Revista Iberoamericana de Tecnologa

Postcosecha
ISSN: 1665-0204
rebasa@hmo.megared.net.mx
Asociacin Iberoamericana de Tecnologa
Postcosecha, S.C.
Mxico

Fernndez Campos, Martn; Da Silva, Adriana; Martnez Debat, Claudio

ANLISIS DE TRANSGNESIS MEDIANTE PCR DE 20 HARINAS DE MAZ (POLENTAS) QUE SE
ENCUENTRAN A LA VENTA EN EL MERCADO URUGUAYO
Revista Iberoamericana de Tecnologa Postcosecha, vol. 13, nm. 1, 2012, pp. 92-104
Asociacin Iberoamericana de Tecnologa Postcosecha, S.C.
Hermosillo, Mxico

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=81324433012

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Anlisis de transgnesis mediante PCR de Martn Fernndez Campos y cols. (2012)

ANLISIS DE TRANSGNESIS MEDIANTE PCR DE 20 HARINAS DE MAZ

(POLENTAS) QUE SE ENCUENTRAN A LA VENTA EN EL MERCADO URUGUAYO

Martn Fernndez Campos1, Adriana Da Silva2, Claudio Martnez Debat1.

1
LaTraMA - Laboratorio de Trazabilidad Molecular Alimentaria. Seccin Bioqumica. Facultad de Ciencias.
2
Universidad de la Repblica. Igu 4225. CP 11400. Montevideo, Uruguay. Laboratorio de Bromatologa,
Intendencia Municipal de Montevideo. Isla de Flores 1323. CP 11200. Montevideo, Uruguay. e-mail:
clau@fcien.edu.uy

Palabras clave. Harina de maz. ADN, transgnesis, Bt

RESUMEN
En Uruguay, la liberacin de vegetales modificados genticamente est regulada por el Decreto de Ley No
353/008 (2008). Si bien existen varios eventos transgnicos en trmite de liberacin, tanto de soja como de
maz, por el momento slo los maces Bt11 y Mon810 y la soja RR son los nicos cultivos genticamente
modificados (GM) liberados al ambiente en nuestro pas, que ocupa el 9 lugar en el mundo como productor de
cultivos GM. Con respecto al maz, en la zafra 2009/2010 aproximadamente el 85% del maz sembrado fue GM
(unas 90 mil hectreas). Asimismo, si bien el nuevo decreto crea una nueva estructura para bioseguridad en
vegetales, deja a libre albedro el etiquetado de transgnico/no-transgnico en el producto comercial final
derivado del mismo. Teniendo en cuenta que el consumidor insiste en conocer exactamente qu es lo que est
comprando tanto para consumo, procesamiento o para raciones animales, hemos encarado el poner a punto
tcnicas de biologa molecular para la trazabilidad y determinacin de transgnicos y utilizarlas en muestras
reales de consumo masivo. En este trabajo se pusieron a punto las tcnicas de extraccin de ADN, PCR y
electroforesis para rastreo de maz transgnico mediante la deteccin del promotor 35S. Se seleccionaron para
su anlisis 20 muestras de harina de maz (polentas, proporcionadas y codificadas por el Laboratorio de
Bromatologa de la Intendencia Municipal de Montevideo, Uruguay) en busca del promotor 35S, secuencia de
ADN comn a muchos eventos transgnicos y, en particular encontrada en los eventos Bt 11 y Mon 810, nicos
autorizados para produccin y consumo en Uruguay. Hecho el rastreo para determinar transgnesis, se
determin especficamente qu evento estaba presente en las mismas, buscando detectar maz Bt11, Mon810 y
Bt176 (muy utilizado en Argentina en 2006-7). De las 20 muestras recibidas, se pudo extraer ADN de 18 de ellas,
las cuales resultaron todas positivas para el promotor 35 S, con 9 muestras positivas para Bt11 y Mon810, 5
muestras positivas slo para Bt11, 4 muestras positivas slo Mon810 y finalmente ninguna muestra result
positiva para Bt176.

PCR-BASED ANALYSIS OF TRANSGENE PRESENCE IN 20 COMMERCIALLY AVAILABLE
CORNMEAL SAMPLES URUGUAY

Key words. Cornmeal. DNA, transgenesis, Bt
ABSTRACT
In this study we present data pertaining the presence of genetically modified maize in commercial cornmeal
(polenta) samples consumed in Uruguay. When this study was conducted (2008), only two transgenic maize
events were aproved for sowing in Uruguay: Bt11 and Mon810; nevertheless, by the years 2008-2009,
approximately 90% of cultivated maize was genetically modified. While recent improvements concerning
biomonitoring of genetically modified organisms (GMOs) will be inforced in a novel biosecurity law, labelling of
the final commercial products derived from GMOs is not mandatory, being left to the producers decision. In
contrast, many consumers insist on knowing the components of a product that is utilized for direct
consumption, further processing or animal feed. Given this situation, we used molecular biology techniques to
detect and identify if GM maize components were present in 20 commercially available cornmeals (polentas)

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provided to us by by the Laboratorio de Bromatologa de la Intendencia Municipal de Montevideo.

Furthermore, for this study we optimized DNA extraction, PCR amplification and acrylamide electrophoresis
techniques in order to perform a screening for the 35S CaMV promoter (a recombinant sequence common in
over 90% of currently available GM maize lines), as well as event-specific (Bt11, Bt176 and Mon810) genetic
markers. We were able to obtain DNA from 18 out of 20 polenta samples: all 18 DNAs were positive for the 35S
CaMV promoter; of these, 9 samples contained event-specific markers for both Mon810 and Bt11 events, while
5 were positive only for Bt11 and 4 were positive only for Mon810. None of the analyzed samples contained
event Bt176 (which is extensively sowed in the neighbouring country of Argentina).

