20 Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 1, Nr.

1, Decembrie 2005

Influena anticoagulantelor, pH-ului i integritii hematiilor

asupra procesului de glicozilare in vitro a hemoglobinei
Influence of anticoagulants, pH and integrity of blood cells on haemoglobin
glycation process in vitro

Nemes-Nagy Enik1, Trefor Higgins2, Becky L. Shank2, Pap Zoltn3,

Hobai tefan1
1. UMF Trgu Mure, Disciplina de Biochimie,
2. Centrul de Laboratoare Medicale Dynacare Kasper, Edmonton, Canada,
3. Clinica de Pediatrie II din Trgu Mure

Rezumat
Dintre cele 5 anticoagulante studiate, citratul de Na i K2EDTA s-au dovedit a fi cea mai bun alegere,iar
pH-ul de 7,5-8 este ideal pentru urmrirea in vitro a procesului de glicare. Nu au fost observate diferene reale ntre
probele diluate cu soluie salin i tampon Hepes. Probele cu hematii intacte au prezentat o cinetic mai bun dect
probele hemolizate.

Abstract
From the 5 anticoagulants studied, Na citrate and K2EDTA proved to be the best choices, and pH of 7,5-8
was ideal for following in vitro glycation process. No real difference occurred between samples diluted with saline
and Hepes buffer. Samples with intact blood cells presented a better kinetics compared to hemolized samples.
terapeutice individualizate 4.
Introducere
Scopul studiului
Exist numeroase metode de determinare
a hemoglobinei glicozilate (HbA1c), dintre care Scopul acestui studiu a fost punerea la
metoda cu HPLC este una foarte modern i pre- punct a unei metode de studiere in vitro a proce-
cis 3. n literatura de specialitate sunt raportate sului de glicozilare a hemoglobinei i analiza
cazuri care prezint discrepan ntre valorile gli- efectului diferitelor substane anticoagulante, a
cemice (satisfctoare) i cele de HbA1c (foarte hemolizei i a modificrii pH-ului asupra desf-
ridicate), care sunt presupui "glicatori rapizi", a urrii acestui proces.
cror depistare ar ajuta la alctuirea unei scheme Dac s-ar putea dezvolta o metod satis-
 Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 1, Nr. 1, Decembrie 2005 21

Figura 1. Aspectul unei cromatograme obinute cu ajutorul analizorului Variant II Hemoglobin Testing System
fctoare pentru aprecierea ratei de glicozilare a
hemoglobinei, acesta ar putea oferi un mod de
testare a pacienilor diabetici care sunt presupui
"glicatori rapizi", pentru a optimiza tratamentul
acestora.
Material i metod
S-a realizat incubarea eritrocitelor ntr-o
soluie de glucoz de 25 mmol/l la 37oC i efec-
tuarea unor cromatograme cu analizorul Variant
II Hemoglobin Testing System (funcionnd pe
principiul cromatografiei lichide de nalt presiu-
ne), de la firma Bio-Rad (Figura 1).
S-a ncercat simularea ct mai real a
condiiilor din interiorul organismului uman. Ast-
fel, nu s-a recurs la splarea hematiilor, s-a ncer-
cat evitarea hemolizei prin utilizarea unor probe
proaspete, i meninerea unui pH optim de 7,5.
Am urmrit n special modificarea procentual a
HbA1c i a formei intermediare labile (baz
Schiff).
Am utilizat probe de snge recoltate n
eprubete vacutainer cu: 1). K2EDTA 7,2 mg, 2).
citrat de sodiu tamponat 0,105M, 3). fluorur de
sodiu 15 mg i oxalat de potasiu 12 mg, 4). hepa-
rin 15,9 mg, cu gel i litiu, 5). 1 ml de ACD so-
luie B coninnd citrat trisodic 13,2g/l, acid citric
4,8 g/l i dextroz 14,7 g/l.
Mod de lucru
S-au utilizat probe de snge de la pacieni
diabetici i nediabetici, aduli i copii, recoltate
pe diferite anticoagulante, cu maximum 24 de ore
nainte de analiz. n prima etap de tatonare s-au
utilizat i probe de snge proaspete recoltate de la
voluntari.

