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ffiMUNOLOGIA
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EXPERIMENTAL .
M. Se. Mara Cristina Pico Beltrn
M. Se. Isabel G. Giraldino Falero
Dr. Anselmo 9tero Gonzlez
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~/EDITORIAL
VFLIX VARELA
LA HABANA , 1997
Edicin: Lic. Niurka Casanovas Herrero
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Diseo, realizaci6n y emplane: Emilio Garca Viera '' l I' .. .
Diagramacin: Jos A. Bouza Puigdevall . '. \.
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Correccin: Violeta Recarey Fernndez y Niurka Casanovas Herrero , ,_"a ;.;:;:: ~~

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Este libro de texto ha sido evaluado por la Comisin de ca rrera de Bioquimica,

basado en el informe de los oponentes: Dr. Juan Flix Amador y Dr. Anselmo
A
Otero Gonzlez, quien pas a ser autor del libro por sus valiosos aportes, y Yanul, Natacha y Pedro Pablo,
autorizado por la Direccin de Formacin Profesional del Ministerio J e Edu-
cacin Superior.
Aurora , Anabel y Juan Carlos,
nuestros hijos.

Mara Cristina Pico Beltrn, 1997

Sobre la presente edicin:
Editorial Flix Varela, 1997

EDITORIAL FLIX VARELA

San Miguel No. 1111
e/ Mazn y Basarrate, El Vedado
Ciudad de La Habana, Cuba.
ISBN: 959-07-0130-2
 PREFACIO

Inmunologia experimental fue concebido como libro de texto para

estudiantes de las carreras Biologa, Bioqumica y Microbiologa, que se
imparten en la Facultad de Biologa. Va tambin dirigido a estudiantes de
otras carreras universitarias y a tcnicos y profesionales que trabajan en la
produccin de anticuerpos, as como en la deteccin y cuantificacin de
antgenos y anticuerpos. El libro est organizado en nueve captulos. El pri-
mero, dedicado a la produccin convencional de anticuerpos; los captulos
del 11 al VIII, a las tcnicas serolgicas e inrnunoensayos; y el ltimo, a la
produccin de anticuerpos monoclonales.
Debemos agradecer muy especialmente al Dr. Juan Flix Amador por
la revisin minuciosa que hizo del manuscrito y sus aeertadas sugerencias;
tambin a un grupo de colegas que con sus experiencias y recomendaciones
contribuyeron a esta obra. Ellos son: Lic. Sonia Lpez, Dra. Mayra Lpez,
M.C . Mara Esther Fajardo, Dr. Mario lvarez y los licenciados Antonio
Bencomo, Roberto Alegre, Ana Maria Barral, Celeste Arranz, Pedro Estvez,
Mximo Daz y Julio Machado.
Un reconocimiento para Jorge Luis Santiesteban, quien con paciencia
infinita confeccion los dibujos.

Los autores.
1
'
1 .,..

5
 CAPTULO 1
PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
POLICLONALES

La produccin de anticuerpos es una prctica frecuente en los laboratorios

docentes, de investigaciones biomdicas y en los centros de obtencin de
biopreparados . La diversa utilidad de estos reactivos justifica su produccin
y los estudios acerca de la potenciacin y modelacin de antgenos, de los
mecanismos y regulacin de la respuesta inmune y de la obtencin de
anticuerpos por diferentes procedimientos, como los biotecnolgicos y de
ingeniera gentica, y la inmunizacin in vitro.
El mtodo convencional para obtener anticuerpos policlonales (AcP) con-
siste en la inoculacin del inmungeno a animales inmunocompetentes (Fi-
gura l). Este procedimiento, llamado inmunizacin, se fundamenta en la
respuesta de anticuerpos, la cual conlleva una serie compleja de mecanis-
mos internos del animal, que el experimentador intenta manipular a travs
de la potenciacin de! inmungeno, las dosis, el intervalo entre ellas, la va y
el modo de administrarlas.
A travs de diferentes vas el inmungeno inyectado llega a los rganos
linfoides secundarios (bazo, ganglios linfticos y otros). Se utilizan las rutas
subcutnea (s .c.), intradrmica (i.d.), intramuscular (i.m.), intraperitoneal
(i.p.), intravenosa (i .v. ), intracardaca (i.c.) y retroocular (r.o .), esta ltima
en el caso del ratn . En ocasiones el inmungeno puede ser inyectado direc-
tamente en el bazo (va intraesplnica) o en los ganglios (va intralinftica).
En los rganos linfoides secundarios el inmungeno es retenido e interacta

~~
 con diferentes clulas, teniendo lugar la respuesta inmune. Los anticuerpos Pa ra identificar al antisuero y al anticuerpo se acompaan con el nombre-
producidos en estos sitios son liberados a la sangre (Figura 1) y se localiz.an del antgeno para el que son especficos . Por ejemplo, un suero que conten-
fundamentalmente en la fraccin gamma-globulnica del suero (Figura 2) . ga ant icuerpos contra mioglobina se denomina suero anti-mioglobina o
antisuero anti-mioglobina; y los anticuerpos, anticuerpos anti-mioglobina. En
ta prctica se pueden abreviar sustituyendo la palabra antisuero o anticuer-
po por la letra alpha (a) o un signo menos(-), y queda en este caso: a-mioglo-
bina o -mioglobina.
Los anticuerpos policlonales son de nat!.!_raleza hetero~ea y esto tiene
.. gran importancia prc~ca . A diferencia de los anticuerpos monoclonales
~ i!I) (AcM) son producidos por clulas plasmticas (CP) provenientes de dife-
rentes clOnes de clulas B, de ah su carcter policlonal La heterogeneidad
_' w. 6
de los antisueros policlonales se manifiesta en la naturaleza de los anticuerpos

~ { sangre - Incubacin
centrifuqacin
~ .Suer0 inmune

WJ 1
Celulas
sintetizados. Estos anticueipos estn dirigidos contra sitios (epitopos) dife-
~ntes de la molcula de antgeno y reaccionan con distintos grados de afini-
dad en la medida n que ajusten con el q>itopo Figura 3). Los AcP pertene-
cen -a diferetes isotipos inmunoglobulnicos de la especie animal en que se
Figura 1. Obtencin de anticuerpos policlonales por el mtodo convencional.
producen. A todo esto hay que agregar la historia inmunolgica del animal
en cuestin, que se manifi esta en una adicional diversidad de anticuerpos
Albmina Albmina
que acompaan al anticuerpo de inters en el suero sanguneo.
A
j
o o (-
l-) El fundamento de la produccin de anticuerpos policlonales es la respuesta
e o
.e E o
e ....o a. E ....o .e de anticuerpos y la memoria inmunolgica que durante ella se establece
O
(!)
Q)
al
-
<t
o
(!) m
Q)
-<t
Q,
para el antgeno en cuestin. Cuando un individuo inrnunocompetente se
pone por vez primera en contacto con el antgeno, pasan varios das (7 a 1O)
antes de que puedan detectarse anticuerpos en la sangre (perodo de latencia),
alcanzando un mximo para luego descender (Figura 4). ~1..a duracin del
Descendente
NORMAL
. Oescenden te
HIPERINMUNE ....
perodo de latencia depende, entre otros factores, del lmite de deteccin de
la tcnica empleada para detectar los anticuerpos. Si despus de un interva-
lo de tiempo se administra al animal una segunda inyeccin, en los pocos
fi gura 2. Grficas electroforticas correspondientes tt un suero normal y a un suero das siguientes el nivel de anticuerpos en sangre aumenta bruscamente (dis-
hiperirunune.
minuye el perodo de latencia con respecto a la respuesta primaria) hasta

Se denomina suero inmune, inmunosuero o antisuero al suero de un ani-
alcanzar valores mucho ms altos que los observados en la primera res-
puesta. La respuesta secundaria se caracteriza por una produccin ms
mal que ha sido sometido a un proceso de inmunizacin y contiene anticuerpos rpida, abundante y sostenida de anticuerpos y es resultado de la puesta a
especficos contra el inrnungeno inoculado. El suero inmune puede, en oca- punto del sistema fonnador de anticuerpos, como consecuencia del primer
siones, ser consecuencia de una infeccin natural . El calificativo hiperinmune contacto con el antgeno que dio lugar a una poblacin amplificada de clu-
se refiere al suero de un animal que ha sido inmunizado repetidamente y las, las llamadas clulas memoria (Roitt, 1978). Este tipo de respuesta es
contiene altas concentraciones de anticuerpos especficos . propia de los antgenos timodependientes (TD).
8 9
r-

Se acostumbra denominar dosis sensibilizonte de antgeno a la primera.

:>.,
r::;-:i
inoculacin en el animal virgen; y dosis desencadenante, secundaria o

~
de o 1ta .. booster" al estmulo anti gnico para inducir una respuesta secundaria das,
/~afinidad meses o af\os despus del estmulo primario.

BAQE :>.c;;;:l
En la produccin convencional de anticuerpos generalmente se practican
inoculaciones seriadas del inmungeno con el propsito de incrementar la
concentracin de anticuerpos. La cintica de su produccin sigue el patrn
de la respuesta secundaria (Figura 4), es decir, el ttulo de anticuerpos circu-

~ =7:j de baja lantes aumenta despus de cada reinmunizacin hasta alcanzar un nivel
mximo, ms all del cual inyecciones adicionales no lo afectan. Despus
afinidad
de ese mximo el ttulo se mantiene durante meses y, en ocasiones, aos,
observndose un plato en la curva.
Figura 3. Heterogeneidad de los anticuerpos sintetizados contra wt antgeno. Tras cad inyeccin de antgeno hay una rpida cada de los anticuerpos
circulantes (fase negativa) . Esto se debe a la neutralizacin de anticuerpos
circulantes durante el perodo en que hay exceso de antgeno.
Cuando se emplean antgenos con adyuvantes del tipo Freud o compuestos
de aluminio por las vas i.m. o s.c., se ha observado que la respuesta de
anticuerpos puede crecer muy lentamente hasta alcanzar un mximo a los
Respuesta primaria Respuesto secundario 2-3 meses y entonces tiende a persistir como un plato. En este momento es
Copcentra- que se debe poner la segunda dosis, preferiblemente sin adyuvante (Dresser,
cion de Ac
en el suero 1986).
1
Primera inyeccin se11undo ipyeccin
11 de inmungeno de inmunogeno Los sueros inmunes en general contienen menos de 5 mg de anticuerpo por
mililitro de suero, lo que equivale a menos del 1O % de su proteina total,
1
valorada en aproximadamente 70 mg/mL . En sueros de ttulos muy eleva-
dos la cantidad de anticuerpos en la fraccin ganuna-globulnica (Figura 2)
1
suele ser menor del 50 %.
1 A las diferencias de carcter cuantitativo de las respuestas primaria y se-
cundaria se suman otras, como los isotipos de los anticuerpos y sus afinida-
fi ~', des . En la respuesta primaria predomina el isotipo lgM y en la secundaria, el
IgG . Con el tiempo, la afinidad de los anticuerpos aumenta, mientras que su
o 10 20 30 40 ' 60 70 ao 90 01'as especificidad puede disminuir.

Figura 4. Respuestas primaria y secwtdaria de anticuerpos.

Virgen: Se aplica este calificativo al animal o a Ja clula que no ha tenido contactoant~
con el antgeno. En ingls se utiliza el tnniI101111p1imed. ',7,
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Algunos antgenos no producen respuestas secundarias . Son los denomina-
dos antgenos timoindependientes (TI) porque no involucran la participacin
de clulas T en la respuesta. Generalmente son polmeros que presentan
mltiples copias de un epitopo, como es el caso de polisacridos de origen
bacteriano (Figura 5). La unin del antgeno polimrico a mltiples molcu-
las de anticuerpo sobre clulas B (lgm) es suficiente para estimularla .a
proliferar y secretar anticuerpos. Los antgenos TI al parecer no generan
memoria inmunolgica ni anticuerpos de alta afinidad y el isotipo predomi-
nante es lgM. En animales malos respondedores, los antgenos TO pueden
tambin dar slo respuestas primarias.
Entrecruzamiento de receptores (lgm)
I
) (
\f
~ \,.
...
Figura 5. Activacin de clula B por Ag timoindependiente.
Cuando es necesario obtener anticuerpos con determinadas caractersticas
de especificidad, isotipo o grado de afinidad, el protocolo de trabajo para su
produccin se disear de acuerdo con el fin deseado.
Con un tratamiento adecuado del inmungeo o una forma de administrarlo
es posible obtener anticuerpos contra prcticamente cualquier sustancia,
con la calidad requerida o en cantidades de 1-5 mg/mL de suero (superiores
a las fisiolgicas), que podran llegar en algunas ocasiones a valores notables
de 50 mg/mL (Dresser, 1986).
No es posible establecer reglas para la produccin de anticuerpos en anima-
les de experimentacin. En esto influyen numerosos factores como las par-
ticularidades del antgeno, la complejidad' de la respuesta inmune y lo varia-
da que puede ser en cada uno de los individuos, aun cuando pertenezcan a
12
....
una misma lnea gentica, se inmunicen de la misma forma y se mantengan
en condiciones similares de vida.
En muchas ocru;iones es posible disponer de programas evaluados por otros
investigadores, que pueden ser oJ)ciones o puntos de partida para obtener
anticuerpos de una calidad determinada. No obstante, aun cuando se repro-
duzcan esquemas, los resultados pueden ser diferentes. En la prctica casi
siempre se introducen modificaciones que responden a las condiciones pro-
pias y al comportamiento del animal de experimentacin, de ah que la pro-
duccin de anticuerpos tenga un cierto carcter emprico.
Los anticuerpos tienen mltiples aplicaciones:
- En la clnica se utilizan con fines teraputicos y profilcticos en diversos
estados infecciosos y txicos, lo mismo en el hombre que en los anima-
les; as como en el trasplante de rganos y tejidos, y en las enfermedades
~
autoinmunes en humanos.
En el diagnstico y seguimiento mdicos; en estudios epidemiolgicos
.; <I para la identificacin y cuantificacin de antgenos bacterianos, virales y
de otros tipos, en el hombre y en animales .
En la identificacin de microorganismos aislados de procesos infecciosos . .
En la tipifica~in de grupos sanguneos y en las pruebas de histocompa-
tibilidad para determinar molculas HLA (antgenos de leucocitos huma-
nos) con vista al trasplante de rganos y tejidos. -,
- En la clasificacin taxonmi.ca de microorganismos, plantas y animales.
En trabajos bioqumicos y de ingeniera gentica, para la purificacin,
caracterizacin y cuantificacin de protenas recombinantes .
En la cuantificacin de hormonas de origen humano, animal y vegetal.
- En estudios inmunoqumicos y en muchos otros .
RESPUESTA INMUNE HUMORAL
El conocimiento de los principios bsicos de la biologa de la respuesta inmu-
ne y su regulacin es un prerrequisito para la produccin exitosa de
anticuerpos. Esto capacita al investigador para inducir una respuesta vigo-
13
 rosa de anticuerpos en vez de resultados impredecibles, CQmo la tolerancia
(Ttjssen, 1985).
Las dos ltimas son esenciales para la mayora de los antgenos (protenas;
Una respuesta inmune humoral es consecuencia de una serie compleja de polipptidos y sus conjugados), los llamados antgenos TD.
eventos que involucran al antgeno y, al menos, cuatro tipos de clulas (Figu-
ra 6). Fagocitosis del antgeno
l . La clula B, precursora de la clula que produce los anticuerpos . Como primer paso en la respuesta de anticuerpos, los antgenos son
2. La clula plasmtica, linfocito B terminalmente diferenciado, que sinteti- endocitados inespecficamente por macrfagos u otras clulas del SRE.*
za y secreta los anticuerpos. Entre estas ult imas se incluyen, adems de los macrfagos, las clulas de
Langerhans (CL) en la piel y las clulas dendrticas (CD) en el bazo y
3. La clula T auxiliadora (Th).
ganglios linfticos . Como todas estas clulas procesan antgeno se denomi-
1
4. La clula accesoria llamada clula presentadora de antgeno (APC : nan colectivamente clulas presentadoras de antgeno. Para los antgenos
1
1 antigen presenting cell) . TO esta degradacin no especfica es esencial para que se inicie una res-
puesta efectiva .
Muchas de las tcnicas comunes para optimizar el trabajo de inmunizacin
111
tratan de incrementar la eficiencia de la fagocitosis . Ellas incluyen la selec-
cin de un sitio de inyeccin apropiado, alteracin de la forma del antgeno y

IP~
el empleo de adyuvantes . No todos los sitios de inyeccin son igualmente
11
buenos para servir de blanco en la fagocitosis . Los sitios ptimos tienen alto
contenido de APC y ritmos bajos de degradacin de antgeno. Las rutas de
inyeccin comnmente empleadas son la s.c ., i.d., i.m., i.p . e i.v. La eficien-
cia de la fagocitosis tambin depende del tamao y forma del antgeno. Los

ll '-.._,/ -----------
~ ~ . ~ (CP?}./ ~ rf '\
antgenos particulados son fcilmente fagocitados, mientras que las molcu-
las pequeas solubles lo son menos . Por esta razn, convertir las molculas
pequea.s solubles en agregados particulados usualmente es una forma efec-

V - ~~
1 tiva de incrementar su inmunogenicidad. El tercer mtodo usado con fre-

[V
cuencia para incrementar la fagocitosis es mezclar el antgeno con
\'J ~v-,, -, . -r(~ adyuvante. Los adyuvantes ayudan en dos formas : primero; ellos protegen
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111
1
y ont icuerpo "'~:.:-- r{ Despus que el antgeno es endocitado por una APC, la vescula fagoctica
se fusiona con un lisosoma y el antgeno es parcialmente degradado. Apare-
l!l Figura 6 . Clulas que participmi en la respuesta de w11icuc11xis SRE: Sistema retculo-endotelial. Conj unto de clulas capaces de atrapar colorantes vi tales
' Y partculas. Originalmente el tnnin<> se emple para incluir las clulas con acti vidad
14 fagoc tica. Su principal funcin es eliminar partculas de la sangre. Incluye las APC .

15
 cen entonces sobre la superficie de la APC fragmentos peptdicos del antgeno
presentados por protenas clase 11 del CPH . Aunque una molcula
clase 11 es capaz de unir un amplio rango de estructuras, algunos fragmen-
tos antignicos pueden no ser unidos . Si ninguno de los fragmentos del
antgeno se une a protenas clase 11, este puede evadir la vigi lancia del siste-
ma inmune. Los animales con molculas clase II que no unen fragmentos
de un antgeno determinado se conocen como no respondedores a ese
antgeno (Figura 7) .
Activacin de clulas Th. Interaccin APC-Th
En el paso siguiente de la respuesta inmune la clula Th se une a la APC.
Esta interaccin es mediada por la unin del complejo pptido antignico-
protena clase 11 sobre la APC y el receptor especfico para antgeno sobre
la clula Th (RCT). Este RCT reconoee al pptido antignico para el cual
es especfico presentado por una molcula clase 11 del MHC sobre la APC .
De esta forma, las clulas Th no responden a antgeno libre ni a protenas
clase II no ocupadas .
La unin de una APC a una clula Th da inicio a una cascada de eventos
que conducen a la proliferacin y diferenciacin de la clula Th.
El primer paso es la activacin de la clula Th, que requiere dos seales . La
primera es la unin del complejo pptido antignico-molcula clase 11 al
RCT, lo cual garantiza que slo las clulas Th capaces de reconocer ese
antgeno sean estimuladas. La segunda seal es mediada por la unin de un
polipptido soluble, la interleuquina 1 (IL-1) producida por la APC . La pro-
duccin de IL-1 no es especfica, pero dentro de la poblacin de clulas Th
slo responden aquellas que estn unidas. a una APC portadora del pptido
antignico para el que son especficas.
Protenas clase II: Glicoprotenas de superficie celular codificadas por el CPH, que actan
como receptores de pptidos.
CPH: Complejo principal de histocompatibilidad. En ingls: majar histocompatibility
complex (MHC). Conjwito de genes los cuales codifican para glicoprotenas de superficie
celular (molculas clase I y clase II) que regulan interacciones entre clulas del sistema
inmwie, y otras protenas no superficiales como componentes del sistema complemento
(C2, C4, factor u), el factor de necrosis tumoral (1NF) y linfotoxina. Estos genes son muy
polimrficos y estn presentes en anfibios, pjaros y mamferos.
16
.l
El oaso siguiente es la proliferacin y diferenciacin de la clula Th, que
inv~lucra un segundo factor polipeptdico, la interleuquina 2 (IL-2), secretada
par las propias clulas Th en respuesta a la estimulacin combinada de
antgeno e IL-1 . Este estimulo combinado tambin induce a la clula Th a
sintetizar receptores para lL-2 (RIL-2). En presencia de IL-2 estas clulas
se dividen exponencialmente. Esta proliferacin requiere la continuada
estimulacin del factor de crecimiento IL-2 y, en ausencia de l, se detiene
la divisin celular. El sistema es controlado por el nivel de expresin de RIL-2
sobre la superficie de clulas T proliferantes. En ausencia de estimulacin
antignica el nmero de RIL-2 declina rpidamente. Las clulas T en repo-
so no pueden responder al factor de crecimiento porque carecen del RIL-2
(Figura 7).
Ni Ja IL-1 ni la IL-2 son especficas de antgeno y cualquier clula T que
porte el receptor correspondiente responder consecuentemente al unir el
ligando. La especificidad de la respuesta viene dada por el requerimiento de
que se reconozca el antgeno por el RCT para inducir y mantener la expre-
sin del RIL-2 . Este sistema de regulacin permite una amplificacin rpida
de la respuesta de clulas Th especficas y hace posible su control cuando
cesa la estimulacin antignica.
Activacin de clula B. Interaccin Th-B
Mientras que las clulas Th especficas para el antgeno estn proliferando,
eventos similares conducen a la divisin de clulas B especficas para el
antgeno. Los antgenos son procesados por la clula Ben forma muy simi-
lar a las APC, con la diferencia de que en la primera este procedimiento es
especfico, ya que se intemaliza el antgeno unido al anticuerpo de superficie
que acta como receptor para antgeno en la clula B. Los complejos antigeno-
anticuerpo se intcmalizan, se procesan y los pptidos antignicos asociados
a molculas clase II del MHC aparecen en la superficie de la clula B.
Estos complejos son anlogos a los de la APC, de tal forma que las mismas
Th que fueron estimuladas a proliferar despus de unirse a las APC, pueden
ahora interaccionar con la clula B.
Como podr apreciarse, la interaccin Th-B es un factor principal en la
regulacin de la respuesta de anticuerpos .
17
 La unin de la clula Th activada a la clula B que porta en su superficie el
complejo fragmento antignico-molcula clase 11 hace que la clula B sinteti-
ce progresivamente receptores para diferentes factores sintetizados por la
u ~.,.'?')' clula Th activada, los llamados BSF (B cell stimulation factor), conocidos
e ~ r-c ""'t'
}- ':' ~\-e ~ ~ actualmente como interleuquinas 4; 5 y 6 (IL-4, IL-5, IL-6) . De acuerdo con

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estos factores los procesos de la respuesta de la clula B pueden clasificarse
en tres etapas : activacin, proliferacin y diferenciacin (Figura 8).
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Despus de umr las IL-4 y -5 la clula B comienza a sintetizar el receptor

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g cin con otras seales, induce la diferenciacin de la clula B en divisin a
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cr clulas plasmticas y clulas B memoria.
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Las CP estn especializadas para secretar grandes cantidades de
inmunoglobulinas . El 40 % o ms del total de su sntesis proteica est dedi-
cada a la produccin de anticuerpos . Ellas estn terminalmente diferencia-

- 1.
das y viven alrededor de 3-4 das, sobre todo en los rganos linfoides secun-
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,. Las clulas B memoria son clulas de larga vida que no secretan
inmunoglobulinas, pero retienen anticuerpos en su superficie (lgm) como
receptores especficos para antgeno. Estas clulas permanecen en circula-
.\J!) 4 g~
~ Qtca cin y estn informadas (en ingls, primed) para responder a una subse-
..._o -e
cuente exposicin al antgeno. Los eventos celulares y moleculares como

19
consecuencia de las interacciones de las clulas B memoria con el antge
son similares a los de las clulas B vrgenes (Figura 7).
Diferenciacin de la clula 8, cambio de clase y anticuerpos
de mayor afinidad
Dos procesos de carcter gentico acompaan la diferenciacin de la clu
la B . El primero es la mutacin somtica de las regiones y de las cadenas p
y L de Jos anticuerpos funcionales . El segundo es el proceso de cambio
clase (en ingls, switch).
Las mutaciones somticas ocurren al azar en las regiones V y dan lugar
anticuerpos con afinidades diferentes a la de los anticuerpos producidos por
la clula B original. Las clulas con lgm de mayor afinidad son selecciona-
das preferentemente sobre las que tienen receptores de menor afinidad y
proli~eran debido a que sus anticuerpos de superficie se unen ms
eficientemente al antgeno. Las clulas con receptores de mayor afinidad
siguien la misma va de diferenciacin de otras clulas B, dando lugar a
clulas plasmticas y clulas memoria.
El segundo evento gentico que acompaa la dtvisin y diferenciacin de la
clula B es el cambio de clase. Las cadenas P producidas durante los estados
primarios de estimulacin de la clula B son de la clase . Por recombinacin
del ADN cromosomal que codifica el polipptido cadena P, una unidad funcio-
nal VDJ se mueve de una regin C a otra; esto hace que la misma regin V se
e
exprese con diferentes regiones y conduce a la produccin de anticuerpos
que son ms eficientes para ciertos propsitos. Por ejemplo, slo algunas cla-
ses de anticuerpos pueden atravesar la placenta, son liberados a las secreciones
mucosas o fijan complemento. Durante la ma~uracin de una respuesta hu-
moral tpica, los anticuerpos lgM, que son caractersticos de la respuesta pri-
maria, son remplazados por anticuerpos IgG. Debido a la maduracin de la
afinidad expuesta con anterioridad, las molculas IgG normalmente tienen
mayor afinidad para el antgeno que las de IgM .
CONTROL DE LA RESPUESTA INMUNE
En la prctica est bien demostrado que, con muy pocas excepciones, las
respuestas inmunes estn limitadas a niveles relativamente bajos de
20
anticuerpos circulantes (Dresser, 1986), lo que sugiere que existen meca-
nismos para su control.
La respuesta inmune es un proceso complejo altamente regulado. En ese
control intervienen el antgeno, el sistema inmune y los sistemas nervioso y
endocrino. La interconexin de estos sistemas permite hablar hoy da de un
sistema inmunoneuroendocrino que participa, a travs de sus interacciones,
en Ja induccin, desarrollo y duracin de las respuestas inmunes.
En la seccin anterior se habl de factores genticos que condicionan la
induccin de una respuesta inmune. Ellos codifican para gl icoprotenas de
superficie que tienen a su cargo el reconocimiento del antgeno y las
interacciones celulares que hacen posible la activacin y diferenciacin de
la clula B, precursora de las clulas productoras de anticuerpos .
Esta seccin slo tratar aquellos aspectos de la regulacin no vistos ante-
riormente y que el experimentador debe tener en cuenta para una inmuniza-
cin exitosa .
Si la respuesta inmune est dirigida por la presencia del antgeno, su des-
truccin catablica por ciertos tipos de macrfagos puede constituir, adems
de la primera lnea de defensa, uno de los ms efectivos controles de la
respuesta. En consecuencia con esto, el experimentador inyecta el antgeno
en lugares donde pueda ser fcilmente fagocitado y en una forma que favo-
rezca este proceso, por ejemplo, agregado o mezclado el inmungeno con
adyuvante .
Sin embargo, est claro desde los primeros das de la Inmunologa que, aun-
que inyecciones repetidas del inmungeno pueden incrementar los niveles
de anticuerpos, en algunos casos, de manera notable, se alcanza un punto a
partir del cual ninguna cantidad de inmungeno puede conducir a incremen-
tos mayores . Esto puede estar controlado por mecanismos como el feed-
back del anticuerpo, la supresin celular (Ts) y la tolerancia inmunolgica
~dquirida . Cada uno de ellos puede ser relevante para el desarrollo de
inmunizaciones exitosas.
~e ha demostrado que la inoculacin de anticuerpos especficos previa a la
inyeccin del inmungeno inhibe tanto la respuesta primaria como la secun-
daria. No obstante. en ciertas circunstancias, los complt:jos antgeno-anti-
cuerpo pueden potenciar la respuesta. Las grandes cantidades de anticuerpo
21
presentes pueden actuar reduciendo la concentracin efectiva del
inrnungeno, acelerando su eliminacin, quiz por competir con los recepto-
res de la clula B dentro de los rganos linfoides . Cualquiera que sea el
mecanismo, lo cierto es que cuando a un animal que tiene un elevado ttulo
de anticuerpos se le da un booster del mismo inmungeno, este casi siem-
pre resulta inefectivo. Por esto se aconseja tener paciencia y esperar que el
nivel de anticuerpos haya descendido antes de una nueva inoculacin. lo que
constituye regla sumarsima de la inmunizacin .
Los anticuerpos de una clase (IgG) pueden influi1 sobre la produccin de
anticuerpos de otra clase (lgM) contra el mismo antgeno. En contraste con
esto, el control feedback del anticuerpo puede estar mediado por anticuerpos
especficos para determinadas partes de la molcula inmunoglobulnica: por
ejemplo, a travs de determinantes isotpicos, alotpicos e idiotpicos . En los
ltimos aos la hiptesis 'de la red" (trama idiotipo-antiidiotipo) ha enfocado
la ateqcin sobre el ltimo tipo, tantv desde el punto de vista del control de
los anticuerpos individuales, como del desarrollo y mantenimiento del reper-
torio de clulas B (Dresser, 1986).
La induccin de tolerancia, que es la anttesis de la produccin de anticuerpos,
debe evitarse. Es importante, por tal motivo, conocer algunas de las condi-
ciones que favorecen una u otra respuesta.
A nivel celular la tolerancia puede deberse a uno o ambos de dos posibles
mecanismos: la eliminacin o inactivacin de clulas 8 o Th con especifici-
dad para los determinantes del antgeno en cuestin y la induccin de una
supresin especfica mediada por clulas Ts que actan contra el antgeno o
posiblemente contra el idiotipo del anticuerpo, controlando la diferenciacin
o la eliminacin de precursores de clulas B.
Cualquiera que sea el mecanismo de induccin de tolerancia, resulta nece-
sario conocer las circunstancias que pueden favorecerla y que son adversas
a la produccin de anticuerpos:
1. La dosis de antgeno. En individuos adultos la tolerancia puede ser
inducida contra antgenos potentes tanto con dosis pequeas repetidas o
con grandes cantidades (tolerancia de zona baja y de zona alta, respec-
tivamente). En general los tolergenos* son tambin inmungenos . El
*Tolergeno: Sustancia capaz de inducir tolerancia.
22
que tenga lugar la tolerancia o la inmunidad tras la administracin del
antgeno depende de un nmero de factores : la dosis, forma del antgeno,
ruta de administracin y estado inmunolgico del individuo. Las
inmunoglobulinas heterlogas agregadas son usualmente inmungenos
potentes, pero son a menudo tolerognicas s1 se inyectan en forma
monomrica por la ruta i.v.
2. Inmadurez del animal. El feto tiene poca o ninguna capacidad para
sintetizar sus propios anticuerpos, aunque esta capacidad es rpidamente
adquirida en las semanas inmediatas despus del nacimiento; no obstan-
te, est claro que el mecanismo inmune del recin nacido es altamente
susceptible a la induccin de tolerancia.
3. Tratamiento inmunosupresor La respuesta inmune en los adultos pue-
de ser inespecficamente reducida por el tratamiento con radiacin
ionizante, drogas, inmunosupresores o sueros antilinfocticos. La combi-
nacin de tratamiento supresor e inyeccin de antgeno puede conducir a
una tolerancia parcial.
En l.i Figura 9 estn esquematizados en un modelo bastante simplificado los
f:-icwrcs que participan en el control de la respuesta de anticuerpos y sus
" . ~.1 cc ioncs (Roitt, 1985).
.\ l..\N IPULACIN DE LAS INTERACCIONES APC-Th-B
E\ LA PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
Las consecuen~ias de las interacciones APC-Th-B explican por qu algu-
nos compuestos constituyen buenos inmungenos y otros no.
Para que un compuesto induzca una respuesta primaria y una fuerte respues-
ta secundaria, debe contener un epitopo que pueda unirse al anticuerpo de
superficie celular de uria clula B virgen . Esta unin es un requerimiento
absoluto para una respuesta de anticuerpos y determina la especificidad
de los anticuerpos resultantes, ya que el sitio de unin para el antgeno
sobre la Igm es idntico al sitio de combinacin de los anticuerpos
secretados . Un animal inmunocompetente puede producir al menos
7
10 anticuerpos diferentes con sitios de combinacin para un nmero
similar de antgenos y la mayora de Jos compuestos, aun los ms peque-
os, pueden unirse firmemente como mnimo a uno de esos anticuerpos
de superficie .
23
 tizan en un animal inmunoompetente la cooperacin Th-B, esencial como
ya se vio para la proliferacin y diferenciacin de la clula Ben CP.
1n h i b i e 1o'n d e 1<?
retroallmentac1on I Antgeno Catabo 1is mo En cuanto al repertorio de molculas clase 11 del MHC, aunque es mucho
' menos amplio que el de los receptores de las clulas B y T, ya que en
cualquier animal normal existen aproximadamente 40 protenas clase 11 dis-
tintas, cada una de ellas es capaz de unir un nmero relativamente alto de
pptidos diferentes .

.,
res1on
La no respuesta de anticuerpos a un antgeno TD podra resolverse aten-
diendo a la naturaleza de los factores que impidan interacciones APC-Th-B
adecuadas .