INTRODUCCIN 700 mil hectreas GM aproximadas para la
Durante la zafra 2009/2010, 15.4 millones zafra 2008/2009, y que representaron un
de agricultores en 29 pases plantaron cultivos aumento en el rea de siembra de un 40% en
transgnicos, ms del 90% de estos pases comparacin con la zafra anterior, siendo ste
fueron naciones en desarrollo (ISAA, 2010). el mayor aumento mundial de rea de siembra
Tambin fue el ao en que se alcanzaron las para el perodo). En la zafra 2009/2010 se
81 millones de hectreas sembradas con sembraron aproximadamente 880 mil
OGMs en el mundo (solamente tres aos hectreas entre soja y maz GM (ISAAA, 2010).
despus de que se alcanzaran las primeras 40 Si bien los eventos aprobados hasta el
millones de hectreas). La Unin Europea momento son pocos en relacin a otros pases
sigue resistindose a la aprobacin de nuevos productores de transgnicos, estas cifras
eventos modificados para liberacin al mantienen a Uruguay como el dcimo pas con
ambiente y solamente autoriza los mismos mayor rea de siembra de OGM en el mundo y
para su utilizacin en alimentos animales, el cuarto a nivel de Sudamrica por detrs de
humanos y piensos. Sin embargo en Brasil (25,4 millones de hectreas), Argentina
Sudamrica el crecimiento de cultivos (22.9 millones de hectreas) y Paraguay (2,6
transgnicos liberados al ambiente sigue en millones de hectreas) (ISAAA, 2010).
alza, liderado por Argentina y Brasil (Marshall, En Uruguay, el 21 de julio de 2008 se
2009). aprueba un nuevo Decreto de Ley (No.
En Uruguay hasta el momento hay tres 353/008) que establece normas relativas a
eventos aprobados para liberacin al Bioseguridad de vegetales y sus partes
ambiente, maz Bt11, maz Mon810 y soja RR genticamente modificadas. Se establece la
(40-3-2). En cuanto a las reas de siembra, la posibilidad de que nuevos eventos vegetales
soja transgnica ya ha alcanzado genticamente modificados puedan ingresar al
prcticamente el 100% del rea total pas bajo la previa evaluacin de una nueva
sembrada mientras que el maz ha alcanzado estructura orgnica en materia de
casi el 90% (aproximadamente el 88% en la Bioseguridad de Vegetales creada en el mismo
zafra 2008/2009) del rea de maz total decreto. Se trata de una primera etapa previa
sembrada, lo que equivale casi al 100% del a la redaccin de una Ley Nacional de
total posible (hay que recordar que en Bioseguridad, la que sigue pendiente.
Uruguay es obligatorio para el maz plantar un Dicho decreto establece una poltica de
10% de maz no transgnico como refugio) coexistencia regulada (Devos et al., 2009),
(Cmara Uruguaya de Semillas, CUS, 2009). De reconociendo que los diferentes sistemas
todas maneras an hay muchos productores productivos: convencional, orgnico, o
orgnicos que siembran maz y soja no transgnico, tienen un rol a cumplir en la
genticamente modificados siendo el rea de agropecuaria y por tanto es deseable
siembra no GM muy pequea en comparacin promover el desarrollo de esos diferentes
con el rea GM total sembrada (que fue de sistemas productivos.

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En cuanto a lo que a trazabilidad de consumidor quiere pagar ms por algo que lo

transgnicos en alimentos respecta, el Artculo que realmente vale (Al-Jowder, 1999).
4 de este nuevo decreto establece que [se Sin embargo, en el caso especfico del maz
promovern] acciones tendientes a la GM, se han encontrado efectos negativos
implementacin del etiquetado voluntario inesperados en el estado sanitario de animales
"GM" o "no GM", aplicable a aquellos de laboratorio alimentados con derivados de
alimentos en los que se pueda comprobar cultivos transgnicos. Esto refuerza la
mediante anlisis del producto final la necesidad de la deteccin e identificacin de
presencia de ADN o protenas genticamente los OGMs que pudieran estar presentes en
modificados. alimentos de consumo masivo (Sralini et al.,
Derechos de los consumidores. La 2007; Kilic and Akay, 2008; Finamore et al.,
preocupacin de los consumidores en relacin 2008; Velimirov et al., 2008).
a la composicin de los alimentos es cada vez En Uruguay, se consume el maz bajo
mayor, y exigen informacin clara y exacta, muchas modalidades, siendo una de las ms
dado que la eleccin de un producto puede populares (por su bajo costo y la sencillez de
estar relacionada con un estilo de vida preparacin) la polenta, que consiste en
(vegetarianismo, preferencia de productos granos de maz pulverizados mecnicamente
orgnicos), problemas de salud (ausencia de mediante molienda seca sin ningn proceso de
lactosa o gluten), o temas religiosos (ausencia coccin, de donde se obtienen grits que son
de cerdo para los judos y musulmanes, y de preparados por hervido en agua salada con el
vaca para los hindes) (Rodrguez M, 1994). agregado opcional de leche (Araya, 1996).
Por lo tanto, la descripcin y/o etiquetado de
los alimentos debe ser fidedigna y precisa. MATERIALES Y MTODOS
La informacin que debe ser suministrada La estrategia experimental utilizada en este
al consumidor final est regida por ley en la trabajo para la deteccin e identificacin de
mayora de los pases, de manera que los transgnicos en muestras de polenta se bas
alimentos deben coincidir exactamente con lo en la extraccin de ADN a partir de las mismas
descrito en sus etiquetas. As, se busca tanto y su posterior anlisis mediante PCRs. Tanto la
proteger al consumidor como evitar una deteccin del transgnico como la
competencia desleal que afecte al comerciante identificacin del evento especfico se basaron
honesto (Lumley, 1996). La descripcin falsa, en tcnicas de PCR que utilizan cebadores
fraudulenta, de los contenidos de los especficos y posterior resolucin de los
alimentos en las etiquetas de los productos es amplicones obtenidos mediante electroforesis
un problema generalizado, dadas las en geles de poliacrilamida. Los perfiles
importantes ganancias que puede producir obtenidos para las muestras problema se
(Patel, 1994, Ashurst and Dennis, 1996), compararon con controles positivos y
particularmente en productos de alto valor negativos de maz transgnico. Algunas de los
agregado. Algunos casos de adulteracin han amplicones se secuenciaron para lograr una
generado graves problemas de salud, como la ulterior confirmacin de los resultados.
sustitucin de algunas especias con xido de
plomo, o la adicin de anticongelante al vino, Muestras utilizadas.
o un contaminante txico al aceite de oliva Las muestras empleadas para la realizacin
(Vallejo, 2005). La mayora de los casos de de los anlisis fueron 20 polentas (harinas de
fraude alimenticio tienen consecuencias maz) proporcionadas por el Laboratorio de
econmicas ms que de salud, ya que ningn Bromatologa de la Intendencia Municipal de
Montevideo. Todas las muestras se

