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Marcelo Guerra
Departamento de Botnica UFPE
Figura 1.1 Principais etapas da tcnica de hibridizao in situ. A marcao da sonda (a)
feita independentemente da preparao da lmina (b). Em seguida, a sonda e o DNA
cromossmico so desnaturados (c, d) e, quando colocados em contato, a sonda hibridiza
in situ (e) com o DNA-alvo. A marcao da sonda pode ser detectada por anticorpos ligados
a fluorocromos (f) e visualizada diferencialmente ao microscpio (g).
A PREPARAO DA LMINA
Embora permita alcanar os objetivos em poucos experimentos e apresente boa
repetibilidade de resultados, a HIS um procedimento relativamente longo e
dispendioso, exigindo controle rigoroso da qualidade das lminas. Lminas com
muitas metfases e com cromossomos bem espalhados so fundamentais para se
obterem resultados inequvocos e tornar a tcnica economicamente vivel. A
preparao das lminas segue os mesmos procedimentos utilizados na preparao
de lminas para a colorao com fluorocromos, apresentados detalhadamente por
vrios autores (veja, por exemplo, Guerra e Souza, 2002).
Para controlar a qualidade das lminas, antes de serem utilizadas na HIS, elas
podem ser analisadas na microscopia de contraste de fase, que permite visualizar os
cromossomos sem corantes, ou aps colorao rpida, por exemplo, com DAPI
(abreviatura do corante fluorescente 4-6-diamidino-2-phenilindole). As melhores
lminas devem ser descoradas e estocadas secas em caixas hermeticamente fechadas
a 20 ou 80 oC. Nessas condies, as lminas podem ser conservadas por alguns
meses antes de serem utilizadas para HIS. Em alguns organismos nos quais a tcnica
de preparao de lminas produz um grande nmero de boas metfases, como em
humanos e mamferos em geral, esse controle de qualidade simplificado ou
dispensado.
TIPOS DE S ONDAS
Sondas so seqncias de DNA isoladas que se encontram representadas no
cromossomo uma nica vez ou que apresentam milhares de cpias em cada
cromossomo. Essas seqncias repetidas podem estar organizadas no cromossomo
em tandem, ou seja, uma em seguida outra, formando blocos relativamente grandes
de DNA-alvo, ou podem se encontrar dispersas no complemento cromossmico,
intercaladas com diversos outros tipos de seqncias.
seqncia que codifica o precursor 45S dos RNAs ribossomais 28S, 18S e 5,8S,
geralmente referidos como DNAr 5S e 45S, respectivamente.
Uma caracterstica importante dos DNAr 5S e 45S que a seqncia de
nucleotdeos desses genes muito conservada evolutivamente, o que significa que
elas so muito similares em todos os eucariotas. Por exemplo, uma sonda de DNAr
45S produzida a partir do genoma de trigo, denominada pTa71 (Gerlach e
Bedbrook, 1979), foi utilizada para localizar o DNAr em muitas outras plantas,
inclusive gimnospermas e pteridfitas (veja, por exemplo, Kawakami et al., 1999;
Murray et al., 2002), e at mesmo em organismos to diferentes quanto peixes
(Pendas et al., 1993) e gafanhotos (Rocha, 2002).
O DNA ribossmico 45S, geralmente referido apenas como DNAr, uma
seqncia moderadamente repetitiva, que forma blocos com muitas repeties, em
um ou mais pares cromossmicos. Cada unidade de repetio contm trs genes
(DNAr 18S+5,8S+28S) e seus espaadores, sempre transcritos juntos em um
nico RNAm. Os stios do DNAr 45S correspondem s constries secundrias,
observadas por tcnicas de colorao convencional. Entretanto, stios muito
pequenos ou pouco ativos podem no ser visveis com essas tcnicas mas serem
detectados com HIS. No feijo caupi (Vigna unguiculata), por exemplo, apenas um
ou dois cromossomos so observados com constries secundrias, enquanto com
HIS aparecem blocos de DNAr 45S em cinco dos seus 11 pares cromossmicos
(Guerra et al., 1996). No homem, os genes de DNAr 45S esto nas constries
secundrias dos cromossomos acrocntricos 13, 14, 15, 21 e 22, havendo cerca de
150 a 200 cpias no genoma.
