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JULIANO TONIATO
BOTUCATU SP
Agosto 2013
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO
FACULDADE DE CINCIAS AGRONMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
JULIANO TONIATO
BOTUCATU SP
Agosto - 2013
V
AGRADECIMENTOS
SUMRIO
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LISTA DE TABELAS............................................................................................... X
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... XII
LISTA DE EQUAES........................................................................................... XIII
RESUMO................................................................................................................... 1
SUMMARY............................................................................................................... 4
CAPTULO I............................................................................................................. 5
CONSIDERAES INICIAIS................................................................................. 6
1.1. INTRODUO............................................................................................. 6
1.2. REVISO BIBLIOGRFICA...................................................................... 7
1.2.1. Leveduras alcolicas - Saccharomyces cerevisiae............................ 7
1.2.2. Taxonomia........................................................................................... 7
1.2.3. Metabolismo: Fermentao alcolica e respirao.............................. 8
1.2.4. Fermentao alcolica........................................................................ 9
1.2.5. Cintica .............................................................................................. 9
1.3. REFERNCIAS.............................................................................................. 14
CAPTULO II............................................................................................................ 16
VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA
COMPARAR A PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE
LEVEDURAS..... 16
RESUMO................................................................................................................... 16
SUMMARY............................................................................................................... 16
2.1. INTRODUO.............................................................................................. 17
2.2. MATERIAL E MTODOS............................................................................ 19
2.3. RESULTADOS E DISCUSSO.................................................................... 22
2.4. CONCLUSES.............................................................................................. 29
2.5. AGRADECIMENTOS................................................................................... 29
2.6. REFERNCIAS.............................................................................................. 30
IX
CAPTULO III.......................................................................................................... 35
ANEXOS................................................................................................................... 36
CAPTULO IV.......................................................................................................... 58
CONSIDERAES FINAIS.................................................................................... 59
X
LISTA DE TABELAS
Pgina
CAPTULO II............................................................................................................. 16
VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA
COMPARAR A PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE
LEVEDURAS............................................................................................................. 16
Tabela 2.1: Velocidade especifica () a partir da fermentao dos trs mostos..... 22
Tabela 2.2. Consumo de acar, produo de etanol e quociente respiratrio . 25
Tabela 2.3. Fatores de converso paras os mostos testados ... 27
Tabela 2.4. Caracterizao da matria prima utilizada no preparo dos mostos ......... 28
CAPTULO III............................................................................................................ 35
FERMENTAO DO MELAO.............................................................................. 36
Tabela 3.1 Etanol produzido (g/L) durante a fermentao do mosto de melao. 36
Tabela 3.2 Acar (g/L) consumido durante a fermentao do mosto de melao 37
Tabela 3.3 Biomassa (g/L) produzida durante a fermentao do mosto de
melao......................................................................................................................... 38
Tabela 3.4 Velocidades Instantneas de produo de etanol (g/L.h) produzida
durante a fermentao do mosto de melao................................. 38
Tabela 3.5 Velocidades Instantneas de consumo de substrato (g/L.h) durante a
fermentao do mosto de melao................................................................................ 39
Tabela 3.6 Velocidades Instantneas de produo de Biomassa (g/L.h) durante a
fermentao do mosto de melao................................................................................ 39
Tabela 3.7 - Valores de Max para a consumo de substrato (S), produo de
etanol (P), e biomassa (X) ..................................................................................... 40
Tabela 3.8 Comparao estatstica entre os fatores de converso calculados a
partir dos dados experimentais.................................................................................... 41
FERMENTAO DO CALDO DE CANA ....... 43
Tabela 3.9 Etanol produzido (g/L) durante a fermentao do mosto caldo de cana 43
Tabela 3.10 Acar consumido (g/L) durante a fermentao do caldo de cana...... 44
XI
LISTA DE FIGURAS
Pgina
CAPTULO I...................................................................................................................... 5
CONSIDERAES INICIAIS.......................................................................................... 6
Figura 1.1. (A) representao linear das fases do crescimento e (B) representao