Rata de glicare dup Rata de glicare dup Rata de glicare dup

Anticoagulant
adugare de 10 l sol. G 20 l sol. de glucoz 30 l sol. de glucoz
K2EDTA 0,575 1,250 1,505
Heparin 0,590 1,255 1,375
NaF/oxalat de K 0,870 1,360 1,615
ACD soluie B 0,980 1,490 1,615
Tabelul 1. Rate de glicare
22 Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 1, Nr. 1, Decembrie 2005

Ore LA1c% I LA1c% H A1c% I A1c% H P3% I P3% H

3 1,895 2,03 0,056 -0,1 0,52 0,72
6 2,45 2,91 -0,003 -0,14 0,82 1,04
10 2,54 3,15 0,06 -0,09 1,35 5,61
25 2,02 4,06 0,14 -0,07 1,11 11,57
28 1,873 4,01 0,15 -0,042 1,202 12,26
31 1,88 4,17 0,2 -0,025 1,3 12,89
48 0,95 4,02 0,29 0,017 1,09 14,38
Tabelul 2. Evoluia fraciunilor LA1c, HbA1c i P3 (%) la probele recoltate pe K2EDTA (I: probe de
snge intacte, diluate cu ser fiziologic, H: probe de snge hemolizate, diluate cu ap bidistilat)

La probele recoltate pe EDTA am utilizat la aceste dou cromatograme a fost considerat

doar eprubete care au coninut cel puin 3 ml de
snge n tubul de 4 ml, fiindc soluia de EDTA
la concentraii de peste 2 mg/ml micoreaz talia
eritrocitelor i afecteaz permeabilitatea
membranar a acestora 2.
S-a efectuat o analiz cromatografic,
dup care s-a diluat sngele 1:1 cu ser fiziologic,
ap bidistilat sau tampon Hepes (20 mmol/l) i
s-a adugat soluia de glucoz. S-a efectuat o
nou cromatogram, apoi probele au fost
incubate. Media procentelor fraciunilor obinute
P ro b e p e ED T A i n ta cte i h e m o l itice
valoarea de baz.
S-a urmrit n timp modificarea
aspectului cromatogramelor i s-au utilizat pentru
calcul ariile corespunztoare hemoglobinei
glicozilate (HbA1c) i a fraciunii labile ale
acesteia (LA1c), transformate n procentaj,
considernd 100% aria hemoglobinei A. S-a
urmrit i evoluia fraciunii P3, n care am
presupus c ar fi eluate de asemenea unele forme
glicozilate de hemoglobin. n vederea
reprezentrii grafice a rezultatelor, s-a calculat

4 .5
4
3 .5
3
LA 1c % I
2 .5
LA 1c % H
% 2 A 1c % I
A 1c % H
1 .5
P 3% I
1
0 .5
0
-0 .5 0 3 6 10 25 28 31 50
o re
Figur 2. Evoluia fraciunilor LA1c, HbA1c i P3 (%) la probele recoltate pe K2EDTA (I: probe de
snge intacte, diluate cu ser fiziologic, H: probe de snge hemolizate, diluate cu ap bidistilat)
 Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 1, Nr. 1, Decembrie 2005
diferena n procente ntre valorile obinute pe
parcursul urmririi procesului de glicozilare in
vitro i valorile iniiale, considerate ca valori de
baz.
Toate analizele pentru probe, controale,
calibratori precum i manevrele de curare ale
aparatului au fost efectuate conform manualului
de instruciuni corespunztor aparatului Variant
II Hemoglobin Testing System de la firma Bio-
Rad 1.
Rezultate
S-a constatat c evoluia procesului de
glicozilare in vitro este cel mai favorabil cnd
dup adugarea de glucoz, nivelul glicemiei
plasmatice din probele utilizate se situeaz n ju-
rul valorii de 30 mmol/l. Aceast concentraie se
poate realiza prin adugarea de 40 l din soluia
de glucoz de 25 mmol/l la probele de snge di-
luate (1 ml snge total amestecat cu 1 ml ser fizi-
ologic, tampon Hepes sau ap bidistilat).
S-au testat mai multe substane anticoa-
gulante: heparin, K2EDTA, ACD soluie B,
NaF, citrat de sodiu, i s-a msurat pH-ul plasma-
P robe cu citra t de Na
2.5
2
1.5
% 1
0.5
0
0 3.5 7 10
-0.5
ore
Figur 3. Evoluia fraciunilor LA1c, HbA1c i P3 (%) la probele recoltate pe citrat de sodiu (S: probe
diluate cu ser fiziologic, T: probe diluate cu tampon Hepes)
23
tic din probele recoltate pe acestea.
Eprubetele cu heparin au coninut un
strat de gel care a separat faza de celule sanguine
de plasm, astfel aceste tuburi s-au putut utiliza
doar pentru prelucrarea unor probe proaspete de
snge, recoltate de la voluntari. PH-ul acestor
probe a fost de 8,5.
Probele care s-au recoltat pe NaF/oxalat
de K au prezentat hemoliz evident, astfel acest
amestec anticoagulant nu este o alegere bun
pentru urmrirea glicozilrii in vitro a hematiilor,
dac dorim s simulm condiiile fiziologice i
ncercm s meninem eritrocitele intacte. PH-ul
acestor probe a fost de 8,5 uniti.
Eprubetele cu ACD soluie B conin dex-
troz n compoziia acestui amestec, astfel con-
centraia de glucoz plasmatic din probele recol-
tate n aceste tuburi a fost mult mai ridicat com-
parativ cu celelalte eprubete. PH-ul acestor probe
a fost de 8 uniti.
Rezultate satisfctoare s-au putut obine
cu probe de snge recoltate pe K2EDTA i citrat
de sodiu. PH-ul probelor recoltate pe K2EDTA a
fost de 8 uniti, iar plasma probelor de citrat de
sodiu au avut pH-ul de 7,5 uniti, valoare optim
care simuleaz condiiile de uoar alcalinitate
LA1c% S
LA1c% T
A1c % S
A1c % T
P3% S
P3% T
23 28 31 48
24 Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 1, Nr. 1, Decembrie 2005