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encuentran actualmente en el mercado. Cada 500L del sobrenadante, a los cuales se les
muestra fue entregada al laboratorio agregan 500L de isopropanol y se mezcla por
correctamente sellada para que no exista inversin unas 10 veces. Se centrifuga por 15
transferencia de material entre ellas y adems min a 12000 rpm, y luego de descartar el
diferenciadas mediante un cdigo, tal que, sobrenadante se agregan 250L de etanol
solamente el personal del Laboratorio de 70%, centrifugando nuevamente por 5 min a
Bromatologa tena conocimiento del origen 12000 rpm. Por ltimo, se descarta el
de cada una. Tanto los controles positivos sobrenadante, se seca el precipitado, se
como los controles negativos de maz fueron resuspende en 100L de agua mQ y se guarda
proporcionados por el INASE (Instituto en freezer a -20C hasta su posterior
Nacional de Semillas, Ministerio de Ganadera, utilizacin.
Agricultura y Pesca). Se usaron controles La concentracin y pureza de los ADNs
positivos genricos para maz (invertasa), extrados de las muestras se estimaron
promotor del virus del mosaico del coliflor mediante lecturas de absorbancia a 260 y 280
(35S, transgnesis), as como para los eventos nm en un espectrofotmetro Shimadzu UV-
Bt11, Mon810, Bt176. 160A. A partir de estas lecturas se calcularon y
prepararon las diluciones de trabajo (100
Descontaminacin del lugar y elementos de ng/uL).
trabajo. La integridad del ADN extrado fue
Las mesadas, morteros y pipetas fueron estimada mediante electroforesis en agarosa
descontaminados antes de cada experimento 1% con el agregado de Bromuro de Etidio,
siguiendo los siguientes pasos: 5 minutos en concentracin final de 0,01mg/ml. Se
Hipoclorito de Sodio 10%, 5 minutos en sembraron 10 L de los 100 totales. Los geles
alcohol 70% y posterior lavado con H2O se corrieron en buffer TAE 1x (40 mM Tris, 20
milliRo. Se utilizaron guantes libres de talco mM cido actico, 1 mM EDTA).
en todas las etapas experimentales debido a El ADN se visualiz en un transiluminador
razones que ms adelante se discutirn. UV (254nm). Se compararon los perfiles de los
ADNs obtenidos con un estndar de peso
Extraccin de ADN. molecular /HindIII.
Las muestras fueron homogeneizadas
utilizando morteros de cermica (previamente Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).
autoclavados y descontaminados) hasta Las amplificaciones fueron realizadas en un
obtener polvillo fino. Para las extracciones de termociclador de punto final (GeneAmp PCR
ADN se utiliz el protocolo reportado por System 2400, Perkin Elmer ). Las muestras a
Dellaporta et al (Dellaporta, 1983) con ser analizadas fueron preparadas para la PCR
pequeas modificaciones: a 70 mg de muestra en una zona exclusiva (sala de pre-PCR)
homogenizada se le agregan 700L de Buffer descontaminada (segn descripto
de extraccin (Tris-HCl 50mM pH 8.0; EDTA 10 anteriormente) previo a cada anlisis.
mM pH 8.0; NaCl 100mM; SDS 1%; -
mercaptoetanol 10 mM). Se mezcla por Deteccin de transgnesis e identificacin de
inversin unas 10 veces y se incuba a 65 C eventos.
durante 20min, agitando cada 2 min. Para la deteccin se utilizaron los
Posteriormente se agregan 200 L de acetato cebadores 35S-1 y 35S2 que amplifican una
de potasio 5M, se invierte el tubo 5 veces, y se regin del promotor 35S, utilizado en ms del
incuba en hielo por 10 min. Luego se 95% de los eventos transgnicos (Hurst, 1999).
centrifuga a 12000 rpm por 20 min, y se toman El tamao del amplicn es de 195pb. cada