/
,,.
"l.\~
'-----1 Anticuerpo

lnteraccion
1 1. La molcula de inmungeno carece de uno o ms sitios de unin apropia-
dos pqra las molculas clase 11 y el RCT. Frecuentemente esto ocurre con
molculas pequeas que portan buenos epitopos para unir clulas B, pero
son incapaces de inducir una respuesta porque no contienen los determi-
nantes necesarios para estimular la unin con protenas clase 11 y RCT.
. .....;::;
. '0'> - ) idiotpica
Tales molculas son conocidas como haptenos. Para que puedan inducir
-~ ,,.. una buena respuesta de anticuerpos deben ser acoplados a otras molcu-
'/'.7 . Figura 9. Regulacin de la respuesta de anticuerpos.
~ las que, al ser procesadas, provean de sitios adecuados para la unin del
"-' ;J,?(;l T '
~ \..
La segunda propiedad de una molcula que le permite ser un buen inmungeno ~ RCT. Tales molculas son llamadas transportadores o carriers .
es que promueva la comunicacin entre clulas Th y R Para ello debe c 1

disponer al menos de un sitio que pueda ser reconocido simultneamente '

por protenas clase 11 del MHC y el RCT, ya que slo un buen sitio de unin
para el RCT por molcula es suficiente para activar todas las clulas B
disponibles para el antgeno. Esta segunda condicin impone una tercera y
es que el compuesto antignico sea degradable, ya que este sitio debe ser
portado por un fragmento peptdico.
El sitio antignico para la unin del RCT no tiene que estar estructuralmente
relacionado con el epitopo que se une al anticuerpo de superficie de la clula B,
pero los dos sitios deben estar sobre la misma molcula o complejo fisico. La
unin entre ellos puede ser covalente o no covalente, pero s lo suficientemen-
te fuerte como para que permanezcan unidos hasta que el inmungeno entra
en la clula B.
El amplio repertorio de especificidades de clulas T, al igual que el de las .
clulas B, y su amplificacin consecuente a la interaccin APC-Th garan-
~
-
El animal carece de protenas clase 11 para unir los fragmentos peptdicos
del antgeno. El fallo para inducir una respuesta inmune debido a la au-
~ sencia de protenas clase 11 apropi~das es raro y es ms comn en ani-
males inbred tales como lineas de ratones, que en animales outbred,
como los conejos. La mayora de los antgenos tienen al menos un frag-
mento que pueda unirse a una protena clase 11, y un fragmento por
molcula inmunizante es todo lo que se necesita para permitir que todos
los epitopos sobre el inmungeno sean reconocidos . Esta situacin pue-
de ser superada modificando el antgeno para adicionarle nuevos sitios
para unir molculas clase 11. A menudo puede ser resuelta inmunizando
una raza o especie animal diferente.
3. La tolerancia de clulas T. Debido a que los RCT se generan al azar
durante la diferenciacin de las clulas Ten el ambiente del timo, las
clulas que conducen receptores que reaccionan con compuestos pro-
pios, son destruidas . El resultado de estas eliminaciones,,clonales es la .
..,,....\ i
\',

24 25 /~"'.'
' .,,.
(f~,~.'3 ,'. .'..~~iaifc~i
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~g C>j
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_.. ,
,.., C
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/
 t. Antgeno/Inmungeno
tolerancia a lo propio. La ausencia de tales clones de clulas T hace
que sea dificil levantar anticuerpos contra componentes propios. Las cuando se va a producir anticuerpos lo primero que hay que conocer es de
inmunizaciones con antgenos que estn estrechamente relacionados o qu anticuerpo se trata. Para ello se debe saber contra qu deber reaccio-
imitan componentes propios a menudc fallan para inducir una buena nar, es decir, cul es su especificidad. Por ejemplo, si hay que obtener
respuesta de anticuerpos. Mientras ms difiera el antgeno de los com- anticuerpos anti-IgG humana, los anticuerpos debern reaccionar con ella,
ponentes propios del individuo respondedor, mayor probabilidad existe Por tanto, la lgG humana es el antgeno y a la vez el inmungeno que se
de inducir una buena respuesta . Dos procedimientos pueden emplear- inocular al animal de experimentacin.
se para resolver la tolerancia por clulas T. La solucin ms fcil es _ La inmunogenicidad es la cualidad ms importante que debe tener el antgeno
inmunizar animales de otra espec ie . La segunda es mod ificar y se refiere a su capacidad para inducir una respuesta inmune, en este caso,
estructuralmente el antgeno, crendole nuevos sitios para el reconoci- humoral, de ah el trmino inmungeno. Esta propiedad no slo depende de
.._.)
miento por clulas T. hs caractersticas intrnsecas del inmungeno, como su masa molecular y
4. La tolerancia de clulas B. Si la tolerancia es debida a la carencia de su complejidad estructural, sino del organismo receptor, en particular, de su
clulas especficas para el antgeno de inters no hay, por el momento, constitucin gentica.
artimaa para resolver esta deficiencia. Un antgeno podra no ser inmunognico porque es tolerado, debido a su
exposicin previa y apropiada a los mecanismos inmunesJ como se vio ante-
FACfORESQUEDEBENTENERSEENCUENTA riormente, o por otras causas (Dresser, 1986). _..,
EN LA PRODUCCIN DE ANTICUERPOS POLICLONALES En general, las clulas, las protenas agregadas y las molculas de alta masa
molecular son buenos inmungenos; mientras que las molculas solubles,
Estos factores se han ordenacio a manera de algoritmo para desarrollar la
mo~omricas y(o) de baja masa molecular son inmungenos dbiles o nu
ta rea de producir AcP:
los. La inmunopotenciacin de tales antgenos puede lograrse por diferentes
1. Antgeno/lnmungeno mtodos. como se ver ms adelante.
- Purificacin
- Potenciacin Aislamiento y purificacin del antgeno
2. Animal de experimentacin Los antgenos que se utilizan en la inmunizacin de animales son muy diver-
- Seleccin sos y tienen diferentes orgenes. Pueden ser molculas; como las protenas
- Mantenimiento y cuidados del suero sanguneo y las toxinas microbianas; componentes celulares, como
protenas flagelares y lipopolisacridos de las paredes bacterianas ;
3. Programa de inmunizacin
macromolculas y virus o clulas, como bacterias y linfocitos. En estos lti-
- Dosis e intervalo entre ellas
mos casos se trata de un mosaico de antgenos .
- Va y modo de administracin del Ag
- Desangrados La preparacin de algunos inmungenos puede ser muy simple, tal como
la obtencin y estandarizacin de glbulos rojos sanguneos . En otros ca-
4. Titulacin de anticuerpos
sos puede ser muy compleja, por ejemplo, si se debe purificar una hom10-
5. Purificacin de anticuerpos na peptdica que se encuentra a niveles de trazas en um macla biolgica
6. Conservacin de anticuerpos compleja . En ocasiones el inmungeno, despus de purificado, debe ser .
UES BIBLIOTECA DE MEDICINA
27
26
1111111111111111111111
jNVENT ARIO: 1100800~

fragmentado o t rans fo rmado, Jo que involucra nuevas etapas de purifica-
c in .
El grado de pureza de un inmungeno no est necesariamente relacionado
con la especificidad del anticuerpo producido, ya que trazas de impurezas
muy inmunognicas pueden debilitar la respuesta al inmungeno principal .
Por otra parte, la facilidad con que los anticuerpos se producen contra impu-
rezas altamente inmunognicas puede ser til para su remocin . La pureza
del inmungeno es menos importante en la inmunizacin con vista a la pro-
duccin de AcM, ya que cada clon de linfocitos produce un tipo particular
de anticuerpos.
La expresin pureza bioqumica debe ser bien analizada . Una protena
separada por PAG E y teida con azul Coomassie, que muestra una banda
nica, sometida subsecuentemente a la tincin con plata ( 100 veces ms
sensible que la primera) puede revelar muchas bandas adicionales . Es posi-
ble utilizar en las inoculaciones bandas proteicas cortadas directamente de
geles de poliacrilamida, aun cuando contengan dodecil sulfato de sodio (SOS) .
Los inrnunoprecipitados obtenidos en geles de agarosa constituyen tambin
excelentes inmungenos. Se cortan los fragmentos del gel que contienen los
inmunoprecipitados, se lavan en salina fisiolgica y se inyectan al animal.
Estos mtodos son una alternativa cuando los procedimientos de purifica-
cin son difciles.
as preparaciones,.._inmunognicasdeben mantenerse libres de contaminacin
microbiana, ya que tales- contaminantes pueden daauil anima~r
des_n~tur~i~n o cambio~tructurales i!n el ant~no . En los casos que
sea posible deben esterilizarse y(o) cons~jlrse con un preservativo inocuo
--- - - ----
emplear aziaa sooica (NaN), pu~s_u1t.Yeneno muy potente.
--..
--
al animal, como el timerosarilla concentracin final de _Q,_Ol %. Nunca se
En la purificacin de antgenos proteicos, as ~modelos ant~se
e~s__co.!locid~ puri~_cacin de protenas : precipitacin
coqal~s in_orgnicas o solventes orgnicos, cromatografa de diferentes
tipos, ultrafiltracin y ultracentrifugacin, entre otros .
El aislamiento y purificacipjle antge11os conlleva su valoracin cualitativa
y-crr___@fitativa. La electroforesis en gele.s de poliacnlamida, la focalizacin
isoelctrica y la inmunoelectroforesis en el primer caso, y los mtodos de
Lowry, Coomassie y espectrofotomtricos en el segundo. permiten la valo-
. 28
racin del inmungeno que se emplear en las inmunizaciones y en la titula-
ci cfe~ticuerpos .
Aplicacin de los preparados antignicos
Los preparados antignicos tienen mltiples aplicaciones, entre las que se
encuentran:
- La inmunizacin de animales para la obtencin de anticuerpos policlonales
y en la primera etapa de la produccin de anticuerpos monoclonales.
- La titulacin y valoracin de anticuerpos .
- La purificacin de anticuerpos por cromatografa de afinidad.
- El d iagnstico de enfermedades infecciosas en el hombre y los animales,
a travs de la deteccin de anticuerpos en el suero de los pacientes, as
como en estudios epidemiolgicos y en el seguimiento de enfermedades
o vacunaciones.
- La vacunacin de personas y animales, ya que las vacunas son prepara-
dos antignicos inocuos.
- El estudio inmunoqumico de los antgenos para lo que se requiere prepa-
rados de gran pureza.
Antgenos bacterianos (Margni, 1983)
Cuando una bacteria se inocula a un animal se forma ms de un tipo de
anticuerpo, y esto se debe a que un microorganismo es un mosaico antignico
en el que se encuentran antg'enos diferentes, cada uno con capacidad inmuno-
gnica. Estos antgenos pueden ser protenas, frecuentemente situadas en
la membrana celular y el espacio periplasmtico; carbohidratos que consti-
tuyen, sobre todo, antgenos de superficie; y en algunos casos, como el de
las enterobacterias, complejos glicofosfolipdicos que son verdaderas
endotoxinas y forman parte de la pared celular~No todos los constituyentes
antignicos de una bacteria tienen la misma capacidad inmunognica; hay
algunos que originan anticuerpos con suma facilidad, mientras que otros
slo estimulan cai,:itidades pequesimas . Las bacterias, por su tamao y
complejidad, son inmungenos potentes .
A los antgenos bacterianos ubicados en el soma se les denomina antgenos O;
a los de la envoltura o capsulares, antgenos K1 y a los flagelares, antgenos H. .
29
Algunos microorganismos producen y liberan al medio sustancias con mar-
cado poder toxignico para los animales y el hombre. Estas sustancias, co-
nocidas como exotoxinas, son antgenos eficaces a pequeas dosis y pue-
den ser neutralizados totalmente por los anticuerpos que originan . Como
muchas bacterias son productoras de enzimas, la inoculacin de un caldo de
cultivo a un animal puede originar anticuerpos para las exotoxinas e incluso
para tales enzimas .
El hecho de que un microorganismo sea un complejo antignico capaz de
inducir anticuerpos para sus diferentes componentes, hace que en ocasio-
nes no se interpreten correctamente las reacciones serolgicas, sobre todo,
las reacciones cruzadas que ocurren cuando se enfrentan sueros inmunes
con antgenos heterlogos . Estas reacciones pueden ocurrir entre
microorganismos que posean cierto grado de parentesco, pero se observan
a veces en especies de ubicaciones taxonmicas totalmente diferentes .
El grupo de las enterobacterias incluye un gran nmero de especies de ba-
cilos cortos, gramnegativos, no esporulados, cuyo habitat natural es el tracto
intestinal del hombre y otros animales. Algunas bacterias de este grupo son
patgenos para el hombre y causan varios tipos de enfermedades
gastrointestinales. Otras, como la Escherichia co/i, son microorganismos
saprofiticos en el tracto intestinal, aunque pueden causar enfermedades en
el tracto genitourinario o en el respiratorio.
La diferenciacin de las enterobacterias no es fcil, y su clasificacin se
basa en caractersticas morfolgicas, reacciones bioqumicas y propiedades
antignicas.
De acuerdo con los criterios de clasificacin, las bacterias entricas fonnan
grupos dentro de los cuales se encuentra uno de gran importancia mdica
que incluye a especies del gnero Sa/mone/la. Entre los microorganismos
de este gnero se encuentran los agentes causales de la fiebre tifoidea, la
paratifoidea, gastroenteritis y varios tipos de infecciones septicmicas .
Las diferentes especies del gnero Salmonella estn antignican1ente rela-
cionadas y este es el criterio bsico para su clasificacin. Por las similitudes
en el antgeno somtico se clasifican en grupos, y las especies dentro de un
mismo grupo se diferencian por su antgeno flagelar.
En la Salmonella typhi se ha identificado, adems, un antgeno superficial
termolbil, denominado Vi. No es un componente exclusivo de este micro-
30
organismo, y puede hallarse en otras Salmonellas e, incluso, en otras
enterobacterias no pertenecientes a este gnero.
f Los antgenos O y H fueron descritos en un inicio como termoestable y
termolbil, respectivamente. El antgeno O es un complejo formado por un
polisacrido, una protena y un fosfolpido . Su especificidad inmunoqurnica
est determinada por el oligosacrido. Forma parte de la pared celular de la
cnterobacteria y es la cnterotoxina de Salmonella . Es resistente a tempera-
turas de l 00 C durante tiempos prolongados y no se destruye con alcohol ni
.;on cidos diluidos. Los estudios qumicos han demostrado que el antgeno
Hes una protena fibrosa, del tipo de la queratina. La protena flagelar puri-
ficada, llamada flagelina, de masa molecular 41 000 Da, no contiene fsforo
y s trazas de lpidos y carbohidratos. Es lbil a temperaturas mayores de 60 C
y al tratamiento con alcohol y .cidos . El antgeno Vi es de naturaleza
glicolipdica y difiere qumicamente del antgeno O. Cuando est presente
recubre totalmente al antgeno somtico, impidiendo la aglutinacin con el
antisuero correspondiente. 6
Preparacin de antgeno O de Sa/monella -~
Mate rial
- Cepa de Salmonella - Tubos con caldo agar
- Frasco Roux - Tubo estril vaco
- Pipetas - Tubos de centrfuga
- Frascos para envasar - Asa
- Bao de agua - Nefelmetro de Me Farland
- Salina fisiolgica (SF)
M todo
1. Sembrar la cepa de Salmonella en tubos con agar nutriente e incubar a
37 C durante 18-24 horas .
2. Cosechar el crecimiento obtenido agregando 2 mL de solucin salina
estril y agitando vigorosamente hasta obtener una suspensin homog-
nea .
31
 \nticuerpos como antgenos (Jaske and Capra, 1986)
3. Sembrar boca a boca utilizando dicha suspensin en frasco de Kollc o
Roux . Incubar 24-48 horas a 37 '( {.,os anticuerpos son molculas glicoproteicas complejas (inmunoglobulinas,
Figura 1O) que pueden actuar como inmungenos y antgenos. A partir de
4. Agregar a cada frasco Roux 10 mL de SF estril. Agitar y colectar la ellos es posible obtener antisueros que permjten distinguir serolgicamente
suspensin en tubos estriles . Repetir este paso. variantes de estas molculas. Estos antisueros han conducido a la definicin
5. Colocar los tubos en bao de agua a ebullicin durante 120 minutos . de al menos tres tipos de detenninantes antignicos en las inmunoglobulinas,
que se emplean para clasificar los anticuerpos en isotipos, alotipos e idiotipos
6. Enfriar y centrifugar a 3 000 rpm durante 20 minutos. Desechar . el (Figura 11). (Ver Tabla l.)
sobrenadante.
7. Resuspender el sedimento bacteriano en SF con fonnaldehdo al 0,3 %
Antgeno
hasta igualar su turbidez con el tubo# 3 del nefelmetro de Me Farland .
8. Hacer la prueba de esterilidad de la suspensin e incubar los tubos a
37 C durante 48 horas. Observar si hay crecimjento.
9. Envasar la suspensin en un frasco o mpula estril, tapar aspticamcnte
con tapn de goma y retapa de aluminio. Etiquetear y guardar en refrige-
racin. ~
Fab

Extraccin de un antgeno soluble de Escherichia coli

Materia/

- Cepa de Escherichia coli.

- Los mismos de la preparacin de antgeno de Salmonel/a .

Mtodo
1. Sembrar la cepa de E. coli en agar nutriente.
2. Recoger el crecimiento en SF procurando que quede bien concentrado.
3. Centrifugar a 3 000 rpm durante 20 minuto!' para lavar las clulas . Rcpe- 1 Fe
tir tres veces.
4. Colocar el tubo en bao de agua a 100 C durante 60 minutos .
5. Centrifugar a 12 000 rpm durante l hora.
6. Recoger el sobrenadante, que es do.nde est el antgeno, y envasarlo
aspticamente. Guardarlo en fro. Figura 1O. Estructura de la molcula de lgG .

33
32
 ~ll~U'%1/
~
~~ ,,. '.. ;,;;~::
~<~:<
. (o\'<-_.,,.;...
,....,,/
}.
~ (
u Figura 12. Genes de regiones constantes. Arriba: ratn. Abajo: hwnano.
,J:JJ
~'~'li\?
.,< .y
1sot (pica Alotpica 1dio t i'p1co
Figura 11 . Variantes de las imnunoglobuli.nas.
Los isotipos por lo general definen determinantes de la regin constante (C)
que distinguen los productos de cada uno de los genes de las regiones de
las cadenas pesadas (P) y ligeras (L) . Se han distinguido cinco clases de
cadenas pesadas que se identifican con los smbolos griegos : alpha (a),
gamma (y), my () , psilon (E) y delta(&) . Dos de estas clases tienen varios
miembros relacionados y se dividen: y en cuatro subclases en el humano (y 1,
y2, y3, y4) y en el ratn ( yl , y2a, y2b, y3 ); y a en dos subclases en el
humano (al y a2) . Las molculas de inmunoglobulina se nombran de acuerdo
con las cadenas P que poseen, por ejemplo, si tienen cadenas se denomi-
nan molculas IgM . Cada una de las di ferentes regiones C de las cadenas P
o isotipos (entindase clases y subclases) est representada por un gen
separado en el genoma haploide (Figur(l 12). Atendiendo slo al aspecto
gentico se podra hablar nicamente de clases de inrnunoglobulinas, aun-
que desde el punto de vista serolgico es posible referirse a clases y subclases .
.Para una descripcin completa de una molcula de anticuerpo la cadena
ligera tipo kappa (K) o lambda p. ) debe especificarse, por ejemplo, IgM (K) .
Tanto en el hombre como en el ratn hay un solo gen para la regin C de K
en el genoma haploide, pero las cadenas A. estn codificadas por cualquiera
de varios genes de regin C, existiendo por tanto en varias formas isotpieas.
Los genes para las cadenas P, K. A. estn en cromosomas separados . En el
hombre los genes P estn en el cromosoma 14, los genes K sobre el
cromosoma 2 y los genes A. sobre el cromosoma 22 . Todos los genes C de
las cadenas P y L se expresan normalmente, de ah que todos los isotipos
estn presentes en el suero de un individuo normal.
34
5' ~
Genes de regiones consto ntes
3'
5' ~ 3'
Genes de regiones constantes
Para hacer antisueros especficos contra un isotipo determinado es nece-
sario inmunizar animales de diferentes especies (xenoantisuero), ya que
los individuos normales de la misma especie no reconocen esos determi-
e nantes como extraos. Se debe inmunizar preferentemente con la cadena
que porta el isotipo de inters y(o) absorber con posterioridad el antisuero
resultante para garantizar su especificidad. Las similitudes que existen
entre las regiones e de las inmunoglobulinas de diferentes especies ani-
males trae como consecuencia reactividades cruzadas de los anticuerpos
anti -isotpicos . De acuerdo con el uso que se les vaya a dar a estos
anticuerpos a veces es necesario absorberlos frente a inmunoglobulinas
heterlogas.
El alotipo se refiere a determinantes codificados por un alelo de un gen
inmunoglobulinico dado. Mientris que los isotipos estn presentes en todos
los miembros de una especie, los alotipos lo estn slo en algunos de ellos .
Por consiguiente, no todos los individuos poseen todos los alotipos y el.
antisuero contra estos determinantes puede fabricarse dentro de la especie,
inyectando protenas de un alotipo (aloantgeno) en un individuo de la misma
especie cuyas protenas son de un alotipo diferente. Xenoantisueros con
especificidad para un alotipo pueden tambin producirse.
Los determinantes idiotipicos estn localizados en las regiones variables (V)
de la molcula anticuerpo. Estos determinantes definen la individualidad o
exclusividad de cada inmunoglobulina. El antisuero anti-idiotipo se obtiene
inmunizando un animal con una poblacin homognea de molculas de
35
inmunoglobulinas, tales como una protena de mi e loma* o anticuerpos mono-
e
clonales . Los anticuerpos que se generan son absorbidos exhaustivamente o
Vl
con inmunoglobulina normal hasta que el antisuero es especfico slo para la ro
e
protena inmunizante. En este caso pueden emplearse animales de la misma .! Col
:::i

especie o line:a gentica y animales de otra especie a la que pertenece el e

Col ~1 ..o
o
Co
~ rs o
anticuerpo inmunizante. Tambin pueden obtenerse anticuerpos monoclonales
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anti-idiotpicos mediante la biotecnologa del hibridoma. ** = ~ ~
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Potenciacin de inmungenos "
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La potenciacin de inmungenos puede lograrse por diferentes mc;todos.
que se basan fundamentalmente en:
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- La manipulacin del mecanismo de cooperacin T-B (efecto carrier ). e~ :>< :>< e e

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- El empleo de adyuvante. B 3 :g~ rs

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La potenciacin puede lograrse tambin por agregacin de las molcu-
las de antgeno, utilizando reactivos de unin cruzada, como el glutaralde-
hdo, o el calor. Tambin pueden ser absorbidos sobre clulas como eritro-
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Esta metodologa se emplea cuando se desea obtener anticuerpos contra

molculas pequeas (hormonas , pptidos) generalmente con masas
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moleculares menores de l O kDa, y consiste en la conjugacin de esta mol-
cula, que sera el hapteno, a una macromolcula, por lo general la hemocia- ~ -Qj
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Protena de mieloma: Paraprotena. inmunoglobulina homognea (monoc lonal) derivada ~u -~

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de un clon neoplsico de clula plasmtica y no relacionada con una estimulacin anti gnica ~
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conocida. e U"I e: - -e: o \-