A seqncia do DNAr 5S um pouco mais varivel que a do DNAr 45S.
Cada espcie possui, geralmente, uma s seqncia de DNAr 5S repetida muitas
vezes em tandem em um nico par de stios cromossmicos ou, menos freqente-
mente, em dois ou mais pares. No homem, os genes do DNAr 5S esto localizados
no cromossomo 1 (200-300 cpias). Em algumas espcies podem ocorrer seqn-
cias de DNAr 5S ligeiramente diferentes, formando blocos de repeties distintas,
localizadas por HIS em diferentes regies do genoma (veja, por exemplo, Martins
e Galetti, 2001).
Afora o DNA ribossmico, duas outras seqncias repetitivas, organizadas em
tandem e de funo conhecida, tm sido amplamente estudadas. A primeira, e mais
conservada, a seqncia do DNA telomrico (Richards et al., 1993). Esse DNA
ocorre caracteristicamente nas regies terminais de cada cromossomo, embora
excepcionalmente seja encontrado em outras regies cromossmicas, princi-
palmente prximo aos centrmeros de alguns animais (veja discusso no Captulo
4) e plantas (Guerra e Kenton, 1996; Kondo e Tagashira, 1998). A segunda, menos
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 5
SONDAS GENMICAS
Em plantas, principalmente, tm sido muito utilizadas as chamadas sondas genmicas,
formadas pelo DNA genmico total de uma espcie. A sonda genmica, constituda
por um grande nmero de seqncias nicas e repetitivas, funciona da mesma
maneira que uma seqncia repetitiva dispersa por todo o genoma, marcando todos
os cromossomos igualmente, com a vantagem de ser muito mais facilmente obtida.
Essa tcnica, denominada de hibridizao genmica in situ ou GISH (Genomic In Situ
Hybridization), tem sido aplicada com sucesso na anlise de hbridos interespecficos
e no estudo evolutivo de diversas espcies poliplides (Stace e Bailey, 1999). Em
animais, as sondas genmicas tambm tm sido utilizadas (veja, por exemplo,
Svartman e Vianna-Morgante, 1999), embora esse tipo de sonda encontre aplicao
maior no estudo dos poliplides raros em animais.
Por exemplo, para distinguir os cromossomos das duas espcies que deram
origem a um tetraplide natural, como o tabaco, o DNA total de um dos supostos
pais diplides extrado, marcado e hibridizado com os cromossomos do poliplide
(Figura 1.2). Se a espcie da qual se extraiu o DNA for realmente um dos pais do
tabaco, metade do conjunto cromossmico tetraplide dever ser diferencialmente
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 7
marcada (no caso em que cada pai contribuiu com igual quantidade de cro-
mossomos que o mais freqente). Caso no haja marcao, uma indicao
de que aquela espcie no foi envolvida na formao do tetraplide. Por outro lado,
se todos os cromossomos hibridizarem com a sonda genmica de um diplide,
provvel que a espcie em questo seja um autopoliplide ou descenda de duas
espcies muito prximas (Figuras 1.2 e 2.9).
DNA marcado de uma espcie junto com o DNA da outra espcie sem marcao
e em concentrao mais alta. Este ltimo DNA funcionar como bloqueador (ou
supressor) das seqncias exclusivas desta espcie e das seqncias comuns a ambas.
Dessa maneira, apenas o genoma oriundo do diplide que est sendo testado
aparecer marcado.