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tubo contena 1L de ADN molde, 1L de cada Para el resto de las reacciones, es decir,
cebador 35S-1 y 35S-2 [10M], 0,2L Taq control endgeno de maz y determinacin de
polimerasa Fermentas (equivalente a 1U), los eventos Bt11, Mon810 y Bt176, se utiliz el
0,2L de solucin dNTPs Fermentas (25mM), mismo protocolo que para el rastreo de 35S
2,5L Buffer KCl (10x), 2,5L de MgCl2 (25mM) pero usando los cebadores especficos
y H2OmQ c.s.p. 25L. El termociclador fue correspondientes. Para Bt11: IVS2-2/PAT-B
programado para realizar 4 minutos de con un amplicn de 189 pb; para Mon810:
desnaturalizacin inicial a 94C, seguida de 35 VW01/VW03 con un amplicn de 170pb; para
ciclos: 30 segundos a 94C, 30 segundos a Bt176 Cry05/Cry06 con un amplicn de 134
62C y 30 segundos a 72C. Por ltimo un ciclo inv) endgeno de maz IVR1/IVR2 con un
de elongacin de 7 minutos a 72C. amplicn pb. (Tabla 1).

Tabla 1: Lista de oligonucletidos utilizados en las PCRs.
Especificidad Nombre Secuencia 53 Tamao Tm Referencia
amplicn (pb) (C)
Maz IVR-1 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC 226 69.5 Ehlers et al., 1997
Maz IVR-2 GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC 69.5 Ehlers et al., 1997
GM 35S-1 GCTCCTACAAATGCCATCA 195 58 JRC
GM 35S-2 GATAGTGGGATTGTGCGTCA 60.4 JRC
Evento Bt11 PAT-B GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT 189 64.54 JRC
Evento Bt11 IVS2-2 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT 62.52 JRC
Evento Mon810 VW01 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG 170 64.55 JRC
Evento Mon810 VW03 TCCATCTTTGGGACCACTGTCG 64.54 JRC
Evento Bt176 Cry05 CCGCAGCCGATCCAACAATG 134 64.5 JRC
Evento Bt176 Cry06 GCTGATGTCGATGGGGGTGTAG 66.4 JRC

Electroforesis en geles de poliacrilamida. de minutos con el fin de evitar que se
La visualizacin de los productos de PCR (7 sobreexpongan. Los mini-geles una vez
L de 25 totales) se realiz en mini-geles de revelados- son escaneados y conservados para
poliacrilamida, preparados con 7mL de su posterior anlisis en sobres de nylon
acrilamida-bisacrilamida 6% en tampn TBE 1X sellados y guardados a temperatura ambiente.
(90mM Tris base, 90mM cido brico, 2mM
EDTA pH 8.0), 7L TEMED, y 70L de Electroforesis en geles de agarosa 2%.
Persulfato de amonio 10%. Los mini-geles se Los geles se prepararon y corrieron en las
revelaron mediante la tcnica de tincin de mismas condiciones que los 1%, con la
plata con modificaciones (Sanguinetti, 1994): diferencia que se utilizaron 2 gr. De agarosa
luego de la electroforesis fueron incubados cada 100 mL. de buffer TAE y un Ladder 100 pb
por 5 min en solucin fijadora (10% etanol y (Fermentas) como estndar de peso
0,5% cido actico glacial en H2O mRO) con molecular.
agitacin constante, posteriormente 8 min en
solucin de plata (0,225% AgNO3 en H2O Secuenciacin de los Productos de PCR.
mRO), luego se lavan 2 veces en agua mRO El remanente de algunas de las reacciones
durante aproximadamente 30 segundos y por de PCR (aproximadamente 18 uL) fueron
ltimo se exponen al revelador (3% NaOH; purificados en columnas AxyPrep PCR Clean-
0,12% formaldehdo en H2O mRO) hasta que up Kit, siguiendo las instrucciones del
se completa la tincin. Para detener la fabricante, y la solucin de ADN eluido fue
reaccin de tincin se deben colocar concentrada hasta 10 uL en un secador vacuo-
nuevamente en la solucin fijadora por un par rotatorio (Speed-Vac). Un uL fue usado para

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confirmar en un mini gel de acrilamida 6%,en contrastndolo contra la base de datos del
las mismas condiciones que antes, la presencia GenBank mediante el algoritmo Blastn.
e integridad del ADN recuperado. Del volumen
restante, se utiliz otro uL para cuantificar el RESULTADOS
ADN en un espectrmetro Nano Drop Extracciones de ADN.
(ACTGene ASP-3700) y el volumen remanente Tal como se aprecia en la Figura 1 y la Tabla
(8 uL aprox.) se enviaron a secuenciacin 2, el mtodo de Dellaporta funcion bien para
directa al Servicio de Secuenciacin del trabajar con este tipo de matrices
Instituto Pasteur de Montevideo. El resultado alimentarias.
de la secuenciacin fue analizado

Figura 1: Resultado de la electroforesis en gel de Agarosa 1% (con Bromuro de Etidio) de las extracciones de
ADN de las veinte muestras analizadas (M1-20, carriles 1-20, 22, 23), el marcador de peso molecular utilizado
como referencia (carriles 1 y 22) fue /HindIII, y los pesos moleculares de sus fragmentos se indican a la
izquierda.

