impart in :
Tesuturi normale: -embrionare -adulte Tesuturi tumorale
Tehnica culturii celulare Pentru recoltare sunt indeplinite anumite conditii
,acestea sunt: Sa se evite contaminarea tesuturilor cu microorganisme
prin respectarea riguroasa a asepsiei Sa se evite traumatizarea in timpul
recoltarii si in cursul manevrelor ulterioare Sa se realizeze cat mai curand
dupa deces De la recoltare si pana la prepararea culturii tesutul s
epastreaza la rece, intr-o solutie salina cu antibiotice,timp de 3-4 ore
1.Tesuturi embrionare umane In acest caz recoltarea se face de la
embrioni de 1-3 luni.Acesta se depoziteaza intr-un cristalizor steril,cu capac
ce contine o solutie salina cu antibiotice Initial tegumentul embrionului
este considerat contaminat,iar sterilizarea se realizeaza cu alcool iodat cu
precautia ca acesta sa nu patrunda in cavitatile embrionului. Fragmentele
de tesut embrionar curate se in alta cutie Petri sterila cu solutie alcalina
dupa ce au fost inlaturate cheagurile de sange prin intermediul unor pense
sterile.
 Dupa ultima spalare fragmentele se aseaza intr-o eprubeta de centrifuga
sterila iar prin intermediul unor foarfeci sterili bine ascutiti se obtine o masa
cu aspect omogen Sub actiunea tripsinei si a agitarii celulele se separa
,iar actiunea acestora se sfarseste in momentul in care solutia se
raceste.Separararea celulelor de tripsina se realizeaza prin centrifugare
Cu o pipeta Pasteur se recolteaza o cantitate de suspensie de tesut
embrionar si se intinde pe un recipient de cultura
 Recipientul se lasa cu suprafat ccu suspensie in jos la o temperatua de
37,timp de 30- 60 de minute. Dupa aceasta perioada se introduce
mediul nutritiv,iar recipientele sunt astuparte cu dop de cauciuc si incubate
intr-un termostat la 37 Pe perioada incubarii aceste recipiente nu
trebuiesc miscate pe o perioada minima de 3-4 zile
2.Tesuturi adulte Aceste tesuturi provin prin interventie chirurgicala: -piele
-mucoase -tesut uterin -rinichi -splina si ganglioni etc. Fragmentele se
introduc in solutie salina cu antibiotice ,unde se lasa 2-3 ore si apoi se
efectueaza etapele de prelucrare preliminara identice cu ale embrionului.
Controlul culturii Acesta este de doua feluri: Controlul mediilor: -control
pentru contaminatii -control al constantelor fizico-chimice -control de
eficienta Controlul morfologic: a)Tehnici de microscopie fotonica:
-examinarea celulelor in stare vie la microscopul cu contras defaza
-examinarea preparatelor fixate si colorate b)Tehnici de histoautografie
c)Tehnici de microscopie electronica
Cultivarea virusurilor Cultivarea virusurilor pe culturi celulare Virusurile
pot fi izolate pe celule vii, receptive. Cultura celular : sistem biologic in
vitro alc tuit din celule izolate vii, care i p streaz capacitatea de
multiplicare i nu se organizeaz n esuturi. Condi ii necesare pentru p
strarea n via a celulelor din cultura celular : - condi ii aseptice - mediu
nutritiv (mediu de cultur lichid ce con ine substan e nutritive, surs de
energie, factori de cre tere, vitamine, sistem tampon, indicator, antibiotice i
antifungice) mediile comercializate Eagle, Hanks, M199 - pH adecvat
- temperatur constant - atmosfer cu 10% CO2
 n func ie de provenien a celulelor, culturile celulare se clasific n: -
culturi de origine animal sau uman - culturi de celule embrionare sau
adulte - culturi de celule normale sau tumorale Culturile celulare
primare sunt culturi realizate direct din esuturile surs . Liniile celulare
stabilizate deriv din culturile primare, se men in n via timp nelimitat prin
subcultiv ri.