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e: fj ~ 5
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Hibridoma: Clon derivado de una clula hbrida previamente seleccionada (clonaje). Resul-
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"O "O (i (i :=
linfoide). El hibridoma combina la capacitlad de producir anticuerpos del linfocito I3 y la <". :: o-o-oro
de replicarse indefinidamente de la clula de mielorna. 8. . ~ 0 0 .S
oc:..c:E
E= .~ 6o u CiJ
- - ::i ~
36 w <( ~
* ** **
*
 Conjugacin con BSA empleando carbodiimida
El fenmeno que se producira sera el siguiente: el car ricr , despus del Materia/
procesamiento del conjugado hapteno-transportador por la APC, aporta los
sitios para el reconocimiento de la clu la Th por su RCT en el conte:-..10 de - Hapteno purificado - Soluciones de NaOH y HCL 1 mol/L
~~~
las molculas MHC propias. Esta clula, una vez activada, ayuda a la clula B - N-hidroxisucci.nimida (NHS) - Pipetas -'6~'>.
(cooperacin Th-B) que reconoci el determinante haptnico, como ya se '"~< ~, 1' .. "

; ',(;~.
. J -.

- Carbodiimida - Membrana de dilisis g

~ti
vio anteriormente, producin9ose la respuesta de anticuerpos contra el
hapteno (Mitchison, 197 l ). - BSA - Agitador magntico (
.'
Tamb in se producen anticuerpos contra el carrier proteico. al ser reco- \.;<':-.
nocidos sus epitopos en el complejo nativo por clulas B con lgm especi-
ficas . Estos anticuerpos pueden ser irrelevantes, pero en ocasiones deben
ser eliminados, absorbiendo el antisuero frente a l carn er o ligando el
Mtodo
l . Mezclar 30 mg de hapteno en l 00 L del disolvente con l O mg de
N-hidroxisuccinimida disuelto en 1 mL de agua destilada y con 32, 7 mg
//1)

- - fjS,\\\1 \

hapteno o un conjugado hapteno-transportador diferente a una matriz de de carbodiimida disuelta en 1 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 5,5 .
afinidad.
2. Aadir gota a gota una solucin que contenga 60 mg de BSA en 8 mL de
agua con agitacin suave, ajustando el pH todo el tiempo a 5,5 .
Conjugacin con hemocianina empleando glutaraldehdo (GA)
3. Dejar en agitacin 4 horas a TA y guardar toda la noche en fro .
Ma terial
4 . Dializar contra SF exhaustivamente para eliminar los excesos de reac-
- Inmungeno - Frasco mbar tivos .
- Hemocianina - Pipetas 5 Dispensar en alcuotas y liofilizar. Conservar en refrigeracin.
- Glutaraldehdo - Membrana de dilisis
1nmunopotenciacin. Empleo de adyuvante
- Salina fisiolgica - Agitador magntico
El adyuvante es una sustancia o preparado que facilita inespecficamente la
M todo respuesta inmune a un antgeno . Con su empleo se ahorra tiempo e
inmungeno y se obtiene un mayor nivel de anticuerpos especficos. Es
l . Mezclar 5 mg de la protena disuelta en 1 mL de SF con 2 rng de hemo-
cianina en 1 mL de SF. usualmente administrado con el inmungeno, pero puede darse antes o des-
pus de l. Generalmente todos los i.nmungenos solubles y los conjugados
.2 . Echarle a la mezcla 100 L de glutaraldehdo al 2,5 % gota a gota con proteina-hapteno son mezclados con adyuvante. En el caso de i.nmungenos
agitacin suave en frasco mbar. celulares puede obviarse su empleo.J-os adyuvantes se utilizan en la inmu-
nizacin de animales para obtener antisueros y en las vacunas de uso huma-
3. Dejar en reposo en la oscu ridad a temperatu ra ambiente (TA) durante
4 horas. no y animal. Los ms empleados son el completo (ACF) e incompleto (AIF)
de Freund, el alumbre y el gel de hidrxido de aluminio.
4. Dializar contra salina fisiolgica o PBS para eliminar el exceso de
glutaraldehdo. El AIF es una emulsin de agua en aceite de parafina con un estabilizador. El
ACF contiene adems micobacterias muertas, las que inducen fonnacin de
5. Conservar el conjugado en alcuotas congeladas o liofilizadas .
39
38
 granuloma en el sitio de inyeccin. Ambos adyuvantes, al ser mezclados con
el antgeno en solucin o suspensin acuosa rinden una emulsin muy espesa
que al ser inyectada se deposita en el sitio de inoculacin. El AIF, por carecer
de micobacterias, es menos efectivo que el ACF. Actualmente se ha tratado
de remplazar por un producto ms refinado: el adyuvante 65 . Las emulsiones
de antgeno con adyuvantes de Freund no pueden administrarse por va i.v. y
son inaceptables para uso humano por su tendencia a desarrollar abscesos
estriles y desrdenes autoinmunes. Se recomienda emplear el ACF slo una
vez en la primera inoculacin y continuar con el AfF.
El alumbre es una mezcla de sulfato de aluminio y potasio. Las protenas
precipitan con el aluminio, pennaneciendo insolubles. El antgeno absorbido
sobre alumbre con Bordetel/a pertussis (Bp) es una poderosa mezcla
adyuvante cuando se inyecta i.p . en ratas y ratones . El gel de hidrxido de
aluminio est fonnado aproximadamente por un 2 % de Al(OH) en una
3
forma gelatinosa muy hidratada que absorbe fuertemente los antgenos
proteicos . Convenientemente diluidas, las preparaciones antignicas con
alumbre o gel de hidrxido de ah.~minio pueden administrarse por va i.v. sin
provocar trombosis fatales . Por su baja toxicidad los adyuvantes de alumi-
nio se emplean en humanos.
El estudio de la naturaleza de los adyuvantes, comenzando con un anlisis
de las fracciones activas del mycobacterium, ha conducido a la disponibili-
dad de adyuvantes sintticos. El muramil dipptido (MDP), cuando se adi-
ciona al AIF, eleva las respuestas inmunes a niveles muy cercanos a los
obtenidos con ACF. El desarrollo de adyuvantes bien definidos y caracteri-
zados que no posean efectos colaterales indeseados tiene amplias perspec-
tivas . Sin embargo, los estudios realizados para alcanzar ttulos altos de
anticuerpos han demostrado que ningn adyuvante ha podido exceder la
eficacia del ACF. Algunos pueden ser tan buenos o ms convenientes (alum-
bre con Bp) por presentar menos efectos colaterales en los individuos in-
yectados (Dresser, 1986).
Granuloma: Acumulacin compacta de macrfagos formada en el sitio de inoculacin. Los
granulomas que rodean al antgeno se digieren con dificultad. Ellos se forman cuando las
clulas T reconocen el antgeno en Ja superficie del macrfago. Las clulas T activadas
segregan linfoquinas que atraen macrfagos adi.cionales y los activan. Cuando los granuloma<;
crecen, pueden desarrollar necrosis.
40
Otras lneas de investigacin prometen el empleo en animales y quiz evert-
tualmcnte en el hombre, de sustancias naturales con preferencia por dife-
rentes compartimientos celulares, por ejemplo, lipopolisacridos (LPS), que
posi blemente afectan de modo directo las clula$ B o en fonna indirecta
potenciando el efecto cooperativo de las clulas Th . Lcntinan, un 1-6 glucano
natural originado por el basidiomiceto lentinos edades , se piensa estimula
clulas Th . Saponin parece ser otra sustancia que puede convertirse en un
adyuvante de eleccin. tanto mezclado con el antgeno como incorporado a
liposomas . Los liposomas, hechos de vesculas de membranas artificiales,
pueden ser preparados para que contengan antgenos solubles en agua y, en
,irtud de su tamao y propiedades superficiales, ser eficientemente captu -
rados por los macrfagos. La incorporacin del lipido A (c:xtrado d~~ LPS) a
membra.ryas artificiales puede incrementar grandemente la efi cacia de los
liposoms (Dresser, 1986).
El modo de accin de los ad)U\antes ha sido objeto de numerosos estudios
y es poco probable que todos acten de la misma foll}a . Veamos un. resu-
men de algunos de los modos de accin que se proponen:
1. El antgeno libre nom1almente se difunde muy rpido desde los tejidos
locales que rodean el sitio de inyeccin, y una importante funcin de
algunos adyu,antes es contrarrestar esto, provocando un reservorio o
depsito del antgeno de larga vida. Los adyuvantes ms corrientes de
este tipo son los compuestos de aluminio y el AIF. El efecto depsito que
se logra cuando un antgeno es liberado lentamente de una emulsin de
agua en aceite en un adyuvante tipo Freund, puede imitar la liberacin
continua de antigeno durante la etapa temprana de una infeccin natural.
2. Se sabe que algunos adyuvantes. principalmente el ACF, es un potente
estimulador de clulas T, By reticuloendoteliales. Entre estos ad}uvantes
tenemos, adems, el levamisol , el !entinan, el sulfato de dextrano y los
lipopolisacridos bacterianos . Algunos ad)uvantes pueden actuar como
estimuladores diferencialt:s o seales que inducen a los precursores de
las clulas B a entrar en una va que conduce a la inmunidad ms que a
la tolerancia, por lo cual se crea una situacin que convierte al antgeno
soluble en inmunognico. En el caso de estas clulas tambin se ha ob-
servado un efecto estimulante del ad)uvante que facilita su proliferacin
cuando ellas han contactado con el antgeno. Algunos adyuvantes pue~
41
 den alterar la relacin 111/Ts en una pol)lacin dada, incrementando o
disminuyendo la respuesta a antgenos TO.
3. Los adyuvantes pueden provocar el secuestro temporal de las clulas
linfoides circulantes (>80 % de clulas T) en los ndulos linfticos que
drenan el sitio de inyeccin de la mezcla ad)'1JVante-inmungeno, y se
incrementa la probabilidad de una interaccin fa vorable entre cl ulas B,
T, APC y el inmungeno. A este fenmeno se le denomina 'trampa de
linfocitos". Esto puede estar relacionado con la formacin de gran u lomas.
El grado de respuesta humoral en un sistema experimental mostr estar
directan1ente relacionado con la presencia de granulomas como respuesta
a la micobacteria en ACF (Dresser, 1986).
4. Los estudios realizados han demostrado que virtualmente todos los
adyuvantes estimulan los macrfagos. Los macrfagos activados se cree
que actan mejorando la respuesta inmune por un incremento en la can-
tidad de antgeno de superficie y en la eficiencia de su presentacin a los
linfocitos . El macrfago activado segrega factores solubles estimulantes
que amplifican la proliferacin de los linfocitos .
Liposomas como carrier y adyuvante
Los liposomas son vesculas lipdicas sintticas, que consisten de bicapas
concntricas fosfolipdicas separadas por compartimientos acuosos . Ellos
se forman cuando los fosfolpidos se enfrentan al agua. Las molculas de
fosfolpido se organizan preferentemente en una conformacin en la que
sus cadenas hidrofbicas de cidos grasos previenen el cvntacto con el
agua, quedando los grupos hidrofilicos en las superficies (externa e interna)
de la bicapa en contacto con el medio acuoso.
Los antgenos pueden ser asociados con los liposomas en diferentes fo r-
mas. Ellos pueden ser atrapados en las vesculas disolvindolos en ia solucin
acuosa usada para la preparacin de los liposomas . Con este procedimiento
simple los antgenos quedan atrapados en los compartimientos acuosos y
expuestos en la superficie externa. La relacin antgeno encapsulado y
antgeno expuesto puede variar con la estructura del antgeno, por ejemplo,
presencia de grupos hidrfobos . Existen evidencias experimentales que
muestran que los antgenos encapsulados en liposomas tienden a estimular
respuesta de IgG, mientras que la exposicin superficial tiende a estimular
respuesta de IgM contra el mismo antgeno. La exposicin superficial pue-
de ser llevada a cabo por la unin covalente del antgeno a uno de los
fosfolipidos usados en la preparacin del liposoma.
Adems de servir como transportador a los haptenos, los liposomas pueden
actuar com adyuvante para haptenos y antgenos proteicos . Ellos son cap-
turados con rapidez por los macrfagos, por lo que la respuesta a detenni-
nados antgenos puede ser mejorada notablemente cuando se administran
asociados a estas estructuras.
Una de las ventajas de los liposomas como adyuvante es su biodegradabilidad.
Al ser ingeridos por los macrfagos son consecuentemente digeridos por
sus fosfolipasas lisosomales . Otra ventaja importante de los liposomas es
que pueden estar constituidos por fosfolpi dos (por ejemplo. fosfatidilcolina)
que no son txicos a las dosis empleadas y que adems no son inmunognicos
por s mismos.
La adyuvanticidad de los liposomas puede ser mejorada mediante la adi-
cin de otros compuestos adyuvantes como el lipopolisacrido (LPS) o el
l pido A derivado del LPS o sustancias inmunoestimulantes como
interleuquinas.
Las ventajas que presentan los liposomas como transportador y adyuvante
los convierten en un candidato para la preparacin de vacunas . Las posibi-
lidades que ofrecen estas estructuras son muchas y es por eso que constitu-
yen un tema de investigacin muy actual .
P reparacin de liposomas mult ilaminares (MLV, mu/ti/aminar vesicle)
por d ispersin simple y po r congelacin-descongelacin (FAT -MLV,
free ze and thawy-M LV)
Ma terial
- Factor de crecimiento epidm1ico (EGF, epidermic growing fac tor)
- Dipalmitoilfosfutidikolina (DPPC)
- Colesterol
- Neogticolpido

42 PBSpH 7,2 ,./ :r. .. '-: ~

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C}.. A"

Nitrgeno lquido
- Vortex
- Contador gamma
- Retroevaporador
- Bao de ultrasonido
Mtodo
l . Aadir a un tubo cnico la DPPC y el colesterol en las cantidades reque-
ridas . Estas cantidades dependen de las concentraciones de ambos lpidos
y de la relacin DPPC :colesterol que se desea evaluar. Por ejemplo,
l DPPC: 1,4 colesterol para l O mg totales de lpidos .
2. Rotoevaporar hasta lograr una pelcula fina y desecar hasta completar
un tiempo de 40 minutos.
3. Aadir 500 L de la mezcla EGF no marcado-EGF marcado preparada
convenientemente.
4 . Dejar reposar durante 30 :ninutos y despus agitar vigorosamente en
vortex hasta resuspender la pelcula.
5. Sonicar los liposomas 2 minutos y dejarlos eposar l minuto. Repetir este
ciclo cuatro veces ms.
6. Pasar la suspensin obtenida a un vial Eppendorf con tapa de seguridad
y comprobar que el tubo qued bien tapado.
7. Congelar la suspensin en nitrgeno lquido y descongelarla a 40 C.
Repetir este ciclo cuatro veces ms .
8. Para purificar los liposomas, centrifugarlos a 15 000 rpm durante
30 minutos. Transferir el sobrenadante (SNl) a otro vial.
9. Resuspender el sedimento en 500 L de PBS y repetir la centrifugacin.
Transferir el segundo sobrenadante (SN2) al mismo vial con SN 1. Re-
petir el lavado con PBS dos veces ms y mezclar los cuatro sobrena-
dantes .
10. Contar la radioactividad del sedimento final y del vial con los cuatro
sobrenadantes .
44
i
Preparacin de la mezcla inmungeno-adyuvante de Freund
Ma terial
- lnmungeno en SF estril - Jeringuillas de 2 mL
- ACF o AIF - Agujas
- Viales o bulbos pequeos - Guantes
M todo
1. Diluir convenientemente el inmungeno en SF estril de acuerdo con la
cantidad y el volumen que se suministrar al animal. Es conveniente
preparar un volumen un poco mayor de mezcla.
2. Tomr porciones iguales de la fase acuosa (SF) que contiene el
inmungeno y de la fase oleosa (ACF o AIF) . En algunas circunstancias
puede emplearse un volumen ms pequeo de la fase acuosa.
3. Mezclar los dos volmenes Puede hacerse inyectando vigorosamente
con una jeringuilla de 2 mL y una aguja de calibre fino (0,5 mL) peque-
as porciones de la solucin de inmungeno al adyuvante. La fase acuo-
sa que aparece en el fondo del vial es reinyectada de nuevo en el aceite.
Repetir esta operacin hasta que haya adicionado todo el inmungeno.
Continuar la emulsifcacin con una aguja ms larga, ya que con el au-
mento de la dispersin se incrementa la viscosidad de la mezcla .
Cuando se preparan volmenes pequeos puede utilizarse el mtodo de
las dos jeringuillas interconectadas por un tramo de manguera fina (Figu-
ra 13).
Las jeringuillas deben llenarse un poco menos de la mitad de su volumen:
una con el inmungeno y la otra con el adyuvante. Primeramente se
impulsa el inmungeno dentro del aceite y viceversa, de manera que el
fluido expulsado de una jeringuilla entre ~n la otra, repitindose hasta que
se alcance la viscosidad adecuaca.
4. Para comprobar si la mezcla est lista para ser inyectada se deja caer
una gota en agua fra . La gota debe mantenerse ntegra. Si se dispersa,
la emulsin es de aceite en agua y no puede esperarse de ella una buena
accin adyuvante.
45
 Preparacin de un antgeno proteico con alumbre

Material
a) - Beaker de 25 o 50 mL
- Protena purificada (inmungeno)
- Solucin de bicarbonato de sodio l mol/L - Tubo de centrfuga
- Solucin de alumbre 0,2 mol/L - Pipetas
- Solucin SF -Timerosal

m:--~~--~~) ~l l - Centrfuga - Espectrofotmetro

b) -
M todo
1. MezcJar 1O mL de la solucin proteica que contiene 10-20 mg/mL con
4,5 mL de la solucin de bicarbonato de sodio l mol/L .
2. Adicionarle lentamente con agitacin 1O mL de la solucin de alumbre
e)~ l.~ ,<---~~-l - 0,2 mol/L .
3. Dejar en reposo 15 minutos a TA.
4. Centrifugar la suspensin durante 1Ominutos a 3 000 g .
Figura 13. Jeringuillas intcrcooectadas para mez.clar irunungeno y ACF/AIF.
5. Lavar el sedimento tres veces con SF.
5. Una vez comprobada la calidad de la emulsin se puede proceder a su 6. Conservar en SF con timerosal a una concentracin final del 0,01 % en fro.
inoculacin, preferiblemente por las vas i.m., s.c. o i.d.
Observacin Obse rvacin

Toda la manipulacin debe realiz.arse con guantes. Si la persona se pincha La diferencia entre la lectura a 280 nm de la solucin proteica original y la del
debe retirrsele inmediatamente todo vestigio de emulsin. El inmungeno sobrenadante despus de la adsorcin, permite hacer un estimado de la pro-
no debe exceder la concentracin 75 mg/mL para obtener emulsiones esta- tena absorbida. Con este dato se calcula el volumen de SF en que deber
bles. El suero total debe diluirse al menos 50 veces. Siempre el inmungeno suspenderse el sedimento de acuerdo con la concentracin que se deba pre-
debe aadirse al ACF/AIF y nunca al revs. Las emulsiones de Freund parar.
inyectadas i.m. o i.d. pueden causar irritacin y hasta malestar al animal.
Cuando esto sucede, el animal debe ser eliminado. La inyeccin de Adsorcin de un antgeno proteico al gd de Al(OH) 3
emulsiones de Freund en los cojines de las patas es un modo satisfactorio de Ma terial
estimular ndulos linfoides locales (popliteales), pero a menudo causa abs-
- Protena purificada (inmungeno) - Beaker
cesos y molestias en el animal .
- Gel de hidrxico de aluminio - Pipetas
46
47
 - Salina fisiolgica
- Centrfuga
- Espectrofotmetro
Mtodo
1. Mezclar el irunungeno y el gel de Al(OH)3 en la proporcin 70-100 g
de gel por cada microgramo del inmungeno proteico. Agitar la mezcla
unos minutos .
2. Incubarla 1 hora a 37 C o toda la noche en fro .
3. Inyectarla al animal preferiblemente por va i.m. o s.c .
Observacin
Para preparar la mezcla se debe conoc<'.r la concentracin del gel de Al(OH).,
para calcular el volumen que se tomar de acuerdo con la qosis de inmungeno
a administrar. El grado de adsorcin puede calcularse, como en el caso
anterior, con las lecturas a 280 nm de la solucin proteica original y el
sobrenadante resultante de la adsorcin.
2. Mezclar bien en un tubo0,4 mLde la protena en SF (10-20mg)con 0,4 mL
del sedimento celular.
J Aadir gota a gota con agitacin 0,5 mL de GA al 2,5 % en PBS fro,
protegiendo la mezcla de la luz.
4. Incubarla con movimiento en la oscuridad durante 1-2 horas a TA.
5. Lavar las clulas exhaustivamente para eliminar el exceso de
glutaraldehdo.
6. r Resuspender en PBS o SF de acuerdo con la concentracin requerida y
aadir timerosal hasta una concentracin final del 0,01 %. Se pueden
conservar en fro por espacio de 40 das.
Observacin
Emplear eritrocitos de la misma especie animal que utilizar en la inmuniza-
cin.
Recomendacin

Adsorcin de un antgeno proteico a eritrocitos con GA Inyectar al ratn 0,5 mL de una suspensin al 3 % y al conejo 1 rnL de una
suspensin al 5 %, en ambos casos i.p.
La inmunizacin con antgenos proteicos adsorbidos sobre clulas o partcu-
las sintticas como la bentonita (Alp 3 4Si0~ H~O) y el ltex de 2. Animal de experimentacin
poliestireno, es utilizada con bastante frecuc:ncia. Esta \ariante puede resul-
tar til con inmungenos de alta y baja masa molecular. Para seleccionar el animal de experimentacin se deben tener en cuenta
cuatro aspectos : la especie animal a que pertenece el inmungeno, el volu-
Material
men de suero que se necesta, la cantidad de antgeno de que se dispone y si
- Irunungeno proteico se producirn ~ticuerpos monoclonales...
- PBS
- Sangre con anticoagulante De acuerdo con el carcter ajeno que debe poseer el inmungeno para
-Timerosal
ser reconocido por el sistema inmune del receptor, si se quieren obtener
- Glutaraldehdo (GA) para M.E. - Tubos de centrfuga anticuerpos contra la albmina o la IgG de ratn no se pueden utilizar
- Salina fisiolgica ratones, pero s conejos o carneros. En la prctica, las inmunizaciones
- Centrfuga
Mtodo deben efectuarse en animales que estn lo ms alejados posible en la
evolucin del animal al que pertenece el inmungeno. En el caso de pro-
tenas de mamferos altamente conservadas y, por tanto, dbilmente
l. Lavar los eritrocitos con abundante SF tres veces . Centrifugarlos
inmunognicas, una alternativa es la inmunizacin en pollos . Sin embargo,
10 minutos 1 2 500 rpm en los dos primeros favados y a 3 500 rpm en el
ltimo para que las clulas sedimenten en forma compacta. cuando se desea obtener anticuerpos contra alotipos o idiotipos

48 49
inmunoglobulnicos s es conveniente utilizar animales de la misma especie \.A..
a la que pertenece el inmungeno. -o
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Un amplio nmero de especies de vertebrados se utilizan para la produccin
de antisueros. Los ms empleados a nivel de laboratorio son conejos, rato- =-
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animales rinde aproximadamente 25 mL de suero en el conejO, 100-200 L (.)
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~n y 1-~ mL en ~ters y curie!~. ~do se requieren Q
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g~~olrnenes de suero, se utilizan aajmales de~ com~eros,
~hivos, cabaJos~rdo1._y asnos. (Yer._Tubla 11.)
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El ms til en los laboratorios es el conejo por su tamao y docilidad. Ellos u
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La constitucin gentica del animal es un factor determinante en la respues-
ta inmune. Como ya se vio anteriormente, la habilidad para responder a un
inrnungeno est bajo el control de loci que forman parte del MHC . Existen
otras fuentes de variacin, ya que en animales con la misma constitucin
gentica y sometidos a un proceso de inmunizacin similar, se han observa-
do considerables diferencias en la respuesta de anticuerpos (Dresser, 1986).
Finalment~ e! estado general de_salud del aninaj_g~ va a ser utilii.ado para
producir el antisuero puede tener un significativo efecto sob re los iveles de
anticuerpos. Una mala nutricin, aniiales enfermos, malas condiciones hi-
ginicas y otras situaciones de "estrs", pueden verse reflejadas en res-
puestas pobres de anticu~s .
Los animales sometidos a un proceso de inmunizacin deben recibir una
dieta refori.ada y s~entada-oon -oomplejo B-y cido ascrbi~ . Si es
posble se les debe dar alimento verde. Deben ser vigilados durante todo el
experimento Pl'3: detectar cualquer anomala como falta de-J!Ctito, diarrea
o malestar. En estos ~os debe suspenderse el trabajo con el animal y
consu ltar al mdico veterinario.
Los animales que van a ser desangrados deben mantenerse en ayuno, slo
con agua, 12 horas antes de la operacin, para evitar la obtencin de sueros
< lipmicos. El sangrado debe realizarse en un cuarto relativamente caliente
para tener un buen flujo de sangre.
En el conejo, la sangre se colecta de la~6~ margi~ o d,<! la arteria central
~e ~ En el primer~ se puede o tener de una vez hasta 50 mL y en
el segundo,_hasta 100 mL . La puncin carg393 generalme11te se utiliza
p a - 1 y debe ser practicada por una persomi experta.
C,2!! !~ayuga de u~ bomba de vaco puede ~esangrarse en su to~lidad el
~mal (aproximadamente 250 mL de sangre). Si la manipulacin ha sido
correcta y la sangre no fluye es muy probable ~ue el animal est 'estresado".
En ese csoTs recomeaable "iio insisti~ y dejar al animal en "iibiente
tranquilo hasta el da siguiente.
El sangrado no siempre es necesario para obtener anticuerpos . La gallina
provee grandes cantidades de anticuerpos en sus huevos . El contenido de
IgY (contrapartida de la IgG de los mamferos) de una yema( 100 mg!) es
equivalente a ms de 15 mL de suero; adems de lo fcil que resulta la
colecta de los huevos en comparacin con la de la sangre de los animales.
52
por sus caractersticas genticas e individuales los animales se comportan
como respondedores buenos, malos o nulos . Esto hace necesario, para ase-
gurar un resultado satisfactorio, adems de seleccionar el ms conveniente,
disponer de un grupo de animales y evitar e11 Io posible trabajar con uno
solo. ~ el caso de los conejos, dos animales d~~n utilizarse como mnimo;
y en el de los ~temes y dems roedores, de tres a seis . Cada uno de los
animales debe evaluarse individualmente.
Todc el personal que trabaja de forma regular con animales (cuidadores,
tcnicos, i'VeSt1gaCiOres, estudiantes) debe estar vacunado contra algunas
enfermedades . En el caso del conejo y del ratn, contra la leptospirosis.
Otra medida de bioproteccin es el empleo de guantes y boquera durante
toda la manipulac~n .
Para inyectar y desangrar animales se re_suiere habilidad, paciencia y entre-
namiento. En la mayora de los pases estos procedimientos y el cuidado y
mantenimiento de los animales de laboratorio estn regulados por leyes .
Estas regulaciones tienen el propsito de asegurar el .bi_enestar de los anima-
les, que el operador est entrenado y que la manipulacin est justificada. El
uso de los animalese st gobernado adems por consideraciones ticas y es
objeto, en estos momentos, de intenso debate por las organizaciones que
tienen a su cargo la proteccin de los mismos (Harlow and Lane, 1988) . .t
*
3. Programa de inmunizacin
Las formas en que el experimentador puede manipular la respuesta a un
antgeno determinado pueden dividirse en dos grandes categoras : la modifi-
cacin del antgeno, de la que ya se trat en el punto 1; y las condiciones de
inocu lacin del antgeno que incluyen al animal de experimentacin (punto 2),
la dosis y ruta de administracin del inmungeno, el nmero de inyecciones
y el intervalo entre ellas. De esto trataremos eri este epgrafe.
El programa de inmunizacin recoge el plan de actividades que se desarrolla
con vista a la produccin de los anticuerpos, y est relacionado fundamen-
''
talmente con el trabajo que se realiza en el animal de experimentacin, in-
cluyendo la titulacin de anticuerpos en el suero sanguneo.
Es necesario que el experimentador anote en su cuaderno los siguientes
datos : tipo de animal, raza, sexo, edad, peso, estado de salud, nmero de la
53
 chapilla que lo identifica y de la jaula; as como cada una de las incidencias
del trabajo: fecha de las inoculaciones y desangrados, tipo de antgeno y
modo de preparacin, vol umen, dosis y va de administ racin, tipo de
adyuvante, va y modo de sangramiento, afectaciones que se presenten en
el animal (enfermedad, prdida de peso, ''estrs"), resultado de las titulaciones
y cualquier otro dato que pueda resultar de inters.
Dosis de l inmungeno
Un aspecto de primer orden en el programa de irununizacin es la dosis , ya
que cantidades muy pequeas o grandes del inmungeno es posible que
resulten improductivag Las dosis muy pequeas pueden ser insuficientes
para estimular el mecanismo de la irununidad. Las muy altas son factibles
de inducir tolerancia. Por ejemplo, 5 mg de IgG de ratn inyectada a un
curie! puede hacerlo tolerante a esta protena de fonna tal que si se le
administra al da siguiente una segunda dosis inmunognica de la IgG murina,
el animal no responder.
Dos criterios diferentes deben ser considerados para determinar la dosis
apropiada: primero, la dosis ptima de inmungeno para lograr la respuesta
ms efectiva; y, segundo, la dosis mnima para inducir la produccin de un
antisuero policlonal til. Se ha demostrado que existe una relacin sigmoidal
entre la respuesta y la dosis administrada, existiendo una dosis ptima que
se corresponde con una respuesta mxuna. Es posible suponer que con esa
dosis el inmungeno pueda alcanzar las partes apropiadas del organismo.
La mayora de los materiales que se inyectan deben ser catabolizados antes
de alcanzar las clulas apropiadas. La eficiencia de este proceso depender
de varios factores del husped, la ruta de inyeccin, el uso de adyuvante y la
naturaleza intrnseca del antgeno. As, la dosis efectiva puede tener poca
relacin con la dosis administrada. La detenninacin de la dosis ptima de
inmungeno no se realiza rutinariamente, por lo que en la prctica la dosis
tiene un cierto carcter emprico. Para los conejos un antgeno proteico
mezclado con adyuvante es recomendable administrarlo en dosis de 0,5-1 mg
en cada inmunizacin. Para los ratones puede ser reducida a 50- l 00 g .
Una regla general bastante aceptable para determinar la cantidad de
inmungeno que se necesita para producir una respuesta fuerte en ratn es
utilizar dosis l 00 veces menores que las empleadas en conejo.
54
La cantidad mnima d.e inrnungeno capaz de inducir una respuesta depen-
der de la naturaleza del antgeno y del hospedero. Para los conejos, la dosis
mnima est en el rango de l O g por inyeccin, aunque 100 g por inyec-
cin se recomienda frecuentemente . Si no se requiere respuesta de
anticuerpos detectable despus de la inoculacin primaria, las dosis iniciales
pueden ser ~ueas . Las inyecciones secundarias y los boosters finales
es posible darlas con cantidades similares a las de la inyeccin primaria.
Estas recomendaciones son en cierta forma contradictorias. Tradicional-
mente se ha propuesto que las inoculaciones primarias sean dos o tres veces
mayores que los boosters. Sin embargo, la mayora de estas recomendacio-
nes son vlidas para inrnungenos potentes. Para inrnungenos desconoci-
dos una o dos inyecciones con una dosis baja para sensibilizar al animal
seguidas por un booster mayor, han resultado efectivas para producir
anticuerpos. Si no hay informacin acerca de la inrnunogcnicidad de un
antgeno, el mejor consejo es inyectarlo y ver los resultados .
La mayora de las preparaciones antignicas estn contaminadas con com-
ponentes menores. La Figura 14 ilustra una dosis-respuesta a una prepa-
racin antignica, la cual contiene un 1 % de un contaminante de similar
mmunogenicidad que el componente principal. Puede observarse que, a
muy bajas dosis, la respuesta est enteramente d irigida al componente
principal; y, a dosis mayores, la respuesta a l componente menor puede
exceder la del principal. La economa del inrnungeno por lo visto refuerza
la especificidad para el componente antignico principal. Sin embargo, a
veces se requiere que el sistema inmune del animal descubra los compo-
nentes menores, por ejemplo, cuando se desea producir un antisuero hu-
mano total (a-SHT), es decir, un antisuero que contenga anticuerpos contra
la mayora de los componentes del suero sanguneo. En este caso resulta
necesaria la inmunizacin repetida con grandes dosis de la mezcla de
inmungenos .
Otro aspecto relacionado con la dosis es la afinidad de los anticuerpos.
Siskind ( 1969) demostr que la afinidad de los anticuerpos sintetizados en
una respuesta decae cuando la dosis de inmungeno se incrementa. A bajas
concentraciones solamente las clulas B con receptores de afinidad eleva-
da pueden unir antgeno suficiente para ser estimuladas. Como ya vimos, los
receptores inmunoglobulnicos del linfocito B son una muestra precisa de las
55
 molculas de anticuerpo que esa clula y sus descendientes directos sinteti- TABLA 111. Comparacin entre una dosis nica de inmungeno
zarn, de ah que el reconocimiento por receptores de afinidad elevada con- y la misma dosis dividida en 4
duce a una respuesta de anticuerpos de alta afinidad.
Respuesta de CFA"' ( 10')
en ratones CBA

Eritrocitos de camero i.p. lgM lgG

Respuesta ContomiMnte 4 lo clulas el da o 15 6

~ 1'10' clulas los das O: 2: 4; 6 77

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CFA: Clulas fonnadoras de anticuerpos.
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Ests valores corresponden a la media aritmtica del niunero de CFA entre los 5 y 21 das,
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~ empleando cuatro animales en cada conteo.
' -~~7: - .. <:'
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Loo C de inmunoeno principal .f Vas de administracin del inmungeno
La seleccin de la via de inyeccin debe tener en cuenta: el volumen a
Figura 14. Curva dosis-respuesta correspondiente a un inmungeno y su contaminante.
inyectar, el tampn y otros componentes que se administrarn con el
inmungeno y la velocidad con que este deber ser liberado a los linfticos
Para que el reconocimiento del inmungeno tenga lugar, se requiere una o a la circulacin sangunea.
concentracin adecuada del antgeno que se mantenga durante un tiempo
suficiente. El secuestro del inmungeno en sitios irrelevantes para las clu- En conejos, los volmenes grandes de inyeccin normalmente se adminis-
las de la inmunidad y su ruptura catablica son ejemplos de mecanismos tran por va s.c. en mltiples sitios. En ratones estos slo pueden darse por
naturales que tienden a reducir la concentracin efectiva del inmungeno. va i.p. Se debe tener en cuenta que los volmenes grandes pueden causarle
La Tabla III muestra cmo una dosis de antgeno, aparentemente demasia- dolor al animal, de ah que deban evitarse. Si se utilizan adyuvantes de Freund,
do pequea para estimular una respuesta. secundaria, puede ser mu y el inmungeno no debe inyectarse i.v. Si se desea una liberacin lenta del
inmunognica simplemente dividiendo la dosis y distribuyendo las inyeccio- inmungeno, las inyecciones deben hacerse i.m. o i.d. Para liberacin inme-
nes entre viarios das. Mantener' la concentracin del inmungeno en un diata se usa la via i.v.
determinado umbral durante largo tiempo es la base de la accin de los El mtodo de Vaitukaitis, utilizado por muchos colegas, usa inyecciones ml-
adyuvantes de depsito, ya mencionados aqu, as como del xito de los tiples i.d. de muy pequeos volmenes de ACF que contienen 1-10 g del
protocolos de inmunizacin con inyecciones repetidas a intervalos cortos de inmungeno en el lomo del animal. La ventaja de este procedimiento es la
pequeas dosis de antgeno. formacin de una costra sobre el granuloma-absceso en el sitio de la inyec-
cin, que es seguida de la externalizacin de la mezcla aceitosa y la cura
Cuando se trabaja con inmungenos .celulares comnmente se utilizan dosis
en el orden de 104-10 6 clulas. eventual de la lesin. Este procedimiento reduce la posibilidad de poliartritis
y otros efectos colaterales de los adyuvantes de Freund.

56 57
A continuacin se presenta un resumen de las principales vas utilizadas en
la inmuniz.acin de animales:
Vfa intramuscular
Es la ruta de preferencia cuando se utiliz.an adyuvantes de depsito. Permi-
te un rpido acceso a la circulacin sangunea y linftica. pero en ausencia
de adyuvante los inmungenos solubles se diluyen y se pierden, por lo que
resultan poco efectivos . Es una buena regla cuando no se dispone de pro-
gramas de inmuniz.acin ya probados ensayar primero inyecciones i.m. y
-si el animal no responde- utiliz.ar la s.c. o la i.p.
Vfa subcutdnea
El inmungeno se asimila lentamente. Es til para boosters porque se mini-
miz.a la posibilidad de choque anafiltico. Se recomienda cuando se em-
plea adyuvante.
Va intradrmica
Provee un rpido acceso a los linfticos y puede ser til cuando se emplean
irunungenos caros, ya que se inoculan volmenes muy pequeos. Se utiliz.a
con adyuvante o sin l. Cuando se emplea ACF se forma una lcera en
2-3 das. El conocido mtcxio de Vaitukaitis usa esta va.
Va intravenosa
Es la ruta preferencial para inmungenos celulares y adsorbidos sobre alum-
bre, aunque en este caso se aconseja junto con una inoculacin s.c. La
respuesta es rpida pero no sostenida. Tiene el riesgo de reacciones
anafilcticas. Nunca se emplea con adyuvantes de Freund. Es la va por
excelencia para inducir tolerancia.
Vfa intraperitoneal
Se utiliz.a fundamentalmente en ratones por su fcil ejecucin.
Choque anafilctico: Reaccin generaliz.ada ysevera, que puede ser mortal, en un individuo
sensibilizado.
58
Cojines de las patas
con AC F prcxiuce inflamacin severa, ulceracin y necrosis. Se emplea
cuando es absolutamente necesaria. Otros adyuvantes no causan reaccio-
nes tan severas, pero es preferible inocular una sola pata del animal.
Boosters e intervalo entre las dosis
Se debe esperar un tiempo antes de reintrcxiucir antgeno en un animal sen-
sibilizado (en ingls, primed). Un mnimo de 2 o 3 semanas es recomenda-
ble, pero este intervalo puede ser mayor. Conejos y ratones permanecen
sensibilizados hasta 1 ao despus de recibir la primera inyeccin.
Los intervalos entre las inoculaciones secundaria, terciaria y subsecuentes
pueden variar, pero usualmente deben demorarse hasta que el nivel de
anticuerpos circulantes descienda para prevenir la rpida desaparicin del
inmungeno inyectado (efecto feedback del anticuerpo) . Tener paciencia
es ms importante que una nueva inyeccin. En conejos las inoculaciones
se dan normalmente entre 4-6 semanas . En ratones los boosters deben
espaciarse al mertos 21 das .
Desangrados
Despus de una inoculacin de inmungeno las muestras de suero permiten
monitorear la respuesta de anticuerpos. A menudo se hace un primer san-
grado antes de comenz.ar las inmuniz.aciones para disponer de un control
negativo en las titulaciones . Aunque pueden colectarse muestras de suero
despus de la inyeccin primaria ellas no contienen, por lo general,
anticuerpos tiles, ya que estos usualmente poseen afinidades bajas .
Las muestras de suero deben tomarse 7-14 das despus de una inocula-
cin . Este tiempo corresponde, por Jo comn, con el pico de ttulo de
anticuerpos para la mayora de las rutas de administracin.
En conejos estos sangrados se hacen normalmente de la vena marginal y en
ratones, de la vena del rabo. Estos sitios se utilizan porque son de fcil
accesibilidad y no poseen muchas terminales nerviosas . En los conejos pue-
den colectarse 2-3 mL de sangre (o ms) y en los ratones, 200-400 L,
cantidades que resultan suficientes para los ensayos de anticuerpo.
Si el antisuero tiene la calidad requerida, el animal debe ser desangrado lo
ms pronto posible y tcxio lo ms que se pueda, ya que el antisuero va .
59
 cambiando de un da para otro. Despus de un desangrado grande el animal
deber descansar durante un tiempo antes de ser inoculado de nuevo . En
conejos los boosters pueden espaciarse 6 semanas y cantidades de 50 mL
de sangre o mayores es posible colectar 1O das despus de cada booster.
Otra alternati va puede ser el desangrado terminal que conlleva la muerte
del animal.
A manera de conclusin podemos decir que el programa de inmunizacin es
dinmico y se establece en la prctica de acuerdo con el comportamiento
del animal de experimentacin, reflejado en las titulaciones de los sueros, de
ah su carcter emprico.
' Utilizacin de las v as de inoculacin en el conejo
Materia/
- Guantes quirrgicos - Tijera
- Inmungeno -Xilol
- Conejo - Etanol al 70 %
- Cepo
- Algodn estril
- Jeringuillas y agujas estriles
Va intravenosa (o endovenosa). Vena marginal de la oreja
Mtodo
1. Ponerse los guantes y mantenerlos puestos durante toda la manipulacin.
2. Colocar el animal en el cepo. Desinfectar la zona de inoculacin con
etanol al 70 %. Estimular la circulacin sangunea pasando un algodn
humedecido en xilol por encima y por debajo de la vena marginal y( o)
dando unos golpecitos sobre ella con el dedo.
3. Comprobar que el mbolo de la jeringuilla se desplace con fluidez y lle-
narla con el inmungeno; eliminar el aire residual y enrasar hasta el vo-
lumen apropiado. Emplear aguja nmero 21 y de lf. pulgada de longitud.
4. Agarrar la oreja de modo que descarise sobre los dedos ndice, del medio
y anular. Sostenerla firme con el pulgar.
60
5. Introducir la aguja con el bisel hacia arriba en la vena. Verificar su canar
lizacin (entrada de una pequea cantidad de sangre a la jeringuilla y(o)
no resistencia al desplazamiento hacia delante del mbolo) . Introducir el
inmungeno lentamepte hasta completar la dosis inrnunizante. Presionar
con un algodn seco y estril el sitio de inoculacin. unos segundos antes
y despus de extraer la aguja. para evitar prdida de inmungeno.
6. Asegurarse que no sale ya la sangre para retirar el algodn. De lo con-
trario, mantener la presin sobre la vena.
7. Limpiar bien con agua corriente la oreja del animal para eliminar todo el
xilol.
l!. Retirar el animal del cepo y observarlo durante 15 minutos. El cuidador
de animales debe conocer que el conejo est bajo un rgimen de inmuni-
zacin, debiendo suplementar su dieta y avisar de inmediato sobre cual-
quier afectacin que detecte en el mismo.
Observacin
Recordar que al colocar y retirar el conejo del cepo debe agarrarse por la
piel del lomo y jams por las orejas . Si debe intentar de nuevo la inyeccin,
hacerse un poco ms arriba del pinchazo original o cambiar de oreja.
Va intramuscular
Mra do
1. Colocarse los guantes.
2. El ayudante debe inmovilizar el animal tomndole con una mano las ore-
jas y con la otra la piel del lomo, y presionndolo contra la mesa.
3. Comprobar que el mbolo de la jeringuilla se desplace con fluidez y lle-
narla con el inmungeno; eliminar el aire residual y enrasar hasta el
volumen apropiado. Emplear aguja nmero 18 (o 20) de Y2 pulgada de
longitud.
4. El inoculador debe agarrar y estirar una pata trasera del animal, desin-
fectando su parte interna (donde hay mayor masa muscular) con un
algodn embebido en alcohol.
61

5. Introducir la aguja perpendiculannente a la piel con el bisel hacia arriba
Administrar la dosis inmuniz.ante y presionar con un algodn seco y estril
el sitio de inoculacin unos segundos antes y despus de extraer la aguja .
6. Observar el animal durante 15 minutos . El cuidador de animales debe
conocer que el conejo est bajo un rgimen de inmunizacin, debiendo
suplementar su dieta y avisar cualquier afectacin que observe en el
conejo. No debe alarmarse por la inmovilidad del animal durante las pri-
meras 24 horas despus de la inyeccin.
7. Si emplea ACF o AIF debe lavar inmediatamente la jeringuilla y la aguja,
primero con alcohol y despus con detergente, hasta que queden bien
limpias.
Va subcutnea
Mtodo
1. Colocarse los guantes.
2. El ayudante debe inmovilizar el animal tomndole con una mano las ore-
jas y con la otra las patas traseras (por las articulaciones), estirndolas, y
presionndolo contra la mesa.
3. Eliminar el pelo del lomo del anin1al cerca de las patas delanteras con
tijera o mquina de pelar.
4. Comprobar que el mbolo de la jeringuilla se desplace con fluidez y lle-
narla con el inmungeno; eliminar el aire residual y enrasar hasta el vo-
lumen apropiado. Emplear aguja nmero 18 (o 20) de 3/4 o l pulgada de
longitud.
5. Desinfectar la zona con un algodn embebido en alcohol. Levantar la
piel del sitio de inoculacin con los dedos pulgar e ndice. Introducir la
aguja con el bisel hacia arriba por la zona inferior del pliegue hasta que la
punta de la aguja se mueva libremente. Presionar con los dedos pulgar e
ndice la piel que rod~ la base de la aguja y administrar el inmungeno.
Presionar con un algodn seco y estril el sitio de inoculacin unos se-
gundos antes y despus de extraer la aguja.
6. Observar el animal durante 15 minutos. Poner en conocimiento del cui-
dador de animales que el conejo est bajo un rgimen de inmunizacin .
62
7. Si se emplea ACF o AIF se debe lavar inmediatamente la jeringuilla y la .
aguja, primero con alcohol y despus con detergente, hasta que queden
bien limpias.
Observacin
La inoculacin s.c. puede efectuarse tambin en la zona a\'.ilar de las patas,
pudiendo esta forma resultar molesta para el animal.
Vio intradrmica (dentro de la piel). Mtodo de Vaitukaitis, 1972
M todo
1 Colocarse los guantes.
2. Eliminar el pelo de la zona de inoculacin (lomo del animal cerca de las
patas delanteras) por depilacin o mediante tijera o mquina de pelar.
3 lnmoviliz.ar el animal como en el caso de la inoculacin s.c.
4. Comprobar que el mbolo de la jeringuilla se desplace con fluidez y enra-
sar con el volumen adecuado. Emplear jeringuillas de tuberculina y agu-
jas finas (nmero 26 o 27) de Y2 pulgada de longitud.
5. Desinfectar la zona. Levantar la piel del sitio de inoculacin con los de-
dos pulgar e ndice. Introducir la aguja con el bisel hacia arriba en la zona
media del pliegue (dentro de la piel), manteniendo todo el tiempo y aun
despus de cada inoculacin, la presin en la base de la aguja. Adminis-
trar en cada inyeccin volmenes pequeos de 50-100 L , debiendo for-
marse una pequea roncha (habn). Mantener la aguja dentro de la piel
unos segundos, para evitar la prdida de inmungeno . Repetir en mlti-
ples sitios convenientemente alejados, hasta completar la dosis total.
6. Observar el animal durante 15 minutos. Poner en conocimiento del cui-
dador de animales que el conejo est bajo un rgimen de inmunizacin.
7. Si se emplea ACF o AIF lavar inmediatamente la jeringuilla y la aguja,
hasta que queden bien limpias.
Observacin
La formacin del habn indica que el inmungeno qued dentro de la piel.
De lo contrario, la inoculacin fue subcutnea. Debe tenerse mucho cmdado
63
cuando el animal vuelva a ser manipulado, debido a las lesiones que apar1
cern en su piel. A continuacin se explica la preparacin y aplicacin de 1 Vio intraperitonea/
crema depilatoria. Mtodo
l . Colocarse los guantes.
Depilacin
2. El ayudante debe agarrar al animal por las articulaciones de las patas
Material traseras y por la piel del lomo, y colocarlo con la cabeza hacia abajo para
Frmula I Frmula JI que los intestinos se desplacen y quede libre la cavidad abdominal.

Sulfuro de bario 6g Sulfuro de Na o K 4 g 3. Comprobar que el mbolo de la jeringuilla se desplace con fluidez y lle-
xido de zinc 6g Hidrxido de Ca 4g narla con el inmungeno. Emplear aguja nmero 18 (o 20) de% pulgada
Almidn comercial 12 g Glicina l mL de longitud .
Agua corriente hasta Kaoln 32 g 4. Limpiar la zona abdominal entre las patas traseras con un algodn embe-
consistencia de pasta Agua corriente hasta bido en alcohol. Introducir la aguja perpendicularmente (la aguja debe
consistencia de pasta moverse con libertad) y administrar la dosis en la cavidad peritoneal.
Retirar la aguja.

Frmula /JI 5. Vigilar el animal durante 15 minutos y comunicar al cuidador de animales

que el conejo est bajo un rgimen de inmunizacin.
Sulfuro de Na o K 90 g
xido de zinc 1Og 6. Si emple ACF o AIF proceder en seguida a la limpieza de la jeringuilla
Harina de trigo 4g y la aguja.
Maicena 3g
Petrolato lquido o Sangrado por la vena marginal del conejo .-
cualquier grasa liquida 1 cucharada Materia/
Agua corriente hasta 100 mL
- Guantes quirrgicos - Alcohol al 70 %
Mtodo - Conejo -Xilol
1. Eliminar pelo de la zona a depilar con tijera o mquina de pelar (lo ms - Cepo - Petrolato
que se pueda). -Tijera - Tubo de centrfuga
2. Con guantes de goma aplicar suavemente la pasta a "contrapelo". - SF estril - Algodn estril
3. Dejar actuar por 5 minutos y eliminar con agua tibia. No friccionar! - Bistur - Gasa estril

Observacin Mtodo
1. Colocarse los guantes.
La depilacin debe hacerse l o 2 ho:as antes de las inyecciones.
2. Poner el conejo en el cepo. Eliminar el pelo sobre la ven marginal con
tijera y desinfectar el lado posterior y el borde de la oreja con alcohol.
64
65
3. Estimular la circulacin sangunea pasando por encima y por debajo de
la vena marginal un algodn humedecido en xilol. Se pueden dar, ade-
ms, algunos golpes sobre la vena. Inmediatamente untar petrolato en la
zona de la vena marginal hasta formar una fina capa con vista a prevenir
la coagulacin e impedir que la sangre se riegue por la oreja.
4. Agarrar firmemente la oreja de modo que descanse sobre los dedos
ndice, del medio y anular, y sostenerla con el pulgar
5. Con la punta del bistur hacer un pequeo corte diagonal o incisin (no
muy severos) sobre la vena marginal, e inmediatamente colocar debajo
de ella el tubo de centrfuga humedecido en SF. Comprimir la base de la
oreja para prevenir el retomo venoso. En los primeros momentos el flujo
de sangre puede ser pobre, por lo que se esperarn unos segundos. Re-
tirar los cogulos que se formen con un pedazo de gasa estril .
6. Terminada la recoleccin, colocM un algodn sobre el corte y apretar la
vena hasta que cese la salida de sangre. Si no se detuviera. fijar el algo-
dn con esparadrapo y buscar al veterinario.
7. Lavar con agua abundante la oreja para eliminar todo el xilol y retirar el
animal del cepo.
8. Colocar la sangre a 37 C. Ver obtencin del suero.
Observacin
Si lo que se desea es titular anticuerpos, una muestra pequea de sang re
(1-2 mL) es suficiente. Si el flujo no se hace regular, se puede aplicar nue-
vamente xilol lejos de la incisin, ya que este causa hemlisis . Una nueva
incisin debe hacerse ms arriba de la original o en la otra oreja. Dejar caer
la sangre sobre la pared del tubo para prevenir la hemlisis . Con este proce-
dimiento se puede colectar hasta 50 mL de sangre. Recordar que el animal
debe mantenerse 12 horas antes del sangrado slo con agua.
Sangrado del conejo por la arteria central de la oreja
Material
- Guantes - SF estril
- Conejo - Alcohol al 70 %
66
- Cepo -Xilol
- Tijera - Tubo de centrfuga
- Jennguilla y aguja estriles - Algodn estril
Mtodo
1. Ponerse los guantes .
2. Colocar el animal en el cepo. Si es necesario, eliminar el pelo sobre la
arteria central con la tijera. Desinfectar la parte posterior de la oreja con
alcohol.
3. Estimuar la circulacin sangunea pasando por encima y por debajo de
la arteria un algodn humedecido en xilol . Se pueden dar, adems, unos
golpecitos sobre la vena.
4. Agarrar firmemente la oreja de modo que descanse sobre los dedos
indice, del medio y anular, y sostenerla con el pulgar.
5. Verificar si el mbolo de la jeringuilla se desplaza con fluidez y humede-
cerla en SF estril. Emplear aguja nmero 21 (o 20) de Y. pulgada de
longitud.
6 . Introducir la aguja en la arteria central con el bisel hacia arriba y el
mbolo en el tope. Desplazarlo lentamente hasta colectar el volumen
requerido de sangre. Presionar la arteria con un algodn estril unos
segundos antes y despus de extraer la aguja.
7. Quitarle la aguja a la jeringuilla y verter la sangre por la pared del tubo
de centrfuga humedecido en SF estril.
8. Retirar el algodn cuando ya no salga sangre. Si no se contuviera, man-
tener el algodn con esparadrapo y buscar al veterinario.
9 . Lavar con abundante agua corriente la oreja para eliminar el xilol y
retirar el animal del cepo. Darle agua y comida abundante.
10. Poner la sangre a 37 C. Ver obtencin del suero.
Observacin
El sangrado puede tambin realizarse insertando la aguja dentro de la ar-
teria y recolectando la sangre directamente en el recipiente. Un nuevo
67
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intento de introducir Ja aguja debe hacerse por debajo del pinchazo original <:.J

o en Ja otra oreja. Por esta va puede colectarse hasta 100 mL de sangre, Obtencin de plasma y clulas san2uineas
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4
aunque debe comenzarse por una cantidad menor, por ejemplo, 40 mL . El El plasma es el lquido procedente de la sangre no coagulada, despus aeE~-:
intervalo entre las extracciones debe ser de al menos 1 mes . Recordar rar las clulas. Su aspecto y composicin es p(cticamente similar al suero, a
que el animal debe mantenerse 12 horas antes del sangrado alimentndo- diferencia de que este no contiene el fibringen': Aunque para la mayora de los
se slo de agua.
proccd.imientos inmunolgicos se emplea el suero, puede ser conveniente en
Obtencin del suero SAnguineo ocasiones utilizar el plasma, por ejemplo, cuando se van a realizar adems ensa-
yos con las clulas. Otras veces se necesita obtener las clulas sanguneas, o
Materia/ ,..... ,.(
sea, eritrocitos para soporte de los antgenos o en las tcnicas de
- Sangre sin anticoagulante
- Incubadora o bao de agua
- Aplicador
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inmunoaglutinaci11'.' En todos estos casos se debe prevenir la coagulacin, aa-
diendo a la sangre un anticoagulant.Q El ms recomendable es la heparina, sin
- Ppeta ;;. ,:';r '/)
embargo es caraf.-El empleo de soluciones anticoagulantes tiene como inconve-
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- Refrigerador - Tubos Eppendorf
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niente en las determinaciones serolgicas y de otros tipos, el error volumtrico
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que introducen.. En esos casos es ms provechoso aadir un anticoagulante en
- Centrfuga
polvo o una solucin que se seca dentro del mismo recipiente. v
Mtodo A continuacin se describen varios reactivos y soluciones que pueden em-
plearse para evitar la coagulacin de la sangre y obtener plasma y(o) clu-
l. Dejar coagular Ja sangre en bao de agua (o incubadora) a 37 Coa TA
durante 2 horas. las sanguneas. -1..

2. Dejar retraer el cogulo incubndolo 12 horas (toda la noche) a 4 C. Materia/

3. Desprender el cogulo cuidadosamente con una varilla o aplicador (si
qued pegado a la pared del tubo) y centrifugar la sangre a l O 000 g
durante l Ominutos.
4. Tomar con pipeta el sobrenadante y distribuirlo en alcuotas, conservn-
dolo a -20 o -70 C. Puede mantenerse por unos pocos das a 4 C sin
preservativo o un tiempo mayor con preservativo (azida sxlica o timerosal
a una concentracin final de 0,01 %).
Observacin
Cuando slo necesitamos una pequea muestra de suero, si la separacin
del cogulo es satisfactoria, se puede obviar la centrifugacin. La cantidad
mxima de suero que se obtiene corresponde aproximadamente a la mitad
del volumen de sangre total. Volmenes menores pueden obtenerse, si el
tiempo apremia, dejando coagular la sangre 15 minutos a 37 C o a TA,
mantenindola en fro 30 minutos y(o) centrifugndola.
68
Hepa rina
Emplear 0,5 mg o 50 unidades de heparina por mililitro de sangre, que se
coloca en el recipiente donde se colectar la sangre. Se pueden heparinizar
los capilares, tubos y otros recipientes empleando la cantidad correspon-
diente a la relacin ya indicada de heparina y secndola a l 00 C durante
unos minutos . Muchas veces es suficiente endulzar el frasco limpio con la
solucin comercial de este producto.
Solucin de A/sever
Frmula: 4, 7 g de cido ctrico; 16,0 g de citrato trisdico; 15,0 g de glucosa
y agua destilada hasta completar l L . Mezclar l volumen de solucin de
Alsever por 4 volmenes de sangre.
Citrato sdico
Emplear 4-5 mg de citrato sdico por 1 mL de sangre o l volumen de una
solucin de 3,8 g de citrato sdico 2 Hp / l 00 mL de agua por 9 volme-
nes de sangre.
69
 _,,--

Oxalato de sodio
Utilizar 1-2 mg de oxalato sdico por mililitro de sangre o 1 volumen de una
s<>lucin que contenga O, 75 g de oxalato de sodio/! 00 mL de agua por 9 vol-
menes de sangre.
EDTA (cido etilendiaminotetraactico)
Utilizar 1 mg de EDTA-Na 2 por mililitro de sangre Se puede haCt"r el
ptetratamiento de los recipientes de fonna similar a la heparinizacton. con
una solucin de l g de EDTA-Na/JOO mL de agua destilada
Mtodo
nmero 18 con una jeringuilla de 5 mL y extraer de una vez todo el
lquido que sea posible. Cada ratn puede producir 2 o 3 ascitis que se
extraern cada 3-7 das .
4. Incubar el fluido 1 hora a 37 C y toda la noche a 4 C . Centrifugarlo a
3 000 g durante IO minutos . Si aparece una capa de aceite removerla y
desecharla. Tomar el sobrenadante y centrifugarlo de nuevo si fuera
necesano .
5. Aadirle azida sdica a una concentracin final del 0,02 % y un inhibidor
de proteasa como el PMCF a una concentracin final de 0,01 mol/L .
Dispensar el lquido y conservarlo a - 20 C.

1. Recoger el volumen requerido de sangre en el recipiente que contenga el Observacin

anti coagulante.
Un simple ratn puede rendir hasta 1O mL de lquido asctico en cada extrac-
2. Agitar suavemente la mezcla. cin y la concentracin puede ser tan alta como 1O rng de anticuerpos/mL .
3. Centrifugar la sangre a l O 000 g durante 1O minutos .
4. Titulacin de anticuerpos
4 Separar el plasma (sobrenadante) de las clulas sedimentadas ."
,. Durante el programa de inmunizaciones las muestras de suero permiten
Induccin de ascitis con adyuvante de Freund monitorear y saber en qu cuanta ha tenido lugar la respuesta de anticuerpos.
Los sueros son chequeados frente al propio inmungeno por una o varias de
Material
las tcnicas que se describirn en los captulos subsiguientes . En contrapo-
- Inmungeno en ACF sicin con la propiedad inmunognica, la propiedad antignica del inmungeno
es su capacidad para reaccionar especficamente con los anticuerpos indu-
- Ratones ~
cidos por l. Una reaccin positiva indica que ha tenido lugar la respuesta de
- Jeringuillas y agujas anticuerpos .
Mtodo El incremento de las clulas B que conducen Igm especficas para el
inmungeno (las llamadas clulas fonnadoras de anticuerpos, CFA), se de-
l . Preparar el inmungeno en ACF usando la relacin 1 volumen de ant- tectan a los 5-6 das de la inoculacin primaria. Los anticuerpos se detectan
geno/9 volmenes de adyuvante.
usualmente en el suero a los 1O das despus de la inyeccin y persisten a un
2. Inyectar 0,2 mL de la emulsin los das O; 14: 21: 28 y 35 por la va nivel bajo por unos pocos das, alcanzando un pico alrededor de los 20 das
intraperitoneal. El hinchamiento del abdomen es usual que ocurra des- (Figura 4) . Las respuestas primarias a menudo son muy dbiles, particular-
pus de la tercera o cuarta inyeccin. Si no se desarrolla ascitis, se debe mente para antgenos solubles que se catabolizan con rapidez. En muchas
repetir la inyeccin semanalmente. ocasiones una sensibilizacin fuerte puede tener lugar en ausencia de
anticuerpos detectables, por lo que en la prctica no es de gran valor
3. Colectar la ascitis cuando el abdomen alcance un tamao notable pero
monitorear esta respuesta .
antes de que el animal tenga dificultad para caminar. Utilizar una aguja

70 71
 '

La respuesta a la segunda y subsecuentes inoculaciones del mismo en medio lquido, la tcnica de Farr y el ELISA. Tambin en estos casos s<>- .
inmungeno es muy diferente. El nmero de clulas B con lgm especficas utiliza el trmino titulacin para expresar la concentracin de anticuerpos
para el antgeno se incrementa exponencialmente despus de la segunda Por mililitro de suero. '
inyeccin, alcanzando un pico entre los 3 y 4 das. Los anticuerpos en el
suero tambin se detectan en este tiempo, pero con frecuencia se observan Cuando la titulacin se realiz.a por diferentes mtodos, los resultados no siem-
a los I0-14 das. Es tpico que los niveles altos persistan durante 2-4 sema- pre resultan coincidentes. En la Tabla IV se presentan los ttulos de anticuerpos
nas (Figura 4). anti-IgG humana obtenidos en conejo, utilizando cuatro mtodos.
Normalmente las muestras de suero se toman 7-14 das despus de una Resulta obvio que la titulacin est relacionada con el mtodo empleado
inoculacin. Cuando se estudia la cintica de la produccin de anticuerpos para detectar los anticuerpos y, en particular, se debe destacar ei 'lmite de
se desangra el animal en intervalos de 2-3 das. deteccin, pues tcnicas como la inmunodifusin convencional requieren
mayores cantidades de antgeno y anticuerpo para su exteriorizacin que el
La titulacin de anticuerpos se refiere a la valoracin cuantitativa o RIA o el ELISA. Estas ltimas permiten detectar cantidades de anticuerpos
semicuantitativa de los anticuerpos producidos por el animal de experimen- en el orden de los nanogramos o aun menores.
tacin.
TABLA IV. Ttulo de anticuerpos anti-lgG humana
La pa.labra ttulo se aplica de ordinario para indicar la cantidad relativa de
anticuerpos o la potencia inmunolgica de un antisuero. A veces el ttulo se
expresa en funcin de la dilucin lmite, por ejemplo, un titulo l / l O000 signi- Ttulo Nmero
Mtodo de titulacin
fica que el antisuero aglutin o precipit el antgeno homlogo cuando se (g/mL) de es:perimentos
disolvi en la proporcin 1 rnL de antisuero: 1O000 mL de diluyente. El ttulo Precipitaci n cuantitativa 250-300 6
se emplea tambin en abstracto: suero de alto o bajo ttulo, sin ningn valor
numrico. A veces el trmino puede conducir a confusiones, pero es real-
Titu lacin de Sewell 260-280 4
mente til y, si no se empleara, sera necesario aplicar otro igualmente am-
biguo, tal como potencia o avidez.
lnmunodifusin radial 1 138 2,8 6
En la titulacin por el mtodo de dilucin lmite,de antgenos solubles es muy
empleada la inmunoprecipitacin en gel (inmunodifusin) y, en el caso de lnmunoelectroforesis
1 127 2,7 6
antgenos celulares, la inmunoaglutinacin. Los antgenos moleculares pue- de Rocket
den ser adsorbidos sobre clulas o partcuJas inertes como el ltex de
poliestireno, lo que permite titular los anticuerpos por inmunoaglutinacin. La titulacin es uno de los componentes de la caracterizacin del anticuerpo
Esta tiene la ventaja sobre la inmunodfusin de ser ms rpida y detectar y a veces resulta suficiente para el fin que se le va a dar. No siempre el
cantidades menores de anticuerpo. suero con mayor contenido de anticuerpos es el mejor. Para determinados
trabajos se deben valorar otras propiedades del anticuerpo, como el isotipo,
Esta forma de titulacin, a pesar de ser una valoracin arbitraria, en muchas
la afinidad o la capacidad de reaccionar cruzadamente con otros antgenos
ocasiones resulta suficiente para el trabajo que se desarrollar. Si se nece-
(antgeno heterlogo). De acuerdo con las caractersticas del anticuerpo
sitan valoraciones absolutas pueden emplearse la precipitacin cuantitativa
que se desea obtener, se trazar la estrategia de trabajo.
Antgeno heterlogo: Antgeno diferente al que indujo la fonnacin de los anticuerpos, pero
Antgeno homlogo: El que se emple en la irummizacin, o sea, el irunungeno.
que reacciona con ellos.

72 73
 Es importante que el experimentador tenga en cuenta que no debe mezclar
el suero de diferentes animales ni el de un mismo animal si corresponden a
momentos distintos de la inmunizacin.
~P.<flco

/~ ~ontom:n~ GJ/- )--

5. Purificacin de anticuerpos
-
Los anticuerpos pueden ser purificados a partir del suero inmune, del lquido
asctico o de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma. Para ello se
Soporte
emplean los mtodos inespecficos y los especficos. o motriz