SONDAS CROMOSSMICAS
Um conjunto de seqncias gnicas ou nao-gnicas localizadas em determinado
cromossomo pode ser reunido para formar uma sonda capaz de pintar apenas
aquele cromossomo. Para isso necessrio reunir um bom nmero de seqncias
distintas e que estejam distribudas aleatoriamente por todo o cromossomo. Dessa
maneira, foram construdas sondas que marcam, distintamente, cada um dos 23
pares de cromossomos humanos em toda a sua extenso. Essa tcnica, chamada
de pintura cromossmica (chromosome painting), tem tido numerosas aplicaes na
citogentica clnica e no estudo da evoluo de aves e mamferos.
As sondas cromossomo-especficas levaram ao desenvolvimento de tcnicas
que permitem corar simultaneamente cada cromossomo humano em uma cor
diferente (ver Captulos 6 e 7). Para isso foi necessrio desenvolver tambm novos
equipamentos de microscopia, programas de anlise de imagens apropriados e
diversas outras melhorias na tcnica e nos reagentes utilizados (Schrck et al., 1996;
Eils et al., 1998). A hibridizao de sondas cromossomo-especficas humanas em
outros mamferos tornou possvel identificar regies cromossmicas homlogas em
espcies to diferentes quanto o homem e o cavalo, separados h 70-80 milhes
de anos (Raudsepp et al., 1996). A anlise comparada de caritipos de espcies distintas,
utilizando-se sondas cromossmicas, denominada Zoo-FISH (Captulo 4).
Essas sondas permitem tambm visualizar os cromossomos no ncleo
interfsico, onde se encontram descondensados, formando territrios cromossmicos
individualizados. Nesses casos, a anlise cromossmica geralmente feita em
microscopia confocal, que permite observar o ncleo em numerosos planos focais
distintos e integrar essas imagens em uma reconstruo tridimensional (veja, por
exemplo, Habermann et al., 2001).
Sondas do tipo pintura so tambm conhecidas para alguns outros mamferos,
aves e drosfila (Fuchs et al., 1998; Griffin et al., 1999). Em plantas no foi ainda
possvel pintar cada um dos cromossomos de um caritipo distintamente, mas j
so conhecidas pinturas para alguns poucos cromossomos (Schubert et al., 2001).
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 9
OBTENO DA SONDA
O tipo de sonda mais fcil de ser obtido o utilizado na hibridizao genmica in
situ, formada pelo DNA total, fragmentado e marcado. Se a sonda desejada for um
DNA satlite, ela poder ser isolada do DNA total da espcie por intermdio de
um gradiente de densidade. Nesse caso, o DNA satlite separado do DNA principal
pela diferena na proporo de AT:GC entre essas duas fraes, que se reflete em
diferena de densidade entre elas.
Sondas de DNA satlite so mais facilmente obtidas por digesto do DNA
genmico com enzimas de restrio. Uma enzima de restrio que produza um corte
em uma unidade de repetio produzir cortes idnticos em todas as demais
unidades desse DNA repetitivo organizado em tandem. Isso resultar na formao
de fragmentos de DNA de igual tamanho, os quais aparecero em um gel de
eletroforese como uma banda caracterstica. Eventualmente, alguns monmeros
podero conter mutaes no stio de restrio, levando formao de dmeros,
trmeros, etc., produzindo no gel de eletroforese um padro de bandas em escada.
Esse padro tambm pode ser obtido quando se realiza digesto enzimtica por
tempo insuficiente para que ocorram todos os cortes (digesto parcial). Em ambos
os casos, o padro de bandas em escada constitui indicao clara de que o DNA
repetitivo se encontra em tandem. A banda produzida pela digesto total contendo
os monmeros poder ser recortada do gel e seu DNA poder ser extrado, marcado
e utilizado como sonda.
No caso do DNA repetitivo disperso, o isolamento dessa seqncia dever
ser feito a partir de uma biblioteca genmica (coleo de fragmentos de DNA
inseridos em vetores de clonagem que juntos cobrem todo o genoma de um
organismo), exigindo grande nmero de testes para encontrar a seqncia
repetitiva desejada.