din torentul sanguin. Prin adugare de tampon
Hepes, acelai pH de 7,5 s-a putut obine i n ca-
zul probelor de snge recoltate pe K2EDTA.
Am calculat i comparat rata de glicare n
cazul probelor recoltate pe diferite substane anti-
coagulante (K2EDTA, heparin, NaF/oxalat de K,
ACD soluie B). Am luat n calcul procentajul
fraciunii labile (LA1c), mai exact diferena din-
tre valoarea obinut dup diferite perioade de in-
cubare i cea iniial, raportat la unitatea de timp
(o or). Probele au coninut snge nediluat, la ca-
re s-au adugat cantiti diferite din soluia de
glucoz de 25 mmol/l (10, 20, 30 l).
Mediile din primele dou ore a ratelor de
glicare corespunztoare diferitelor condiii sunt
cuprinse n Tabelul 1. n cadrul acestui experi-
ment fiecare eprubet a coninut snge proaspt
prelevat de la aceeai persoan voluntar.
Pe baza tabelului ratele de glicare la pro-
bele cu K2EDTA i heparin seamn mult, dup
adugare de 20 l din soluia de glucoz 25
mmol/l, cifrele sunt chiar identice.
Probele care au prezentat hemoliz (re-
coltate pe NaF/oxalat de K) arat rate de glicare
mai ridicate, iar ratele cele mai mari sunt la pro-
bele recoltate pe ACD soluie B.
Pe baza rezultatelor de mai sus corobora-
te cu valorile glicemice obinute la aceste probe,
s-a hotrt continuarea experimentelor utiliznd
20 l soluie de glucoz 25 mmol/l la 1 ml de
snge integral, astfel la probele diluate 1:1, s-a
adugat 40 l din soluia de glucoz. Asfel am
obinut glicemii plasmatice n intervalul 29,7 -
36,4 mmol/l (media fiind 31,86 mmol/l), n func-
ie de glicemia iniial a probelor respective.
n etapa urmtoare am comparat procesul
de glicare la probele hemolizate (1 ml snge inte-
gral + 1 ml ap bidistilat) i la probele la care
am ncercat s meninem hematiile intacte (1 ml
snge integral + 1 ml ser fiziologic), utiliznd
probe recoltate pe K2EDTA, cu cte 40 l din so-
luia de glucoz (rezultate n tabelul 2 i pe figura
2).
Pe figura 2 nu a fost redat evoluia frac-
iunii P3 (%) n cazul probelor hemolizate, dato-
rit valorilor foarte ridicate obinute ncepnd de
la 10 ore de incubare, probabil din cauza unor
cantiti mari de produse de degradare acumulate
n aceste probe.
S-a urmrit procesul de glicare timp de
48 ore, la probe pe K2EDTA i citrat de sodiu.
Fiecare prob a fost mprit n trei. n prima
eprubet sngele a fost diluat 1:1 cu ser fiziologic
i s-a adugat 40 l din soluia de glucoz, n a