\~~ -7~@>- >-

Con los mtodos inespecficos se obtiene una fraccin enriquecida en IgG
especfica. Entre ellos son muy utilizados en los laboratorios: la precipitacin
con sales inorgnicas (sulfatos de amonio y de sodio), polietilenglicol (PEG),
cido caprlico y otros ; la cromatografia de intercambio inico y la
cromatografia de afinidad con protena A (SpA) o protena G . Con estas
. mismas tcnicas se puede purificar la fgG normal a partir de un suero o una
mezcla (poof) de sueros normales.
Con los mtodos especficos se obtiene el anticuerpo de inters purificado,
libre de otros anticuerpos . Ellos se basan en la absorcin reversible de
anticuerpos o de los contaminantes que lo acompaan (Figura 15).
Con este fin se emplea la cromatografia de afinidad con soporte de Sepharosa
y los llamados inmunoabsorbentes constituidos por geles de protenas
polimerzadas con glutaraldehdo.
El mtodo de eleccin depender enteramente de los requisitos que deba
tener el preparado final. En la prctica son aconsejables los mtodos
inespecficos, en tanto que los especficos deben emplearse cuando se re-
quieren preparados de anticuerpo de alto grado de pureza.
Protena A: Constituyente de la pared celular dcSraphylococcus aureus. MM= 42 000 Da .
Se une a la regin Fe de la IgG de la mayoria de las especies de mamferos, incluyendo tres
subclases de la hwnana (excepto IgG3) y todas las subclases del ratn. Puede tambin
unirse a otras clases de Ig (lgM e lgA) de una forma ms dbil, al parecer por sus regiones
Fab. La protena A se une ampliamente para identificar y aislar IgG y complejos Ag-Ac.
Se emplea con frecuencia en ensayos irummoenzirnticos.
Protena G: Constituyente de la pared celular de estreptococos del grupo
C. MM= 30 000 Da. Se une a la regin Fe de la mayora de las lgG, incluyendo la lgG3
humana. Comparada con la SpA, la protena G reacciona ms fuertemente y con un rango
ms wnplio de Ig de diferentes especies de"marnferos. No se une a otras clases de lg y es,
por tanto, un reactivo ms verstil y especfico para formar compkjos con las IgG.
74
'
Co - contaminante
f 1gura 15 . Absorcin reversible. Amba. absorcin del Ac de. inters con el Ag como ligando.
[)eha_10. absorcin del Ac contaminante.
Aisl amiento de IgG del suero sanguneo
por precipitacin con sulfato de amonio
Este mtodo se basa en el fenmeno precipitacin por salado (salting out)
que se produce cuando las molculas de agua qm: solvatan a la protena en
la solucin, son eliminadas por la sal que se adiciona. De esta fonna se
incrementa la interaccin protena-protena y esta precipita en su fonna
nativa .
Las tcnicas de precipitacin salina se utilizan en el aislamiento y concen-
tracin de protenas, y constituyen con frecuencia la primera etapa del pro-
ceso de purificacin. Son econmicas, sencillas y no afectan las propieda-
des biolgicas de las protenas, por lo cual pueden constituir incluso un
medio para su conservacin.
Para los sueros de mamferos se obtienen rernltados buenos con el 33 % de
concentracin final del sulfato de amonio, aunque el rendimiento (y tambin
la contaminacin) puede aumentarse con saturaciones mayores . La mayo-
ra de los anticuerpos de conejo pueden precipitarse con una saturacin del
40 %, mientras que los de ratn necesitan una concentracin final de la sal
del 45-5"0 % . (Ver Tabla V)
75
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Cuando se trabaja con pequeos volmenes de suero se precipita con la,
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Debe emplearse siempre un reactivo de la mayor calidad.
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La fraccin que se precipita corresponde a la fraccin gammaglobulinica
del suero (Figura 2), que contiene fundamentalmente todas las clases de
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- Suero sanguneo
- SAS pH 7. Ver anexos
- Agua destilada
- Beaker pequeo
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...., - Solucin de sulfato de amonio al 33 % (Tabla V) - Tubos de centrfuga
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- Solucin de BaCl2 - Agitador magntico

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tivo celular) a 3 000 g durante 30 minutos. Medir el volumen requerido,
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;;.: Vi N "" r::;r:;:,
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(suero diluido+ SAS) a la concentracin final requerida. Aplicar la fr-
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3. Adicionar el volumen de SAS gota a gota con agitacin suave. Dejar
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o~ ..,...,. ' ' o :; 3 reposar la mezcla l hora a TA y toda la noche a 4 C. Algunos autores
Vi
N - 00 N .... -ro ro
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recomiendan agitar durante 1 hora en vez del reposo.

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..,. - ....: e 4 . Centrifugar la mezcla a 3 000 g durante 30 minutos.
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~ '";.o 5. Lavar el precipitado con un pequeo volumen de la solucin de sulfato
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o ro ro de amonio (2-3 mL por cada mililitro de precipitado es suficiente). Este
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lavado puede repetirse una o dos veces ms. Efectuar las centrifugaciones
como en el punto 4. La concentracin de la solucin de lavado ser la
misma o ligeramente superior que la concentracin a la que se realiza la
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precipitacin. Si se precipita al 33 % se lava con una solucin al 33 %~ si
se precipita al 40 % se utiliza una solucin al 40 % para lavar el precipi-
tado.
6. Restituir el precipitado en un volumen similar al del precipitado de agua
destilada o un volumen suficiente para su disolucin total.
7 . Para obtener preparaciones de mayor pureza se recomienda reprecipitar.
En ese caso el precipitado se restituye al volumen original de suero y se
procede nuevamente como indican los puntos 1-6.
8. Poner a dializar con agitacin. primero contra agua destilada (tres cam-
bios en 6 horas) y despus contra el tampn o solucin apropiados (12 ho-
ras). El volumen de lquido contra el que se dializa debe ser 500 veces el
volumen de la muestra. Comprobar la remocin de toda la sal de amonio
con la solucin de BaCl 2 . Si se observa un precipitado al mezclar 1 mL de
esta solucin con 1 mL del lquido de dilisis, debe continuar el proceso.
9. Extraer el contenido del saco de dilisis y centrifugarlo para eliminar
cualquier precipitado.
10. Determinar su concentracin y pureza, y conservarlo conveniente-
mente . Puede adicionarle azida sdica a una concentracin final del
0,02%.
Observacin
Si la dilisis se realiza a TA puede aadirse NaN 3 al agua destilada y al
tampn, para evitar la contaminacin de la muestra. Si la fraccin gamma-
globulnica va a ser purificada por cromatografia, el ltimo paso de dilisis
debe realizarse contra el tampn de corrida, al menos durante 2 horas . La
eliminacioo de las sales puede tambin realizarse por filtracin en Sephadex G-25.
Las membranas de dilisis deben llenarse previamente con agua, para ase-
gurar su buen estado y no lamentar prdidas de la preparacin. Despus de
utilizadas deben lavarse bien y conservarse sumergidas en agua destilada
con NaN 3 en fro . Deben rotularse para ser siempre utilizadas con el mismo
tipo de preparacin. Cuando el (NH 4 ) 2 S04 no es de buena calidad, puede
aadrsele EDTA (5 mmol/L) a su solucin. Recordar que esta tcnica per-
mite aislar la fraccin gammaglobulnica normal si se parte de un suero o de
un pool de suero normal.
78
Pur~ficacin de lgG mediante cromatografa de intercambio inico , .
Un intercambiador inico es un material insoluble (por ejemplo, celulosa)
con grupos carga.dos unidos covalentemente (como dietilaminoetil, DEAE o
carbox..imetil, CM) y contraiones mviles . Estos contraiones pueden ser sus-
tituidos de forma reversible por otros iones de la misma carga, sin cambio en
la matriz insoluble (Figura 16).
a
/ CH2 CH3
O-CH2-CH2N'CH2C~
Contrain
Partcula de OEAE-celulosa (_intercombiodor oninico) ,..,
O-C H -e
2 11
/o-
@
O Contrain
Partcula de CM-celulosa (intercambiador catinico)
Figura 16. Materiales de celulosa para intercambio inico.
Si la matriz posee grupos pos1t1vos , el contrain ser negativo ; tal
intercambiador recibe el nombre de aninico . Si posee grupos negativos, el
contrain ser positivo y el intercambiador, catinico.
En este tipo de cromatografia la separacin de las protenas se basa en sus
caractersticas de carga, lo que les pennite interactuar reversiblemente con
el intercambiador, bajo condiciones fijadas . Por tanto, la cantidad y distribu-
cin de las cargas, as como el tamao molecular, desempean un papel
importante.
Tratndose de una absorcin reversible, la cromatografia de intercambio
inico se realiza en dos etapas : 1) Ja adicin y fijacin de las protenas de la
matriz y 2) la elucin de cada una de las protenas. mediante gradiente de
fuerza inica o pH.
A diferencia del mtodo general, la purificacin de IgG se d 'cta en una
sola etapa, ya que en las condiciones de baja fuerza inica y pH en que se
realiza la tcnica, quedan retenidas las otras protenas del suero sang uneo
79
 Material
mientras que la JgG eluye, y se obtiene en las primeras fracciones prcti
mente pura (Figura 17). _ Suero sanguneo o fraccin gammaglobulnica dializados contra el tam-
pn de corrida
/ - Columna 1,5-2 x 20-25 cm ~~
1V .:..111;:~.r'"".
,, ~"' .'<:,~...., IS
Suero sanguneo o
DEAE-52 '-0'?'.
1,
.<!2"'" !] I ...
~"-..
~ ~
~ .,,.
Y-gtobul i na - Agitador de vidrio ( -! , .. ;~ ~~!

- Tampn fosfato 17,5 mmol/L (de baja f.i.*); pH 6,5

Frasco Mariotte ..
't> DEAE-
celulosa
~'""r.'. ,..,

~ 'f Q-0~ - Tampn fosfato 17,5 mmol/L; NaCI 0,2 mol/L; pH 6,5 (de alta f.i .)
~ J Protenas - Pipetas
6- r; sricas
. ( "
.11' ~
Y lgG - Tubos de ensayo
- Colector de fracciones
f y lgG - Espectrofotmetro

Figura 17. Purificacin de IgG porcromatografia en DEAE-celulosa (Wla sola etapa).
El pl de Ja IgG humana (5,8-7,3) es una consecuencia de la heterogeneidad
de estas molculas . Las protenas por encima de su pl se cargan negativa-
mente y, por debajo de l, positivamente.
A pH 6,5 una gran parte de las molculas de IgG (con pi ~ 6,5) se encuen-
tran neutras o positivamente cargadas, por lo que no pueden fijarse al
intercambiador aninico y eluyen con el tampn de corrida. Las que estn
por encima de su pi (pi < 6,5) tendrn una ligera carga positiva y podrn
fij a rse al intercambiador, aunque tienen que competir con las otras protenas
del suero con mejores o similares condiciones para la absorcin. Es la IgG3,
que representa aproximadamente el 7-8 % de la IgG srica total, la que en
parte queda retenida en el intercambiador.
El pi de las IgG de conejo, ratn y otras especies de mamferos se comporta
de manera similar al de la IgG humana, lo que posibilita que se purifiquen
por el mtodo que aqu se describe.
Corrientemente se emplean en la c_romatografia de intercambio inico la
DEAE-celu losa, el DEAE-Sephadex A-50 y el DEAE-Sephacel, y pueden
realizarse en columna o en batch.
80
Mtodo
1. Pesar la cantidad necesaria de DEAE-52 conociendo que l g de la resi-
na hinchada alcanza un volumen aproximado de 12 mL y admite l mL de
suero sanguneo total. Un mililitro de SHT contiene aproximadamente
70 mg de protenas totales y 12 mg de lgG .
2. Suspender el DEAE-52 (1 g) en 50 mL del tampn de corrida, taparlo y
dejarlo en fro toda la noche. Eliminar el sobrenadante por decantacin o
filtracin a vaco y lavar el gel cuatro o cinco veces con 50 mL del
mismo tampn.
3. Con la ayuda de un agitador de vidrio colocar en la parte inferior de la
columna (sostenida en posicin vertical) una finsima capa de lana de
vidrio.
4. Aadir 2 o 3 mL del tampn de corrida y segudan1ente, y en fonna
continua , la suspensin de DEAE-celulosa, hasta obsen ar el
empaquetamiento de la columna de gel (cuando se mantenga estable su
altura). Esto se hace con el extremo de la columna abierto . Mantener
f.i.: Fuerza inica.
81
 siempre una cantidad de tampn sobre la superficie del gel para evitar~
su desecacin.
5 . Dejar correr el tampn de baja fuerza inica (al menos dos veces el
volumen ,de gel) para que se estabil ice y equilibre el intercambiador.
Medir e pH del eluato. Si no es 6,5 debe contin uarse la adicin de
tampn hasta que se alcance este valor.
6 . Cerrar el extremo de la columna y retirar con cuidado la columna de
lquido . Colocar gentilmente la muestra sobre la superfici e del
intercambiador y abrir la salida.
7. En seguida que haya penetrado toda la muestra, aadir con precaucin Tompn
un poco de tampn y conectar el frasco Mariotte as como el colector de Papel
fracciones . En su defecto, recoger manualmente fracciones de 2 mL (o - d e filtro
mayores, dependiendo del tamao de las cubetas del espectrofotmetro).
Ajustar el flujo a 0,2 mL por minuto, variando la altura del frasco Mariotte
(Figura 18).
8 . Leer la absorbancia a 280 nm de cada una de las fracciones contra el
tampn de corrida en el espectrofotmetro.
Coleccin de
9 . Cuando haya salido un pico, lavar la columna con el tampn de alta f.i . 1 1 11 las fracciones
hasta que la lectura a 280 nm sea menor que 0,03 . Volver a equilibrar la
columna con el tampn de baja f. i. !Jara su reutilizacin.
10. Seleccionar las fracciones con las mayores lecturas, mezclarlas y leer la
DO de la mezcla a 280 nm para determinar su concentracin proteica,
Figura 18. Representacin esquemtica de la cromatografia en colwnna.
conociendo que una solucin de lgG humana de 1O mg/mL tiene una
absorbancia a 280 nm de 13,6. Separacin batch sobre intercambiadores aninicos
lJ . Evaluar la pureza de la IgG. Conservarla.en alcuotas congeladas a -20 Aunque los procedimientos batch son menos eficientes que las tcnicas de
o - 70 C con preservativo o sin l. columna, tienen ciertas ventajas, especialmente en los procesos a gran es-
Observacin cala. La separacin en batch es muy rpida y no la afectan los cambios
(hinchamiento o contraccin) del intercambiador.
Puede colocarse en la superficie del gel un anillo de papel de filtro para
aplicar la muestra. Al finalizar la corrida debe lavarse el intercambiador con Este tipo de separacin se lleva a cabo mezclando el intercarnbiador, previa-
el tampn de alta molaridad para desprender toda la protena absorbida. La mente equilibrado con el tampn apropiado, con la muestra que va a ser
resina limpia puede conservarse durante varios meses a 4 C con sales absorbida; tambin dializada con antelacin contra el mismo tampn. La
fenilmercricas al 0,00 l % en solucin dbilmente alcalina. mezcla se mantiene, por lo general, l hora en agitacin suave a temperatura
ambiente.
82
83

./
,,

El gel se separa por filtracin al vaco o centrifugacin, las protenas absor-
bidas se desprenden resuspendiendo el intercambiador en soluciones de alta
molaridad o con un pH diferente.
Segn Harlow and Lane ( 1988) la mayora de las matrices de DEAE admi-
ten 1 mL de suero total por cada 2 mL de matriz hinchada, bajo las condicio-
nes de fuerza inica y pH descritas en la tcnica anterior.
Cromatografia de afinidad con protena A (Ey et al. , 1978)
La cromatografa de soluciones de anticuerpo sobre una columna de prote-
na A es uno de los mtodos ms efectivos y ampliamente utilizados para
purificar AcP humanos, de conejo, de ratn, equinos, de vaca, de asno, de
perro, de cerdo y de curie!. Los AcM de ratn IgG2a e IgG2b st: unen bien
a la SpA. Los anticuerpos de la subclase IgG3 tienen afinidades interme-
dias, pero las molculas IgGI se unen con afinidad baja. La mayora de los
AcM de rata no pueden ser purificados por este mtodo
Con anticuerpos de alta afinidad un simple paso de purificacin es suficiente
para obtener preparaciones adecuadas para la mayora de las aplicaciones .
Material
- Solucin de Ac (suero, ascitis o sobrenadante del cultivo celular)
- Tris 1,0 mol/L, pH 8
- Tris 100 mmol/L, pH 8
- Tampn glicina 100 mmol/L, pH 3
- Columna de Sepharosa-protena A
- Tubos cnicos
- Espectrofotmetro
Mtodo
1. Ajustar el pH a 8 de la preparacin cruda previamente centrifugada
(suero, ascitis o sobrenadante de hibridoma), adicionndole 1/10 de volu-
men de Tris 1 mol/L, pH 8.
2. Pasar la solucin a travs de la columna de Sepharosa-protena A. Estas
columnas unen aproximadamente 10-20 mg de anticuerpo por mililitro de
84
gel (una molcula de protena A une dos molculas de anticuerpo). El
suero contiene alrededor de 12 mg/mL de IgG total ; la ascitis, entre
1-1 O mg/mL; y los sobrenadantes de hibridoma, de 2-50 g/mL de anti-
cuerpo monoclonal.
3. Lavar la columna al menos con 10 volmenes de Tris 100 mmol/L, pH 8
hasta que la lectura del eluato a 280 nm sea menor que 0,03.
4. Eluir la IgG de la columna con glicina 100 mmol/L, pH 3,0.
5. Colectar las fracciones en tubos cnicos que contienen 50 L de Tris
1 mol/L, pH 8. Mezclar gentilmente para neutralizar el pH de los eluatos
que oomprenden la lgG.
6. Leer las fracciones a 280 nm para identificar aquellas que contienen los
anticuerpos . Mezclarlas y dializ.arlas convenientemente; cuantificar y eva-
luar la pureza de los anticuerpos y conservarlos de forma adecuada.
Observacin
Cuando una misma columna se utiliza para purificar anticuerpos diferentes,
puede contaminarse un lote con los residuos de la corrida anterior. Para
evitarlo se debe lavar la columna con urea 2 mol/L, LiCl 1 mol/L y glicina
100 mmol/L, pH 2,5 . Pueden emplearse otros tampones como glicina
1,5 mol/L, NaCI 3 moliL, pH 8,9 para la dilucin o la dilisis de la muestra y
la fijacin de los anticuerpos a la matriz, y tampn citrato O, l mol/L, pH 3
para la deabsorcin.
Purificacin de anticuerpos por cromatografa de afinidad
con antgeno como ligando (inmunoafinidad)
La purificacin por inmunoafinidad no es un mtodo comnmente empleado
para aislar anticuerpos. Esta tcnica es compleja y debe ser utilizada princi-
palmente para aplicaciones especiales de los anticuerpos.
Material
- Sepharosa 48 activada con CNBr
- HCI 1 mmol/L
- Antgeno (5-10 mg/mL de gel de acoplamiento)
- NaHC0 3 O, 1 mol/L, NaCI 0,5 mol/L, pH 8,3
85
- Antisuero especfico en tampn borato, pH 8,3
- Tris-HCI O, 1 mol/L, pH 8 (tampn de bloqueo)
- Filtro-de vidrio aglomerado, porosidad G-3
- NaAc O, l mol/L, NaCI 0,5 mol/L, pH 4
- -'tolumna cromatogrfica l x 8 cm
- Tampn borato O, 1 mol/L, pH 8,3
- Frasco Mariotte
- Glicina 0,2 mol/L, pH 2,8
- Glucosa l mmol/L
Mtodo
l. Pesar 1 g de Sepharosa 4B activada con CNBr, suspenderla en 10 mL
de HCl l mmol/L y dejarla en reposo durante 15 minutos. Tener en
cuenta que l g de esta resina rinde 3,5 mL de gel.
2. Lavarla con 200 mL de la misma solucin y 50 mL del tampn de aco-
plamiento a travs de filtro G-3 .
3. Aadir el gel sobre la solucin de antgeno y agitar de forma mecruca
(no se puede usar agitador magntico) durante 2 horas a TA o 4 C toda
la noche.
JO. Despus que la muestra haya penetrado por completo, restituir el flujo
del tampn borato y dejar pasar una cantidad igual a 2 volmenes de gel.
La velocidad de flujo no deber ser mayor de 1O mL cm2 b-1 .
11 . Lavar la columna con glucosa 1 mmol/L debiendo pasar una cantidad
igual a 10 volmenes de gel. Tomar una muestra del eluato y leer su
absorbancia a 280 nm . Si la lectura excede a 0,03 continuar lavando
con la solucin de glucosa. Este paso es muy importante, ya que se
eliminan los posibles contaminantes que se encuentran unidos
inespecficamente a la matriz.
12. Eluir los anticuerpos retenidos en la matriz con tampn glicina pH 2,8.
Durante esta operacin continuar el monitoreo de las fracciones a
280 nm .
13. Mezclar las fracciones que contienen los anticuerpos y neutralizar la
solucin rpidamente con Tris slido, por dilisis o por filtracin sobre
Sephadex G-25 .
14. Equilibrar de nuevo la matriz de Sepharosa con tampn borato pH 8,3 y
guardarla a 4 C con timerosal a una concentracin final del 0,02 % .
Observacin

4. Recuperar el lquido y leer su absorbancia para comprobar si tuvo lugar Si los anticuerpos son de alta afinidad, la elucin puede realizarse con HAc
la unin del ligando (antgeno en este caso) y en qu cuanta. 0,5 mol/L. Esta tcnica puede emplearse para purificar antgeno, ligando el
anticuerpo especfico a la matriz.
5. Aadir 50 mL de Tris-HCl 0, 1 mol/L, pH 8 y dejar reposar 2 ha TA o
mejor toda la noche a 4 C para bloquear posibles grupos residuales en la
Preparacin de un inmunoadsorbente con GA. Inmunoabsorcin
matriz.
6. Lavar el gel en forma alterna cinco veces con el tampn de acoplamien- Materia l
to (pH 8,3) y el tampn acetato (pH 4). - 250 rng del antgeno - Agua destilada
7. Equilibrar la matriz finalmente con tampn borato pH 8,3. - Antisuero a purificar - Tris saturado o en polvo
8. Prepa rar la columna cromatogrfica, procediendo como en la Glutaraldehdo (GA) - Beaker pequeo
cromatografia de intercambio inico (Figura 18).
Tampn fosfato O, l mol/L, pH 7 - Pipetas
9. Aplicar la muestra que contiene los anticuerpos de inters. previamente
- Tampn borato O, l mol/L, pH 8,3 - Agitador magntico
dializada contra el tampn borato.
- Glucosa l mmol/L - Centrfuga
86
87
- Glicina 0,2 moVL, pH 2,8 - Espectrofotmetro
- Agitador magntico
Mtodo
l . Pesar 250 mg del antgeno y disolverlos en 5 mL del tampn fosfato
0,1 moVL, pH 7.
2. Aadirles gota a gota y con agitacin suave 1 mL de GA al 2,5 % .
3. El gel formado se deja reposar durante 3 h a TA.
4. Lavarlo exhaustivamente con agua destilada hasta que a 280 nm d una
lectura menor que 0,03. Las centrifugaciones se realizan a 5 000 rpm y a
4 <>C durante l O minutos .
5. Equilibrar el gel lavndolo dos veces con tampn borato pH 8,3 .
6. Aadirle 20 mL del antisuero al antgeno polimerizado y dejar la mezcla
en agitacin durante 2 ha TA o toda la noche a 4 <>C .
7. Centrifugar para recuperar el suero absorbido y lavar el gel con glucosa
1 mmoVL hasta que la absorbancia a 280 nm sea menor que 0,03 .
8. Eluir los anticuerpos adsorbidos con glicina 0,2 moVL, pH 2,8 (o cido
actico 0,5 moVL), recogiendo fracciones de 5 mL cada una. Neutrali-
zarlas inmediatamente con Tris saturado. Mezclarlas y detenninar su
concentracin y pureza.
9. Equilibrar nuevamente el gel con tampn borato pH 8,3 para ser
reutilizado. Conservarlo a 4 C con azida sdica a una concentracin
final del 0,01 %.
Observacin
Este mtodo es ms econmico que la cromatografia de afinidad con
Sepharosa activada y es til en la purificacin de anticuerpos a gran escala.
Se recomienda el empleo de los inmunoadsorbentes para la eliminacin de
los contaminantes, tanto del antgeno como del anticuerpo. Cuando se puri-
fican antgenos se polimerizan los anticu~rpos especficos.
88
Purificacin de lgY a partir de la yema del huevo (Kurstak, 1986)
Material
- Huevo de g~llina inmunizada - Solucin de N~S0 4 (para los lavados)
- NaOH O, 1 moVL - Freezer
- N~SO 4 slido - Centrfuga
Mtodo
1. Separar la yema del huevo, romper su membrana y diluirla con 9 vol-
menes de agua destilada. Ajustar el pH a 7 con NaOH O, 1 moVL .
2. Congelar y descongelar la preparacin.
3. Remover los lpidos por centrifugacin 3 000 g a 4 C dur~te l hora.
4. Recuperar la solucin de anticuerpos filtrndola a travs de lana de vi-
drio o pipeteando a travs de la capa de lpidos.
5. Purificar la lgY por precipitacin con sulfato de sodio al 17 % de satura-
cin final, procediendo como en la precipitacin de la fraccin
gammaglobulnica con SAS .
Observacin
La precipitacin de la lgY puede hacerse tambin con un volumen igual de
una solucin de sulfato de amonio al 34 % .
Absorcin de antisueros frente a antgenos particulados heterlogos
A menudo los antisueros antibacterianos manifiestan _reactividades cruza-
das con bacterias relacionadas (antgenos heterlogos) . En estos y otros
casos resulta conveniente la absorcin del antisuero para eliminar los
anticuerpos que reaccionan cruzadamente con antgenos o epitopos que son
compartidos por la bacteria homloga y la heterloga (Figura 20) . Para ello
es suficiente mezclar el antisuero con las bacterias heterlogas, previamen-
te lavadas varias veces con SF y sedimentadas por centrifugacin, en la
relacin 1 volumen de antisuero/ 1-2 volmenes de clulas.
Las clulas se resuspenden suavemente en el antisuero y se deja reposar la
a
mezcla TA o a 37 C durante 15-30 minutos. AJ cabo de este tiempo se ~
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89 { ,...
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centrifuga y se recoge el suero absorbido (Figura 19). Si aJ ser ensayado
nuevamente frente a la bacteria heterloga se observa an reaccin positi-
va, se repite la absorcin.
l)na relacin de absorbancia a 278 y 251 run mayor que 2,5-3 puede dar una, .
idea bastante_aproximada de la pureza de la IgG cuando esta se purifica por
algunos de los mtodos anteriormente propuestos (ljssen, 1990).

Con este procedimiento disminuye el ttulo original de anticuerpos contra el TABLA VI. Coeficientes de estincin
antgeno homlogo, pero el antisuero gana en especificidad. La absorcin de inmunoglobulinu G ( A1! ) a 280 nm
puede realiz.arse con diferentes bacterias o una mezcla de ellas y tambin
puede llevarse a cabo con antgenos solubles~ as se obtiene un precipitado Especie Coef. de extincin
que se elimina por centrifugacin.
Humano 13,6

Suero anti A + bact. A - +++ Conejo 13,8

Suero anti A + bact. B - +
Bovino 13,8

Ratn 14,0
Aq homlogo Ag heterlogo

Camero 14,0
J:~o
..o

-
Caballo 12,6
~Yo
Bacteria
:./-'')1
~;.61
B -
o~ Mtodo de Lowry

---
~~ 0~Centri
C1dn
fugo - ... Este mtodo colorimtrico es uno de los ms utilizados en la cuantificacin
de protenas y se basa en la accin reductora de los aminocidos aromticos
Figura 19. Absorcin de antisuero frente aAg celular. (tirosina y triptfano) sobre el reactivo Folin-Ciocalteau, la cual da como
resultado una coloracin azul. El mtodo de Lowl)' permite detectar con-
Cuantificacin de anticuerpos centraciones de protenas en un rango de 0.05-0,5 mg .
Mtodo espectrofotomtrico
Matehai
Los anticuerpos purificados pueden cuantificarse espectrofotomtricamente, - Anticuerpos o fraccin irununoglu lnica - Reactivo Folin-Ciocalteau
utilizando el valor del coeficiente de extincin (E) determinado para los isotipos a cuantificar
inmunoglobulnicos de las diferentes especies animales (Tabla VI).
- Estndar de IgG 1 mg/mL en SF - Tubos de ensayo
Cuando se utilizan diluciones de la prep!faein de anticuerpos, se debe mul-
tiplicar el valor obtenido por el factor de dilucin, por ejemplo, si se emplea - Salina fisiolgica - Gradilla
una dilucin 1/100 se multiplicar por l 00.
91
90
 - Reactivo A - PipetaS
- Reactivo B - Espectrofotmetro o fotocolormetro
Mtodo
l . Preparar en SF una solucin de IgG estndar a la concentracin 1 mg/ml .
Leer su absorbancia a 280 nrn y corregir la concentracin empicando el
coeficiente de extincin (Tabla VI).
2 . Para hacer la curva patrn aadir en una serie de tubos las siguientes
cantidades de la solucin de IgG estndar: l O; 20; 40; 60; 80; 100; 200;
300; 400 y 500 L . Completar el volumen a 600 L con SF.
3 . Hacer djluciones apropiadas de la muestra a cuantificar (al menos dos)
y aadir 0,6 mL en cada tubo.
4 . Preparar el blanco con 0,6 mL de -SF.
5 . Preparar la cantidad necesaria de reactivo C mezclando 60 mL del reactivo
A por cada mililitro del reactivo B. Desecharlo despus de 24 horas .
6 . Aadir 3 mL a cada uno de los tubos del reactivo C, agitar y dejar en
reposo durante l O minutos
7. Aadir 0,3 mL del reactivo Folin-Ciocaltcau previamente diluido al do-
ble con agua destilada, mezclar y dejar en 1eposo 30 minutos .
8 . Determinar la absorbancia a 650 nm contra el blanco.
9 . Para realizar los clculos, sumar y promediar las concentraciones de
IgG (corregidas) en cada uno de los tubos de la curva patrn e igual-
mente sus absorbancias correspondientes . Dividir el promedio de las
concentraciones entre el promedio de las absorbancias para determinar
la cotangente (j) de la curva.
10. Para calcular la concentracin de la muestra, multiplicar la absorbancia
por la cotangente y el factor de dilucin correspondiente. Promediar las
concentraciones determinadas para cada dilucin. Eliminar aquellas lec-
turas que no caigan en el rango de la curva patrn.
Observacin
Es conveniente hacer todos los tubos por duplicado y promediar sus
absorbancias . La curva patrn debe hacerse cada vez que se preparan ne-
92
vos reactivos. Mientras se utilizan los mismos, puede trabajarse slo con las , .
111 ucstras y el blanco, y realizar los clculos con la cotangente ya calculada.
Para establecer las diluciones apropiadas de la muestra se puede hacer una
lectura previa a 280 nrn y estimar aproximadamente su concentracin, te-
niendo en cuenta que una unidad de DO corresponde aproximadamente a
0,8 mg de lgG/mL .
Micromtodo de Lowry
Material
- Solucin de BSA l mg/mL
- Solucin de NaOH 1 mol/L
- Na2C0 3 al 2 %
- Solucin de tartrato de sodio al 1 %
- Solucin de Cu SO 4 al 1 %
- Reactivo de Folin-Ciocalteau 1 mol/L (si est ms concentrado, diluirlo
con agua destilada)
M todo
Aadir a tubos plsticos 20: 40: 60: 80 y 100 L de la solucin de BSA.
2 Completar a l 00 L con agua destilada y hacer un blanco con 100 L de
agua destilada .
3. Aadir a cada tubo l mL de la mez.cla siguiente: N~C0 3 19,6 mL + 0,2 mL
de tartrato de Na + Cu SO 4 0,2 mL . Esperar 15 minutos
4. Adicionar a cada tubo 100 L del reactivo Folin-Ciocalteau y esperar
45 minutos.
5. Leer la absorbancia a 730 nrn contra el blanco.
Evaluacin de la pureza de los anticuerpos
La pureza de la preparacin de anticuerpos puede realizarse por tcnicas
in munolgicas. que se estudiarn en los captulos posteriores ; por
electroforesis en acetato de celulosa y en geles de poliacrilamida, y por
otros mtodos, aunque los aqu mencionados son los ms empleados .
93

Electroforesis de zona de las protenas del suero sanuneo
',
La electroforesis es la migracin de partculas cargadas bajo la influencia
de un campo elctrico. Entre los factores que gobiernan la migracin se
encuentran la densidad de carga, el pH del solvente, la fuerza inica y el
carcter e intensidad del campo elctrico. Tambin influyen el tamao y la
fonna de las partculas, la temperatura, las propiedades de adsorcin del
medio soporte y la electroendoosmosis.
Las protenas son separadas en la electroforesis de zona casi exclusiva-
macroglobulinemia de Waldestrm. l.Jna intensa disminucin en la concentra-,
cin de la y~obulina srica, como ocurre en la hipogamrnaglobulinemia, tam-
bin puede ser descubierta con esta tcnica. Las cadenas ligeras libres (pro-
tenas de Bence Jones) son identificadas con facilidad en la orina, cuando se
encuentran en concentraciones aumentadas como en el mieloma mltiple .
A B
o o o
+ e e e
=:::> -:::> -:::>

1111 1
.D
mente sobre la base de su carga elctrica superficial. El medio soporte es, .e .D o
o o
OI
en teoria, inerte y no impide ni estimula el flujo de las molculas en el campo OI
'
elctrico. Por lo general se emplean tiras de papel o de acetato de celulosa
como soporte. Sin embargo, el acetato de celulosa ofrece la ventaja de una
-OI
1

tS
1
CIJ
tS
1
1
,.....

migracin rpida (60-90 minutos) . Adems, sobre l pueden aplicarse

microcantidades de protena, se adapta a los procedimientos de tincin y
puede transparentarse, facilitndose as el anlisis de los resultados (Stites y 1gura 20 Electroforesis de zona de las protenas del suero. A, visualizacin de las bandas
por tmcin. B, conversin de las bandas en picos en el densitmetro.
col., l 985) .
En la electroforesis, las muestras de suero o de otro lquido biolgico se Mate na/
colocan en el origen y se separan sometiendo la tira a un campo elctrico
- Muestras de SHT
alrededor de 90 minutos, empleando una solucin tampn alcalina. A este
pH la mayora de las protenas se cargan negativamente y migran hacia el Akohol etlico al 95 %
nodo en virtud de su carga. Despus las tiras se tien para visualizar las - Tiras de acetato de celulosa
bandas proteicas y se leen en el densitmetro. La absorcin variable debido - Solucin transparentadora
a las concentraciones proteicas diferentes es descubierta por una celda fo-
toelctrica y reproducida por un registrador. Las bandas se convierten en - Tampn Veronal 0,025 mol/L, pH 8.6
picos (Figura 20), y pueden ser cuantificadas las principales fracciones . El - Papeles de filtro
suero humano normal se separa por este mtodo en cinco principales ban- - Colorante rojo Ponceau al 0,2 %
das : albmina, a.1-globulina: a.2-globulina, ~-globulina y y-globulina. En las
- Cristal.es de azul de bromofenol o soluc. saturada en etanol
preparaciones puras de IgG slo se observa la banda correspondiente a la
y-globulina. - Solucin decolorante
La electroforesis de zona es un mtodo extraordinariamente valioso para el - Aplicadores o pipetas de 10 A. (P.. = 1 L)
diagnstico de paraprotenas humanas, como el mieloma mltiple y la - Equipo de electroforesis (cubeta con su tapa y fuente de poder)
- Estufa
Paraprotena: Protena de miel orna, irummoglobulna homognea (monoclonal) derivada de - Densitmetro
un clon neoplsico de clula plasmtica y no relacionada con una estimulacin antignica
conocida.
95
94
Mtodo
1. Vert'r el tampn Veronal en los dos compartimientos de la cub
electrofortica (diluido previamente tres veces).
2. Trazar una lnea con lpiz en la tira de acetato de celulosa a una distan-
cia de 1/3 del extremo catdico.
3. Dejar flotar la tira sobre el tampn por unos segundos y slo despus
que se haya impregnado bien sumergirla unos segundos en el tanlpn.
Secarla entre dos papeles de filtro .
Preparacin de fragmentos Fab (Kursta~ 1986)
En algunas ocasiones los fragmentos Fab son ms adecuados (cuando no
~senciales ) que la inmunoglobulina completa en los inmunoensayos. Los
fragmentos Fab prcxiucen un menor background (color de fondo) en los
ensayos 1nmunoenz1ma r:cos po sandwich ; disminuyen la absorc in
inespecfica de factores reurr.atoideos (FR) y restringen la especificidad
de los anticuerpos . Ellos penetran ms fcilmente los tejidos y son, por tan-
ro. a menudo empleados en lo5 ensayos inmunohistoqumicos; teniendo, ade-
ln<iS. la vntaja de que eliminan la absorcin inespecfica por receptores

4 . Colocar adecuadamente la tira de forma que sus extremos descansen
sobre los dos puentes de papel de filtro que se encuentran sumergidos
en el tampn de la cubeta.
5. Equilibrar el sistema con la corriente o el voltaje apropiado (punto 7)
durante l Ominutos.
para Fe, si estos est.1 presentes en el tejido.
Las inmunoglobulinas son escindidas en fragmentos Fab y Fe debido a la
:;-:nstbihdad de su region bisagra al ataque proteoltico. Las enzimas ms
cmpieadas son pepsina y papana (Figura 21) . Estos reactivos deben ser de
la meJOr calidad.
Fd

~(
6 . Aplicar 1,5-2 A. de cada muestra en la lnea traz.ada, habindoseles aa-
dido previamente como indicador de la corrida un cristal de azul de .
Fo~ . b Reducc i n ~adeno
'/1igera
t~si --B---
bromofenol. Guardar una distancia de 0,5 cm entre cada una de las Po of.n - Fe
muestras y entre las muestras y los bordes de la -tira.
7 . Tapar el equipo y efectuar la electroforesis empleando corriente cons-
Papan a
--~--- -llFc'

tante (2 mA por tira) o voltaje constante (LSO V).

8 . Terminada la corrida, sumergir la tira, tan pronto como sea posible, en la Fa~~
solucin colorante. Despus de 3-5 minutos escurrirla y hacerle varios
lavados con cido actico al 5 % (solucin decolorante).
9 . Para transparentarla, sumergirla en alcohol al 95 % e inmediatamente
- Fabc.

en la solucin transparentadora, mantenindola en ella 5 minutos. Colo-

car adecuadamente la tira sobre una lmina de vidrio y guardarla en la
.':.
~..~ ~
estufa a 60 C durante 20 minutos. f:bl) ..
Reduce ion ~
10. Realizar la lectura en el densitmetro. Fob 1
; : Ppt idos
Observacin
=1=r==
pH 4%G
11 Fe ( P)
l~vitartocar las tiras con los dedos, empleando para ello una pinza. Recupe- Figura 21 . Fragmentos de la IgG de conejo obtenidos por digestin enzimtica.
rar las soluciones de lavado que contienen colorante hacindolas pasar por
FR : Autoanticuerpo contra la IgG o lgA, usualmente de la clase IgM, que se presenta con
carbn activado.
mayor frecuencia en el suero de pacientes con artritis reumatoidea.

96 97
Varias inmunoglobulinas e igualmente sus subclases difieren bastante ...:n su Digestin con papa/na
sensibilidad a Ja digestin proteoltica. Los periodos de incubacion de dife-
,\falena/
rentes inn1u~oglobulinas con diversas proteasas se dan en Ja Tabla VIL
- Papama (dos veces recnstaJiuuia de la sigma)
TABLA VII. Perodos de incubacin (en horas) req u erido~ - lgG en el tampn fosfato
para la digestin de IgG (Tijssen, 1990)
- Tampn fosfato 200 mmol/L ; EDTA 2 mmol/L ; cistena 10 mmol/L,
pH7,4
IgG Papana Pepsina Tri psi na
.. Acido iodoactilA) (previamente recristalizado) 10 mmol/L
Humana - Incubadora
IgGl 4 24 48-72 Mtodo
IgG2 48a 6 48-72 1. Disolver la pann.~ en el tampn fosfato a 10 mglmL . La IgG (2~30 mglmL)
lgG3 4 1 48-72 debe haber sido previamente dial izada contra este tampn y llevada a
37 C.
IgG4 24a 2 48-72
2. Adicionar la papa na a la IgG en la relacin l mg de enzima por 100 mg
Conejo 24b 20 - de lgG.

Ratn 3. Parar la reaccin por a..;;cin de cido iodoac.tico.

4. Dializar el digerido contra el tampn apropiado.
IgGl 27 12c -
Observacin
IgG2a 4 4-8c -
Para la digestin de Ja lgG monoclonal de ratn deben hacerse experimen-
IgG2b 4 e - tos pilotos, ya que puede reaccionar l!n forma ~iferente a la policlonal.
.s IgG3 ~ --
- 15 mine - o
Digestin con pepsina
Bovina 48a - - Materia/
Carnero 48a 48a 1 ~~.

~
- Pepsina (dos veces recristalizada, de Warthington) ',vn~ 1.(1/~ C.'// ;,
. ,- ~.1;..-1'.
~ <_

(.;i~ iaift--Tfc11-- ~<8\0

Caballo 48a - - - IgG en el tampn acetato
.;:;' .

-.....
- Tampn acetato 200 mmol/L, pH 4,7 -;t..\ H !;
~ !? i> 1
a: Ms resistente. - Tris-HCl 1 mol/L . .,,.4,, ;;;,.. . /
MEll\C\~
b: Subpoblaciones igualmente resistentes. ~../
Mtodo
c: IgGI debe ser digerida a pH 4,2; IgG de otras subclases a pH mayor (4,5), sin embargo,
algunos F(ab ') 2 sern digeridos; lgG2b es completamente degradada a 15-30 minutos l . Disolver lapesinaenel tampn acetato a 10 mg/mL . La IgG (2~30 mg/mL)
(pierde actividad inmunolgica). debe haber sido dializada previamente contra el mismo tampn y llevada
a 37 C.
98 99
2. Adicionar la pepsina a la tgG en la relacin 1 mg de enzima por J O mg
de IgG .
3. Incubar a 37 "C durante 1-48 horas (Tabla VII) .
4. Parar la reaccin subiendo el pH a 7.5-8.0 con Tris .
5. Dializar la preparacin contra el tampn apropiado.
Observacin
A veces se requiere mayor concentracin de enzima (~jemplo, con la IgG2a
de ratn) o un pH menor (con la IgGI de raton) La digestin de lg(J d
ratn, de conejo y humana con pepsina nndc F(ab ). que puede ser reducido
a Fab' con 2-mercaptoetanol Para ello diahz.ar el dgcndo contra Tns-HCl
550 mmol/L, pH 7,8 y deaerearlo al vac10 Adicionarle l-m.!rcaptoetanol
1O mmol/L e incubar la mezcla a 3 7 "C dur"11te l hora. Seguidamente bajar
el pH a 6,.5 y adicionar N-etilendiami.u 1O-nmol/L para alquilar los grupos
tioles: La temperatura se baja a O C ) se dializ.a la preparacin contra el
tampn apropiado.
.Digestin con tripsina
Material
- Tripsina {cristalizada, tipo IX, sigma)
- IgG en el mismo tampn
- Tris HCl O, 1 mol/L; CaC1 2 20 mmol/L, pH 7,8
- Fenilmetilsulfonil fluoruro l mmol/L o inhibidor de tripsina del frijol de
soya, O, 1 mg/mL
Mtodo
l . Disolver la tripsina en el tampn Tris-HCI a 2 mg/mL . La IgG debe haber
sido previamente dializada contra el mismo tampn y llevada a 3 7 C .
2. Adicionar la tripsina a la lgG en la relacin 1 mg de enzima por 200 mg
de lgG (de carnero, en este caso).
3. Incubar 1 hora a 37 C (Tabla VII).
4. Parar la reaccin con el fenilmetilsulfo_nil fluoruro o el inhibidor de tripsina.
5. Dializar el digerido contra el tampn apropiado.
100
Observacin
La tripsma rinde el mismo tipo de fragmentos que la papana. Estos frag-
mentos son denominados f ab(t) y Fc(t). La tripsina es mejor proteasa para
la lgG de camero, siendo suficiente l hora de incubacin para la digestin
completa Para la lgG humana se requiere una concentracin doble de la
enzima y la adicin de tripsina fresca a varios mtervalos durante 2 horas de
incubacin . La lgM humana requiere unas 18 horas de incubacin . La lgM
de raton debe ser digerida bajo condiciones ligeramente diferentes .
Purificacin de fragmentos Fab y Fab '
Estos fragmeutos pueden ser purificados por varios mtodos. Las tcnicas
mas popula-es son la cromacograf1a sobre CM- o DEAE-celulosa, la filtra-
cin en gel y la crom.uografia de afinidad con SpA o protena G.
Los intercambiadores i:nicos de DEAE en tampn fosfuto de sodio 5 mmol/L,
pH 8 permiten el paso del Fab o lo retienen ligeramente, pudiendo ser
deabsorbido incrementando de fonna tenue la concentracin de NaCI.
La purificacin puede re-af:arse con SephJd.ex G -200 empleando PBS .
La pureza de los fragmentos debe ser comprobada por electroforesis en
S DS- PAG E.
6. Conservacin de los antkuerpos
Para conservar los sueros inmunes o los anticuerpos purificados por algu-
nos das (menos de l semana) pueden mantenerse en fro a 4 C .
Si no se desea congelarlos, se pueden mantener durante l mes o ms aa-
dindoles un preservativo como azida sdica o timerosal al 0,01-0,02 %. La
fraccin garnmaglobulnica puede conservarse precipitada o restituida con
la sal de amonio, lo que impide su contaminacin y la conserva en fo rma
activa durante mucho tiempo.
Los sueros inmunes y los anticuerpos punficados (estos ltimos preferi-
blemente concentrados) pueden congelarse en pequeas alcuotas a -20 o
- 70 "C. Para conservarlos durante periodos muy prolongados se recomien-
da aiiadirles preservativo, un inhibidor de proteasa como PMCF a una con-
centracin final de 0,01 mmol/L, y reducirles el pH a 6,0-6,5 con un tampn
acetato. Tambin pueden conservarse liofilizados (en fo1ma de polvo seco)
hermticamente cerrados a 4 "C.
10 1
 CAPlTULO 11
LA REACCIN ANTGENO-ANTICUERPO

La reacc in que tiene lugar entre un ant1geno y su anticuerpo especfico, los

llamados mmunorreactantes, recibt: el nombre de reaccin serolgica. La
serologa es la ciencia que estudia estas reacciones .
La interaccin entre el antgeno y el anticuerpo puede representarse como
una reaccin bimolecular reversible:
Ag + Ac ~AgAc

Esta interaccin tiene lugar en vim1d de las mismas fuerzas de corto alcan-
ce que gobiernan cualquier interacc ion protena-protena . Sin embargo, la
interaccin especfica antgeno-anticuerpo es cuantitativamente mayor de-
bido a la complementariedad entre el sitio de combinacin del anticuerpo
(paratopo) y el determinante antignico o epi topo, lo que hace que las mol-
culas interaccionen estrechamente sobre un rea tridimensional relativa-
mente extensa. No obstante, por la naturaleza de esas fuerzas pueden ser
revertidas cambiando el pH o la fuerza inica del medio, lo que resulta de
gran utilidad en la purificacin de antgenos y anticuerpos, como ya se vio en
el captulo anterior.
La reaccin antgeno-anticuerpo transcurre en dos etapas :
Primera etapa. interaccin primaria entre el antgeno y el anticuerpo, que
viene dada por el reconocimiento especfico y la combinacin de un deter-
minante antignico con el sitio de unin del anticuerpo correspondiente.

103
Segunda etapa. Interaccin secundaria, en la que se manifiesta la interaccin
primaria ant.geno-anticuerpo. Puede ser, por ejemplo, la lisis provocada por
el sistema complemento, la fagocitosis o simplemente la precipitacin y la
aglutinacin. Es esta manifestacin secundaria la que a menudo observa-
mos en el laboratorio y fue precisamente la que dio lugar al descubrimiento
de los anticuerpos.
La reaccin antgeno-anticuerpo se manifiesta de muy diversos modos,
teniendo cada reaccin su peculiar significacin y valor. La reaccin entre
un antgeno soluble y su antisuero especfico se llama inmunoprecipilacin~
y la que tiene lugar entre angenos celulares o particulados y el antisuero
correspondiente, inmunoaglutinac1n. En ambos casos el mecanismo b-
sico es similar y slo existen diferencias en cuanto al tamao de las par-
tculas antignicas . Esta reaccin ha sido explicada por la teora dd en-
rejado.
TEORA DEL ENREJA.DO (Fasquelle et al , 1970)
Esta teora, propuesta por Marrack (lQ38) y desarrollada por Heidelberger,
Pauling y Goldberg, se fundamenta en Ja multivalencia del antgeno y el
anticuerpo. Segn ella, la multivalencia del antgeno y la bivalencia del
anticuerpo conducen a la constitucin de una red en la que alternan regu-
larmente las molculas de antgeno y anticuerpo. Por ~jemplo, si tres o
ms molculas de anticuerpo se unen a una molcula de antgeno (Figura 22),
se forman puntos ramales que, al incorporarse nuevas molculas de
antgeno y anticuerpo, dan lugar a un producto ramificado cada vez ms
grande. De este modo se constituyen progresivamente masas de volumen
creciente. Una vez alcanzado el volumen c~tico de solubilidad, la masa
del complejo desborda las fuerzas que lo mant.ienen en solucin y aparece
el precipitado.
Manifestacin secundaria: El efecto secundario es consecuencia de la interaccin antgeno-
anticuerpo y no se corresponde exactamente con ella, en especial con antgenos que tienen
pocos epi topos. Con haptenos, por ejemplo, aunque la interaccin primaria ocurre, no hay
precipitacin o lij:icin del complemento.
104
~
..
. I A
e
~ o
B
E::- E
9 Anticuerpo Antgeno
f 1gura 22. Complejos Ag-Ac. A, en la equivalencia. B, en exceso de! Ac. C, en exceso de Ag.
D y E, complejos solubles en exceso de Ag.
La constitucin de la red varia segn las ooncentraciones relativas de antgeno
,. anticuerpo:
- Cuando el antgeno es limitante en Ja reaccin, el complejo contiene una
gran proporcin de anticuerpos que saturan el mximo de determinantes
antignicos, pero que conservan en su periferia numerosas estructuras
complementarias an disponibles.
- Existe una relacin ptima (RO) para cada sistema antgeno-anticuerpo
que favorece la furmacin de una red muy densa y, por tanto, la precipita-
cin. A esta RO precipita prcticamente todo el antgeno y el anticuerpo.
- Cuando el antgeno est en exceso (anticuerpo limitante), el precipitado
es rico en antgeno y los anticuerpos no son lo suficientemente numero-
sos como para reunir todas las molcu las de antgeno en la malla de la
red. Los precipitados se aproximan a cadenas lineales con relacin mo-
lar 1/1 . A concentraciones mayores de antgeno muchas molculas de
antgeno permanecen libres o con un solo anticuerpo unido. En este mo-
mento los complejos son tan pequeos que pueden permanecer solubles .
En la zona de gran exceso de antgeno no existen complejos precipita-
dos.
105
La teoria de la oclusin de Boyd ( 1956) completa la teoria del enrejado. En
el momento de la formacin del complejo la combinacin recproca de los
grupos polares de las estructuras del antgeno y del anticuerpo conducen a
la prdida de su poder hidrfilo. Adems, en el interior de la red se encuen-
tra un cierto nmero de grupos polares an libres, excluidos de su contacto
con las molculas de agua debido al desorden molecular, a causa de lo cual
pierden su poder hidrfilo. Esta dob le prdida de grupos hidrfilos eficaces
disminuye la solubilidad del complejo y produce su precipitacin. En efecto:
- En exceso de antgeno persisten los suficientes grupos polares Libres para
mantener una mayor o menor cantidad de los complejos en solucioo.
- En la relacin ptima de antgeno y anticuerpo la formacin de una red
muy densa disminuye el mximo de la eficacia de los grupos hidrfilos,
precipitando todos los complejos . .
- En exceso de anticuerpo, los complejos estn constituidos en gran parte
por molculas de anticuerpo y la solubilidad de los complejos es funcin
fundamentalmente del nmero de grupos polares eficaces a nivel del
anticuerpo. Si antes de la fonnacin del complejo los anticuerpos slo
implicaban un nmero bastante limitado de grupos hidrfilos, despus de
la formacin del complejo persiste una cantidad an ms reducida, preci-
. pitando los complejos. Este es el caso de los anticuerpos de conejo y de
la mayora de los mamferos, estando compuestos estos anticuerpos en
gran parte por euglobulinas. Por el contrario, si los anticuerpos implican
una gran proporcin de grupos hidrfilos, los complejos formados per-
manecen en solucin. Esto es lo que sucede con los inmunosueros de
caballo antiproteicos.
CONDICIONES PARA LA REACCIN SEROLGICA
(Cushing and Campbell, 1960)
En todas las reacciones serolgicas, especialmente en las que se produce la
agregacin, debe tenerse en cuenta las condiciones del medio en que tiene
Euglobulina Trmino en desuso utilizado para identificar Ja frsccin de globulins sricas
que precipita en agua destilada o a bajas concentraciones salinas. Esta fraccin contiene Ja
mayor parte de las inmunoglobulinas. Se Je denomina seudoglobulina a la fraccin del suero
ms soluble que la euglobulina, pero menos que la albmina.
106
lugar la reaccin . La formacin de un complejo que termina por observarse.
a simple vista depende, en parte, de factores fsicos y qumicos inespecficos
~ secundarios con respecto a la combinacin especfica primaria antgeno-
a.nticuerpo. Los cambios consecutivos que se producen influyen sobre la
estabilidad de los complejos pequeos iniciales a medida que estos crecen y
forman agregados.
Los sistemas serolgicos, como todos los coloidales, suelen estar en equili-
brio delicado en Jo que respecta a su estabilidad fisiCCKiumica, por lo que
<;On influidos por aquellos factores que alteran las propiedades superficiales
de las grandes molculas o que afectan el ritmo de contacto entre ellas.
Algunos de los factores que corrientemente influyen sobre las reacciones
serolgicas son los electrlitos, el pH, la asociacin con otras sustancias
incspeccas que existan en el medio (iones, protenas y otras), temperatu-
ra, tiempo, agitacin y volumen.
La presencia de c.1erta cantidad de electrlitos es necesaria para la solubilidad
de los anticuerpos y para la formacin de los inmunocomplejos. Las reac-
ciones de precipitacin y de aglutinacin ordinariamente se realizan en solu-
ciones de NaCL al 0,85 % (0, 15 moVL) (salina fisiolgica) o en soluciones
tamponadas, con una concentracin aproximada de O, 15 moVL . Un aumen-
to de la concentracin salina tiende a modificar el equilibrio antgeno-anti-
cuerpo y a provocar cambios en la relacin molecular del precipitado. Las
concentraciones salinas al 15 % hacen que parte del anticuerpo combinado
~n los complejos polisacridos del neumococo-anticuerpo se disocie, lo que
permite la obtencin del anticuerpo puro. La reduccin de la concentracin
salina generalmente da lugar a un aumento moderado en la cantidad de
precipitado.
El pH de los sistemas serolgicos est, por lo general, en tomo a la neutra-
lidad, pero puede oscilar entre 5-9 sin que haya cambios notables, a menos
que el antgeno sea inestable a esa condicin de pH Fuera de esos pH las
cantidades de antgeno y anticuerpo que se combinan para fom1ar el com-
plejo se reducen, a causa de la disociacin no slo de los grandes complejos,
sino tambin de las combinaciones primarias antgeno-anticuerpo.
Muchos de los antgenos y Ja mayora de las protenas sricas pueden combi-
narse, has.ta cierto punto, con otras sustancias en solucin. La carga elctrica
de las pFe>tenas del suero es negativa en soluciones con pH superior a 7 ._
107
En consecuencia, si se aaden sustancias de carga elctrica positiva, se
produce cierto grado de asociacin incspccifica, simplemente como resulta-
do de la atraccin de las partculas de cargas opuestas. No obstante. hay
factores menos evidentes y, en ciertas cpndicones, los antgenos y anticuerpos
pueden combinarse con otras protenas sncas. cualquiera que sea su car-
ga. Esto puede alterar la reaccin especifica y, en algunos casos..., pueden
ser arrastradas con el inmunoprecipitado. Los agentes desnaturaliUites
cidos, bases, el calor, alcoholes y detergentes, tienden a provocar la aso-
ciacin de molculas proteicas y pueden reforzar o inhibir las reacciones
serolgicas, dependiendo una u otra conducta del grado de asociacin
inespecfica con otra protena y de la intensidad de la desnaturalizacin. Los
complejos antgeno-anticuerpo suelen ser "pegajosos" y tienden a adherirse
a las superficies . Esta propiedad se refleja tambin en la tendencia de 1
flculos a adsorber componentes no especficos del sistema. De al que,
cuando se realizan anlisis cuantitativos, debe tenerse cuidado en eli
estas sustancias, lavando el precipitado.
La temperatura y el tiempo son factores importantes en las r?cciones
serolgicas. En general, su velocidad es proporcional a la temperatura, por
lo que es prctica corriente real izar los ensayos a 37-40 "C para acelerarlas.
Sin embargo, la temperatura tambin influye sobre la solubilidad de los com-
plejos y su equilibrio final, de tal manera que, para obtener cantidades mxi-
mas de precipitados y aglutinados, se conservan los sistemas de reaccin
durante algn tiempo a O o 4 "C. Algunas reacciones, como aquellas en las
que intervienen las llamadas "aglutininas fras", no son posi~le si no se man-
tienen los inmunorreactantes a baja temperatura durante varias horas. La
combinacin inicial del antgeno y el anticuerpo es rpida y, en la mayora de
los sistemas, se completa en unos pocos minutos. Sin embargo, las reaccio-
nes secundarias que llevan a la insolubilidad requieren un plazo relativarnen
te largo y pueden no alcanzar un mximo hasta pasados 6-8 das, en algunos
sistemas precipitantes. La agitacin de la ~ezcla de los inmunorreactant1
incrementa la velocidad de la reaccin. De igual forma la centrifugacin
acelera la rapidez de la reaccin y permite la consolidacin de la un '
antgeno-anticuerpo. :
Un factor de importancia principal para la velocidad y extensin de la'
inmunoprecipitacin es la proporci de antgeno y anticuerpo en la mezcla.
La cantidad de precipitado depender no slo de la cantidad total de antgeno
108
~ anticuerpo existente en el sistema. sino de las cantidades relativas de cada,
componente. La relacin de irununorreactantes para el tiempo ms corto de
precipitacin corresponde a RO (relacin ptima) . Con un exceso de antgeno
el tiempo de reaccin se incrementa y la formacin del precipitado es par-
cial o totalmente inhibida. Esto tiene importancia prctica, ya que el exceso
de antgeno puede ser la causa de que no se observe reaccin . Teniendo en
cuenta los principios de la teora del enrejado en la irununoprecipitacin,
podra esperarse que se fornlaran tambin complejos solubles en la regin
de exceso de anticuerpo, pero salvo con los antisueros de caballo contra
antgenos proteicos, no se forman; y si no se produce la precipitacin a
concentraciones antignicas bajas, se debe simplemente a la insuficiencia
del antgeno para producir un precipitado apreciable (ver floculacin ). Debe
agr~arse a todo lo anterior, que la influencia del exceso de antgeno o anti-
cuerpo no se limita a la formacin de precipitado, sino que tan1bin puede
producir cambios en los precipitados ya formados . Esta reversibilidad es
posible que conduzca a una disolucin parcial o total de los precipitados
. -:stablec1dos cuando se ex ponen a un exceso de uno de los dos
mmunorreactantes Los agregados de nueva formacin son ms sensibles a
este efecto disolvente que los precipitados bien establecidos, en los que el
antgeno y el anticuerpo estn unidos ms firmemente.
La relacin de concentraciones antgeno/anticuerpo no es de tanta impor-
tancia en las reacciones de aglutinacin, pero en ocasiones es necesario
diluir el antisuero para obtener aglutinados fuertes . Esto ocurre cuando la
concentracin de anticuerpo es tan elevada que las clulas completamente
cubiertas, no permiten que las molcu las anticuerpo ligadas a una clula
puedan hallar sitios con qu combinarse sobre otra clula.
La forma ms sencilla de controlar la ex-tensin de la formacin de los
inmunocomplejos es variar la concentracin de antgeno o de anticuerpo.
Con tal de que ninguno de los dos componentes est saturado, aadiendo
ms anticuerpo o antgeno a un volumen constante se incrementar la can-
tidad de antgeno o anticuerpo unido. respectivamente Con anticuerpos de
alta afinidad el exceso de anticuerpo puede emplearse para unir el antgeno
disponible . No suceder as con anticuerpos de baJa afinidad . En este caso
una fraccin significativa del antgeno permanecer libre.
Incrementando el volumen de reaccin dismi nuye la concentraci n de
antgeno y a nticuerpo, y en consecuencia decrecer la cantidad de.
109
inmunocomplejo formado cuando ninguno de los dos componentes est sa-
turado. En el caso de anticuerpos de baja afinidad el volumen de reaccin
influir notablemente sobre la cantidad de complejos formados .
La mayora de los procedimientos inrriunoqumicos involucran interacciones
multivalentes (Figura 22) que estabilizan sobre manera los irununocomplejos,
rindiendo reacciones prcticamente irreversibles .
Las interacciones multivaJentes permiten la formacin de uniones Ag-Ac
finnes an con anticuerpos de baja afinidad . Debido a que algunas tcnicas
favorecen las interacciones multivalentes, los anticuerpos de ba3a afinidad
pueden operar bien en estas tcnicas, pero no en todas . Cuando los
anticuerpos muestran comportamientos distintos en tcnicas diferentes a
menudo es debido a diferencias en la umon multi\'alente y, por tanto, a
anticuerpos de afinidad baja. Similarmente, una reaccin cruzada inaparente
en una tcnica, puede dominar los resultados en otro tipo de ensayo.
AFINIDAD Y AVIDEZ
La unin del anticuerpo y del antgeno sigue los principios tennodinmicos
bsicos de una interaccin bimolecular reversible. Si [Ag] es la concentra-
cin molar de sitios de unin del Ag no ocupados, [Ac] la concentracin
molar de sitios de combinacin del anticuerpo no ocupados y [Ag - Ac] la
concentracin molar del inmunocomplejo, la constante de afinidad Ka pue-
de representarse:
Ka= [Ag-Ac]
[Ag] fAcJ
En trminos prcticos, la afinidad describe la cantidad de complejos Ag-Ac
que se encuentran en equilibrio.
El tiempo para alcanzar este equilibrio depende del ritmo de difusin de los
inmunorreactantes y de la afinidad de los anticuerpos. Los anticuerpos de
aJta afinidad unirn grandes cantidades de antgeno en un tiempo ms corto
que los anti .:uerpos de baja afinidad.
En la prctica esto significa que interacciones de alta afinidad se comple-
tan bien antes que las de baja afinidad. Los anticuerpos de alta afmidad
11 o
funcionan mejor en todas las tcnicas inmunoquimicas. Esto se debe no slo ,
a su mayor capacidad, sino a la estabilidad de los inmunocomplejos. Por
ejemplo, el tiempo medio para la disociacin de un anticuerpo de alta afini-
dad unido a un antgeno proteico pequeo es de 30 minutos o ms, mientras
que para un anticuerpo de baja afinidad este tiempo puede ser de unos
pocos minutos o aun menos.
El rango de valores de la constante de afinidad (Ka) para complejos Ag-Ac
es enorme y se extiende desde valores menores de 105 mol1 hasta vaJores
mayores de 10 1:! mo11 .
Como todas las reacciones de equilibrio, Ka se afecta por la temperatura, el
oH y el solvente. Las variaciones que se producen pueden tanto dirigir la
1eaccin hacia la unin completa o a la liberacin del antgeno unido.
Otra fo~a de medir la unin entre un antgeno y su anticuerpo especfico
es el empleo de la constante de disociacin (Kd) :
Kd = [Ag] [Ac]
[Ag -Ac ]
Para anticuerpos de alta afinidad los valores de Kd sern proporcionalmen-
te bajos, y viceversa.
Las constan.tes de afinidad o de disociacin de los anticuerpos monoclonales
pueden determinarse con exactitud, pero no as las de los anticuerpos
policlonales, porque constituyen mezdclS complejas de anticuerpos de afini-
dades diferentes.
El trmino avidez es ms descriptivo y se refiere a la estabilidad de los
complejos Ag-Ac. En cc>ntraste con la afinidad, la avidez no se define en
trminos tennodinmicos, sino por el ensayo particular empicado para me-
dir la interaccin antgeno-anticuerpo.
Los antgenos inmovilizados sobre fase slida a altas concentraciones pro-
mueven una alta avidez. Cuando un anticuerpo (o un antgeno) se une a un
antgeno (o a un anticuerpo) sobre una fase slida, la interaccin es bifsica
y dos factores , adems de la afinidad intrnseca, controlan la fuerza de la
interaccin. Estos son: la elevada concentracin local del antgeno (o del
anticuerpo) y la posibilidad de unin bivalente (Figura 23) . La unin inicial
111

del antgeno (o del anticuerpo) al antgeno (o anticuerpo) inmovilizado est
limitada por la difusin, pero despus que la primera interaccin Ac-ep1topo
ocurre, la formacin del segundo enlace puede ser una conversin
intramolecular, si es estricamente posible. Adems, la alta concentracin
local de antgeno (o de anticuerpo) incrementa la probabilidad de que cual-
quier anticuerpo (o antgeno) que se disocie se una a otro antgeno (o anti-
cuerpo) de la vecindad. En esencia. la difusin tiene lugar, pero la elevada
concentracin de antgeno (o anticuerpo) fijado a la fase slida acta como
una trampa para unir el otro mmunorreactante a la fase slida. Estos facto-
res contribuyen a una mayor avidez.
adicin de un volumen igual de SAS prec1p1ta los inmunocomplejos, mien-
tras que el Ag* libre pemianece en d sobrenadante. Los precipitados se
lavan con sulfato de amonio al 50 % para remover el Ag* libre. La propor-
cin de Ag unido a! anticuerpo y Ag* libre, previa a la adicin de la sal de
amonio, no se altera apreciablemente debido a que el SAS inhibe ("conge-
la.') la formacin y disociacin de los complejos. Finalmente se lee la radio-
actividad del precipitado en un contador de radiaciones. La cantidad de
radioactividad en el prr..cipitado es proporcional a la cantidad de Ag* unido
al anticuerpo y los resultados se expresan en trminos de la capacidad de
unir Ag/mL del antisuero.
Cuando se ensayan varios antisueros de la misma especificidad, los resulta-
dos deben calcularse para el mismo grado de exceso de antgeno. De acuerdo
con el ensayo original de Farr, una cantidad constante de Ag se adiciona a

"~et
una serie de diluciones del antisuero y la capacidad de unir Ag se determina
a cada dilucin. Asi'!lismo los resultados se expresan por la dilucin del
antisuero que une el 33 % del Ag* (Figura 24).

o o O. Resulta obvio que mientras mayor sea la dilucin del antisuero que una el
33 % del Ag, mayor ser su capacidad de unin. Esto significa que tiene una
avidez ms elevada y, es de esperar, que func_ionar mejor en los
Alto avidez Bojo av i dez
mmunoensa yos.
Figura 23 . La min bivalente a antgenos irunovihzados sobre una fase slida incrementa la Existe una variante ms simple en la que se emplea un gran exceso del Ag