Dado que las muestras M2 y M18 no M18 fue 1,100, con medidas de Abs260 de
produjeron un perfil apreciable de ADN en la 2135ng/l y 2040 ng/l respectivamente
corrida electrofortica en agarosa, se repiti (Tabla 2).
su extraccin, aunque nuevamente sin
resultados positivos (Figura 1). Si bien las Deteccin de transgnesis e identificacin de
medidas de Abs260 (Tabla 2) fueron eventos.
consistentes con los resultados mostrados en Todas las muestras de las que se pudo
la Figura 1, solamente 5 polentas mostraron extraer ADN amplificable (18/20) son positivas
una relacin Abs260/Abs280 dentro del al utilizar los cebadores 35S (ver Figura 2 como
ptimo de pureza (entre 1,6 y 1,8) (Gallagher ejemplo de amplificacin del promotor 35S,
and Desjardins, 2001). De las restantes, cinco banda de 195 pb), lo que nos indica la
polentas mostraron relacin de absorbancia presencia de material genticamente
entre 1,3 y 1,6 y el resto de las veinte modificado. Asimismo, se obtuvo la banda
muestras resultados entre 1,1 y 1,3. De todas esperada de 226 pb cuando se utilizaron los
maneras, excepto M2 y M18, todas las cebadores IVR-1 e IVR-2 sobre las mismas
muestras amplificaron correctamente en las muestras, resultando M2 y M18 nuevamente
posteriores PCR. La relacin de Abs260/A280 negativas (datos no mostrados). Los resultados
de la muestra M2 fue 1,227 y la de la muestra (ver Tabla 3) arrojan que el evento BT176 no

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Anlisis de transgnesis mediante PCR de Martn Fernndez Campos y cols. (2012)

est presente en ninguna de las muestras pero Como ulterior confirmacin de que las
si lo estn los eventos Mon810 y BT11. Se bandas obtenidas por PCR correspondan a los
encontr el evento Mon810 en trece de las eventos analizados, decidimos realizar una
muestras mientras que el Bt11 en 14 de ellas secuenciacin directa de algunos de los
(Mon810 positivo y Bt11 negativo en cuatro productos de PCR obtenidos. En todos los
muestras, Bt11 positivo y Mon810 negativo en casos hubo coincidencia entre los resultados
cinco, y los dos en nueve) (Figura 3). de las PCRs y posteriores electroforesis, y las
secuencias nucleotdicas obtenidas (datos no
Tabla 2: Medidas de Abs260, A280, relacin mostrados).
Abs260/280, y concentracin de cidos nucleicos en
ng/l para las muestras analizadas (M1-M20). Tabla 3. Resultado del rastreo del promotor 35-S,
Muestra A260 A280 A260/A280 [ADN] ng/L
control endgeno IVR y la identificacin de
M1 0,150 0,105 1,428 750
M2 0,427 0,348 1,227 2135 eventos Bt11, Mon810 y Bt176 para las 20 harinas
M3 0,094 0,060 1,572 470 de maz M1-M20, analizadas mediante PCRs y
M4 0,128 0,105 1,224 640 posteriores electroforesis en geles de acrilamida
M5 0,226 0,149 1,523 1130 6% (no mostrados para los eventos ni IVR) y
M6 0,174 0,149 1,167 870
agarosa 2%. Se puede observar que luego de
M7 0,088 0,051 1,726 440
M8 0,293 0,212 1,380 1465 realizar la PCR no se obtuvieron resultados
M9 0,204 0,168 1,215 1020 positivos que muestren la presencia de ADN en las
M10 0,378 0,236 1,605 1890 muestras M2 y M18, y tampoco se detect el
M11 0,179 0,160 1,119 895 evento Bt176 en ninguna de las 20 muestras. El
M12 0,409 0,356 1,147 2045
resto de las muestras presentan una de las 3
M13 0,304 0,236 1,157 1520
M14 0,346 0,216 1,604 1730
posibles combinaciones de Bt11 y Mon810
M15 0,375 0,226 1,657 1875 (mezcla, solo Bt11 o solo Mon810).
M16 0,196 0,150 1,305 980 IVR 35-S Bt11 Mon810 Bt176
M17 0,321 0,185 1,730 1605 M1 + + + +* -
M18 0,408 0,371 1,100 2040 M2 - - - - -
M19 0,299 0,249 1,201 1495 M3 + + + - -
M20 0,387 0,329 1,174 1935 M4 + + + - -
M5 + + + + -
M6 + + + + -
M7 + + + + -
M8 + + + + -
M9 + + + + -
M10 + + - + -
M11 + + + - -
M12 + + - +* -
M13 + + - + -
M14 + + + + -
M15 + + - + -
Figura 2: Deteccin de transgnesis. Resultado de M16 + + +* + -
la electroforesis en gel de poliacrilamida 6% M17 + + +* + -
+ M18 - - - - -
teido con Ag . Se aprecia la banda
M19 + + + - -
correspondiente al amplicn de 195 pb generado M20 + + + - -
por la PCR utilizando los cebadores 35S1 y 35S2 y *: resultaron claramente positivos en acrilamida 6% y negativos
los moldes de ADN obtenidos a partir de seis de en agarosa 2%.
las veinte muestras de polentas analizadas. Existe
reaccin positiva en las seis polentas analizadas DISCUSIN
en este experimento. MPM: Marcador de peso Extracciones de ADN
molecular L100, Carril 1: Control negativo. 2-7:
Tal como se muestra en la Figura 1, el
Muestras M10-M15. 8: Control positivo.
mtodo de Dellaporta modificado result

eficiente tanto en la cantidad como en la

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Anlisis de transgnesis mediante PCR de Martn Fernndez Campos y cols. (2012)

calidad del ADN obtenido para dieciocho de las M18 se realizaron al menos tres intentos de
veinte muestras de harinas de maz analizadas. extraccin de ADN mediante el protocolo
En todas las muestras (menos M2 y M18) se Dellaporta (as como utilizando el kit comercial
puede apreciar la presencia de una banda de DNeasy Plant Mini Kit, Qiagen, datos no
alto peso molecular lo que indica que se mostrados) sin obtener resultados positivos en
obtuvo ADN de buena calidad para utilizar en las PCRs.
las posteriores PCRs. Para la muestras M2 y