semilogartmica................................................................................................................... 11
Figura 1.2: Curvas tpicas da variao das concentraes dos componentes de uma
fermentao................................................................................................................. 12
CAPTULO II..................................................................................................................... 15
VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA COMPARAR A
PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE LEVEDURAS.................... 16
Figure 2.1: Ethanol production (g L-1) during the 10 hours of experiment 23
Figure 2.2: Sugar consumption (g L-1 ) during the 10 hours of experiment... 24
Figure 2.3: Biomass production (g L-1 ) during the 10 hours of experiment.. 26
CAPTULO III.................................................................................................................... 35
FERMENTAO DO MELAO...................................................................................... 36
Figura 3.1 Planilha do Excel utilizada para o clculo das velocidades especficas.......... 40
Figura 3.2 Representaes grficas dos dados obtidos durante a fermentao do
melao................................................................................................................................ 42
FERMENTAO DO CALDO DE CANA...................................................................... 39
Figura 3.3 Representaes grficas dos dados obtidos durante a fermentao do caldo
de cana................................................................................................................................ 50
FERMENTAO DO CALDO DE MOSTO MISTO...................................................... 51
Figura 3.4 Representaes grficas dos dados obtidos durante a fermentao do caldo
de cana............................................................................... ................................................ 57
XIII
LISTA DE EQUAES
Pgina
CAPTULO I.............................................................................................................. 5
CONSIDERAES INICIAIS.................................................................................. 6
Equao 1.1: Clculo das velocidades instantneas de consumo de substrato,
produo de etanol e biomassa ................................................................................... 12
Equao 1.2. Clculo das velocidades especificas de consumo de substrato,
produo de etanol e biomassa ................................................................................... 12
Equao 1.3. Fator de converso de substrato em produto...................................... 13
Equao 1.4. Fator de converso de substrato em Biomassa.................................. 13
Equao 1.5: Tempo de gerao caracterstico de cada cepa .................................... 13
CAPTULO II............................................................................................................. 16
VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA
COMPARAR A PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE
LEVEDURA............................................................................................................... 16
Equao 2.1. Clculo das velocidades instantneas de consumo de substrato,
produo de etanol e biomassa ................................................................................... 20
Equao 2.2. Clculo das velocidades especificas de consumo de substrato,
produo de etanol e biomassa ................................................................................... 20
Equao 2.3. Clculo dos fatores de converso .......................................................... 21
Equao 2.4. Clculo dos fatores de converso .......................................................... 21
Equao 2.5. Quociente respiratrio........................................................................... 21
Equao 2.6. Equao de Boltzmann.......................................................................... 21
1
RESUMO
impacto social, poltico e ambiental. O objetivo deste trabalho foi descrever a cintica
escolhidas foram BG-1, CAT-2 e PE-2 (de destilarias) e UNIFERM (levedura seca de
acares redutores, etanol e massa celular. A linhagem BK foi a que apresentou maior
velocidade de produo de etanol e consumo de substrato. CAT-1 foi a que mais produziu
etanol. As duas linhagens formam o grupo das rpidas enquanto as linhagens PE-2 e BG-1
foram as que apresentaram as menores velocidades ficando no grupo das lentas. PE-2
apresentou dois dos maiores fatores de converso YP/S enquanto a BG-2 tendeu a consumir
uma vez que esto ligados velocidade, eles esto fortemente associadas formao e
densidade da espuma.
SUMMARY
Ethanol is a greenhouse-friendly fuel with immense social, political and environmental
impact. Our objective was to describe fermentative performance and yield for four yeast
strains from Brazilian ethanol plants during the fermentation of three types of must - molasses,
Sugar cane and mixed must (sugarcane and molasses). We used BG-1, CAT-2 e PE-2 (ethanol
plant strains) e UNIFERM (dry bakers yeast). Fermentations were carried in triplicates. Each
hour we collected and analyzed samples for reducing sugars, ethanol and biomass. Yeasts
were split into two groups fast and slow fermenters. For the fast fermenter BK has shown the
4
highest speed values for both substrate consumption and ethanol production while CAT-1 had
the highest ethanol yield. For the slow fermenter PE-2 had two of the greatest YP/S factors
while BG-1 tended to use sugar through aerobic pathways. Kinetic parameters could not be
related to ethanol yielding although, they are directly connected to foam formation and its
characteristics.
CAPTULO I
6
CONSIDERAES INICIAIS
1.1 INTRODUO
e seu custo competitivo sem os subsdios que viabilizaram o programa no seu incio, o
Prolcool. Alm disso, desde os tempos do Brasil colnia, a cultura da cana-de-acar tem
sido uma grande fonte de riqueza para a economia brasileira (SCHNEIDER. et al., 2012).
Hoje, o Brasil o maior produtor mundial de cana-de-acar e etanol com crescente
aumento na produo. No primeiro semestre de 2012 foram exportados mais de 595 mil litros
e em 2011 foram exportados mais de 2 milhes de litros (UNICA, 2012).
de fermentao.