avidez. marcado y una dilucin nica del antism.. .:> (Hudson and Hay, 1988).

TCNICA DE FARR PARA MEDIR LA CAPACIDAD

DE UNIN DE ANTGENO DE UN ANTISUERO
La tcnica de Farr (1958) o del sulfato de amonio es un radioinmunoensayo .g 80
(emplea Ag marcado con istopo radioactivo) y se utiliza para medir canti- -
s::
::1
dades absolutas de antgeno unido al anticuerpo. Se basa en la capacidad OV -

del anticuerpo para combinarse con el antgeno y no en efectos secundarios g

Q)
.2' '~
como la inmunoprecipitacin. Esta tcnica tiene como limitante que slo e 33 - ------------
puede utilizarse con antgenos que son solubles en soluciones de sulfato de Q) 20 - . 1
amonio saturadas al 50 % (por ejemplo, la albmina). "C '1
;!. 1
En la prctica una cantidad constante de Ag radiomarcado (Ag*) se adicio- Dilu c in de l suero
na a una serie de diluciones del antisuero, y se alcanza el punto en la zona de
exceso de antgeno en que la precipitacin espontnea de los inmunocomplejos Figura 24 . Capacidad de unir Ag de un antisuero determinada por la tcnica del sulfato de
no puede ocurrir y se establece un equilibrio Ag* + Ac .c..._ Ag* Ac . La amonio (de Farr).

112 11 3
TCNICA DE PRECIPITACI N CUANT ITATIVA
EN ME DIO LQUIDO PARA MEDIR LA CANT IDAD +++++ ..... + - -
----- - -+++
- - - - + Ac
DE ANTICUERPOS EN UN SUERO + + + + Ag

----~:~.:L"
E
e:
De Jos numerosos mtodos pa ra estimar la cantidad de anticuerpos en el oIX) ;p
suero u otros fluidos (o de antgeno). la reaccin de precip1tac1n cuantitati- C\I
va en medio lquido es uno de los ms populares . A diferencia de la rcnica o
de Farr, se basa en el efecto secundario de la inmunoprecipitac1n y pcnn1tc o Oy65
"U
en algunos sistemas, cuando se trabaja rigurosamente. una medicin exacta .....
del contenido de anticuerpos (o de antgeno) Esta tecnica fue dcsarrol lada 'O. 0,5
por Heidelberger y Kendall en 1935 y se basa en la adicin de cantidades
-
<..>

crecientes de un antgeno soluble a una serie de tubos que contienen un ....

111
Q

volumen constante de antisuero. El precipitado se obtiene por centnfugac1n, Qi

"O
se lava y se estima su contenido proteico. El p recipitado formad o se
o
incrementa hasta un mximo)' despus decrece. Las tres zonas pnnc1palcs o
de la reaccin se determ inan ensa yando ios sobrenadantes de las 100 150 200 300 400
centrifugaciones frente al ant!geno ~ al anticuerpo De este modo. c:1 lo:; g de HSA a ad i do
sobrenadantes contienen anticuerpo libre. ciaran reaccin positiva c1 wdo
se aada antgeno, y reaccionaran con el anticuerp0 s1 cont1,;nen anugc110 Figura 25 . Curva de prec1pitac1"n cuantllativa de albmina de suero hwnana (HSA ) con
libre (Figura 25). anticuerpos anti-HSA Se adicionaron cantidades incrementadas de Ag a una misma cantidad
de antisuero y Ja 00 del precipitado (disuelto t.'11 NaOH) se determin. Se ensayaron Jos
Las tres z.onas de la reaccin de prec1pitac1n son: la de exceso de anticuerpo sobrenadan tes para detectar Ja presencia de Ag o . ,c libre
o proz.ona, la de equivalencia u ptima y la de exceso de antgeno (Figura 25)
En un suero hiperinmune la mayor propon:.in de anticuerpos es de la clase
Como generalmente se precipita todo el antgeno en las dos primeras zonas,
lgG, a la que corresponde una masa molecular (MM) aproximada de 150 000 Da .
es sencillo calcular la cantidad de anticuerpo en el precipitado, restndole al
precipitado total la cantidad de antgeno aadido. Para obtener el mejor estimado de la valencia antignica se debe plotear la
La cantidad de anticuerpos en el suero se determina en el punto de equiva- relacin # de molculas de Ac/# de molculas de Ag contra la cantidad de
lencia, donde todo el Ag y el Ac han interaccionado y precipitan en forma antgeno adicionada (Figura 26). El intercepto dar la valencia mxima del
de inmunocomplejos, restndole :i la cantidad de precipitado el antgeno aa- antgeno.
dido. En este caso hay una elevada correspondencia entre la interaccin A continuacin se presenta la composicin molecular para el sistema IgG
Ag-Ac y el efecto secundario de p recipitacin. humana-anti IgG humana fabricada en conejo (Williams and Chase, 1971):
Con los valores de Ag y Ac precipitados en las zonas de exceso de anti-
Relacin molecular JgG humana-anti JgG humana
cuerpo y de equi valencia, se puede calcular la composicin moiecular de los
inmunocomplejos precipitados, empleando la fnnula : Extremo de la Zona de equivalencia
zona de exce- Ligero exceso Ligero exceso
# de molculas de Ac
= Masa de Ac . MM del Ag so de Ac de Ac de Ag
# de molculas de Ag MM del Ac Masa de Ag 7 4,5 3,5

11 4 115
 Las primeras tcnicas serolgicas se basaron en los efectos secundarios de
la interaccin Ag-Ac. Entr~ ~llas se encuentran la inmunoaglutinacin, la
inmunoprec1pitacion )' la fijacin del complemento (Tabla VIII) .
OI 5
.,o
~
Con el empleo de sustancias radioactivas y el desarrollo de los
:J
radiommunocns:Jyos (RIA) comenz una nueva era en la tecnologa serolgica:
.g 4 cl\iso <le marcadores para amplificar la seal de la interaccin Ag-Ac .
o
E De igual fom1a, el marcaje con enzimas admite la deteccin y cuantificacin
......
u de- ancigenos y anticuerpos con la utilizacin de conjugados enzimticos que
~ 3
., rmdcn, al reaccionar con su sustrato, un producto coloreado .
o
:J
u
Estos inm1moensayos con marcadores (Tabla VIII) permiten detectar y
'..! 2 estimar cantidades muy pequeas del analito (antgeno o anticuerpo que
o se anal iza). Las mediciones pueden efectuarse con gran exactitud y pre-
E
e cisin .
~g
u Las concentraciones que se utilizan 1e los inmur.orreactantes son bajas, por
..2
41 lo que el efecto secundario de la precipitaci:-i debe potenciarse conVagentes
a:
J 10 20 30 40 s'o s'o io ao 9o
O de HSA adicionada
100 precipitantes como e:poliet1lenghcol o anticuerpos anti-inmWloglobulinas .
Las rna~rotcnicas serolg1cas requieren ms de 0,5 mL de muestra; las
Figura 26. Detenninacin de la valencia antignica. En este caso cinco epi topos fueron rcco- microtcn i ca~ -que son las ms comw1es- . entre 0,5 y 0,05 mL; y las
n<>eidos por el antisucro. ultrarnicrotcmca::. requieren menos de C,05 mL . Los microensayos gastan
menos reactivos, lo que constitu) e un factor econmico importante. En los
La reaccin antgeno-anticuerpo puede tener lugar en solucin o sobre una
micro y ultramicroensayos es menester prestar especial atencin a la~ure
fase slida. En este ltimo caso es posible que se trate de las paredes pls-
za de los reactivos, incluyendo el agua, as como a I<flimpieza de la cristale-
ticas de tubos o de pozos de una placa de microtitulacin. La reaccin sobre
ra y dems accesorios.
fase slida puede resultar ms efecti va y permite detectar, por lo general,
cantidades menores de antgeno y anticuerpo que ei ensayo en solucin. La gran diversidad de tcnicas serolgicas que existen actualmente, y las
que devendrn, obliga al experimentador a hacer una seleccin racional,
TCNICAS SEROLGICAS O INMuNOENSAYOS . teniendo en cuenta los objetivos del trabajo y la disponibilidad de recursos .
Es importante sealar que a veces un simple ensayo de aglutinacin o pre-
Estas tcnicas se fundamentan en la reaccin antgeno-anticuerpo y consti- cipitacin puede brindar la informacin que se neces ita.
tuyen una parte importante de la Inmunoqumica. Tienen una gran aplica-
Es lgico que, entre varios mtodos, se elija aquel que presenta la mayor
cin en la medicina humana y veterinaria, la fitopatologa, la biologa, la
sencillez de manipulacin. El mtodo ms sencillo por lo general es el ms
bioqumica, la microbiologa y en otros campos.
rpido, no necesariamente por el tiempo total hasta la obtencin del resulta-
Los inmunoensayos permiten detectar y cuantificar antgenos y anticuerpos, do, sino por el tiempo laboral invertido en su ejecucin. Un mtodo sencillo
debiendo disponerse para ello del anticoerpo o del antgeno especfico, res- y rpido es muchas veces tambin econmico. Por lo menos lo es en cuanto
pecti vamente. al tiempo de trabajo invertido en el ensayo. A_qu hay que considerar tam-

116 117
bin los precios nacionales ~ extranjeros de reactivos y su a.;ccsib1l idad. SENSIBILIDAD, DET ECTABILIDAD, EXACTIT UD,
inversiones en eq:.iipos, su mantenimiento y amorti zacin La disponibilidad PRECISIN Y F:SPECIFIC lD -\ D
de reactivos y equipos nacionales puede ser un factor importante a la hora
de tomar decisiones . En todo esto se fundamenta la tendencia actual en el Scnsib1i1dad, lmite de detecc1on o detectabilidad, exactitud y precisin son
tcrrnmos que con frecuencia ~~utilizan indiscriminadamente y que es nece-
mundo con relacin a las llamadas tecnologas apropiadas .
sano distinguir con cland.1d p:ua poder interpretar correctamente los resul-
T ABLA VIII. Tcn icas se ro lgicas de frecuen te u til izacin tados experimentales.
en n uestro med io _ La sensibi/Idad se define por la curva dosis-respuesta (Figura 27), y se
a) BASADAS EN EFECTOS SECUNDARIOS corresponde con el cambio en la respuesta (dR) por unidad de reactante
De aglutinacin: (d<.. '), por lo que se expresa como dR..dC (no necesariamente constante) .
Esto :.1gmfka que aquel:a tecnica capaz de responder con una diferencia
Aglutinacin directa de bacterias, eritrocitos, espermatozoides u otras celulas
mayor a un~ pequea \.ariacin del reactante es la ms sensible. Corriente-
Hemaglutinacin pasiva meme cuando se hab 1a de sens1bil1dad no se refiere a esto, sino a la cantidad
Aglutinacin de partculas de ltex de poliest1reno menor de reactante qut: puede dete.;:tar la tcnica. Esta propiedad corres-
po nde a l lmite de d f! tecc1ri o d 0 1ectab ili1,.'ad. Por defini cin, la
De precipitacin:
detectabilidad de un mtodo es igual a dos .:iesviaciones estndar (2 OS),
Inm unodifusin doble o tcnica de Ouchterlony determinada OS de n:.,estras rcpetid'is. Por lo tanto, un valor igual a 2 SOS
Inmunodifusin radial es detectable, o sea. se pul"de distinguir de cero con una probabilidad del
Contrainmunoelectroforesis 95 ~o . Cuando se hab la de mejor o mayor dctectabilidad se est refiriendo a
que la tcnica es capaz de denotar cantidades menores de analito. En la
Inm unoelec troforesis
Tabla IX aparecen ios limites de deteccion de .ilgunas tcnicas serolgicas .
De neutralizacin :
Toda tcnica serologica, para un sistema experimental dado, tiene un limite
Neutralizacin de virus o toxinas de deteccin. La sensibilidad es caracterstica de tcnicas como el RIA, el
Lisis celular: ELISA o la precipitacin cuantitativa, en las que es posible medir con obje-
Fijacin del complemento tividad la reaccin antgeno-anticuerpo y, por lo tanto, dR!dC. Esto no suce-
de con tcnicas como la inmunoaglutinacin o inmunodifusin convencional,
b) QUE UTILIZAN MARCADORES
por el carcter subjetivo de la valoracin, aunque se evidencian diferencias
Marcador en la intensidad de los aglutinados y lneas de precipitado que se correspon-
Radioinmunoensayos (RIA) Istopo radioactivo den con variaciones en las concentraciones de los inmunorreactantes .
Inmunofluore scencia Fluorgeno Una cierta confusin existe con respecto a los trminos exactitud y preci-
Ensayos inmunoenzimticos sobre fase slida Enzima sin. La exactitud es el grado de correspondencia entre el valor obtenido
(ELISA) con cierto mtodo y el valor real o un valor estndar aceptado. La misma
est influida por errores sistemticos: buena exactitud significa que no hay
Ensayos inmunoenzimahistolgicos (EIH) Enzima
errores sistemticos . Estos (efectos de la conservacin de los reactivos,
Inmunomicroscopa electrnica (IME) . Compuestos electrn mala calibracin de las pipetas y otros) pueden minimizarse por evaluacin
densos
sistemtica de los reactivos, las pipetas y otros instrumentos de medicin .

118 11 9
 La exactitud depende del principio de la rc:accin y del material problema .

-
a::
_..
R1/R / 3 ,'///2
Tienen influenctas sobre ella la"espccific1dad del mtodo y reacciones o
interferencias secunda.ras sobre la reaccin indicadora. Por lo tanto, no se
puede determinar la exactitud de un mtodo para la distincin de cierta
sustancia en agua. cuando en la practica se va a dosificar en suero.
_La precisin de un mtodo se define como la dispersin de los datos obte-
o
.....
(/) nidos para una muestra procesada varias veces, y est limitada por errores
QI
::>
a.
accidentales . Estos pueden deberse a pequeas fluctuaciones en las medi-
(/)
QI
ciones, variaciones en la 'temperatura, 'composicin inica de la muestra y
a: otros; adems, pueden minimizarse con el empleo de estndares, aunque no
es posible evitarlos completamente . Los mtodos automatizados, al eliminar
:' 4 /( 5
Concentracin ( C)
e -- ---e a lgunos de estos factores , tienen generalmente mejor precisin que los m-
todos manuales.
'
En la prctica. el estudio de la precisin incluye:
Figura 27. Los concepto.;; de scn~ibilic.iud (.:R dC) y detectabihclad lmite de d.:tecc16n) se
presentan en el cuadro 1 El sistema A tiene detcctab1lidad mavor (habilidad para detectl!I
pequeas cantidades) que el sistema B, mil!Tltras que este: es ms sensible (respuesta mayor - Repetibilidad, que es la precisin en serie, o sea, ta precisin cuando se
a cambios ligeros de concentracin). Los conceptos de precisin y exactitud se ilustran en los procesan muestras iguales una tras otra en condiciones idnticas el mis-
cuidros 2-5 , en los que las lneas interrumpidas muestrar, Ja rel~ci n 1.oorica, y las lnc::iH mo da.
slidas c.on los puntos, Jos resultados expenmentales El cuadro 2 muestra mayor precisin
(desviacin estndar peque\a) pero baja exactitud:. 3. prL-cisin y exacutud altas; 4. prec.i sin
y exactitud bajas; y 5, muestra baa p1ecisin pero exactitud alta. - Reproducibilidad, que es la precisin cuando muestras iguales se proce-
san una cada da, es deci r, la pre.cisin de da a da.
TABLA IX. Lmites de deteccin para la determinacin de
antgenos y anticuerpos por 1 mL Para defin ir la precisi n, en trminos g enerales , se recomienda la
reproducibilidad; cuando no se puede determinar, se utiliza la repetibilidad.
Tcnica Limite de deteccin La reproducibilidad y la repetibihdad se determinan con DS, o mejor con ei
Inmunodifusin doble en agar coeficiente de variacin CV = DS. 100/X.
50- 100 g
(Ouchterlony)
La diferencia entre exactitud y precisin es evidente. Un mtodo puede ser
lnmunodifusin rdial < 10 g
altamente exacto pero de poca precisin, y viceversa. Los conceptos de
Contrainmunoelectroforesis < 1 g exactitud y precisin se pueden representar. segn Bttner ( 1970), en forma
Electroforesis en cohete < s g de tiros sobre un blanco (Figura 28).
Fijacin del complemento 10 ng Aquellas tcnicas, como la inmunod.ifusin radial (CV> JO%). cuyos resul-
Inmunoaglutinacin 10 ng tados presentan altas desviaciones estndar son poco precisas . Lo mismo
Ensayo inmunoenzimtico < 10 ng sucede con las tcnicas que emplean dj)uciones seriadas del reactante. El
Inmunoluorescencia < 0,0 1 pg
ttulo en funcin de la dilucin lmite en tcnicas como la inrnunoaglutinacin
y la inrnunofluorescencia, debido a la subjetividad de las determinaciones,
Radioinmunoensayo < 0,0 1 pg
puede fcilmente ser dos veces mayor o menor que el observado, siendo el
Tomado de: Behrmg Diagnostic Ma1111a/ 011 Proteinology a11d lmm1moassays. 2da edicin, ttulo preciso totalmente inexacto.
B<::hnng Diagnosti;,.s (N~w .Jcrse", 1977).
12
 Errores No hoy Accidenta les Sistemticos Casos + por El isa . 100
Detectabibdad comparada = Casos + por tcnica de referencia

Precisin
Exactitud
@@Buena
Bueno
Molo
Buena
Bueno
Malo
Especificidad comparada
=
96
100
. 100 =96 %

Casos - por El isa

= Casos _ por tcnica de referencia
. 00
1

Figura 28. ExactauJ y prec1s1n
La especificidad, otro trmino con frecuencia mal empleado, debe referir-
se al grado de discriminacin del ensayo entre muestras pos'itivas y negati-
vas .
CONFIABILIDAD DE LA TCNICA
~ menudo Ja delimitacin de antgenos o anticuerpos se utiliza como mto-
do indirecto para diagnostica:- una determinada enfermedad o reconocer
la presencia de un agente patgeno\En ese caso es imprescindible conocer
la confiabilidad o seguridad de la tcnica. Para ello se deben calcular la
detectabilidad y especificidad comparadas, tomando como referencia un
mtodo bien establecido y seguro.
Un ejemplo seria el de un ELISA para determinar la presencia de anticuerpos
en personas infectadas con el virus X, al emplear como tcnica la referen-
cia del aislamiento del virus . El estudio se realiza con 200 personas :
l 00 infectadas con el agente (casos +) y 100 supuestamente sanas en las
que no se registr la presencia del virus (casos-). En las 200 personas se
ensay la presencia de anticuerpos anti-X en el suero mediante el ELISA.
Los resultados fueron los siguientes:
98
= 100 =98%
100
En este _caso la tcnica es confiable porque tiene un alto por ciento de
detcctabilidad y especificidad (> 95 %). Es capaz de detectar el 96 % de los
casos infectados con el virus, aunque el 4 % de ellos no son registrados
(falsos negativos), posiblemente debido al lmite de deteccin del ELISA.
En cuanto a la especificidad, slo fue capaz de registrar dos casos falsa-
mente positivos .
Es posible aumentar la detectabilidad en una tcnica en detrimento de la
especificidad. modificando las condiciones experimentales. Este cambio debe
ser valorado Si se trata de un ELISA para pesquisaje de SIDA, es ms
importante no perder nmgn caso positivo. aun cuando la tcnica tenga un
menor por ciento de especificidad comparada, ya que los falsos positivos
sern esclarecidos con las pruebas confirmatorias.
PREPARACIN DE DILUCIONES DOBLES
Material
- Antisuero o solucin de antgeno

Casos+ Casos - - Salina fisiolgica u otro diluente

Resultados + 96 2 Tubos de ensayo, tubos Eppendorf o placa de microtitulacin

del ELISA - 4 98 - Pipetas bien calibradas

--
100 100

122 123
Mtodo Ley de la volumetra . V,C, = 1
v:
, donde i significa inicial y f, final ; y los

1. Calcular previamente el volumen X que se va a preparar de cada dilu- dos volmenes i-: y VI' y las concentraciones C, y C deben estar expresa-
dos en las mismas unidades. 1
cin. Este volumen debe ser, por precaucin, mayor que el que se re-
quiere para los ensayos. Mrodo
2. Aadir en cada uno de los tubos o en los pozos de la placa de 1. Determinar previamente el volumen que se va a preparar de la solucin
microtitulacin un volumen X del diluente Se requieren tantos tubos o final (V).
pozos como diluciones a preparar.
2. Calcular el volumen que se necesita de la solucin injcial <i-:> para prepa-
3. Aadir al primero de ellos un volumen X del antgeno o del anticuerpo rar V, a una concentracin determinada (C/ Despejar V, de la frmula :
que se va a diluir. Homogeneizar bien, cargando y descargando cinco
veces la pipeta. y evitar la formacin de espuma. Esta mezcla corres- V - V C
ponde a la dilucin 1/2 (o 1:2) . 1 - --

e,
4 . Pasar un volumen X de la dilucin l/2 al rubo o pozo siguiente. Homoge-
neizar bien y cuidadosamente, as como prevenir la fomiacin de espu- 3. Calcular el volumen de diluente (Vdil) que se requiere para hacer la dilu-
cin:
ma. Esta dilucin es la 1/4 .
5. Continuar en la misma forma hasta completar las diluciones requeridas vd.i = V, - i-:
(1/8 ; l / 16; 1/32 ... ). 4. Medir con exactitud el volumen de diluente, verterlo en el recipiente
6. Utilizarlas en un corto periodo De lo contrario, cubrir bien el recipiente adecuado y aadirle la cantidad previamente calculada (V) de la solu-
que las. contiene. Desecharlas una vez que hayan sido usadas . cin original. Cuando se preparan volmenes mayores, utilizar balones
aforados Homogeneizar bien y cuidadosamente.
Observacin
5. Si no se utiliza la dilucin al momento. cubrirla bien para evitar la evapo-
Recuerde que a la solucin original (sin diluir o diluida) le corresponde dilu- racin de lquido. Desecharla una vez que haya sido utilizada.
cin l/l . Para montar el ensayo puede utilizarse una misma pipeta o punta
Cuando i-: no es medfle porque es muy pequeo o no tenemos pipeta de
para todas las diluciones, si comienza por la dilucin mayor (menor concen- ese volumen :
tracin) y va progresivamente hasta la menor (mayor concentracin), des-
cargando bien la punta antes de tornar la siguiente endulzndola con la Mtodo
nueva dilucin.
1 y 2. Esto deriva del clculo anterior. Por ejemplo, ~ = 2,5 L y la pipeta de
menor capacidad disponible es de 5 L .
PREPARACIN DE DILUCIONES APLICANDO
3 . Aplicar la ley de la volumetra para cakular V,. y darle a ~ el volumen
LALEYDELAVOLUMETRA
ms pequeo que se pueda medir, en este ejemplo, 5 L . Despejar V, :
Material
Vf
ve
__ ,_,
El mismo que en el mtodo anterior, adems de probetas y balones afo- -
rados .
c.r
124 125
4. Calcular el volumen de diluente que se requiere para la dilucin
(Vd~ = V1 - V).
5. Medir exactamente el volumen de diluente, verterlo en el recipiente ade-
cuado y aadirle el V, de la solucin original. Homogene1z.ar bien y cuida-
dosamente. Si los volmenes son mayores, emplear balones aforados.

Observacin
Cuando se utiliza como expresin de la concentracin 1/2: 1/ 100: 1/6 400 .. , CAPTULO III
recuerde que a la solucin original le corresponde C, = l/l = 1. Ejemplo:
Qu volumen de antisuero (V,) se debe tomar para preparar 250 mL (V) REACCIONES Y TCNICAS
de una dilucin l/20 (C )? Clculo : V, 1 = 250 l/20 , despej ando
1
V,= 250 1/20 = 12,5 mL . Cuando V, es demasiado pequeo (menos del DE INMUNOPRECIPITACIN
l % del V), no es necesario restarle al volumen total (V) el V, para calcular
la cantidad de diluente necesaria. En se caso VcW = Vf . ""
Cuando una solucin de antgeno multivalente y soluble se mezcla con su
antisuero correspondiente. el antgeno se combina muy rpidamente con el
anticuerpo y, si las cond1c1ones son adecuadas para los inmunorreactantes,
forman agregados prec1p1tantes o floculantes . Se suele llamar a estos
antgenos prec1p11gcnns ) a los anticuerpos, prec1p1tinas. La reaccin
puede efectuarse en mecho liquido~ sem1slido (gelificado). Esta ltima se
conoce como inmunodifusin .
La inmunoprecipita~el mtodo ms simple y directo para la demostra-
cin de reaccione~n el laboratorio.

INMUNOPRECIPITACIN EN MEDIO LQUIDO

La precipitacin en medio lquido puede ser semicuantitativa o cuantitativa .
En la primera, la cantidad de precipitado fonnado dentro de capilares se

Se refiere a Ja reac.cin de tloculacin, en Ja q~ el antgeno solubley el anticuerpo prepitan

solamente en w1 rango muy estrecho de relaciones de concentracin Ag/Ac, debido a la
solubilidad de Jos complejos fonnados, tanto en exceso de Ac como en exceso de Ag. Estas
reaccion':!s se obtienen solamente con ciertos antisueros: ejemplo: antisuero de caballo
contra Ja toxina diftrica.

127
126
mide en milmetros: y en la segunda, al precipitado formado en tubos cni-
cos se le determiria la concentracin proteica por los mtodos convenciona-
les de determinacin de protenas .
Para efectuar la precipitacin cuantitativa resulta ventajoso conocer preVla-
mente la relacin aproximada anticuerpo-antgeno ptima (RO) con vista a
seleccionar el rango de cantidades de antgeno ~ convenieme. RO puede
determinarse por el mtodo de preci pitacin rpida en medio lquido, con el
ejemplo de diferentes relaciones anticuerpo/antgeno. RO corresponde a
aquella relacin donde aparezca ms rpidamente el inmunoprecipitado. Esta
relacin tambin puede determinarse por inmunodifysin semicuantitativa.
Precipitacin rpida semicuantitativa en medio lquido
para determinar RO
Material
- Antisuero
- Tubos de ensayo
- Antgeno
Gradilla
- Medidor de tiempo
- Salina tamponada en fosfato (PBS) (KHl0 4 3,63 g; NafiP0 4 l2 H,0
14,3 g; NaCl 50 g, para l L de 8i0 destilada. (Diluir l/10 para utilizar.)
Mtodo
l . Adicionar a una serie de nueve tubos las siguientes cantidades de
antgenos: O; 20; 50; l 00; 150; 200; 250; 350 y 450 g .
2. Aadir PBS a cada tubo hasta un volumen de 0,45 mL .
3. Adicionar O, l mL del antisuero ( sin diluir) al primer tubo, mezclar inme-
diatamente y medir el tiempo que demora en aparecer el precipitado.
Proceder de la misma forma con cada tubo. Determinar RO, que co-
rresponde al tubo donde aparezca ms rpido el inmunoprecipitado.
4. Si es necesario, incubar primero 30 minutos a 37 C y despus 30 minu-
tos a 4 C. Centrifugar a 2 500 rpm durante media hora. Observar el
128
precipitado El mximo de precipitado se encuentra en el tubo con la
relacin anticuerpo/antgeno ptima.
5. Conociendo RO preparar el rango de antgeno para la precipitacin cuanti-
tativa, de la siguiente forma: cuatro tubos que contengan el 20; 40; 60 y
80 % de la cantidad equivalente de antgeno (zona de exceso de anticuer-
po); un tubo para la equivalencia (RO), y tres tubos que contengan respec-
tivamente l ,5 ; 2,0 y 2,5 veces la cantidad equivalente de antgeno (zona de
exceso de antgeno). Debe prepararse un tubo que slo contenga tampn
(sin Ag), el cual siga todo el experimento (el blanco). Puede utilizarse un
segund0 control con antgeno y suero normal (Williams and Chase, 1971).
Observacin
Puede prepararse, en vez de un solo tubo para la equivalencia, dos o tres
tubos que contengan rangos estrechos de antgeno alrededor de la cantidad
equivalente de Ag, para hacer ms exacta la medicin del contenido de
anticuerpos en el inmunosuero. El rango de antgeno variar de acuerdo con
el contenido de anticuerpos en el antisuero.
Precipitacin cuantitativa en medio lquido (Hudson and Hay, 1980)
Materia/
- Antisuero, en este caso, anti-albmina de suero humano
- Albmina de suero humano (HSA) 1 mg/mL
- Salina tamponada con fgsfato (PBS) (la misma que en la tcnica anterior)
- Hidrxido de sodio O, l m@l/L
- Tubos adecuados para centrifugacin, preferiblemente cnicos, en este
caso, con capacidad para 3 mL
- Pipetas
- Agitador mecnico
- Incubadora
- Centrfuga refrigerada con rotor de ngulo mvil
- Espectrofotmetro
129

Mtodo
l. Se determin previamente la relacin Ac/Ag ptima (RO) y se selec-
cion el rango conveniente de Ag.-
' Observacin
2. Adicionar a una serie de tubos los siguientes microgramos de antgeno
O; 10; 20; 50; 100; 150; 200 ; 250~ 350 y 450.
3. Aadir PBS a cada tubo hasta un volumen de 0.45 mL .
4 . Adicionar O, 1 mL del anti suero (sin dilu ir) a cada tubo y mezclar los
reactantes con un agitador mecnico.
5 . Incubar a 37 C durante 1 hora o a 4 C toda la noche. En la investiga-
cin estas incubaciones pueden e~tenderse hasta 1O das a 4 C, pero en
las prcticas docentes es posible obtener buenos resultados con 30 mi-
nutos de incubacin a 3 7 C y 30 minutos a 4 C.
6 . Centrifugar a 2 500 rpm durante 30 minutos. remover y conservar los
sobrenadantes. Debe emplearse un rotor de ngulo libre para que el
precipitado se fonne al costado del tubo. Drenar los precipitados duran-
te 2 minutos.
7 . Ensayar cada sobrenadante para determinar antgeno o anticuerpo li-
bre. Puede.utilizarse Ja inmunodifusin radial simple.
8. Lavar el precipitado dos veces por centrifugacin con PBS fro . Para
ello aadirle 0,2 mL de PBS y resuspenderlo con agitacin mecnica.
despus verter 0,8 mL del diluente frio por las paredes del tubo y volver
a agitar. Centrifugar 15 minutos.
9 . Redisolver el precipitado con hidrxido de sodio 0.1 mol/L (el volumen
depende de las cubetas disponibles para leer en el espectrofotmetro) .
JO. Leer la extincin a 280 nm y plotear un grfico de DO del
inmunoprecipitado contra la cantidad de antgeno adicionada.
11 . Calcular el contenido de anticuerpos por mililitro de suero conociendo
que:
la DO a 280 nm de una solucin de IgG de 1 mg/mL = 1,439
la DO a 280 nm de una solucin de HSA de 1 mg/mL = 0.530
130
12. Calcular el nmero de determinantes ant1gnicos disponibles sobre cada
molcula de HSA (valencia antignica), si sabemos que la masa molecular
de la IgG es 150 000 Da y la de Ja HSA, 68 000 Da .
El contenido proteico del inmunoprecipitado puede estimarse por otras
tcnicas, como el mtodo de Lowry o el de Kjeldahl .
INMUNODIFUSIN (Ouchterlony y Nilsson, 1973)
La difusin de un soluto en medio lquido es un proceso en el cual la sustan-
cia es transportada de una parte a otra del fluido como resultado del movi -
miento catico de las molculas, con una tendencia a igualar la concentra-
cin del soluto en el medio. ~ :- ~ :
La velocidad de migracin de Ja sustancia es proporcional al gradiente de
concentracin por el coeficiente de difusin de la sustancia, de acuerdo con
la ley de Fick:
. dQ!dt = - DA dC/dx
donde Q es la cantidad de sustancia que difunde a travs del rea A en un
tiempo t; D es el coeficiente de difusin, que depende del tamao de la
molcula; y dC!dx es el gradiente de concentracin.
Debe tenerse en cuenta las siguientes caractersticas del proceso de difu-
sin: 1) Un incremento de la concentracin inicial de la sustancia que difun-
de tiende a incrementar el ritmo de difusin. 2) Un aumento de la tempera-
tura incrementa el valor de D. 3) D varia inversamente con la raz cbica
del volumen de la molcula en solucin. 4) La distancia recorrida por cual-
quier cantidad de soluto varia directamente con la raz cuadrada del tiempo
de difusin.
En la difusin en medio fluido a menudo es dificil evitar disturbios inducidos
por corrientes mecnicas y .trmicas . Una fonna de resolver esta dificultad
es emplear un medio gelificado, por ejemplo, gel de agar o gelatina. El gel
forma una estructura parecida a una red que estabiliza el lquido por largos
perodos y previene las corrientes convectivas . Si el tamao de los poros de
la red es mucho mayor que el de las partculas de la sustancia que _9.ifunde..y.. . ._
, \ tl\D Df ,..
'-~s . i ti!'.. . -< ;
131 : ~ ':. '-'</~;.~
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13Bt!3L/oii'.~- ~g
~ \ . -~-~:~~;!) '
~6'"/ . -&-~ "/
no hay reaccin quimica o fisica con el agente gclificante, puede asumirse
que se cumple la ley de la difusin libre. Se ha observado que, si la concen-
tracin del agente gelificante es suficientemente baja, el ritmo de difusin
para muchas sustancias de pequeo tamao es muy similar en un fluido y en
el correspondiente medio gelificado. Sin embargo, la difusin de molculas
mayores puede ser impedida o retardada si la concentracin del agente
gelificante es muy elevada. Por ejemplo, el dimetro promedio del poro de
un gel de agar al 2 % ha sido estimado alrededor de 3 m .
En la prctica serolgica se utiliz.a gel de agar* o de agarc>Sa al 0,3-1 ,5 % que
permite la migracin libre de la mayora de los inmunorreactantes (antgenos y
anticuerpos). La formacin de gradientes de concentracin admite el estable-
cimiento de zonas ms o menos estrechas en el medio donde la relacin de
reactantes es favorable para la precipitacin; fuera de ellas la agregacin no
tiene lugar debido al exceso o carencia de reactante. Cuando se fonnan los
inmunoprecipitados en un gel de agar a las concentraciones antes menciona-
das, el tamao de los agregados rpidamente excede el dimetro de los poros,
lo que impide su difusin, y aparece una lnea opaca visible de color blanco
correspondiente al inmunoprecipitado. Si el material de ensayo contiene dos o
ms sistemas precipitantes, se induce la formacin de un espectro de lneas de
precipitado donde cada una corresponde a un par antgeno-anticuerpo. Sin
embargo, no siempre pueden evidenciarse todos los sistemas Ag-Ac cuando
se trabaja con mezcla5 complejas, y es por esto que se habla del nmero
mnimo de pares Ag-Ac . Variando las concentraciones de los
inmunorreactantes, es posible visualizar algunos de esos sistemas.
Por lo general se trabaja la inmunodifusincon una capade agarde 1,5-2,0 mm
de espesor. Para calcular la cantidad de agar necesaria slo se necesita
conocer el rea de la lmina o caja que servir de soporte al gel y aplicar la
frmula:
Para un espesor de 1,5 mm
X mL de agar = 1,5 rea de la lmina
El agar est compuesto de dos polisacridos: agarosa y agaropectina. Los grupos sulfato y
carboxilo del agar nativo estn acumulados en la porcin de agaropectina, mit:ntras que Ja
agarosa es un polisacrido neutro. La agarosa muestra escasa propiedad electrrendoosmtica
y posee una baja capacidad de absorcin para sustancias bsicas, lo que la hace el medio de
seleccin para trabajos de electroforesis e inmunodifusin.
132
Para un espesor de 2,0 mm
X mL de agar = 2,0 rea de la lmina
Para aumentar la adhesin del agar se aplica a la lmina una fina capa de
agar y se seca a 80 "C en una estufa antes del recubrimiento.
Las reacciones serolgicas en med io gelificado o reacciones de
inmunodifusin, pueden clasificarse como simples o dobles. En la inmunodi-
fimn simple se establece un solo gradiente de concentracin para uno de
los inmunorreactantes, mientras el otro permanece fijo. El medio de difusin
lo contiene a una concentracin relativamente baja; mientras el correspon- llr
diente reacrante, a una concentracin mayor, difunde de una fuente externa
(pozo cortado en el gel) a travs del medio semislido. En la inmunodifasin
dob le se establecen gradientes de concentracin para los dos
inmunorreactantes. El antgeno y el anticuerpo difunden libremente el uno
hacia el otro desde fuentes externas y separadas (pozos separados) en un
gel serolgicamente neutro.
Los mtodos simples y dobles pueden estar adems caracterizados por la
dimensin empleada. Existen tcnicas unidimensionales (inmunodifusin en
tubos) y bidimensional (difusin radial, en placas). Otras tcnicas ms com-
plejas, como aquellas en que interaccionan varios sistemas de precipitacin,
reciben el nombre de sistemas combinados.
Aunque la formacinde complejos Ag-Ac en un medio semislido depende
de la presencia de electrlitos en el medio, del pH y de la temperatura, el
factor ms importante de la reaccin son las concentraciones relativas de
antgeno y anticuerpo. Los fenmenos de zona a menudo nos conducen a
interpretaciones errneas de los resultados .
Ajustando cuidadosamente las concentraciones de antgeno y anticuerpo,
las tcnicas de inmunodifusin pueden brindar informacin acerca de las
relaciones entre los antgenos, la complejidad de los sistemas antignicos, la
especificidad de los anticuerpos y las concentraciones de los
inmunorreactantes, entre otras .
Existen numerosas variantes de las tcnicas de inmunodifusin. En esta
obra se explican la inmunodifusin radial, algunas variantes de la inmunodi-
fusin doble, la inmunoelectroforesis, la contrainmunoelectroforesis y la
inmunoelectroforesis en cohete. Por la aplicacin prctica en este campo
133
de trabajo se presenta, adems, la electroforesis de zona de protenas
sricas .
Inmunodifusin radial simple o cuantitativa (mtodo de Mancini)
En 1965 Mancini introdujo esta tcnica al emplear la irununodifusin simple
para la determinacin cuantitativa exacta de antgenos mediante la incorpo-
racin de anticuerpos especficos en el agar. La inmunodifusin radial (IDR)
est basada en el principio de que existe una relacin cuantitativa entre la
cantidad de antgeno colocada en un pozo horadado en la placa de agar-
anticuerpo y el anillo de precipitado resultante (Figura 29).
El antgeno a cuantificar y varias diluciones del antgeno estndar (o mejor
varios estndares) son colocados en pozos sucesivos . El antgeno difunde a
partir del pozo, formando un gradiente de concentracin. Al comienzo est
presente en una concentracin relati van1ente alta y crea complejos solu-
bles; onforme el antgeno difunda ms, la concentracin va disminuyendo
de forma continua hasta que se alcanza un punto en el que los
inmunorreactantes estn prximos a sus concentraciones ptimas y se pro-
duce un anillo de precipitado (Figura 29) .
~~
~Jlg ~ qj
Figura 29. Inmunodifusin radial. A, el agar contiene el ~c y los pozos se llenan con una
cantidad exacta de Ag (E). B , el Ag difunde. C, se forma el anillo de precipitado. D , por
dilucin seriada del Ag estndar se forman anillos de tamao decreciente.
Segn el mtodo originalmente descrito por Mancini. el rea circunscripta
por el anillo de precipitado es proporcional a la concentracin de antgeno.
Este mtodo requiere que los anillos alcancen el mayor tamao posible, lo
134
que a menudo require 48-72 horas de difusin . De modo alterno el mtodo
de Fahey permite la medicin de los anillos antes del desarrollo completo
(menos de 24 horas) . En esta modificacin el logaritmo de la concentracin
del antgeno es proporcional al dimetro del anillo.
Con los dimetros correspondientes a los estndares de concentracin co-
nc>eida se traza la curva patrn que sirve para determinar la concentracin
del antgeno (Figura 30).
o
'O
.,,o...a
:::> 111
c.> o
y.~
o=
o'c
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eo111
Q)
o-
o
- Q>
"O L.-----.___d___
e del Ag est ndar
Figura 30. Inmunodifusin radial. Curva de calibracin.
La aplicacin clnica ms importante de la IDR es la cuantificacin de
protenas sricas, por ejemplo, inmunoglobulinas, componentes del comple-
mento y albmina. En el caso de las inmunoglobulinas, anticuerpos dirigidos
slo contra los determinantes isotipicos Fe o de la cadena pesada (P) de la
molcula de inmunoglobulina, deben utiliz.arse, ya que los determinantes
isotipicos de las cadenas ligeras (L) se comparten entre todas las clases de
Ig. Debido a las concentraciones relativamente bajas de IgD e IgE en el
suero humano, esta tcnica se emplea para determinar las tres clases abun-
dantes : IgG, IgA e IgM (Tabla X). No obstante, disminuyendo la cantidad
de anticuerpos en el agar se puede incrementar I~ detectabilidad de la tcni-
ca, por lo que es posible detectar menos de l O g de antgeno por mililitro, lo
cual permite determinar valores reducidos de inmunoglobulinas sricas (IgG,
IgA, IgM e IgD) y de otras protenas . Sin embargo, con diluciones demasia-
do altas no es factible la formacin de los inmunocomplejos precipitantes .
La IDR puede emplearse tambin para la estimacin de anticuerpos, mez-
clando el antgeno correspondiente con el agar.
Uno de los factores que ms afecta la interpretacin de los resultados en la
IDR es la presencia de protenas disociadas o polimerizadas . En algunos
135
casos es posible minimizarlo utilizando muestras frescas o convenientemen- - Controles de calidad. - Erlenmeyer Pyrex
te conservadas .
- Perforador
- Bao de agua
TABLA X. Valores nonnaJes de las inmunoglobulinas G, M y A - Azida sdica al 1O %
en el suero (mg/mL) (Biopreparados, Cuba) - Aguja
- Salina fisiolgica pH 7,2 - Papel milimctrado
Edad IgG IgM lgA - Regla para IDR o pie de rey - Mechero
Recin nacidos 8,30-12.30 0,05-0.15 0.00-0.05
- Lminas de vidrio o cajas plsticas de fondo plano - Probeta
1-3 meses 3,10- 5,50 - 0,19-0,41 0.08-0,3 4
Supt:rficie horizontal (comprobada con nivel - Termmetro
4-6 meses 2,45- 6.15 0,26-0,60 0,10-0Ati de burbuja)
7-12 meses 4,40- 8,80 0.13-0.55 0.19-0.55 - Agitador de vidno
13-24 meses 5,50- 9,70 0.35-0,81 U.l -U. 74
Mtodo ,
25-36 meses 7,05-10,75 0,42-0,80 0,34-1.08
3-5 .aos 7,00-11.60 0.38-0.74 0.70-1 ,20 1. Calcular el volumen de agar necesario empleando la frmula : 0 ,2 x rea
de la lmina. Preparar una solucin de agar al l % en SF pH 7,2 . Calen-
6-8 aos 6,70-11 ,80 0,40-0,90 0.80-1.70
tar con cuidado hasta que se lice perfectamente el agar (se observa el
9-11 aos 8,90-13 ,80 0.-'7-1 ,13 0,70-1.90 lquido transparente y claro). Aadir azida sdica al 10 % hasta una
12-16 aos 8,20-10,70 0.40-0.RO 1,00-2.00 concentracin final de 0, 1 % -(l mL por cada 100 mL de agar).
Adultos 8,55-14.65 0.75-1 ,25 1,40-2.60 2. Poner el agar licuado medido en el bao de agua a 56 C y mantenerlo en
agitacin el tiempo suficiente (aproximadamente 30 minutos) . Compro-
Esta tcnica no es muy precisa, ya que las desviaciones estndar (DS) son bar que su temperatura es 56 C . Adicionarle entonces la cantidad con-
relativamente altas, y operan,por lo general, con coeficientes de variacin veniente del antisuero (recomendada por el fabricante en el prospecto) .
(CV=DS/X IOO)mayoresdel 10%. Mezclar con la varilla cuidadosamente 2-3 minutos para que los
Los controles de calidad son imprescindibles y tanto ellos como las mues- anticuerpos se distribuyan con uniformidad en el agar. Pueden practicarse
tras y los estndares deben aplicarse por duplicado o triplicado. Las pipetas otros mtodos para homogeneizar la mezcla.
que se utilizan en el llenado de los pozos deben estar bien calibradas, pues
3 _ Colocar las lminas o cajas bien limpias. desgrasadas con alcohol y se-
una importante fuente de error es la no uniformidad en el llenado de los
cas sobre una superficie perfectamente horizontal para que el grosor de
pozos . Las mediciones deben hacerse con reglas especiales o pie de rey. la capa sea homogneo.
Material 4 . Aadir con una pipeta de punta ancha la cantidad de agar necesaria.
- Sueros problemas - Pipetas automticas Poner la pipeta en el centro de la lmina en posicin vertical, contactando
la punta ligeramente con ella _ Verter de forma ininterrumpida el volu-
- Anticuerpos monoespecficos - Cmara hmeda
men requerido. Dejar solidificar el agar a temperatura ambiente unos
- Estndares de C conocida ...: Plantilla para los pozos minutos.

136 137
 5. Colocar la lmina en la cmara hmeda. Si es una caja redonda, colocar
en el interior de la tapa un papel de filtro hmedo. Guardar en fro al
menos 2 horas.
6. Preparar los estndares, las mueStras y los controles de calidad. Esta
preparacin puede consistir en hacer diluciones del estndar o de las
muestras, en este ltimo caso cuando se presume que su contenido de
~-:;! ~,.-.{~
~ tgeno es superior al estndar de mayor concentracin. Emplear SF.
,;" "' \ . U,; '-V
0> ......7. ~ momento de montar el experimento hacer las perforaciones en el
~ :;\:\~ gel ycolocar la placa sobre la plantilla. Introducir el perforador vertical-
./~:., mente de una sola vez hasta el fondo, retirarlo y remover el cilindro de
~'~ .. . ,,--agar con la punta de una aguja, sin romper los bordes del pocillo.
' '-'l./n ~
8. Llenar cuidadosamente los pozos con una pipeta bien calibrada (usual-
mente 5 o 1OL) , asegurando que todos se llenen con el mismo volumen
de inmunorreactante sin que se desborde el lquido. Ponerlos todos por
duplicado en posiciones diferentes de la placa. Se recomienda hacer un
pozo control llenndolo con SF. Anotar la disposicin de los reactantes
en la placa.
9. Poner la lmina dentro de la cmara hmeda y asegurar que esta quede
en posicin horizontal durante 24- 72 horas a temperatura ambiente. En
el caso de las placas es ms convenieme ret.irarles el papel hmedo de
la tapa y ponerlas sobre un recipiente con agua (cuidar que no les entre
lquido).
10. Medir con el mayor rigor posible los dimetros de los halos de precipita-
do y promediarlos (si se mont el experimento por duplicado).
11 . Si la medicin se efecta a las 24 horas o en un tiempo menor, trazar el
grfico dimetro al cuadrado (d") contra log 10 de la concentracin de
los estndares . Si se efecta a las 72 horas (tamao mxuno de los
halos), traz.arlo contra la concentracin de los estndares . Interpolar en
esa curva el d 2 de los controles de calidad y de las muestras para calcu-
lar su concentracin.
Observacin
Vigile el agar mientras se funde para evitar su derramamiento. Para que no
se desborden los pozos espere unos segundos hasta que descienda el nivel
138
de la columna de lquido y entonces complete el volumen requerido. Si es
necesario haga una marca a la placa para reconocer la disposicin de los
reactantes Se puede hacer un pequeo corte en el agar en el extremo
superior derecho de la placa. Es importante tener en cuenta que la curva de
calibracin NO parte del origen (Figura 30). La concentracin de los con-
troles de calidad no debe variar con respecto a la reportada por el fabricante
en un 10 % .
Jnmunodifusin doble bidimensional o tcnica de Ouchterlony
En la inmunodifusin doble (IDD) bidimensional el antgeno y el anticuerpo,
depositados en pocillos separados, difunden el uno hacia el otro y precipitan,
formando una lnea opaca de color blanco en la regin donde se encuentran
en concentraciones equivalentes . . Una preparacin que contenga varios
antgenos dar lugar a mltiples lineas de precipitado.
Cuando el anticuerpo y el antgeno difunden en forma radial se forma un
arco que se aproxima a la lnea recta . Los tipos de patrones producidos en
una difusitfdobl~uestran en la Figu ra 31 .
-.
Una de las aplicaciones ms tiles de la tcnica de Ouchterlony es el estu-
dio de identidad entre dos ru;igenos . Para ello ambos antgenos. (Agl y Ag2
o Agl y Ag3) se colocan en pozos adyacentes y los Ac (aAgl y aAg2) en
un tercer pozo equidistante y situado por debajo de los dos primeros. Cada
reaccin antgeno-anticuerpo forma su propia lnea de precipitado entre los
pozos . Como se muestra en la Figura 32, esta podr extenderse a una mis-
ma distancia a ambos lados de los pozos . Esto se refiere a sistemas combi-
nados y los patrones que se describirn corresponden, adems, a sistemas
balanceados .
La comparacin est principalmente basada en el registro de la presencia o
ausencia de interaccin entre las dos lneas de precipitado. Este fenmeno
puede caracterizarse por desviacin, fusin o inhibicin de las lneas de pre-
cipitado (Figura 32).
Tres tipos principales de reaccin pueden ser diferenciados:
Tipo l. Las lneas de precipitado de cada lado se desvan y fusionan comple-
tamente en el rea central. Por tratarse de un sistema halanceado, el arco
formado por las dos lneas fusionadas es simtrico. La reaccin indica la.
139
presencia de determinantes antignicos idnticos en los reactantes compa-
rados . La reaccin de identidad entre un patrn y una proteina purificada es
una forma de identificar esa proteina . Se debe sealar que las lneas
confluyentes indican identidad inmunoqumica en trnunos del antisuero uti-
lizado y no identidad molecular. Por ejemplo, anticuerpos purificados contra
el hapteno dinitrobenceno dan una lnea de confluencia cuando se enfren-
tan, en la forma descrita, a los conjugados dinitrobencen~voalbmina y
dinitrobenceno-albmina de suero bovina.
e G
2
G 8
3
e e
Figura 31 . Patrones de reaccin en la irununodifusin doble. 1, el Ag y el Ac reaccionan en
forma equidistante y gran intensidad (equivalencia). 2. el antgeno est presente en concentra-
cin reducida o no ha difundido con tanta rapidez debido a su mayor tarnax1o. por lo que se
fonna una lnea de precipitado ms cercana al pozo con el antgeno. La lnea estara ms
cercana al pozo del anticuerpo si este est a menor concentracin o tiene masa molecular
mayor que el Ag. 3, existe ms de un sistema de reaccin Ag-Ac. Si se estuviera investigando
la pureza de un Ag, este patrn implica que tiene un contaminante o impureza.
140
l II 111
e 8
fe'\
~
~ 8
Figura 32 . Relaciones de identidad entre dos antgenos investigadas por inmunodifusin
doble <Ouchterlony).
l. Reaccii de identidad.
Il. Reaccin de no identidad.
111 Reacx:in de identidad parcial.
Tipo J/. La ausencia de interferencia es lo ms evidente cuando las dos
lneas de precipitado se cortan extendindose ms all del rea central don-
de ocurre el cruzamiento. Este patrn de reaccin indica que no hay rela- .
cin inmunoqumica entre ambos antigenos.
Tipo 111. Muy similar al tipo 1 con la excepcin de que la fusin de las lneas
es incompleta, por lo cual se forma un saliente o espoln sobre el arco de
interferencia. Esta reaccin indica una relacin inmunoqumica pero no iden-
tidad de los antgenos comparados, aunque a veces se le denomina identi-
dacI parcial. Este es el caso de los antgenos que presentan epitopos comu-
nes . Mientras menos relacionados estn los antgenos, el espoln es ms
pronunciado y muestra menos desviacin . Cuando dos sistemas heterlogos
son comparados por medio del mismo antisuero, el espoln se extiende
hacia la fuente del antgeno menos relacionado con el anticuerpo.
Variaciones de estos tipos de patrones pueden observarse en sistemas no
balanceados (Ouchterlony y Nilsson. 197'3). Cuando la concentracin de
uno de los inmunorreactantes comparados est por debajo del valor umbral
para la formacin de un precipitado visible, su presencia puede revelarse
por la desviacin inducida en el patrn del lado opuesto. Sistemas altamente
desbalanceados no slo inducen bandas migratorias (mviles), sino que cau-
san, con eventualidad, duplicacin de lneas y la formacin de falsos espalo-.
141
 )

nes . Tales espolones se van disolviendo gradualmente, mientras que los ver-
daderos ganan en longitud con el tiempo.
6,4 3,2 1,6 o,a 0,4 0,2 O;I mg/mL
La inmunodifusin doble bidimensional tambin puede empicarse para
scmicuantificar antgenos y antcuerpos . Este ensayo se efecta colocando .i:;
~
O O O o O O O .
el antgeno en un pozo central (por lo general a 0.1 mg/mL) rodeado
circunferencialmente por pozos que contienen diferentes diluciones del
C\I
O O O O O
antisuero . Esta forma es muy til para titular anticuerpos . De modo alterna- 5 L o n ti - H SA
tivo puede efectuarse con el antisuero en el pozo central y diluciones del
antgeno a su alrededor para medir de una manera burda la concentracin .i:;

C\I
del antgeno (Figura 33). ,.....

@ (0 Figura 31 . Titulacin de Ac mediante el mtodo de anchura y movilidad de la banda de

@~
precipitado.

@\@
@ @ La IDO semicuantitativa, efectuada previamente a la precipitacin cuanti-
tativa en medio lquido, permite establecer el intervalo de concentraciones

9@ @Q
~
de antgeno adecuado para dctem1inar con exactitud el punto de equivalen-
cia y consecuentemente el contenido de anticuerpos en el suero.
La Figura 35 ilustra un mtodo basado en el principio de que la posicin de
Figura 33 . Semicuantificacin de Ag y Ac por IDD. El Ag o el Ac se diluyen y se colocan en
la lnea de precipitado en la equivalencia est determinada por los ritmos de
pozos que rodean al pozo central.
difusin relativos del antgeno y, el anticuerpo . La posicin puede determi-
La titulacin de anticuerpos tambin puede llevarse a cabo por el mtodo de narse sobre una base emprica para cualquier antgeno soluble. La IgG hu-
la anchura y movilidad de la banda de precipitado, utiliz.ando antgeno de mana y anticuerpos contra ella obtenidos en conejo se empican para ilustrar
concentracin conocida. Este mtodo (Williarns and Chase. l 971) se funda- el mtodo.
menta en que, en la equivalencia, la lnea de precipitado es aguda, estrecha
y estacionaria. El principal requerimiento es que todos los pozos reciban la
misma cantidad de lquido una vez que hayan sido preparadas cuidadosa-
mente las diluciones del antgeno (Figura 34).
A las 24 horas el estimado de la equivalencia en la Figura 34 parece ser
ligeramente menor que 0,8 mg de HSA/mL de antisuero. A las 72 horas, sin
--
JO
~)
.~
5
o.
.
~ ...
o. -
-- .
() o
-o

embargo, la reaccin parece ocurrir entre 0,8 y 0,4 mg/mL; est claro que
0,8 mg corresponde a un ligero exceso de antgeno y 0,4, de anticuerpo. El
o O o o
verdadero punto de equivalencia de este sistema se determin a 0,55 mg/mL I OL anti-lgG
por la tcnica de precipitacin cuantitativa en medio lquido descrita con
Figura 35 . Titulacin de un anti suero co1;tra la igG htunana por el mc::todo de la posicin de Ja
anterioridad.
handa. En la equivalencia el precipitado es equidistante a los dos pozos.
142
143
Debido a que puede asumirse que la lgG humana y el anticuerpo lgG de
conejo tienen el mismo coeficiente de difusin en el agar, el precipitado en la
equivalencia, adems de irunvil y agudo, debe aparecer equidistante entre
los dos pozos. Ya que slo se considera la posicin de los precipitados
tempranos, la reaccin puede acelerarse incubando la placa a 37 C . De
esta forma los resultados se obtienen en poco tiempo (aproximadamente
6 horas) y no se requiere empleo de preservativo.
Asumiendo que hay aproximadamente. cuatro molculas de anti-IgG hu-
mana por molcula de lgG humana en la equivalencia (Williams and Chase,
1971) y considerando que las masas moleculares del antgeno (lgG huma-
na) y del anticuerpo (lgG de conejo) son similares, se puede obtener de
fonna rpida un estimado de la concentracin de anticuerpos en el suero.
En este ejemplo (Figura 35), al considerar la equivalencia en 5 mg de lgG/mL,
la concentracin aproximada de anti-lgG es de (5 x 4) 20 mg/mL de
suero .
Material
- Antisuero(s) - Pipetas
- Agar purificado o agarosa
- Antgeno(s)
- Azida sdica al l O % - Salina fisiolgica pH 7,2
- Plantilla para los pozos - Superficie horizontal
- Lminas de vidrio o portaobjetos - Perforador
- Erlenmeyer Pyrex - Aguja
- Cmara hmeda (caja de petri con papel de filtro hmedo en el fondo)
Mtodo
l . Calcular el volumen de agar necesario empleando la fnnula : 0,2 x rea
de la lmina o portaobjetos . Preparar una solucin de agar al l % en SF
pH 7,2 . Calentarla con cuidado hasta que se lice perfectamente el agar
(se observa el lquido transparente y claro) . Aadir azida sdica al 10 %
hasta una concentracin final de O, l % ( l mL por cada l 00 mL de agar) .
2. Colocar las lminas o portaobjetosbien limpios, desgrasados con alcohol
y secos sobre una superficie horizontal.
144
3. Aadir con una pipeta de punta ancha la cantidad de agar necesaria.
Poner la pipeta en el centro de la lmina o portaobjetos en posicin ver-
tical, haciendo contactar la punta ligeramente con ella. Verter ininte-
rrumpidamente el volumen requerido. Dejar solidificar el agar unos mi-
nutos a temperatura ambiente.
4. Colocar las lminas en cmara hmeda y ponerlas en fro al menos
2 horas.
5. Preparar los reactantes que se vertern en los pozos de la lmina. Hacer
las diluciones requeridas con SF.
6. En el momento de montar el experimento hacer las perforaciones en el
gel utilizando el perforador, colocando la lmina sobre la plantilla. Intro-
ducir el perforador verticalmente de una sola vez hasta el fondo, retirarlo
y remover el cilindro de agar con la punta de una aguja sin romper los
bordes del pocillo.
7. Llenar cuidadosamente los pozos con pipeta Pasteur, capilar o pipeta
automtica (usualmente alrededor de 10 L) , asegurando que todos se
llenen con el mismo volumen y que no se desborden los pozos. Se reco-
mienda hacer un pozo control con SF. Anotar la disposicin de los
reactantes en la lmina.
8 . Poner la lmina en cmara hmeda a temperatura ambiente du-
rante 24-48 horas.
9. Observar los resultados y anotarlos cuidadosamente.
Observacin
Es recomendable acondicionar las lminas o portaobjetos cubrindolas pre-
viamente con una fina capa de agar y cuando est bien seca aadirles el
volumen requerido de agar para hacer la capa. El agar fundido sobrante
puede guardarse dentro del erlenmeyer bien tapado en fro durante varias
semanas. Las lminas ya recubiertas es posible conservarlas tambin du-
rante ese tiempo, siempre que se mantenga la humedad dentro de la cma-
ra. Es conveniente hacer alguna marca o indicacin en la lmina para reco-
nocer la disposicin de los reactantes. Puede hacerse un pequeo corte en
el agar en el extremo superior derecho de la placa. La reaccin se acelera
notablemente (6- 10 horas suele ser suficiente) incubando la lmina a 37 C .
145
El mtodo aqu descrito es bsico para todas las variantes de inmunodifusin
bidimensional y para las inmunodifusiones en general .
ELECTROFORESIS
La electroforesis es la migracin de partculas cargadas bajo la influencia
de un campo elctrico. Entre los factores que gobiernan la migracin se
encuentran la densidad de carga, el pH del solvente, la fuerza inica y el
carcter e intensidad del campo elctrico. Tambin influyen el tamao y la
forma de las partculas, la temperatura, las propiedades de adsorcin del
medio soporte y la electroendosmosis. Las diferencias en el ritmo de mi-
gracin de los componentes de una mezcla (ejemplo, suero sanguneo) con-
ducen a su separacin.
Por ello, el anlisis de la heterogeneidad de las protenas individuales se
lleva a cabo frecuentemente por electroforesis . La separacin de protenas
en un campo elctrico fue perfeccionada en 1937 por Tiselius, quien emple
la electroforesis libre o de frente mvil. No obstante, debido a la relativa
complejidad de este mtodo, la electroforesis de zona en un medio estabili-
zador como el papel o el acetato de celulosa ha remplazado a la electroforesis
libre (Stites et al., 1985).
Electroforesis de zona de las protenas del suero sanguneo humano
Las protenas se separan en la electroforesis de rona casi exclusivamente
por su carga superficial . El medio soporte es, en teora, inerte y no impide ni
estimula el flujo de las molculas en e! campo elctrico. Por lo general, se
emplean tiras de papel o de acetato de celulosa como soporte. Una ventaja
que ofrece el acetato de celulosa es la rapidez con que se logra la migracin
electrofortica (30-60 minutos). Sobre l pueden aplicarse microcantidades
de protena, se adapta bien a los procedimientos de tincin y puede transpa-
rentarse, lo que facilita el anlisis de los resultados . Por todas estas razones
el acetato de celulosa se emplea comnmente como medio de sostn en la
electroforesis de zona (Stites et al. , 1985).
En la tcnica electrofortica las muestras de suero o de otro lquido biolgi-
co se colocan en el origen y se separan sometiendo la tira a un campo
elctrico durante aproximadamente 30 minutos. con el empleo de una solu-
146
cin tampn alcalina. A este pH lamayora de las protenas se cargan nega-
tivamente y migran hacia el nodo en virtud de su carga. Despus las tiras
se tien para visualizar las bandas proteicas y se leen en un densitmetro.
La absorcin variable debido a las concentraciones proteicas diferentes es
descubierta por una celda fotoelctrica y reproducida por un registrador.
Las bandas se convierten en picos (Figura 36), y pueden ser cuantificadas
las principales fracciones . El suero sanguneo se separa en cinco principales
bandas: albmina, a 1-globulina, a2-globulina, f3-globulina y y-globulina.
La electroforesis de rona es un mtodo extraordinariamente valioso para el
diagnstico de trastornos con paraproteinas* humanas, como el mieloma
mltiple y la macroglobulinemia de Waldestrm. Una intensa disminucin en
la concentracin de la gammaglobulina srica, como ocurre en la
hipogammaglobulinemia, tambin puede ser descubierta con esta tcnica.
Las cadenas ligeras libres (protenas de Bence Jones) se identifican con
facilidad en la orina, cuando se encuentran en concentraciones aumentadas
como en el caso de mieloma mltiple.
Material
- Muestra de suero humano total (SHT)
1
- Tiras de acetato de celulosa
- Tampn veronal 0,025 mol/L, pH 8,6 (tampn veronal 0,075 mol/L,
pH 8,6 : cido dietilbarbitrico 2,76 g: dietilbarbiturato de sodio 15,4 g;
agua destilada hasta l L, dilucin de trabajo l/3)
- Colorante rojo Ponceau al 0,2 % (rojo Ponceau S l g; cido tricloroactico
37,5 g; cido sulfosaliclico 37,5 g; agua destilada hasta 500 mL)
- Solucin decolorante cido actico al 5 % (50 mL de cido actico gla-
cial, agua destilada hasta l L)
- Alcohol etlico al 95 %
- Solucin transparentadora (30 % de cido actico, 68 % de etanol y 2 %
de glicerina)
Paraprotena: Protena de mieloma, irununoglobulina homognea (monoclonal) derivada de
un clon neoplsico de clula plasmtica y en muchas ocasiones no relacionada con una
estimulacin antignica conocida .
147
 3. Dejar flotar la tira sobre el tampn por unos segundos y slo despus que
se haya impregnado bien sumergirla unos segundos . Secarla entre dos
papeles de filtro.
4. Colocar la tira de forma que sus extremos descansen sobre los dos puentes
A de papel que se encuentran sumergidos en el tampn.
5. Equilibrar el sistema durante 10 minutos con la corriente o el voltaje
apropiado (punto 7).

a 6. Aplicar 1,5-2 A. (1 A.= 1 L) de cada muestra en la lnea trazada, habin-

doles aadido previamente como indicador de la corrida un cristal de
azul de bromofenol. Debe guardarse una distancia de 0,5 cm entre cada
una de las muestras y entre las muestras y los bordes de la tira.
7. Tapar el equipo y efectuar la corrida electrofortica empleando corrien-
te constante (2 mA por tira) o voltaje constante (250 V).
8. Terminada la corrida, sumergir la tira -tan pronto como sea posible-
en la solucin colorante. Despus de 3-5 minutos escurrirla y hacerle
varios lavados con cido actico al 5 %.
9. Para transparentarla, sumergirla en etanol al 95 % e inmediatamente en
Figura 36. Electroforesis de zona en acetato de celulosa. A, Wla pequea cantidad de suero o la solucin transparentadora; mantenerla 5 minutos . Colocar la tira sobre
de alguna otra muestra lquida se aplica a tiras de acetato de celulosa. B, se efecta la una lmina de vidrio y guardarla en la estufa a 60 C durante 20 minutos.
electroforesis en Wl tampn adecuado.
1O. Realizar la lectura en el densitmetro.
- Papeles de filtro
Observacin
- Cristales de azul de bromofenol o solucin saturada en etanol
Evitar tocar la tira con los dedos, emplear una pinza. Recuperar las soluciones
- Aplicadores o pipetas de 1O A. de lavado que contienen colorante hacindolas pasar por carbn activado.
- Equipo para electroforesis (cubeta con su tapa y fuente de poder)
- Estufa INMUNOELECTROFORESIS (IEF)
- Densitmetro La inmunoelectroforesis combina la separacin electrofortica de sus-
Mtodo tancias de diferente carga elctrica y su posterior separacin e identifi-
cacin por inmunodifusin doble, lo que conlleva a una elevada resolu-
l . Verter el tampn en las dos cubetas electroforticas . cin de los constituyentes de una mezcla de protenas . Los dos pasos de
2 Trazar una lnea con lpiz en la tira a una distancia de 1/3 del extremo la tcnica se efectan en una placa de agar. El procedimiento se ilustra
catdico. en la Figura 37 .

148 149
 En la placa de agar se perfora un pozo y, a uno de sus lados, un canal o
ranura. La mezcla de antgenos se coloca en el pozo y se separa en un
campo elctrico. Luego se sita el antisuero en el canal y se dejan difundir
antgenos y anticuerpos durante 18-24 horas . Las lneas de precipitado apa-

A 1 O - -l recen en forma de arcos.

En la inmunoelectroforesis, el gel se prepara de la forma ya descrita para
las placas de IDO, con la diferencia de que se emplea una solucin salina
tamponada en vez de salina fisiolgica. El uso de agarosa en lugar de agar
se recomienda si la electroendosmosis debe ser evitada. Generalmente se

~~
utiliza una CC1ncentracin de agar o agaroS(1. al 1-2 % y tampn veronal o
borato a pH alcalino (8,2-8,6) de baja fuerza inica (0,02-0, 1) para evitar el
. 1 calentamiento y deshidratacin del gel que se produce a altas concentracio-
nes salinas.

-j
En el anlisis de suero sanguneo humano (SITT) usualmente se emplea
tampn veronal pH 8,6 a una concentracin 0,075 mol/L con la adicin de
e1
,~x~~~~
~~~~
~~"~o~~~
~S\~~'~
v, ~'"~~-~-~
~--~-~ preservativo. En la cubeta electrofortica se utiliza el mismo tampn diluido
tres veces (0,025 mol/L) .
La electroforesis de protenas en agar est afectada por el flujo
.... <!