Seqncias muito pequenas, como o DNA telomrico ou os microssatlite,
podem ser sintetizadas por encomenda a laboratrios especializados. Sondas para
genes especficos podem ser obtidas diretamente a partir do RNAm citoplasmtico,
transcrito para DNA (DNAc) por meio da enzima transcriptase reversa e
amplificado em um sistema de clonagem bacteriano. Diversas sondas podem
tambm ser obtidas por PCR, desde que se conheam as seqncias que flanqueiam
o DNA-alvo, de maneira a permitir escolher os iniciadores de sntese (primers)
corretos. Neste caso, a mistura de nucleotdeos que fornece a matria-prima para
a sntese das novas cadeias pode conter uma frao de nucleotdeos marcados,
permitindo que se faa amplificao e marcao da sonda simultaneamente.
10 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica
Figura 1.3 Esquema da separao cromossmica por fluxo. Gotas contendo determinado
cromossomo podem ser reconhecidas pela fluorescncia do cromossomo, marcadas com uma
carga eltrica e desviadas do fluxo normal para um coletor parte.
ser separadas por eletroforese, isoladas e testadas como sondas para HIS. Aquelas
que hibridizarem unicamente, ou predominantemente, em um cromossomo sero
utilizadas para compor a sonda cromossmica.
AMPLIFICAO DA SONDA
Da mesma maneira que as sondas cromossomo-especficas, os demais tipos de
sonda precisam tambm ser amplificados, para se dispor de um estoque da sonda.
A amplificao geralmente feita pelos mtodos usuais de clonagem. Para isso a
seqncia a ser amplificada deve ser inserida em um vetor, por exemplo um
plasmdio bacteriano, que introduzido na Escherichia coli. A multiplicao da
bactria resulta na multiplicao do plasmdio e, conseqentemente, na ampli-
ficao do nmero de cpias da seqncia de DNA inserida, ou inserto. Quando
a colnia bacteriana suficientemente grande, as bactrias so lisadas e os
plasmdios (em nmero de milhes) so isolados. A sonda pode ser preparada com
o plasmdio inteiro (o DNA estritamente plasmidial no deve ter correspondncia
no DNA cromossmico e por isso no interfere na hibridizao) ou o inserto pode
ser retirado do plasmdio, por meio de enzimas de restrio, e separado por
eletroforese.
Os plasmdeos bacterianos aceitam geralmente insertos de at 10 kb de
tamanho. Para amplificar seqncias maiores poder ser necessrio utilizar outro
tipo de vetor, como os cosmdios (insertos de 30 a 44 kb), bacterifago P1 (70-100
kb), PACs (130-150 kb), BACs (at 300 kb) ou YACs (0,2 a 2 Mb).
A tcnica de PCR pode ser utilizada na amplificao de fragmentos de DNA
cuja seqncia de nucleotdeos conhecida, como o DNAr 5S ou 18S. No caso de
cromossomos isolados para obteno de sondas cromossomo-especficas, todo o DNA
precisa ser amplificado. Nesse caso, a amplificao feita por um tipo particular de
PCR, denominado DOP-PCR (degenerate oligonucleotide-primed PCR). Esta PCR
utiliza iniciadores de sntese com seqncias muito variadas, que iro se ligar em um
grande nmero de stios, amplificando qualquer DNA fornecido como molde.
TAMANHO DA SONDA
O tamanho dos segmentos a serem hibridizados crtico nos experimentos de HIS,
sendo o tamanho ideal entre 50 e 500 nucleotdeos. Seqncias maiores ou
menores podem ser utilizadas, mas apresentam problemas adicionais. Se a
seqncia a ser hibridizada contiver 20 kb, por exemplo, ela dever ser quebrada
em fragmentos menores, em torno de 400-500 pb. Seqncias muito pequenas,
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 13
MARCAO DA SONDA
MARCAO COM ISTOPOS RADIOATIVOS
Inicialmente, as sondas de DNA ou RNA eram marcadas exclusivamente com
istopos radioativos, produzindo as chamadas sondas quentes. O istopo mais
comumente empregado o trtio (3 H), por emitir radiao de baixa energia,
garantindo melhor resoluo da sonda. Por outro lado, o trtio tem a desvantagem
de exigir exposio demorada, usualmente acima de duas semanas (compare esses
dados na Tabela 1.1). Em alguns experimentos prefervel utilizar um radioistopo
de mais alta emisso de energia, como o 32P, embora a resoluo da sonda seja
sensivelmente reduzida em decorrncia de maior disperso da radiao.