1.2.2 Taxonomia
(CARVALHO et al., 2007). Thomson et al. (2005) confirma essas informaes dizendo que a
alta concentrao de glicose acelera a gliclise, com produo de quantidades de ATP pela
fosforizao do substrato. Esse mecanismo reduz a necessidade da fosforilao oxidativa,
diminuindo no final da via a necessidade de oxignio. O autor afirma que esse fenmeno
surgiu de mecanismos de competio derivados da natureza antissptica do etanol.
1.2.5 Cintica
Figura 1.1 - Parte superior (A), a representao linear das fases do crescimento e na parte inferior (B), a
representao semilogartmica (Fonte: HISS (2001).
Figura 1.2: Curvas tpicas da variao das concentraes dos componentes de uma fermentao, onde S, X, P,
representam substrato, levedura e produto respectivamente e S0, X0 seus valores iniciais (HISS (2001).
(1.1)
(1.2)
(1.3)
(1.4)
Hiss (2001) ainda descreve que a fase exponencial de crescimento tambm tem como
caracterstica o tempo de gerao tg, ou seja, o tempo necessrio para que o valor da
concentrao celular dobre (logo X = 2Xi)
Assim,
ou (1.5)
BATISTOTE, M. et al. Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil. Cincia e
Natura, Ufsm, v. 2, n. 32, p.83-95, 2010.
FURLETTI, M.E.M. Fatores fsicos qumicos que interferem na fermentao alcolica. In:
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PEREIRA, Jr. N.; COUTO, M.A.P.G.; ANNA, L.M.M. Santa. Biomass of lignocellulosic
composition for fuel ethanol production and the context of biorefinery. v.2 Rio de Janeiro:
Ed. Amiga Digital Ufrj, 2008. 45 p. (Biotechnology).
THOMSON, J.M. et al. Resurrecting ancestral alcohol dehydrogenases from yeast. Nature
genetics, v.6, p.630635, 2005.
CAPTULO II
16
RESUMO
ABSTRACT
Since Pasteur yeast selection is used as technique for detecting strains with certain properties.
Nowadays, some strains have been already isolated from Brazilian ethanol plants. Our
objective was to describe and compare kinetic behavior of four strains used in Brazilian
ethanol plants during the fermentation of musts made of sugar cane, molasses and mixed must
of sugarcane juice and molasses and check whether specific velocity () is a good tool to
compare yeasts performance. We used BG-1, CAT-2 e PE-2 (ethanol plant strains) and BK
(dry bakers yeast). Fermentations were carried in triplicates. We collected samples each hour
and then, analyzed them for reducing sugars, ethanol and biomass. CAT-1 and BK are fast
fermenters, BK was the fastest fermenter with the greatest velocities (rs, rp, s and p) while
CAT-1 had the greatest ethanol yield and substrate conversion in two musts (YP/S) and the
second highest s and s. Yet, BG-1 tends to show high QR, thus good growth and PE-2 didn`t
finish the process. s and P values were not related to ethanol yielding and substrate
conversion, although these parameters seem to have a direct correlation to foam formation and
density.
2.1 INTRODUO
Anlises qumicas
Aps serem descongeladas, as amostras foram analisadas para acares redutores (AR), etanol
e biomassa, de acordo com os seguintes protocolos.
Acares redutores Mtodo colorimtrico atravs da oxidao com o cido
dinitrosaliclico (DNS), descrito por Miller (1959) e adaptado por Lopes et al. (2010)
20
Etanol Oxidao do etanol pelo dicromato de potssio descrito por Joslyn (1970)
Biomassa Mtodo gravimtrico descrito por Cooney (1981).
Parmetros cinticos
Velocidade instantnea.
(1)
Velocidade especifica
As velocidades instantneas so importantes ferramentas na descrio da performance
em condies especificas entretanto, ela no suficiente para comparar e descrever diferente
mostos e diferentes concentraes de inculo a quantidade de complexo enzimtico
responsvel pela fermentao varia, o que afeta diretamente a transformao S-P. possvel
normalizar as taxas, dividindo-se os valores de r pela sua biomassa correspondente. O
resultado conhecido como velocidade especifica () descrita na frmula 2 (GADEN, 1955).
(2)
Fator de converso
(4)
Coeficiente respiratrio
(5)
Anlise estatstica
(6)
22
2.3.RESULTADOS E DISCUSSO
igure 1
23
1
Figura 2: Consumo de acar (g L-1) durante as 10 horas de experimento.