;;lfil.
electroendoosmtico. Este se produce porque el agar, al pH utilizado, se
carga negativamente por la ionizacin de grupos inorgnicos cidos. Esta
carga fija se equilibra con grupos ~o+ del solvente, el cual se mueve hacia
o1 ~" 1 el ctodo junto con sus solutos. Como consecuencia de este movimiento se
produce un aplastamiento de la capa de agar. El flujo electroendoosmtico
retrasa la migracin electrofortica de todas las protenas y provoca la apa-
ricin de arcos de precipitado, incluso detrs del punto de aplicacin, que
corresponden a las protenas de menor carga elctrica. Este fenmeno faci-
lita la identificacin de las inmunoglobulinas en el electroforetograma y, en
particular, de la IgG, pues es la protena srica que menor carga elctrica
presenta. La IgG se caracteriza por la longitud y fonna de su arco de preci-
pitado (Figura 38).
Se acostumbra aadir al SITT azul de bromofenol, que migra junto con la
Figura 37. Inmunoelectroforesis. A, el suero humano se coloca en el pozo peorado en el agar. albmina, la protena que va delante, lo que permite visualizar la migracin
B, separacin de las protenas por electroforesis. C, llenado del canal con anti-SHT.
electrofortica y parar a tiempo la corrida.
D, difusin. E, arcos de precipitado.
Frente a un anti suero humano total (aSITT) de calidad y bajo condiciones
determinadas de trabajo, es posible distinguir hasta 30 arcos de precipitado