Tabela 1.1 Caractersticas principais dos radioistopos mais utilizados na HIS (baseada em
Leitch et al., 1994).
MARCAO NO -ISOTPICA
Atualmente, para HIS, usa-se apenas a marcao no-isotpica. Nesse caso, uma
molcula marcadora acoplada a um dos quatro tipos de nucleotdeos presentes
na sonda, a qual posteriormente reconhecida por mtodos imunolgicos ou
similares. Observe que as sondas radioativas possuem apenas substituies de
istopos, enquanto as no-isotpicas possuem acrscimos de molculas sonda.
H duas maneiras distintas de marcar uma sonda no-radioativa: a marcao
direta, que utiliza fluorocromos acoplados diretamente aos nucleotdeos, e a
marcao indireta, na qual os nucleotdeos so acoplados a uma molcula marcadora,
a qual posteriormente ligada a um fluorocromo ou a um outro sistema de
colorao. A marcaco indireta tem sido mais utilizada em razo de sua maior
sensibilidade e por permitir mais facilmente amplificar o sinal emitido pela sonda.
Entretanto, as sondas que podem ser compradas prontas no comrcio so marcadas
diretamente com fluorocromos e so muio eficientes.
As molculas marcadoras mais utilizadas na marcao indireta so a biotina
e a digoxigenina. A biotina um tipo de vitamina H, obtida da clara do ovo, que
pode ser ligada ao nucleotdeo pelo carbono 5 do anel pirimidnico. A digoxigenina
um alcalide extrado de plantas conhecidas como dedaleira (Digitalis purpurea
e D. lanata) e liga-se ao anel pirimidnico da mesma maneira que a biotina. Essa
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 15
ligao normalmente feita por meio de uma molcula espaadora longa, de forma
a evitar interferncia estereoqumica que afete o pareamento da sonda com o
DNA-alvo ou reduza a eficincia do reconhecimento posterior da molcula
marcadora (Figura 1.4). O tamanho da molcula espaadora depende basicamente
do nmero de tomos de carbono que ela possui, e isso geralmente vem indicado
junto com o nucleotdeo marcado. Por exemplo, a biotina 16-dUTP possui uma
molcula espaadora com 16 tomos de carbono separando a biotina do
nucleotdeo (Figura 1.4a).
do nucleotdeo marcado deve ser mais alta que a desse mesmo nucleotdeo no-
marcado, para compensar sua menor receptividade pela DNA-polimerase.
Figura 1.5 Marcao da sonda por nick-translation. A sonda em fita dupla (a) inicialmente
atacada pela DNase, produzindo cortes aleatrios (setas) nas duas fitas (b). Molculas de
DNA polimerase se ligam aos stios cortados (c) e retiram os nucleotdeos sua frente no
sentido 5'-3' (d). Um novo nucleotdeo acrescentado extremidade 3' em cada um dos
espaos vazios criados pela DNA polimerase (e), ficando o corte um nucleotdeo adiante
no sentido 5'-3' (setas). Ao final, todos os nucleotdeos sero substitudos por novos e, em
ambas as fitas, alguns deles estaro marcados.
Figura 1.6 Marcao da sonda por random primers. Para iniciar a reao necessrio reunir
a sonda, os nucleotdeos marcados e no-marcados e os iniciadores de sntese (a), alm da
polimerase (no representada). Os iniciadores paream com regies complementares da
sonda desnaturada (b). A partir dos terminais 3' dos iniciadores, novas fitas complementares
s originais so sintetizadas contendo nucleotdeos marcados (c).