25
CAT-1 a outra linhagem do grupo das rpidas sendo que a fermentao acabou por
volta da quinta hora. Mesmo estando em Segundo nos valores cinticos de S e P, a levedura
apresentou a maior produo absoluta de etanol nos trs motos testados (tabela 2).
Tabela 2.2 Consumo de acar (g), produo de etanol (g) e quociente respiratrio dos
trs mostos testados.
BG-1 PE-2 CAT-1 BK
S melao 108.13 105.16 107.61 106.58
Etanol melao 39.23 46.14 46.21 44.76
QR melao 2.92 4.27 4.00 3.78
S caldo de cana 106.17 81.01 109.47 108.11
Etanol caldo de
cana 36.22 31.38 40.75 38.45
QR caldo de cana 2.22 2.77 2.37 2.66
S misto 98.17 97.11 99.44 103.92
Etanol misto 38.03 31.38 40.75 37.70
QR misto 2.80 2.16 3.22 2.49
TA Etanol total em g: S acar residual aps as 10 horas de fermentao e QR
quociente respiratrio.
Silva (2011) chama o grupo de Tumultuosa e mostra outra caracterstica desse tipo de
fermentao para o autor toda a produo e liberao de CO2 e calor esto concentradas na
fase exponencial e consequentemente na espuma. Usinas cujo tempo um fator importante e
que esto preparadas para o calor e espuma formados podem se beneficiar das leveduras desse
grupo.
No grupo das lentas esto as linhagens BG-1 e PE-2. PE-2 apresentou a maior
quantidade de acar residual aps as dez horas de experimento, por outro lado apresentou os
maiores valores de converso (yP/S) em dois dos trs mostos testados (tabela 3). Conclui-se que
26
a fermentao no havia acabado e que respeitado sua velocidade, ela poderia produziria
quantidades satisfatrias de etanol. No grfico isso verificado pela baixa inclinao da curva.
tudo isso possvel concluir que as velocidades especificas mximas esto diretamente
associadas espuma e suas caractersticas.
2.4.CONCLUSO
2.5. AGRADECIMENTOS
2.6. REFERNCIAS
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CAPTULO III
36
Figura 3.1 Exemplo de planilha do Excel utilizada para o clculo das velocidades
especficas. Ela foi construda de acordo com o proposto por Hiss (2001). X(g/L) a
concentrao horria da Biomassa, M(g/L) a concentrao do componente que se prentende
calcular o , dM/dt o a velocidade instanea r e m a velocidade especfica.
Tabela 3.7 - Valores de Max para a consumo de substrato (S), produo de etanol
(P), e biomassa (X)
S rS P rP X
BG-1 1.17a 86,70a 0.11b 13.86a 0,050b
PE-2 1.38a 88,90a 0.13ab 13.00a 0,013a
CAT-1 1.39a 90,97a 0.14ab 20.29a 0,08ab
BK 1.41a 91,54a 0.23 a 20.63a 0,11a
Valores de Max para a consumo de substrato (S), produo de etanol (P), e
biomassa (X), bem como as velocidades instantneas mximas para o consumo de
substrato (rS), produo de etanol (rP) durante a fermentao do melao. Letras
diferentes indicam valores diferentes (p>5). Os dados so referentes fermentao do
melao. Os valores foram calculados a partir dos dados experimentais.
41
Siglas
BG-1 - Usina Barra Grande,
CAT-1 - Usina Catanduva
PE-2 - Usina da Pedra
BK Levedura de Panificao, marca UNIFERFM
Siglas
BG-1 - Usina Barra Grande,
CAT-1 - Usina Catanduva
PE-2 - Usina da Pedra
BK Levedura de Panificao, marca UNIFERFM
Tabela 3.22 Valores de Max para a consumo de substrato (S), produo de etanol (P), e
biomassa (X), bem como as velocidades instantneas mximas para o consumo de substrato
(rS), produo de etanol (rP) e o intervalo de tempo. Letras diferentes indicam valores
diferentes (p>5). Os dados so referentes aos dados experimentais do mosto misto de melao
e cana-de-acar.
CAPTULO IV
59
CONSIDERAES FINAIS
cromatografia gasosa.
Estudos futuros sobre cintica da fermentao podem envolver o perfil de consumo dos
diferentes acares e a formao de compostos secundrios. Ainda pode ser sugerido um
estudo gentico e quantitativo da dinmica populacional das linhagens durante a fermentao
alcolica.