151

diferentes. La posicin y la forma de estos arcos permite la identificacin y
aun la estimacin cuantitativa de las protenas sricas, aunque se debe se-
alar que el anlisis de un patrn inmunoelectrofortico de una muestra de
suero no es una cuestin sencilla y slo puede hacerlo una persona experi-
mentada. Los arcos de precipitado de cada zona deben enumerarse e iden-
tificarse y su aspecto debe compararse con un suero normal de referencia.
Es necesario estudiar cada arco de modo individual; la modificacin en la
apariencia puede sugerir cambios cuantitativos con respecto a la normali-
dad. Un aumento en la concentracin de un constituyen~ srico puede cam-
biar la forma del arco de precipitado de muchas maneras . La linea puede
ser ms larga y diferente, o ser ms gruesa o parcialmente (o totalmente)
disuelta debido a exceso de antgeno (Fig\ ra 25). En algunos casos puede
haber una divisin secundaria, por lo que se fomlan dos arcos de prec1p1tado
que permanecen unidos en sus extremos. Una disminucin en la concentra-
cin de un componente srico se traduce en una lnea menos intensa, que es
ms c0rta y ms delgada. Puede tambin estar completamente ausente. La
ausencia de un arco de precipitado, por lo tanto, puede deberse a un gran
exceso o a una gran disminucin de un componente. Para determinar cul
de las condiciones est presente, se deben efectuar anlisis repetidos va-
riando la concentracin de la muestra (Nerenberg, 1968).
Seromucoide
a1-glicoproteno p1~1ipoprotena
cxl-lipopro-
tena p1.:.yrotena
cx2- g licoproteina
Figuri: 38. Separacin irununoelectrofortica de un suero hmnano normal.
El mtodo ms comn y simple para identificar un arco de precipitado es
aquel que emplea un antisuero monoespecfico. De esta forma es posible
identificar los constituyentes desconocidos en una preparacin de protenas
152
~
sricas. si disponemos de anticuerpos especficos para cada uno de los com-
ponentes del suero humano. Adems, la reaccin con el anti-SHT permite
conocer el nmero total de arcos en la preparacin, y da un criterio acerca
de la pureza de esa preparacin. Por tales motivos, la IEF se utiliza para
valorar las preparaciones de inmunoglobulinas sricas.
La IEF, junto con la electroforesis zonal, es corrientemente empleada para
detectar protenas de mieloma en suero humano. De manera adicional, las
inmunoglobulinas disminuidas o ausentes que se presentan en diversas
inmw1odeficiencias, pueden ser analizadas por esta tcnica. No obstante, se
debe practicar un anlisis cuantitativo como la inmunodifusin radial simple,
la nefelometra o el radioinmunoensayo para la medicin exacta de los nive-
les de inmunoglobulinas.
Aunque 1a IEF es una tcnica esencialmente cualitativa, se ha intentado
desarrollar variantes cuantitativas {Ouchterlony y Nilsson, 1973). Se han
hecho modificaciones que han resultado particu larmente t iles, como la
contrainmunoelectroforesis y la inmunoelectroforesis en cohete, esta ltima
de carcter cuantitativo .
Material
- Suero humano total (SITT)
- lgG (u otra protena srica purificada)
- IgG (u otra proteina srica) patrn
- Antisuero humano total (a.SITT)
- Agar o agarosa
- Tampn veronal 0,075 mol/L, pH 8,6 (ver electroforesis de zona)
- Azul de bromofenol (solucin saturada en etanol)
- Azida sdica al 1O %
- Lmina de vidrio o portaobjetos
- Perforador
- Aguja
- Plantilla
153

- Papel de filtro
- Pipetas
- Cmara hmeda
- Equipo de electroforesis (cubeta con su tapa y fuente de poder)
Mtodo
1. Preparar el agar al 1,5 % utilizando el tampn veronal y las placas de
agar, b la forma ya descrita para IDO .
2. Colocar la placa sobre la plantilla y perforar los pozos y los canales .
Extraer cuidadosamente el agar de los pozos pero NO el de las ranuras.
3. Verter en la cubeta de electroforesis el volumen necesario de tampn
veronal 0,025 mol/L y col~ la placa de agar entre los dos reservorios
de tampn con la polaridad mdicada. Conectar los extremos de la placa
al tampn por medio de tiras de papel de filtro de aproximadamente
3-4 cm humedecidas en el tampn. Cada tira debe cubrir a los lados de la
lmina alrededor de 0,5 cm de la capa de agar y sumergirse casi 3 cm
dentro del tampn.
4. Colocar los electrodos y con~tar la fuente de corriente directa. Aplicar
8-1 Ovolt por cada centmetro de ancho de la placa. Cubrir la cubeta con
la tapa. Ambientar la cmara durante 10 minutos .
5. Preparar las muestras y aadir a 1 mL de SHT una gota de azul de
bromofenol.
6. Desconectar la fuente de corriente pasados los 1O minutos y llenar cui-
dadosamente los pozos con las muestras, de acuerdo con el esquema
seleccionado . Anotarlo en el cuaderno de trabajo.
7. Cubrir Ja cubeta electrofortica y conectar Ja fuente de corriente, apli-
cando el mismo voltaje. Chequearlo a intervalos de 30 minutos y ajustar-
lo si fuera necesario.
8. Parar Ja corrida cuando la mancha azul del bromofenol est aproximada-
mente a 1 cm del extremo del canal. Con estas condiciones la corrida
debe demorar 1-2 horas.
9. Retirar la placa, remover el agar de las canales y llenarlos con un mismo
volumen de antisuero, en este caso, a.SHT.
154
1O. Colocar la placa dentro de la cmara hmeda en posicin horizontal e
incubarla a temperatura ambiente durante 12-24 horas.
11. Observar y anotar los resultados.
ELECTROINMUNODIFUSIN
En las tcnicas de inmunodifusin el antgeno y el anticuerpo se ponen en
contacto y precipitan en agar exclusivamente por difusin. Sin embargo, la
probabilidad de que ambos inmunorreactantes se encuentren, se puede au-
mentar en forma notable si se impulsan mediante corriente elctrica, lo que
conlleva a una aparicin ms rpida de la linea de precipitado. Reciente-
mente hay un inters renovado en las tcnicas de electroinmunodifusin,
sobre todo en el diagnstico serolgico de enfermedades infecciosas identi-
ficando t antgeno en el suero. Aunque se han descrito numerosas varian-
tes acoplando la electroforesis con la difusin, slo dos han logrado un grado
apreciable de aplicacin clnica . Estas son : la electroinmunodifusin
unidimensional doble o contrainmunoelectroforesis y la electroinmunodifusin
simple unidimensional o electroforesis en cohete (Stites et al., 1985 ).
Contrainmunoelectroforesis (CIE)
Esta electroinmunodifusin unidimensional doble tambin se conoce como
inmunoelectroforesis por contracorriente, electroprecipitacin e inmuno-
electroosmoforesis .
Esta ingeniosa tcnica se basa en la migracin diferencial de antgenos y
anticuerpos en la electroforesis en agar a pH alcalinos . Mientras la mayora
de los antgenos tienen una movilidad anxlica, las gammaglobulinas migran
hacia el ctodo en virtud del flujo endoosmtico. As, colocando el anticuer-
po hacia el lado andico y el antgeno hacia el lado catxlico, separados una
distancia de 5-1 Omm, los inmunorreactantes se mueven uno hacia el otro y
forman una lnea de precipitado cuando se encuentran en proporciones equi-
valentes (Figura 39).
Las desventajas principales de la inmunodifusin doble sin corriente es su
relativa baja detectabilidad y el tiempo requerido para la precipitacin
(24 horas). La CIE puede producir lneas visibles de precipitado en 30 minutos
y tiene una detectabilidad 1O veces mayor que las tcnicas estndar de difu-
sin doble.
155
 ....

Las condiciones de la tcnica son similares a las de la IEF. La CIB' se aplica

2. Colocar la placa sobre la plantilla y perforar los pozos. Extraerles cuida-
en la deteccin de antgenos de importancia clnica, as como de
dosamente el agar.
autoanticuerpos en enfennedades autoinmunes.
3. Llenar los reservorios de la cubeta elcctrofortica con el tampn veronal
( 1/3) y colocar la placa de agar entre los reservorios con la polaridad
adecuada . Poner los puentes de papel de filtro y proceder a la

e - =- .e
8 "" ambientacin como en la IEF.
' 4. Preparar los inmunorreactantes.

5. Desconectar la fuente de corriente y llenar cuidadosamente los pozos

con los inmunorreactantes de acuerdo con el esquema seleccionado.
r ,
j ' '
6. Cubrir la cubeta ele 'ortica y dejar pasar la corriente, chequeando a
Figura 39. Contrainmunoelectroforesis. Se colocan el Ag y el Ac en sendos pozos y se 1 intervalos de 30 minutos y ajustndola si fuera necesario.
impulsan por una corriente elctrica. Se forma una linea de precipitado cuando se encuentran.
J ..7. Parar, la corrida cuando se hayan obtenido las lneas de precipitado
Materia/ (0,5-1 hora).
- Antgenos
'\ Electroforesis en cohete o tcnica de Laurell
- Anticuerpos
En la electroinmunodifusin simple unidimensional, el antisuero especfico
- Agar purificado o agarosa para el antgeno que se desea medir se incorpora al agar. La muestra que
- Tampn veronal 0,075 mol/L, pH 8,6 (ver electroforesis de zona) contiene una cantidad desconocida de antgeno se coloca en el interior de un
pozo. En pozos sucesivos se colocan los estndares de concentracin cono-
- Azida sdica al 1O % cida. Se efecta la electroforesis del antgeno hacia el agar que contiene el
- Lminas de vidrio o portaobjetos anticuerpo. El patrn de precipitacin resultante se asemeja a la estela de
un cohete, de donde se deriva el nombre electroforesis en cohete (Figura 40).
- Perforador
Este patrn se debe a que la precipitacin se produce a lo largo de los
- Aguja mrgenes laterales del antgeno limtrofe, a medida que el antgeno es impul-
- Plantilla sado hacia el agar que contiene el anticuerpo. Gradualmente, a medida que
se pierde antgeno debido a la precipitacin, disminuye su concentracin en
- . Papel de filtro el frente de onda y los mrgenes laterales convergen para formar un punto
- Pipetas preciso. La distancia total de migracin del antgeno para una concentracin
detenninada de antisuero es linealmente proporcional a la concentracin del
- Equipo de electroforesis antgeno. La detectabilidad de esta tcnica es cerca de 0,5 glmL para las
Mtodo protenas. Desafortunadamente, la carga elctrica negativa de las inmuno-
globulinas impide su movilidad electrofortica en este sistema, a menos que
' '
l . Preparar el agar con el tampn veroval y las lminas, tal como se descri- se empleen electrlitos y agar especiales. Recin se han introducido varios
bi en la IEF. sistema<; para la cuantificacin de inmunoglobulinas sricas y de los compo-
nentes del complemento con esta tcnica.
156
157
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O;i '
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Material r ~,,. .......Jrr" :;:'
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/'
- Muestras de antgeno -1,,
l 'l',,,..f"\,
,

- Antgenos estndar
- Antisuero monoespccfico
- Agar purificado o agarosa
- Tampn veronal 0,075 mol/L, pH i,6(ver electrof. de zona)
........:.. _

81 k1) - Azida sdica al 1O %

- Lminas de vidrio

a=== =: ~
11
Perforador
- Aguj
Plantilla
" . - Pipetas

0=== == - - Equipo de electroforesis

- Regla o pie de rey
M e todo

~ Agorcon anticuerpos
i nconora dos
1. Preparar el agar con el tampn ''eronaJ, proceder a la mezcla con el
antisuero y preparar la placa tal C-Omose describi para la IDR.
2. Colocar la placa sobre la plantilla )perforar los pozos. Extraerles el agar
con cuidado.

