Sunteți pe pagina 1din 5

Tehnica FISH (Hibridizarea fluorescent in situ)

Hibridizarea fluorescent in situ (FISH Fluorescence in situ Hybridization) este o tehnic de


citogenetic molecular utilizat n scopul identificrii anomaliilor cromozomiale, numerice i
structurale care nu pot fi detectate prin cariotipare.

Principiul metodei:
Metoda const n ataarea la secvena-int a unei sonde
de ADN monocatenar (de circa 40 kb), marcat fluorescent,
pe baza complementaritii, de o secven-int a unui
cromozom.
Hibridizarea sondei cu ADN-ul celular este vizualizat la
microscopul cu fluorescen echipat cu filtre de excitaie i
emisie, ceea ce permite citirea semnalelor specifice zonei-
int. Se numr i se analizeaz semnalele prezente n o
sut de celule (de ex., trei semnale fluorescente specifice
pentru cromozomul 21 indic sindromul Down- Trisomia
21).

Exist mai multe tipuri de sonde, n funcie de tipul de anomalie cromozomial suspicionat:
Sonde specifice unui locus, pentru identificarea deleiilor sau duplicaiilor
submicroscopice (care nu sunt vizibile utiliznd cariotipul convenional). Absena
semnalului fluorescent corespunztor sondei pe un anumit cromozom, nseamn deleia
(absena) zonei respective. Apariia a dou semnale diferite corespunztoare sondei,
indic o microduplicaie. Aceste sonde sunt folosite i pentru identificarea punctelor de
ruptur cromozomiale n cazul translocaiilor (anomalii de structur care presupun un
schimb de fragmente intre doi sau mai multi cromozomi).
Astfel de sonde pot fi utile in diagnosticarea sindroamelor produse prin microdeleii sau
microduplicaii cromozomiale: Williams, Beckwith-Wiedemann, Prader-Willi, Angelman, velo-
cardio-facial (Di George), cat-eye etc. Fenotipul acestor sindroame include dismorfie facial,
retard mental i diverse malformaii.
Sondele centromerice au rol n identificarea unui anumit cromozom i/sau detectarea
anomaliilor numerice ale cromozomului respectiv.
Sondele telomerice permit diagnosticarea microdeleiilor sau altor rearanjamente
criptice.
Sonde subtelomerice
Sondele specifice unui cromozom permit colorarea ntregului cromozom sau doar a
unei regiuni. Prin colorarea diferit a doi sau mai muli cromozomi se pot identifica mici
rearanjamente n care acetia sunt implicai.

FISH metafazic
ntruct aceast metod presupune ca prim etap de lucru obinerea unor culturi celulare de
limfocite din snge periferic sau amniocite recoltate prin amniocentez n sptmnile 15-17 de
sarcin), rezultatul investigaiei este obinut n dou sptmni.
FISH-ul metafazic aduce in plus fata de cariotip sau de FISH-ul interfazic detalii despre
anomaliile de structura ale cromozomilor.

FISH-ul interfazic

Permite punerea n eviden a anomaliilor numerice, detecia sexului genetic ntr-un timp scurt
(48-72 h). Se realizeaz pe nuclei interfazici fr s fie nevoie de efectuarea de culturi celulare.
Se folosesc sonde de ADN corespunztoare regiunilor centromerice ale cromozomilor
18, X, Y (CEP18, CEPX, CEPY), respectiv sonde locus specifice pentru cromozomii 13 i 21 (LSI13,
LSI21). Metoda este mai puin informativ n cazul contaminrii cu celule materne (comparativ
cu alte tehnici).
FISH-ul interfazic este indicat a fi folosit ca test de screening rapid atunci cnd exist semne de
alert ecografic sau biochimic (dublu test, triplu test), iar ulterior se recomand o evaluare
citogenetic complet.

Avantaje:
Mai puin laborioas
Mai rapid dect citogenetica clasic (cariotiparea): 48 h vs 2-3 sptmni
Foarte sensibil la detectarea rearanjrilor, amplificrilor, deleiilor
Poate subselecta populaiile celulare
Preparare direct
Dezavantaje:
o Interpretarea rezultatelor este subiectiva
o Modele obinute complexe i greu de interpretat
o grad mai mic de automatizare
o nu determina anomalii structurale ale cromozomilor

Bibliografie:
http://www.bcsls.net/pages/documents/Smith-Fluorescenceinsituhybridization-FISHing.pdf
http://geneticlab.ro/images/pages_files/Testul%20FISH.pdf
http://www.materno-fetala.ro/171_Medicina-materno-fetala/Genetica-medicala/FISH-ul-
metafazic.html
http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/fluorescence+in+situ+hybridization
Tehnica PCR (Reacia de Polimerizare n Lan)

Reacia PCR (Polymerase Chain Reaction) este o metod de amplificare enzimatic in


vitro a unei anumite secvene de ADN. Din punct de vedere chimic, reacia PCR este constituit
din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce
hibridizeaz cu cele 2 catene ale secvenei originale (folosit ca matri n replicare). Primerii
reprezint secvene oligonucleotidice monocatenare de 20-30 baze care sunt obinute prin
sintez artificial. PCR se bazeaz pe hibridarea ADN cercetat - primer i replicarea
semiconservativ a ADN.
Diferena esenial ntre o asemenea reacie de replicare i un proces de replicare ADN
in vivo, l reprezint faptul c n reacia PCR etapa de desfacere a dublului helix matri i,
respectiv, cea de ataare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor
trepte de temperatur, iar singura enzim folosit n reacie este o ADN polimeraz ADN-
dependent (cu funcie de replicaz).