P robe c u E D TA

2 .5

2 LA 1c % S
LA 1c % T
1 .5 A 1c % S
% A 1c % T
1
P 3% S
0 .5 P 3% T

0
0 3 6 10 22 28 31 48
ore
Figur 4. Evoluia fraciunilor LA1c, HbA1c i P3 (%) la probele recoltate pe K2EDTA (S: probe de
snge diluate cu ser fiziologic, T: probe de snge diluate cu tampon Hepes)
 Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 1, Nr. 1, Decembrie 2005 25

doua eprubet sngele a fost diluat cu tampon Concluzii i discuii

Hepes i s-a adugat 40 l din soluia de glucoz,
iar sngele din a treia eprubet a fost diluat i
incubat fr adugare de glucoz pentru a vedea
evoluia fraciunilor n lipsa forrii procesului de
glicare. Rezultatele apar pe figurile 3 i 4.
Pe grafic, fraciunea P3 are o evoluie
asemntoare cu LA1c, astfel putem presupune
c i P3 are legtur cu procesul de glicozilare.
Ambele prezint o maxim la 10 ore de incubare.
Nu apar diferene notabile ntre probele diluate cu
tampon i cele diluate cu ser fiziologic. HbA1c
dup o mic variaie negativ, crete evident de la
10 ore dup adugarea de glucoz, care cores-
punde cu panta descrescnd prezentat de LA1c.
Comparnd figurile 3 i 4, la probele pe
K2EDTA diferena dintre valorile de LA1c (%) i
P3 (%) sunt mai mari, iar la probele pe citrat de
sodiu, graficele lor au evoluii foarte apropiate.
HbA1c prezint o evoluie exclusiv deasupra li-
niei de baz n cazul probelor recoltate pe
K2EDTA. Evoluia fraciunilor la probele diluate
i incubate fr adugare de glucoz a fost com-
plet diferit fa de cele anterioare (Figura 5).
Dintre anticoagulantele utilizate am obi-
nut cele mai bune rezultate cu citratul de sodiu i
K2EDTA. Utilizarea tamponului Hepes pentru
meninerea pH-ului fiziologic i a integritii ce-
lulelor nu a adus modificri importante n cineti-
ca reaciei de glicare.
Probele intacte au prezentat o cinetic
reproductibil, cu pant ascendent i descenden-
t, iar la cele hemolizate fraciunile LA1c i P3
au avut valori tot mai mari dup 10 ore, iar A1c a
prezentat de multe ori valori mai mici dect cele
iniiale. Astfel s-ar putea recomanda urmrirea
procesului de glicozilare preferabil pe hematii in-
tacte, minimaliznd riscul ca produii de degrada-
re s modifice aspectul cromatogramelor.
Pe grafice se poate observa c la 21-25
de ore de incubare, survine o scdere important
a procentajului fraciunilor LA1c i P3, ceea ce s-
ar putea explica prin lipsa amestecrii probelor
peste noapte, fiindc aceste puncte au fost obinu-
te de diminea.
Pe baza datelor se poate afirma c fraci-
unea P3 are legtur cu procesul de glicozilare,
evoluia sa avnd aspect asemntor cu graficul

P ro be c u E D T A , c u s er fizio lo gic , fara G

3
2.5
2
1.5 LA 1c %
% A 1c %
1 P 3%

0.5
0
-0.5 0 6 10 23
o re
Figur 5. Evoluia fraciunilor LA1c, HbA1c i P3 (%) pe parcursul incubrii fr adugare de glucoz
la probele recoltate pe K2EDTA i diluate cu ser fiziologic
26 Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 1, Nr. 1, Decembrie 2005
prezentat de fraciunea LA1c.
Fraciunea HbA1c are o evoluie n jurul
liniei de baz, dup care prezint o cretere lent,
dar evident. Dei n literatur s-a semnalat posi-
bilitatea ca reacia de transformare a bazei Schiff
n cetimin s fie reversibil 4, totui aceste
mici scderi sub linia de baz ale HbA1c nu ar
justifica pe deplin aceast explicaie, fiindc de-
viaiile sunt foarte mici i ar putea fi datorate
unor inexactiti de determinare ale aparatului.
Bibliografie
1. Bio-Rad Laboratories: Instruction Manual - Variant
II Hemoglobin A1c program, 2003 Sept.,
L70200107
2. Choen RM, Holmes YR, Chenier TC, Joiner CH:
Discordance between HbA1c and fructosamine,
Diabetes Care, 2003, 26(1): 163-7
3. Higgins T., Beutler E., Doumas B.: Hemoglobin,
Iron and Bilirubin, in: Burtis CA, Ashwood ER,
Bruns D. (eds): Tietz Textbook of Clinical
Chemistry and Molecular Diagnostics, Ed. Elsevi-
er Saunders, 2006, p. 1165-1208
4. Mortensen HB, Christophersen C: Glucosylation of
human haemoglobin a in red blood cells studied in
vitro. Kinetics of the formation and dissociation of
haemoglobin A1c, Clin Chim Acta, 1983,
134(3):317-26