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 19
A HIBRIDIZAO IN SITU
NVEL DE ESTRINGNCIA
Tecnicamente, o nvel de estringncia indica a percentagem mnima de nucleo-
tdeos corretamente pareados, entre a sonda e o DNA-alvo, necessria para manter
a estabilidade da molcula hbrida. Em uma HIS com nvel de estringncia de 80%,
por exemplo, apenas as cpias da sonda com pelo menos 80% de sua seqncia de
nucleotdeos corretamente pareada com o DNA cromossmico permanecero
hibridizadas aps as lavagens ps-hibridizao.
Hibridizaes realizadas com nvel de estringncia alto produzem resultados
mais confiveis, mas se o DNA-alvo no for abundante e de fcil acesso, poder
no ocorrer hibridizao em muitas clulas. Por outro lado, reduzindo-se o nvel
de estringncia, facilita-se o pareamento da sonda com o DNA-alvo, mas aumenta-
se tambm a chance de pareamento com seqncias no-alvo. Portanto, o nvel
de estringncia deve ser ajustado para o tipo de DNA-alvo visado.
20 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica
Figura 1.7 Visualizao da sonda marcada com fosfatase alcalina biotinilada. A avidina
reage com a biotina da sonda e, posteriormente, com a biotina da fosfatase. A enzima quebra
o substrato, a molcula de BCIP, que reage com o NBT produzindo uma substncia escura
onde se encontra a sonda.
22 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica
Tabela 1.3 Principais fluorocromos utilizados na HIS, com seus comprimentos de onda de
mxima excitao e mxima emisso e a cor da fluorescncia emitida (baseada em
Schwarzacher e Heslop-Harrison, 2000).
AMPLIFICAO DO SINAL
Quando o sinal emitido pela sonda for muito fraco, no permitindo observao ou
documentao fotogrfica segura, torna-se necessrio amplificar o sinal, aumen-
tando o nmero de molculas marcadoras e sinalizadoras. A amplificao , nesse
caso, feita adicionando um anticorpo contra a molcula marcadora, contendo esse
anticorpo outras molculas marcadoras. Por exemplo, se a sonda for marcada com
biotina e reconhecida com avidina usa-se um anticorpo antiavidina biotinilado. Esse
anticorpo possui quatro radicais de biotina, podendo ligar-se avidina por um
desses radicais e deixar os outros trs livres para reagirem com novas molculas de
avidina (Figura 1.9). Expondo-se novamente a clula avidina-FITC, duas ou trs
dessas molculas conjugadas se ligaro s biotinas do anticorpo, amplificando
portanto o sinal.
24 FISH Conceitos e Aplicaes na Citogentica
Figura 1.9 Amplificao do sinal da sonda marcada com biotina. A biotina inicialmente
reconhecida pelo conjugado avidina-fluorocromo. Acrescentando um anticorpo anti-
avidina biotinilado, cada stio com uma biotina fica agora com trs biotinas livres. A reao
com o conjugado avidina-fluorocromo repetida, resultando na amplificao do sinal.
tcnica muito empregada para localizar genes e outras seqncias curtas de DNA
no cromossomo (veja, por exemplo, Pedrosa et al., 2002).
A deteco do sinal pode tambm ser melhorada trabalhando-se com
cromossomos mais descondensados, como os paquitnicos da meiose, os politnicos
ou os cromossomos interfsicos. Um stio bem pequeno, com 10 kb, aparecer no
cromossomo metafsico como um pequeno ponto, enquanto em cromossomos
paquitnicos aparecer como uma regio mais longa e mais facilmente visvel.