Figura 3: Identificacin de Eventos. Electroforesis en gel de agarosa 2% (con bromuro de etidio) mostrando el
resultado de las PCR evento-especficas. Slo se sembraron las muestras que mostraron resultado positivo en
un anlisis previo de electroforesis en acrilamida (datos no mostrados). 1: Marcador de peso molecular L100,
2: C(+) 35S, 3: C(+) Bt11, 4: C(+) Mon810, 5: M1 35S, 6: M1 Bt11, 7: M1 Mon810, 8: M3 35S, 9: M3 Bt11, 10:
M4 35S, 11: M4 Bt11, 12: M4 Mon810, 13: M5 35S, 14: M5 Bt11, 15: M5 Mon810, 16: M6 35S, 17: M6 Bt11,
18: M6 Mon810, 19: M7 35S, 20: M7 Bt11, 21: M7 Mon810, 22: M8 35S, 23: M8 Bt11, 24: M8 Mon810, 25: M9
35S, 26: M9 Bt11, 27: M9 Mon810, 28: M10 35S, 29: M10 Mon810, 30: M11 35S, 31: M11 Bt11, 32: M12 35S,
33: M12 Mon810, 34: M13 35S, 35: M13 Mon810, 36: M14 35S, 37: M14 Bt11, 38: M14 Mon810, 39: M15 35S,
40: M15 Mon810, 41: M16 35S, 42: M16 Bt11, 43: M16 Mon810, 44: M17 35S, 45: M17 Bt11, 46: M17
Mon810, 47: M19 35S, 48: M19 Bt11, 49: M20 35S, 50: M20 Bt11. No se analizaron ni M2 ni M18, ya que
haban resultado negativas para 35S, Mon810, Bt11, Bt176 e IVR.

En las etapas iniciales del trabajo, notamos de extraccin, concluimos que el mtodo
que almidn de maz presente en los guantes Dellaporta modificado (originalmente descrito
(Hinsch, 2009) era un foco importante de para la extraccin de ADN de muestras
contaminacin durante la manipulacin, vegetales, cita), rpido y econmico, funciona
principalmente durante la preparacin de las muy bien para la matriz alimentaria tipo
PCR, lo que se evidenci por la aparicin de polenta.
falsos positivos (i.e. seales positivas en los Si bien las medidas de Abs260 fueron
controles negativos sin ADN). Por esta razn se consistentes con los resultados mostrados en
decidi utilizar guantes sin almidn durante la Fig.1, solamente cinco polentas mostraron
los experimentos, lo que redujo una relacin Abs260/Abs280 dentro del
considerablemente el nmero de muestras ptimo de pureza (Gallagher and Desjardins,
contaminadas por lo tanto de falsos positivos 2001) (entre 1,6 y 1,8, Tabla 2). De las
en los resultados finales. En cuanto al mtodo restantes, cinco polentas mostraron relacin

Rev. Iber. Tecnologa Postcosecha Vol 13(1):92-104 99

Anlisis de transgnesis mediante PCR de Martn Fernndez Campos y cols. (2012)