Treptele de temperatur ale unei reacii


PCR standard

o Denaturarea iniial
Pentru ca o reacie PCR s se desfoare
eficient, este foarte important ca
moleculele ADN matri s fie denaturate
iniial complet. Acest lucru poate fi realizat
prin nclzirea iniial a amestecului de
o
reacie 2 min la 94-95 C.
o Treapta de denaturare din cadrul
fiecrui ciclu
De obicei, este suficient o denaturare de
o
20-30 sec la 94-95 C, dar aceasta trebuie
adaptat funcie de termocycler i de
tuburile folosite (de ex., dac se lucreaz n
tuburi de 500 l sunt necesari timpi mai
lungi dect dac se lucreaz n tuburi de 200 l). Totodat,
pentru matrie bogate n GC se recomand folosirea unor timpi
de denaturare mai lungi.
o Ataarea primerilor
n marea majoritate a experimentelor, temperatura de ataare a
primerilor trebuie determinat i optimizat empiric. Alegerea acestei temperaturi reprezint
unul din factorii cei mai critici pentru asigurarea unei nalte specificti a reaciei PCR. Dac
temperatura de ataare este mult prea nalt, nu are loc ataarea primerilor, iar dac
temperatura este prea sczut, atunci crete probabilitatea atarilor nespecifice.
o Polimerizarea propriu-zis
o
Taq ADN pol polimerizeaz aproximativ 60 baze per secund la 72 C. In fiecare ciclu, o perioad
de polimerizare de 45s este suficient pentru amplificarea unor fragmente de pn la 1 kbp.
Pentru amplificarea unor fragmente mai mari de 1 kbp, timpul se calculeaz n multiplii de 45s,
urmat de ajustri pentru diverse matrie.
Pentru a obine o cantitate ct mai mare de amplicon, se poate varia timpul de polimerizare,
astfel: pentru primele 10 cicluri se folosete un timp constant de polimerizare (de ex. 45s
pentru 1 kbp), iar pentru urmtoarele 20 de cicluri se crete timpul de polimerizare cu 2-5s per
ciclu (de ex. 50s pentru ciclul 11, 55s pentru ciclul 12 etc). O asemenea mrire progresiv a
timpului de polimerizare ofer enzimei mai mult timp pentru polimerizare, pentru c pe msur
ce reacia PCR avanseaz, n amestecul de reacie se gsete din ce n ce mai mult matri i
din ce n ce mai puin enzim activ (randamentul enzimei scade datorit expunerii prelungite
la temperaturi nalte).
o Numrul de cicluri
ntr-o reacie PCR obinuit, mai puin de 10 molecule de matri pot fi amplificate n mai puin
de 40 de cicluri, obinndu-se un produs (amplicon) detectabil n electroforez n gel de
agaroz. La o cretere mult prea mare a numrului de cicluri, se pot acumula produi de reacie
nespecifici.
o Polimerizarea (extensia) final
o
n multe reacii, dup ultimul ciclu de amplificare, tuburile de reacie se tin 5-15 min la 72 C
pentru a realiza polimerizarea complet a produilor pariali, precum i renaturarea moleculelor
monocatenare.

Aplicaiile practice ale tehnicii PCR:


- detectarea mutaiilor cunoscute la bolnavi i purttori;
- diagnosticul prenatal i presimptomatic al bolilor ereditare;
- determinarea genelor de predispoziie la bolile comune (coronaropatii, boala hipertonic,
tulburri psihice etc.);
- diagnosticul precoce i evaluarea pronosticului bolilor canceroase;
- determinarea prenatal a sexului;
- identificarea agenilor patogeni (virui, bacterii);
- dactiloscopia genomic (identificarea persoanelor);
- analiza filiaiei (paternitate, maternitate);
- tipizarea HLA;
Avantaje anticipate :
analiza complet n 24-48 ore
interpretare cantitativa mai puin subiectiv decat FISH
mai putin laborioas decat FISH
grad mai mare de automatizare

Dezavantaje :
o aplicarea pentru diagnosticele de aneuploidie este mai limitat
o costuri mai mari dect FISH

Bibliografie:
http://www.bio.unibuc.ro/pdf/micro/documente_de_studiat/Cap3-3_Tehnologia_PCR.pdf
https://robi74ro.files.wordpress.com/2011/02/tehnica-pcr.pdf
www.justmed.eu/files/Imuno/practic/PCR97.ppt
http://www.materno-fetala.ro/167_Medicina-materno-fetala/Genetica-medicala/Importanta-reactiei-
de-polimerizare-in-lant-in-diagnosticul-prenatal.html