Em cromossomos mais distendidos, no apenas a sensibilidade mas tambm
a resoluo da HIS aumenta, ou seja, melhora a capacidade de visualizar duas
sondas muito prximas como sinais distintos, sem superposio. Em humanos, duas
sondas precisam estar separadas por pelo menos um milho de pares de bases (1
Mb) para serem visualizadas como stios distintos em cromossomos metafsicos,
enquanto em cromossomos paquitnicos essa distncia pode ser reduzida para perto
de 60 kb. Em fibras de DNA completamente distendidas a resoluo da HIS ainda
maior, passando para cerca de 0,7 kb (De Jong et al., 1999).
Figura 1.10 Marcao e deteco simultnea de quatro sondas. (a) Sondas distintas,
marcadas com diferentes propores de biotina e digoxigenina foram hibridizadas em um
mesmo cromossomo. (b) A biotina reconhecida por um conjugado (avidina + FITC) e
a digoxigenina, por outro (antidigoxigenina + rodamina), nas mesmas propores da
marcao, resultando em sinal diferente para cada sonda.
Uma alternativa mais simples para localizar vrias sondas em uma mesma
clula fotografar as clulas com duas sondas e, em seguida, descorar a lmina e
utilizar as mesmas clulas para outra HIS com outras sondas. Cheng et al. (2001),
por exemplo, mapearam dez seqncias diferentes de DNA em um brao cro-
mossmico de arroz, utilizando cinco re-hibridizaes seguidas, cada uma com duas
sondas, sempre detectadas com FITC e rodamina. Mller et al. (2002) realizaram
quatro re-hibridizaes em clulas humanas, utilizando em cada re-hibridizao um
conjunto complexo de sondas cromossmicas, como as sondas para pinturas
cromossmicas mltiplas ou para Zoo-FISH.
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 27
Figura 1.11 FISH em fibras estendidas. Ncleos interfsicos sem citoplasma (a) so lisados
(b) e as fibras de DNA so impulsionadas para fora do ncleo por uma corrente lquida (c).
Em seguida, feita a fixao e o DNA-alvo localizado por FISH nas fibras estendidas (d).
Michalet et al. (1997) desenvolveram outra tcnica para obter fios de DNA
estendidos em uma lmina, denominada DNA combing, referindo-se ao fato de que
as fibras de DNA aparecem alinhadas ou penteadas (do ingls, to comb = pentear).
Nesse caso, uma lamnula siliconizada mergulhada em uma soluo contendo
molculas de DNA. Essas molculas tendem a aderir por uma das extremidades
(eventualmente pelas duas) na superfcie siliconizada. A lamnula ento retirada
lentamente da soluo. Ao atravessar o menisco, as molculas so tensionadas no
sentido contrrio ao da retirada da lamnula, o que as torna ao mesmo tempo
estiradas e aderidas superfcie da lamnula (Figura 1.12). A lamnula pode ser
utilizada para FISH, com uma resoluo semelhante das fibras estendidas, que
provavelmente o limite inferior que pode ser obtido com FISH.
Diversas outras variaes da tcnica de HIS procuram, por um lado, aprimorar
os mtodos de marcao e deteco da sonda e, por outro, ampliar o nvel de
resoluo de sondas contguas. Nesse ponto, as tcnicas citomoleculares
confundem-se com as estritamente moleculares, formando um elo importante entre
a anlise citogentica e a anlise genmica. O seqenciamento dos genomas
eucariotas revelou o padro de organizao de vrias seqncias do DNA
cromossmico. A citogentica atual tem procurado entender o significado dessas
seqncias em vrios organismos, verificando sua distribuio espacial em
diferentes tipos de ncleos (interfsicos, politnicos, meiticos) e em situaes
especiais, como nos ncleos de hbridos artificiais e de patologias celulares.
CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 29
Figura 1.12 Fibras de DNA alinhadas por DNA combing. Uma lmina siliconizada
mergulhada em uma soluo contendo molculas de DNA (a). Algumas molculas de DNA
aderem lmina e quando esta retirada da soluo as molculas de DNA so estendidas
pela tenso superficial do menisco, aparecendo alinhadas (b).
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CAPTULO 1 HIBRIDIZAO IN SITU : PRINCPIOS BSICOS 31