de absorbancia entre 1,3 y 1,6 y el resto de las par IVR1/IVR2 que amplifican el gen ivr
20 muestras resultados entre 1,1 y 1,3. De endgeno de maz- nos confirmaran la
todas maneras, excepto M2 y M18, todas las hiptesis de que sea cual sea la razn, no pudo
muestras amplificaron correctamente en las extraerse ADN amplificable de estas muestras.
posteriores PCR. La relacin de Abs260/280 de
la muestra M2 fue 1,227 y la de la muestra Deteccin de transgnesis e identificacin de
M18 fue 1,100. Adems mostraron medidas de eventos.
Abs260 de 2135 ng/l y 2040 ng/l Los resultados de las PCRs de rastreo y
respectivamente. (Tabla 2). Si bien es posible control endgeno (35S e IVR), as como las de
que esta inconsistencia sea debido a errores deteccin de eventos (Mon810, Bt11 y Bt176)
tcnicos en la manipulacin durante las se analizaron por electroforesis en geles de
extracciones de ADN o durante las medidas de poliacrilamida 6% teidos con nitrato de plata
absorbancia, ambos procedimientos fueron y por agarosa 2% (Figuras. 2 y 3). La
repetidos varias veces, por lo que no se puede metodologa de anlisis por geles de
descartar que en esas polentas el ADN poliacrilamida presenta varias ventajas con
estuviese tan degradado que no puedan respecto a la utilizacin de agarosa 2%
utilizarse los mtodos de deteccin e (adicionada de bromuro de etidio), a saber:
identificacin usados en este trabajo. Si este rapidez, costo, la no utilizacin de un agente
fuera el caso, tambin justificara las altas probadamente mutgeno. La alta sensibilidad
medidas de Abs260 que se observaron en (por lo menos diez veces mayor con respecto a
ambas muestras ya que podramos estar la agarosa) es a la vez una ventaja y una
midiendo fragmentos sumamente pequeos desventaja, ya que en ocasiones se pueden
de ADN o inclusive bases sueltas en grandes producir contaminaciones de un carril a otro
cantidades, sin que esto se refleje en bandas (carry over), lo que puede complicar la
de alto peso en las agarosas ni posteriores interpretacin de los resultados. El resultado
resultados positivos durante las PCR. final (Tabla 3) surge de la triple repeticin de
De estas muestras M2 y M18 no puede cada anlisis. Asimismo, y para adecuarnos a
asegurarse ni que contienen material GM ni los estndares analticos corrientes, decidimos
que no lo tienen. En primer lugar porque al no utilizar el resto de las reacciones de PCR
aparecer un amplicn de PCR podra significar (aproximadamente 15 de 25 L totales) para
que en esos carriles no funcion la PCR y en sembrar en geles de agarosa 2% (Fig. 4).
segundo lugar porque podran contener Dado que el amplicn correspondiente al
transgnicos que contienen en su construccin evento Bt176 (134pb) no apareci en ninguna
un promotor diferente al 35S (Ahmed, 2001). de las muestras (y dado que el mtodo
Adems se suma el hecho de que no pudo utilizado para identificarlo es especfico de
obtenerse ADN de buena calidad durante las construccin) podemos afirmar que este
extracciones, por lo que a las dos posibilidades evento (utilizado en Argentina en 2006-7) no
anteriores se les suman tambin los posibles se encuentra en ninguna de las muestras, ni
errores de manipulacin durante las siquiera como un apilado (stacked) o en alguna
extracciones ( y a pesar de que se utilizaron planta hbrida al menos dentro de los lmites
dos mtodos diferentes, incluyendo uno de deteccin de la metodologa y las limitantes
comercial) o la alta degradacin del ADN de de la estrategia de muestreo.
esas muestras. No obstante, la falta de El par de cebadores utilizados para
amplificacin de las muestras M2 y M18 en identificar Mon810 (VW01/VW03), son
todos los casos, -y principalmente la ausencia especficos de evento, lo cual implicara en
de amplicn para las corridas realizadas con el primera instancia que al generar un amplicn

100 Rev. Iber. Tecnologa Postcosecha Vol 13(1):92-104

Anlisis de transgnesis mediante PCR de Martn Fernndez Campos y cols. (2012)

de 170pb estaramos frente a una muestra que varias chacras estamos frente a la posibilidad
contiene dicho evento. Lo que no podemos que no solo una de las opciones descriptas
saber con este anlisis es si, la planta o el ms arriba sea la correcta, sino que la polenta
alimento que se est analizando contienen analizada sea una mezcla de varias de las
material hbrido entre plantas genticamente posibilidades anteriores.
modificadas o si es un evento apilado distinto En los 9 casos en que las muestras dieron
al Mon810 que fue generado por hibridizacin positivo tanto para PAT-B/IVS-2 como
de eventos GM utilizando como uno de los VW01/VW03 las posibilidades de mezcla son
parentales al Mon810. Dicho lo anterior se mucho ms grandes ya que implicaran las
puede concluir que las 4 muestras cuyos combinaciones de todas las anteriores.
anlisis dieron positivos solo para el par Debido a que para realizar el rastreo de
VW01/VW03 podran contener los eventos OGMs se utiliz nicamente el promotor 35S,
comerciales Mon810, Mon810 x NK603 quedaron fuera del anlisis todos los eventos
(presente en Argentina y Brasil y generado por de maz que utilizan promotores diferentes a
hibridizacin de eventos parentales NK603 y este. Si bien en Uruguay no hay eventos
Mon810) y cualquier otro hbrido no comercial liberados hasta el momento que contengan
que tenga como parental una planta Mon810. otros promotores, si los hay en Argentina y
La mencin a posibles hbridos generados Brasil, ambos pases grandes exportadores de
entre plantas pertenecientes a diferentes alimentos hacia Uruguay. Por lo tanto
eventos se justifica pues es sabido que las quedaron fuera del anlisis los eventos tales
distancias reglamentarias entre cultivos GM y como el GA21 (que utiliza el promotor I de
no GM (250 mts. en Uruguay), claves para el actina de arroz) y el TC1507 (con el promotor
modelo de "coexistencia" (Sanvido et al., 2008; ubiquitina de maz); entre otros (GMDatabase,
Devos et al., 2009), estn lejos de cumplirse 2009).
cabalmente y an cuando se respetan, existe Es importante destacar que todas las
flujo gnico a travs del polen entre plantas metodologas aplicadas en este trabajo son
GM y no GM (ver por ej. Galeano et al, 2011). cualitativas y solamente sirven para confirmar
Para el caso de los resultados positivos para la presencia ausencia de un determinado
el par PAT-B/IVS-2 (Bt11), es ms complicado evento o grupo de eventos. Sera importante
an, ya que estos cebadores son especficos de poner a punto los anlisis cuantitativos de
construccin. Esto implica que si luego de la determinacin e identificacin ya que es la
PCR se genera un amplicn de 189pb no nica manera de poder cumplir con los anlisis
podemos afirmar que el evento presente sea exigidos para realizar exportaciones a
necesariamente Bt11 sino que puede ser mercados como la Unin Europea (que exige
tambin cualquiera de los eventos apilados umbrales especficos de presencia). De todas
que hay en mercado que contienen la maneras para las necesidades locales basta
construccin Bt11, sea cual sea su mtodo de con poder determinar la presencia o ausencia
produccin, adems de cualquier hbrido que de material GM en la muestra problema ya
tenga como parental una planta Bt11. Las 5 que no existen umbrales establecidos por ley.
muestras que dieron positivas para el par PAT- Por ltimo, es primordial para poder
B/IVS-2 entonces, podran contener Bt11, estandarizar y certificar los mtodos utilizados
Bt11xGA21 (aprobado en Brasil y Argentina) y el poder acceder a los materiales de referencia
cualquier otro hbrido no comercial que tenga de cada uno de los eventos y de maz no GM.
como parental una planta Bt11. Estos materiales de referencia son sumamente
Como sabemos adems que las harinas de difciles de conseguir, lo cual dificulta el poder
maz son generalmente mezclas de granos de poner a punto las metodologas de anlisis.