Realizarea culturilor primare din tesuturi solide - se prelev esutul surs n
condi ii aseptice - se fragmenteaz esutul n buc i de aprox. 1 mm3, se
spal cu solu ie salin tamponat (SST) pentru ndep rtarea sngelui -
disocierea enzimatic a celulelor: tripsinizarea fragmentelor tisulare n solu
ie de tripsin 0,25% (enzim proteolitic , desface leg turile peptidice) pe
agitator magnetic desfacerea leg turilor intercelulare - colectarea
celulelor izolate n vas colector se face prin filtrare pentru a ob ine
numai celule izolate - repetare tripsiniz rii pn la epuizarea esutului, n
timpul tripsiniz rii vasul colector se p streaz la temperatura de 4C pentru
inactivarea tripsinei
 centrifugarea suspensiei de celule izolate, ndep rtarea supernatantului
(tripsina), sp lare cu SST, n final suspendarea celulelor n mediu nutritiv
- controlul viabilit ii celulelor cu colora ie vital albastru de tripan (se
coloreaz celulele moarte) pentru a se realiza cultura, 90% din celule
trebuie s fie vii) - num rarea celulelor, ajustarea lor la concentra ie de
300000 celule/ml, repartizare volume egale n flacoane de culturi celulare
-2 - incubare n pozi ie culcat - urm rirea form rii culturii cu microscopul
invers Culturi provenite din celule: - normale: celulele se ata eaz de
peretele flaconului, se multiplic pn acoper peretele flaconului, realizeaz
o cultur monostrat (fenomenul inhibi iei de contact) - tumorale: se
multiplic i dup acoperirea suprafe ei disponibile, cresc n mai multe straturi i
n suspensie
Subcultivarea culturilor celulare Dup 5-7 zile de la realizarea culturii se
epuizeaz substan ele nutritive, sursele de energie, se acidific mediul.
Pentru men inerea celulelor n via , acestea trebuie pasate, subcultivate.
Se realizeaz prin versenizare. Celulele se deta eaz de pe peretele
flaconului cu solu ie de EDTA (versen), se centrifugheaz , se spal cu solu
ie SST i se resuspendeaz n mediu nutritiv. Se verific viabilitatea celulelor,
se num r celulele i se ajusteaz la concentra ia optim . Se repartizeaz
volume egale n flacoane de cultur celular .
 Culturile primare realizate din celule normale adulte pot fi subcultivate de
cteva ori (4-6) dup care celulele mor (apoptoz ) Cele realizate din
esuturi embrionare pot fi subcultivate de mai multe ori (celule nediferen
iate), 60-80x, dup care mor. Liniile celulare pot fi subcultivate nedefinit.
Aceste se ob in din esuturi tumorale (HeLa, KB, Detroit 6, etc) sau din
culturi celulare efectuate din esuturi normale care au suferit transformare
malign spontan (Vero). Liniile celulare sunt bine caracterizate, se
manevreaz u or, pot fi folosite pentru izolarea virusurilor.
Inocularea suspensiilor virale n culturile celulare, identificarea izolatelor
virale Se ndep rteaz mediul nutritiv i se introduce n flacon suspensia
viral preg tit n prealabil. Dup o incubare de 1 or (penetrarea virusurilor n
celulele receptive) suspensia se decanteaz , se adaug mediu de ntre
inere (mai s rac n substan e nutritive dect mediul nutritiv, dar care
permite supravie uirea celulelor), se incubeaz . n zilele urm toare se urm
resc modific rile survenite n cultura celular . Identificarea izolatelor se
face prin metode nespecifice i specifice.
 Metode nespecifice: - urm rirea efectelor
citopatice (desprinderea celulelor de pe suprafa a pere ilor, rotunjirea
celulelor, agregarea lor n ciorchine, formarea sinci iilor) - detectarea
incluziilor virale - hemadsorb ia se folose te la detectarea replic rii virale
n cazul n care virusul nu produce efect citopatic (virusul ifluenza):
membrana celulelor n care se replic virusul are structura modificat ,
hematiile ad ugate ader de acestea - interferen a: se bazeaz pe faptul, c o
celul deja infectat cu un virus nu poate fi infectat cu un alt virus se folose
te pentru detectarea virusurilor neproduc toare de ecp - formarea plajelor -
transformarea spontan - microscopia electronic Metode specifice -
detectarea antigenelor virale prin reac ii antigen-anticorp - detectarea
acizilor nucleici virali reac ii de hibridizare, PCR
Izolarea virusurilor pe oul de gaina embrionata