Rev. Iber. Tecnologa Postcosecha Vol 13(1):92-104 101

Anlisis de transgnesis mediante PCR de Martn Fernndez Campos y cols. (2012)

CONCLUSIONES final, es de prever que tanto los productores

En este trabajo hemos puesto a punto la que trabajan con variedades hbridas no
extraccin de ADN -y su posterior genticamente modificadas como los que lo
amplificacin por PCR- a partir de la matriz hacen con maces criollos u orgnicos,
alimentaria "polenta", elaborada a partir de comiencen a etiquetar sus productos para
harina de maz, y de amplio consumo en poder diferenciarlos de los productos
nuestra regin. transgnicos y de esta manera poder darles
De las 20 muestras de polenta (enviadas cierto valor agregado, creando la necesidad de
codificadas por el Laboratorio de Bromatologa tener laboratorios que realicen los anlisis y
de la Intendencia Municipal de Montevideo) se puedan certificar la presencia o ausencia de
pudo obtener ADN analizable a partir de 18 de ingredientes genticamente modificados en
ellas mediante una modificacin del protocolo un producto determinado.
de extraccin de Dellaporta. Dichas muestras Si el pas aprueba ser parte del Protocolo
fueron analizadas mediante PCR en busca del de Cartagena, a nivel de importaciones se
promotor 35S presente en todos los eventos debern analizar los cargamentos para
transgnicos aprobados hasta el momento en constatar que las semillas ingresadas, sea para
el Uruguay y el resultado fue positivo para liberacin al ambiente o para consumo
todas, por lo que se concluye que el 100% de humano, animal o pienso, contengan los
las muestras analizadas estn elaboradas al eventos declarados y no otros diferentes, algo
menos en parte por maz genticamente imposible de determinar a simple vista.
modificado. Adems, debern analizarse los cargamentos
Posteriormente se pas a identificar la que estn declarados como sin contenido de
presencia de los eventos Mon810, Bt11 y material genticamente modificado para
Bt176 para las muestras. Los resultados descartar posibles fraudes o contaminaciones.
arrojan que el evento Bt176 no est presente Sumado a esto, debern analizarse los
en ninguna de las muestras pero si lo estn los cargamentos a exportar para asegurar el
eventos Mon810 y Bt11. Se encontr el evento cumplimiento de las exigencias impuestas por
Mon810 en 13 de las muestras y el Bt11 en 14 el importador. Es bien sabido que muchos
de ellas (slo Mon810 en 4 muestras, solo pases de la Unin Europea tienen estrictos
Bt11 en 5 y mezcla de ambos en 9 de ellas). controles sobre los alimentos derivados de
Esto indicara no slo la presencia de Mon810 OGMs por lo que es importante asegurar que
y Bt11 en las muestras, sino tambin la los productos que se exporten hacia all
posibilidad de varios eventos apilados de los cumplan con las normas establecidas.
cuales Mon810 y Bt11 forman parte. Si bien hasta la fecha en nuestro pas hay
Si el 100% de las harinas de maz de las que aprobados para liberacin al ambiente
se pudo obtener ADN contenan maz nicamente tres eventos transgnicos (Bt11,
genticamente modificado, es de esperar que Mon810 y Soja RR), ya se encuentran desde el
muchos alimentos elaborados a base de maz ao pasado varios eventos de maz en etapa
como galletas, pan, aceites, raciones animales, de evaluacin agronmica (ej. GA21, NK603,
entre muchos otros, tambin lo contengan. TC1507, GA21XBT11 y MON810XNK603, estos
Durante la puesta a punto de las metodologas dos ltimos eventos del tipo apilado), y se
se analizaron "nachos" y "cereales de estima que otros tantos entren al mismo
desayuno" de marcas conocidas y ambos tipos proceso este ao. Esto muestra la necesidad
de productos tambin contenan maz GM. de poner a punto a corto plazo todas las
Aunque la legislacin de nuestro pas no metodologas de trazabilidad para estos
exige el etiquetado transgnico en producto eventos.

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Por ltimo, pero no menos importante, y mittels PCR. Bundesgesundheitsblatt 40:

dado se han encontrado efectos negativos 118121.
inesperados en la salud debido al consumo de Finamore, A., M., Roselli, S., Britti, G.,
alimentos derivados de cultivos transgnicos, Monastra, R., Ambra, A., Turrini and E.
se refuerza la necesidad de la deteccin e Mengheri. 2008. Intestinal and peripheral
identificacin de los OGMs que pudieran estar immune response to MON810 maize
presentes en alimentos de consumo masivo ingestion in weaning and old mice. J. Agric.
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