8> 3. Llenar los reservorios de la cubetaelcctrofortica con el tampn veronal

y colocar la placa de agar entre losreservorios con la polaridad adecua-
da. Poner los puentes de papel de filtroy proceder a ambientar la cma-
ra como en la IEF.

Figura40. Electroforesis en cohete (tcnica de Laurell ). ElAg se coloca en los pozos ( 1-4) in
cantidades decrecientes. Mee.liante electroforesis el Ag is conducido hacia el anticueI)o
contenido en el agar. El patrn de precipttado tien;:, el conomo de la estela de un cohete. Su
longitud es proporciona) a la cantidad de Ag.
4. Preparar las muestras y las diluciones pertinentes con el mismo tampn.
5. Desconectar la fuente de corriente \'llenar cuidadosamente los pozos con
las muestras y estndares, de acuerdocon el esquema seleccionado.
6. Cubrir la cubeta y dejar pasar la corriente, chequendola a intervalos de
30 minutos .
159
7. Parar la corrida cuando se hayan obtenido los cohetes (2-6 horasf
8. Medir la longitud de los cohetes, desde el borde del pozo hasta su extre-
mo. Calcular la concentracin de antgeno en las muestras,

LECTURA Y REGISTRO DE LOS RESULTADOS

La mejor observacin de las reacciones de inmunodifusin se realiza con
iluminacin en campo oscuro con luz incidente. La fuente de luz puede ser
una lmpara fluorescente circular que ofrezca luz omnidimensional . Un lec-
tor de construccin sencilla se muestra en la Figura 41.
El registro permanente de los resultados puede lograrse mediante la tincin de
las preparaciones o la fotografia de las preparaciones teidas o hmedas. El
procedimiento de teido es ms laborioso que el fotogrfico, pero tiene la
ventaja de que consigue leerse ms fcihnentc la preparacin. Por otra parte,
la cmara fotogrfica puede registrar lineas que son invisibles al ojo humano.
Antes de efectuar el teido, las preparaciones deben lavarse exhaustivamente
con salina fisiolgica para eliminar todo el antgeno y el anticuerpo que no
hayan reaccionado. Se recomienda el empleo de un preservativo para retra-
sar la contaminacin durante ese tiempo. Una vez lavadas, las preparacio-
nes deben secarse para reducir la capa de agar a un.film delgado y transpa-
rente. Despus del secado las preparaciones estn listas para teir.
La tincin Je los inmunoprecipitados permite, adems, su caracterizacin
bioqumica. Las tinciones para protenas se emplean a menudo en las tinciones
no selectivas debido a que los inmunoprecipitados siempre contienen prote-
na anticuerpo. Los colorantes comnmente usados son amido negro y rojo
Ponceau. El negro amido es el ms popular, debido a que sus resultados son
muy consistentes. El principal i.nconveniente de algunos colorantes ms li-
geros es la prdida de color durante el proceso de lavado. El colorante se
disuelve en solucin de cido actico. Se puede emplear glicerina en el
solvente, lo que facilita el despegue del agar, una vez teido y secado. El
proceso de coloracin consiste en cambios sucesivos de la solucin de cido
actico hasta que se haya eliminado todo lo posible el color de fondo . Esta
operacin puede demorar varios das . Cuando las preparaciones teidas
estn secas, el agar tiende a despegarse de los portas. La aplicacin de una h gura:41. lluminadordec.ampooscW'o parraobscnapa:?pi~engel~. la fu~~ '!t !~!f
solucin acrlica clara o una pulverizacin con laca evitar este inconve- es W1 tubocircularde luz lrluoresc.enk. la lap!ll tDD111118&iJada en la figura) ti.:n.: una apertura
que se adapta a los c.iiforentes, tama0& l ~ckl'asmninas_
niente. La pulverizacin, adems, preservar las preparaciones y tornar la
pelcula ms clara y fcil de visualizar.
160
Los mtodos selectivos son ampliamente empleados para la caracterizacin
de lpidos, lipoprotenas, polisacridos y glicoprotenas (Ouchtcrlony y Nilsson. 5. Eliminar la tincin de fondo sumergiendo las lminas sucesivamente du-
1973). rante 1 hora cada vez en la solucin de lavado (al menos dos recipientes
con solucin de lavado deben prepararse) . Mantenerlas el tiempo sufi-
Tincin de las placas de inmunodifusin ciente para su decoloracin o llevarlas a una tercera solucin de lavado
hasta que se aclare en su totalidad el fondo .
Materia/
6. Secarlas al aire libre, rotularlas bien. Estn listas para ser fotografiadas o
- Lminas <le inmunodifusin conservadas . Gu~rdarlas protegidas del polvo.
- Negro amido: 5 mg de negro amido. 150 mL de glicerina. ! 00 111 L de Observacin
cido actico glacial y l 00 mL de agua destilada
Se recomienda el uso de preservativo en la salina yel agua para los prime-
- Rojo Ponceau : 50 mg de rojo Ponceau y 100 mL de cido actico al 2 %
ros lavados, para evitar la contaminacin. Emplear pinza para no mancharse
- Solucin de lavado: cido actico al 2 % que contenga 1O % de glicerina los dedos de colorante.
.
- Agua destilada con azida sdica al O, 1 %
- Papel de filtro duro (Whatman No. 50)
- Pinza
- Recipientes para el colorante y las soluciones
- Estufa o ventilador

Mtodo
l. Sumergir las lminas o portas en solucin salina fisiolgica durante
1-3 das para eliminar todo el antgeno y el anticuerpo que no hayan
reaccionado. La solucin debe cambiarse varias veces (puede contener
azida sdica al O, l %).
2. Efectuar otro lavado con agua destilada durante 0,5-1 da para eliminar
la sal de la preparacin, que cristalizaria tras el secado.
3. Secar la preparacin para reducir la capa de agar a una pelcula delgada
y transparente. Utilizar el papel de filtro duro. Para facilitar el manejo.
cortar las tiras del tamao de las lminas. Embeberlo con agua y aplicar-
lo mojado sobre las preparaciones . Seguidamente colocarlas en la estu-
fa, delante del ventilador o al aire libre.
4 . Una vez secas, sumergirlas en la solucin de colorante durante 1O minu-
tos (o menos) o teirlas con un. pincel. Esto ltimo reduce notablemente
la tincin de fondo y los sucesivos pasos de lavado.

162
163
 o
e
o o o CAPTULO IV
o
o o o
o REACCIONES Y TCNICAS
,
o DE INMUNOAGLUTINACION
o
o
o O O
o 'O
La inmunoaglutinacin es una reaccin que tiene lugar cuando se combinan
o
antgenos particulares (aglutingenos) con sus anticuerpos especficos
OO o ooo o o o '() ' o (aglutininas) .
' ' o o o O o Esta reaccin se ha usado <l!npliamcnte debido a la facilidad con que se
e ' ' ' o ' o o lleva a cabo y a su bajo nivel de detectabilidad. Aunque no permite la cuanti-
o ficacin exacta de anticuerpos, los resultados pueden expresarse semicuan-
e e i o titativamente en funcin de'la dilucin mayor del suero que permite aun
observar aglutinado (ttulo).
o o o o

..,
\! o
'
o
o
o
o o o
En la aglutinacin, fas partculas quedan asociadas en retculo por anticuerpos
bivalentes (IgG) o pentavalentes (IgM), y se combina cada extremidad de la
molcula anticuerpo (regin Fab) con un sitio antignico idntico portado

. '
e

o o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o

o
o

o
o por partculas distintas (Figura 43) . La tcnica de inrnunoprecipitacin em-
plea antgeno soluble, por lo tanto, de dimensiones pequeas . Para exteriori-
zarse el inmunoprecipitado se requieren grandes cantidades de antgeno y
lb ms, de anticuerpo. Las reacciones de inrnunoaglutinacin necesitan poco
antgeno y aun menos anticuerpo para manifestarse. Los sitios antignicos
~4l! ..A!~mt&losrdcp'!anbltas:r.ar;a 1inmun00ilfusl'ooesrdoblcsyrotrasvar1D1es. son dependientes de una estructura relativan1cnte voluminosa, de ah que
una ligera modificacin del estado de dispersin de las partculas sea sufi-
ciente para.exteriorizar la reaccin serolgica.

165
 1

o;..r1 IY
1
Anticuerpo
~~/ h ~ ~
--~7
,~OAtJi
1
1

-( 4,'--J>,
~o-
~(),-{
1
1
1
1
1
1
1 Antlgeno
?;_\ 'Entrecruzamiento y aglu---<;..
1 Exceso de anticuerpo ti nocin
I , no entrecruzamiento
Figura 44 . Inhibicin di: la aglutinacin por exceso de Ac.
Figurn43. Reprcs1..11tacinesquemtic.a de la reaccin de nglutirnKifin

La exteriorizacin de la aglutinacin requiere de electrlitos en el medio. A. Aglutinacin directa

Bordet consider la aglutinacin ramo un proceso en dos etapas . En la
primera se produce la unin de los antil.:ucrpos con los determinantes
o
Ag propio de
+ r Ac
~O
Aglutlnacio'n
antignicos de la partcula . En la segunda, la agregacin de las partcu las lo partcula
J.os electrlitos, en concentraciones apropiadas, producen condiciones de
cohesin y carga superficial qui; causan la aglutinacin de las clulas e.Aglutinacin indirecta .
recubiertas de anticuerpo, pero no de las no recubiertas . En la pr;lctica se O+ .
sensibilizacin .r'f...
+ Y---~~oAo
utiliza comnmente una so!ucin de NCI al 0,85 % (salina fis.iolgica) . Ag V
soluble Aglutinacin
Las reacci ones de inmunoaglutinacin esti~ mucho menos sujetas al 'fon-
meno de zona que las rc::iccioncs de pn ;~ ipitac 1n . La inhibicin por exceso C.Aolutlnocln reversa
de antgeno es dificil que se produ zca. La inhibicin por exceso de anticuer
.J;..,
-?~
~ sensibilizacin
po (fenmeno ele prozona) puede observarse con sueros hiperinmunes a
co ncentraciones elevadas de anticuerpo . Una interpretacin dada a este
O + I .. :}~{ +
.
fc nmc1w , al igual que a la prozona de b inmunoprecipitacin cuantitativa, Aglutinacin
es que --a un gran exceso de anticuerpo--- cada clula est recubierta D. Inhibicin de la aglutina ::in
completamente por mol culas de anticuerpo, siendo poco probable el entre
- En presencio de antgeno
cmzamicnto de las clulas por un mismo anticuerpo (Figura 44) .
La reaccin de aglutinacin puede ser directa (activa, simple) o indirecta
(pa:- iva, condicionada) En el primer tipo, los antgenos son componentes
~ + {)
No aglutinac:i&n
natura les de la partcula. En el tipo indirecto, los antgenos son unidos en -En ausencia de anti'gono
forma artificial a la superficie de la partcula que slo funciona como su
soporte . La partcula tambin puede ser recubierta con anticuerpos: a esta
variante se le ha denominado aglutinac;i<in reversa. Existen, adems, la
inhibic in de la aglutinacin y la coaglutinacin (Figu ra 45) .
;0-+ {) :c:0o
Aglutinacin
Figura 45. Algunos tipos de reacciones de aglutinacin.
166
La aglutinacin puede efectuarse en lminas, en tubos o en placas multipozos
de microtitulacin, estas ltimas son pozos de fondo U.
Las bacterias, los eritrocitos y el ltex de poliestireno son las partculas ms
comnmente utilizadas en la aglutinacin, denominndose hemaglutinacin
aquellas que emplean glbulos rojos sanguneos .
Las reacciones de inmunoaglutinacin se usan para identificar y clasificar
bacterias y para tipificar hemates Se han observado reacciones de aglutina-
cin de leucocitos, plaquetas e incluso espermatozoides, esta ltima en ciertos
casos de infertilidad debido a la existencia de aglutininas en el espemta o en la
secrecin vaginal. La aglutinacin se ha extendido a la deteccin de antgenos
moleculares y de anticuerpos contra antgenos particulares y solubles.
TCNICAS DE AGLUTINACIN DIRECTA. '
AGLUTINACIN BACTERIANA
La aglutinacin de bacterias se lleva a cabo entre los antgenos localiza-
dos en su superficie (cpsula, pared, flagelo) y los anticuerpos especfi-
cos. Entre las aplicaciones de la aglutinacin bacteriana estn la identifi-
cacin y clasificacin de microorganismos aislados de diversas fuentes ,
tales como: exudados, heridas, sangre, alimentos, aguas residuales y otras;
y la deteccin de anticuerpos especficos en el suero de pacientes con
vista al diagnstico de enfermedades, en el seguimiento de la evolucin
del proceso infeccioso cuando exista una correlacin entre el ttulo de
anticuerpos y el cuadro clnico, en la evaluacin y seguimiento de progra-
mas de vacunacin y en la titulacin de anticuerpos en los sueros de ani-
males inmunizados.
Material
- Antgeno O de Salmonella
- Antisuero anti-O de Salmonel/a
- Salina fisiolgica
- Tubos de ensayo 13 x 100 mm
- Gradilla
- Pipetas
168
- Bao de agua
Mtodo
1. Colocar en la gradilla una hilera de 1O tubos. Aadir a cada uno 250 L
de SF y proceder a hacer diluciones dobles del antisuero, tal como se
describi en la pgina 123 . Desechar 250 L del tubo 9. El tubo 10 es el
control.
2. Adicionar a todos los tubos 250 L del antgeno O y agitarlos .
3. Sumergir la gradilla en el bao de agua e incubar los tubos 60 minutos.
4. Buscar en el fondo del tubo Ja presencia de aglutinacin. Determinar el
ttulo. Los resultados se dan en unidades aglutinantes por mililitro de
suero que se calculan multiplicando el ttulo por 4 (se emple la cuarta
parte 'de 1 mL en el ensayo).
Observacin
Si hay aglutinacin en el tubo control se desecha la prueba y se prepara de
nuevo el antgeno.
Prueba rpida para aglutinacin bacteriana (mtodo de la lmina)
En una lmina de vidrio o portaobjetos colocar una gota del antisuero y una
gota de la suspensin bacteriana (una muy cerca de la otra). Mezclarlas
bien con un aplicador o varilla (o el fondo de un tubo de ensayo), esperar
unos minutos moviendo la lmina, y observar. En el caso de una reaccin
positiva se forman copos bien visibles a simple vista. En la reaccin negati-
va la mezcla se mantiene turbia.
Prueba de aglutinacin directa con eritrocitos humanos
La superficie de los eritrocitos contiene gran nmero de determinantes
antignicos, que son productos directos o indirectos de los genes. Estos
determinantes constituyen aloantgenos, por lo que permiten clasificar a las
Aloantgeno: Antgeno encontrado solamente en algw10s miembros de una especie. Los Ac
correspondientes se denominan aloa11tic11erpos. En el caso de las aloaglutininas anti-A y
anti-B se acostwnbra llamarlas isoagluti11i11as.
169

personas en diferentes grupos. Se han identificado hasta el momento ms
de 20 sistemas diferentes de grupos sanguneos. Dentro de cada sistema los
aloantigenos se heredan -al parecer- como productos de un gen sencillo
o de un conjunto de genes estrechamente ligados.
La estructura de A y B se muestra en fonna esquemtica en la Figura 46.
Los tres ltimos azcares de la cadena madre, la llamada sustancia H, son
N-acet1lglucosamina, galactosa y fucosa . La N-acetilglucosamina en el gru-
po sangulneo A y la galactosa en el B, estn unidas al ltimo residuo de
galactosa de la cadena madre.

La importancia clnica de un sistema de grupos sanguneos depende de dos

factores: la frecuencia de los aloanticuerpos para estos antgenos en la po-
blacin y su potencia relativa (inrnunogenicidad). Aunque muchos de los
grupos sanguneos no son importantes en la prctica clnica de la transfusin A
sangunea y el trasplante de rganos y tejidos, son marcadores objetivos,
heredados genticamente en forma simple, tiles en estudios antropolgicos
y en casos de disputa sobre la paternidad. J'
B
En 190 l Landsteiner public sus observaciones acerca de la aglutinacin de ~\
los eritrocitos humanos por otros sueros tambin humanos. El comporta- Leb
miento de los individuos lo condujo a clasificarlos en los grupos A, B y O .
Las clulas de personas del grupo A eran aglutinadas por el suero de indivi- H Gl u z g lu cosa
Ga 1 : ga l ac t osa
duos del grupo B, y viceversa. En cambio, las clulas de otros individuos Fue "fu c osa
(grupo 0) no eran aglutinadas por ningn suero. Estas personas tenan Noc zorupo N-acet ilo
aloanticuerpos anti-A y anti-B. Poco tiempo despus del descubrimiento de
Figura 46. Estn1ctura qui mica de los antgenos A, B, H, Le" y Leb de los grupos sanguneos.
Landsteiner se encontr el cuarto grupo, AB, sin aloanticuerpos para los
otros eritrocitos humanos (Tabla XI).
Los grupos sanguneos ABO estn determinados por los genes A, B y O .
Estos genes codifican para enzimas glicosiltransferasas que conjugan los
TABLA XI. Grupos sanguineos del sistema ABO azcares al carbohidrato precursor. Estas enzimas son especficas para sus
sustratos: la transferasa A para la N-acetilglucosamina y la transferasa B
Grupo Antgeno en el Anticuerpo Frecuencia para la galactosa. El gen O no produce transferasa que pudiera modificar la
san guineo eritrocito en el plasma en Cuba(%) sustancia H, debido a ello las personas del grupo O slo tienen el antgeno
A1 A +A 1 anti-B H . Por esto, algunos autores denominan al sistema ABH.
37,2
A1 A+H anti-B (anti-A 1) La cadena precursora es influida por una transferasa que conjuga la fucosa
a la galactosa. Esta enzima es el producto del gen H, el cual se hereda en
B B (+H) anti-A 8,6
forma independiente del sistema ABO . Existen unas cuantas personas a
o H anti-A + anti-B 50,6 quienes faltan los genes H (genotipo hh), por lo que son incapaces de sinte-
tizar una cadena precursora completa . Este fenotipo se llama Oh o tipo
A 1B A+ A,+ B - Bombay. A causa de esta deficiencia las sustancias A y B no pueden for-
A2B A+ B (+H) (anti-A,) 3,6 marse a pesar de existi r transferasas A y B.

Nota: Los parntesis indican que pueden o no estar presentes. 171

170
 El grupo sanguneo A puede subdividirse en los subgrupos A y ~ basado
1
en el nmero de sitios antignicos A sobre el eritrocito. Aproximadamente
el 80 % de las personas A y AB pertenecen al subgrupo A, . La elevada
densidad del antgeno A sobre los eritrocitos en la mayora de estos indivi-
duos se traduce en una especificidad antignica diferente, pero relativamen-
te dbil, tal vez como consecuencia de la interaccin de dos oligosacridos A
estrechamente adyacentes. Las personas ~ y, en especial, las ~B pueden
tener anticuerpos contra estas estructuras (anti-A ) .
1
Puesto que los anticuerpos para A 1 son dbiles, no siem pre son prcti-
cos para la diferenciacin entre A, y A 2 . La distincin, por lo general , se
hace empleando lectnas . La lectina de Do/ichos biflorus aglutina slo
a las clulas A 1 . Con frecuencia se emplea simultneamente con la lectina
de U/ex europaeus, la cual reacciona con la sustancia H qu e los
eritrocitos A 2 poseen en elevadas concentraciones comparados con los
eritrocitos A 1
El origen de las aloaglutininas es todava objeto de discusiones, pero se sabe
que la naturaleza qumica de los antgenos A y B es muy corriente en el
entorno humano, especialmente en bacterias. Experiencias llevadas a cabo
en animales libres de grmenes han mostrado que algunos anticuerpos natu-
rales presentes en el pollo se deban a una hetcroinrnunizacin microbiana
(anti-B originados por la estirnulacin con E. co!i 086, gennen que podra
ser el responsable del anti-B identificado en humanos).
Los nios comienzan a producir anti-A y anti-B despus de los primeros
meses de vida. En los pacientes con inmunodeficiencia humoral, como la
hipogamrnaglobulinemia, la cantidad de anti-A y anti-B puede reducirse a
concentraciones no detectables. El anti-H (adems del anti-A y el anti-B)
est siempre presente en el suero de los escasos individuos Oh, por lo que no
se les puede transfundir con sangre de los grupos A, B, AB u O
Lectinas: Protenas que reconocen residuos especficos de carbohidrato y se unen a
glicoprotenas o glicolpidos de la superficie celular. Son bivalentt:s o polivalentes ya
menudo aglutinan los eritrocitos. Fueron originalmente aisll'ldas de st:m illas de plantas,
pero se han encontrado en otros organismos, como hongos, algas, peces y moluscos.
Anticuerpos naturales: Anticuerpos que no son resultado de una imnunizacin conocida .
172
Los anti-A y anti-B soo, por lo gcnerat lgM. Los aJoanticuerpos lgG son
rnis frecuenk.~ ,en indi,iduos -del grupo O que en tos de k?s grupos A y B,
p<>r esta .razn l a enfermedad hemoltica del recin nacido es mucho ms
comn en la desoendencia de madres del tipo O (rcc<>Rlar que la lgG atra-
, icsa ta placenta). Con mucho menor frecuencia las aloaglutininas son del
isotipo lgA
Los aloanticucrpos anti-A y anti-B puc.den -c ausar hemlisis en presencia de
complement.o y son ms potentes en tas personas del _grupo O . El plasma de
csh: grupo no dct>cr transfundirse en grandes cantidades a pacientes A o
B Es recomendable osar oonccntrados de eritrocitos del grupo O que con-
tengan slo pequeos rnlmcnes de plasma en \'ez de sangre entera.. si no
hubier- tiempo para dctcnninar el .tipo de sangre dd paciente o si no se
d-isponc de sang!re de su mismo grupo .
En 1939. l...enc y S.tetson descubrieron que el suero de una mujer que dio a
'luz un fcto muerto aglutinaba 1os ent:roci-tos del ,g5 % de los adultos huma-
nos . Al siguiente ao. Landstciner y Wicner pubhcaroo sus obsen-aciones
sobre la .inmunizacin de cobayos y conejos con sangre de monos rhesus y,
despus de absol'Ciones apropiadas. obtu\icron un anticuerpo que poda aglu-
tinar en p~oporcin semejante los eritrocitos humanos . Al grupo se le nom-
br Rh. aunque mucho despus se demostr que el anrigmo del mono rhesus
difiere dcl antgeno de los eritrocitos humanos y se rebautiz LW en honor a
Landsteiner '" Wiienor.
De acuerdo .c on 1a teora de Risher y Race, los aloantgenos Rb esl3n deter-
minados por tres paces de .senes ntimamente hgados (Clc.., Dfd, Ele). Pro-
bablemente e:I ()OOilpfomento de D (d) no sea antigniro o el gen d sea
amrfioo, pues no se han encontrado anticuerpos oontra d .
De los aloantgenos Rh el D es el irunungeno ms poticnte y., por tanto, el
ms .i mportute . Provoca .rcs;pucs,t a de anticuc<rpos coo una frecuencia
50 veces ma~1oc que ;t os alloantgenos 'C y E. s, una unidad de sangre D
positi,:a se itramsfuode a un rooeptor Rh negatll\'O, se producien anti-O en el
60-8() % de los casos. Se fnnan anti-e y anti-E en menos del 2 % de las
transfusRJnes i~bles . Por esta causa, en la rutina de los bancos de
~"e .slo se invcsti~ga el ~geno D y :su !PfCSeDoia clelrcnnina la designa-
cin Rh posikw o Rh negativo.
113

El antgeno D puede aparecer en la membrana del eritrocito en formas
dbiles, lo que dificulta la tipificacin del Rh. Estas variantes se denominan D"
y difieren del D normal en que tienen un menor nmero de sitios antignicos.
La deteccin de ou requiere un antisuero potente y la tcnica de Coombs.
Si se identifica ou la sangre se considera Rh positiva.
Puesto que los antgenos Rh slo existen en los glbulos rojos, no hay
anticuerpos anti-Rh naturales. La respuesta inmunitaria slo aparece des-
pus de la exposicin a sangre incompatible, ya sea por embarazo o transfu-
sin. Una excepcin es el anti-e, que puede existir como autoanticuerpo.
El anti-O es el ms comn y el ms potente de los anticuerpos anti-Rh. Una
cantidad tan pequea como 1O L de sangre Rh positiva puede ser suficien-
te para originar la formacin de anticuerpos. Ya que los antgenos Rh apare-
cen pronto en la ontogenia, es posible la inmuniz.acin despus del aborto de
un feto Rh positivo, aunque el riesgo es l0-20 veces menor que despus de
un embarazo a trmino.
Despus de una inmuniz.acin intensa, los anticuerpos pueden ser inicial-
mente IgM, pero por lo general son IgG. Slo hay 10 000-30 000 sitios
antignicos Rh sobre cada eritrocito en comparacin con casi un milln de
sitios A 1 Debido a esta baja densidad de sitios antignicos en la superficie
celular, pueden fijarse pocas molculas de anticuerpo . Si estos son del isotipo
IgG, los entrocitos no aglutinan en solucin salina fisiolgica, por no haber
suficientes molculas de anticuerpo para contrarrestar las fuerz.as de repul-
sin que mantienen a las clulas en suspensin. Los anticuerpos IgM -por
su mayor tamacr- pueden tender un puente, juntando los eritrocitos . Los
anticuerpos anti-Rh de la clase IgG se denominan incompletos y los de la
clase lgM, anticuerpos completos.
La aglutinacin por los anticuerpos IgG puede intensificarse de varios mo-
dos: 1) Mediante el uso de anti-irununoglobulina G humana (reactivo de
Coombs). 2) Por la adicin de BSA al 20-30 % a la mezcla reaccionante.
3) Tratando los eritrocitos con una eitzima proteoltica, por ejemplo, papana.
\
El anticuerpo anti-IgG humana reconoce determinantes isotpicos sobre dos
molculas anti-O que han reaccionado con eritrocitos distintos, establecien-
do un puente entre las partculas, lo que facilita su agregacin. La BSA
cambia la constante dielctrica de la solucin, lo que intensifica (al menos
174
parcialmente) la aglutinacin. Las enzimas proteolticas desdoblan las
glicoprotc nas de la membrana del eritrocito que contienen cido silico, lo
que reduce la carga elctrica negativa y debilita las fuerz.as de repulsin,
pcnnitiendo a las molculas de lgG tender el puente entre los eritrocitos . No
obstante, pueden participar otros mecanismos.
La inmuniz.acin de madres Rh negativas por la sangre fetal Rh positiva
puede evitarse por la administracin pasiva de anticuerpos anti-Rh . Una
sola dosis de 150 a 300 g de inmunoglobulina anti-Rh, administrada dentro
Je las 72 horas posteriores al parto, es suficiente en la mayora de los casos.
El paso de anticuerpos anti-O (tambin anti-A o anti-B) a travs de la
placenta origina la anemia hemoltica del recin nacido. La prueba directa
de Coombs permite detectar los anti-O fijados a los glbulos rojos del recin
nacido en sospecha de eritroblastosis fetal. La prueba indirecta de Coombs
se empica para detectar anti-O en el suero sanguneo de la madre Rh nega-
tiva. as como para tipar un antgeno determinado de los hemates cuando se
empican anticuerpos incompletos.
REACTIVOS HEMOCLASIFICADORES
Estos reactivos. comnmente llamados sueros hemoclasificadores, son mez-
clas de anticuerpos policlonales obtenidos del suero de donantes sanos
inmunizados con uno o va rios antgenos de grupos sanguneos, ya sea de
una forma natural, como en el caso de las mujeres sensibilizadas durante el
embarazo, o mediante inm unizacin inducida . En este ltimo caso estn las
personas sensibilizadas por transfusin o donantes sanos inoculados volun-
tariamente con sustancias especficas de grupo (obtenidas de estromas
eritrocitarios) o con glbulos lavados cuando no se dispone de la sustancia
especfica de grupo.
Estos sueros pueden utilizarse tal como se obtiene del donante especial* me-
diante plasmafresis, o pueden ser sometidos a precipitacin por salado. En
Donante especial: Categora con la que se designan los donantes de sueros que se ut ilizan
en la elaboracin de los reacll\OS hemoclasificadores .
Plasmafresis: Procedimiento de extraccin <le plasma, en el qu.: lns .:kmentos fonncs <le
la sangre le son devueltos al donante.
175
 la actualidad se producen anticuerpos monoclonales hemoclasificadon.--s ror
Resultados de la prueba
la tecnologa del hibridoma. a p.1rtir de sustancias cspc..--cificas de grupo obteni-
das por sntesis quimicas o de los eritrocitos correspondientes (/ r11po sanguneo anti-A anti-E anti -Rh
A positivo (A+) T - +
Tipificacin ABO y Rh de eritrocitos humanos
A negativo (A- ) +
Malerial B positivo (B+) - + +
Sueros hernodasificadores anti-A, anti-B y anti-O B negativo (B-) - +
Lminas de l.-idrio o portaobjetos O positivo (0 +) - - +
Lan~tas dt.-sechablcs estriks (o agujas estriles) O negativo (0 -)
- Apli~dorcs AB pos itivo (AB+) + + +
- Algodn AB negativo (AB-) + +

- Alcohol aJ 70 ' Deteccin de aloaglutininas para antgenos del sistema ABO

- Guantes
Material
M1odo
- Suero problema
1. Ponerse los guantes y realizar toda la tcnica con dios puestos .
- Sangre humana de los grupos A, B y O (citratada o heparinizada)
2. Limpiar la yema del dedo medjo de la mano con alcohol.
- Tubos de ensayo de 13 x 100 mm
3. Practicar un corte con la lanceta y dejar fluir 1 o 2 gotas de sangre.
- Pipetas
4. Dejar caer 3 gotas de sangre separadas una de la otra aproximadamente
2 cm en la lmFm de vidrio. - Lminas de vidrio o portaobjetos

5. Aadir J gota de cada uno de los sueros tipificadon:s en las respectivas - Varillas o aplicadores
gotas de sangre ( 1 gota de sangre para cada tipo de suero) . - Centrfuga
6. Homogeneizar rpidamente las tres reparaciones con aplicadores di fe- - Guantes
rentes y rotar suavemente la lmina unos pocos minutos
Mtodo
7. Observar los aglutinados Con el suero ami-Rh puede demorar hasta
5 minutos la c.'tcriorizacin de la reaccin . En caso de duda se repite el 1. Colocarse los guantes .
ensayo, incubando la lmina a } 7 C durante 3 minutos . 2. Tomar los tres tubos de ensayo que contienen las sangres A, B y O , y
8. Dctenninar cl grupo sangu ~nco basado en la presencia (+ )' o ausencia (-) centrifugarlos durante 1Ominutos a 2 500 rpm .
de aglutinacin con los. sueros hemoclasificadores . Los resultados se 3. Eliminar el plasma sobrenadante con pipetas (no decantar) . Este debe
dan de acuerdo con el siguiente cuadro: ser incoloro y transparente. Si se observa hemlisis, desechar la sangre.

L76
177

IJ
..
4. Tomar una lmina o portaobjetos y dejar caer 2 gotas de la sangre A,
separadas aproximadamente 3 cm, a 1-2 cm de los bordes .
5. Dejar caer al lado de cada gota de sangre 1 gota del suero problema .
Mezclar con un aplicador o varilla formando una superficie circular de
reaccin de aproximadamente 3 cm de dimetro.
6. Imprimir a la lmina un movimiento rotatorio y observar durante 2-3 mi-
nut~ la aparicin o no de aglutinacin .
7. Repetir la operacin con las sangres de los tipos B y O
8. Valorar la reaccin de aglutinacin de los sueros problemas de fuerte
(F), media (M), dbil (D) o no aglutinacin (NA) .
Microtcnica para titular anticuerpos anti-A y anti-Ben suero
humano ("naturales" o inmunes)
Material
- Suero problema
- Sangres humanas de los grupos A y B citratada o hcparinizada
- Placa Takatsi
- Tubos de centrfuga
- Tubos de ensayo
- Pipetas
- Guantes
- Centrfuga
Mtodo
1. Colocarse los guantes .
2. Centrifugar las sangres a 2 500 rpm durante JO minutos Hct1rar e,1plas
ma con pipeta Pasteu r u otra (no decantar). Este tjr bc !;Cr incoloro y
transparente : de lo contrario, desechar la sa ngre P:ir:i l'~ta tcnica
1-2 mL de sangre de cada grupo es sufi ciente.
l 7X
. Preparar sendas suspensiones de eritrocitos A y B al 2 %. Para realizar
3
los clculos puede aplicar la ley de la volumetra (pgina 125), conside-
rando V, = 100 % (el paquete de clulas) . Tambin se pueden preparar
resuspendiendo una gota de clulas en 49 gotas de SF. J-IOOlQitMWizar
bien y cuidadosamente la suspensin.
4. Preparar por duplicado dos series de diluciones dobles del suero proble-
ma, aadiendo 50 L de SF a partir del segundo pozo en todos los pozos
d::: cuatro hileras (por ejemplo, A, 8 , C y D) . Proceder como se describi
en la pgina 123 . Desechar 50 L del ltimo pozo.
5. Prcp:irar tan1bin por duplicado dos controles con 50 L de SF y 50 L
de cada una de las suspensiones (control de eritrocitos del grupo A y
control de eritrocitos del grupo 8).
6. Aadir a todos los pozos de dos hileras (A y 8) 50 L de la suspensin
de eritrocitos del grupo A y a todos los pozos de las otras dos hileras (C
y D). 50 L de la suspensin de eritrocitos del grupo 8 .
7. Mezclar los inmunorrcactantes dndole unos golpes laterales a la placa o
rotndola varias veces . Cubrirla y dejarla en reposo a temperatura am-
biente durante 1-2 horas .
8. Observar los resultados. Las clulas aglutinadas forman una especie de
alfombra que cubre el fondo del pozo, y pueden tener los bordes retra-
dos dando una imagen de 'sombrilla" o formar un anillo. Las clulas no
aglutinadas resbalan por las paredes hasta formar un botn en el centro
del fondo del pozo. Comenzar la observacin por los controles, que de-
ben ser negativos (botones en el fondo del pozo) . Determinar el ttulo
que se corresponder con la mayor dilucin en la que se observa reac-
cin positi\'a Se pueden hacer extensiones en portaobjetos y observar la
reaccin al microscopio ptico con lente de menor o mediano aumento.
Los resultados se presentan en la forma indicada en la Figura 47. Para
calcular el swre se asigna el valor de 5 al ttulo, 1Oal mximo de aglut i-
nacin y valores entre 5 y 1O a las diluciones intermedias . Debe haber
una corr-:spondcncia entre los nmeros y las cruces . La suma de todos
los nmeros -..~ el 11..: ore . Es te \al or puede resultar til para estudios
cstadsttcus ~
7u
 Observacin - Aplicadores o varillas
No se puede utili zar sangre ni suero si no se les realiza las pruebas para - Pipetas
hepatitis By SIDA. Debe tenerse el cuidado de homogeneizar las suspen-
siones de eritrocit0s en el momento de aadirlas a los pozos, pues las clulas - Centrfuga
sedimentan rpidamente. Los tubos, pipetas y puntas que se utilicen para !a - Incubadora
sangre y los eritrocitos deben estar bien secos o endulzados con S F para
prevenir la hemiisis, as como enjuagarse inmediatamente despul!s de ser Mtodo
usados con agua corriente abundante . Hacer lo mismo con la placa de
microtitulacin ai concluir el ensayo. 1. Centrifugar la sangre 1Ominutos a 2 500 rpm. Eliminar el plasma y lavar
una vez las clulas con SF. Retirar d sobrenadante que, como el plasma,
debe ser incoloro y transparente.
Di lucin 1/2 1/4 tia 1/16 1132
2. Preparar dos suspensiones al 2 % con los dos tipos de eritrocitos, y
Observacin ~ ~ ~
microscp i ca \~ ~ \~

Resultados
en cruc~s ++ t t++ t+ ++
o .
..
aadir 150 L del sedimento celular a 6 mL de SF.
3. Disponer en una gradilla 11 tubos numerados del 1 al JO. El tubo 11
corresponde al control negativo (CN).
4. Aadir a cada uno de los JO tubos 1 mL de SF y en el primero agregar
+
1 mL del suero problema. Preparar diluciones dobles (pgina 123) y, al
Seor e 10 8 7 6 5 o;: 36 final , desechar 1 mL del tubo nmero JO. En el tubo 11poner1 mL del
suero problema sin dilu ir.
Figura 47 . Resultados de la aglutinacin .
5. Aadir a los 1Otuhos 0,5 mL de la suspensin de eritrocitos del grupo Q+.
Prueba huUrecta de Coombs para titular Al tubo nmero 11 agregar 0,5 mL de la su sp~nsin de eritrocitos del
antkueli'pos incompletos anti-D grupo o-.
Material 6. Mezcla r suavemente el contenido de todos los tubos e incubarlos 1 ho ra
- Suero problema a 37 C.
7. Centrifugar el contenido de los tu bos a 2 500 rpm durante 10 minutos y
- Sangre humana del grupo o+citratada o heparinizada
lavar los eritrocitos tres veces con SF.
- Sangre humana del grupo o-citratada o heparinizada
8. El ltimo lavado real izarlo a 1 000 rpm por 5 minutos . Retirar los
- Suero de Coombs (suero anti-IgG humana) sobrenadantes . Se puede decantar y escurrir.
- Salina fisiolgica
9. Aadir a todos los tubos 2 gotas del suero de Coombs .
- Tubos de ensayo 13 x 100 mm
10. Centrifugar 1 minuto a 1 000 rm .
- Tubos de centrfuga
11 . Observar la aglutinacin. Es recomendable utilizar un espejo cncavo .
- Gradilla Determinar el ttulo.
180
181
 - ~
Observaciones
Tener en cuenta las sealadas en la tcnica anterior. La observacin de los
resultados tambin puede realizarse colocando 1 o 2 gotas del contenido de
cada tubo sobre una lmina, extendiendo la gota y rotando la lmina . La
prueba directa de Coombs se utiliza para demostrar la sensibilizacin (recu-
brimiento) de los eritrocitos con anticuerpos anti-O. Estos anticuerpos pa-
san a travs de la placenta y reconocen el antgeno D en los eritrocitos
fetales. La prueba se realiza aadiendo el suero de Coombs a los eritrocitos
del recin nacido.
HEMAGLUTINACIN PASIVA
\
......
Una tcnica capaz de detectar hasta 0,2-0,4 g de anticuerpo es esta que
involucra la aglutinacin por anticuerpos de glbulos rojos sanguneos
recubiertos con antgeno. Debido a que este ltimo no es un componente
natural de la clula, la reaccin se denomina hemaglutinacin pasiva . Los
eritrocitos recubiertos con el antgeno se dice que estn sensibilizados y el
procedimiento por el cual se le acopla a la clula se nombra sensibilizacin
(Figura 45).
Los glbulos rojos de diversas especies se utilizan como soporte, ya que son
fciles de obtener, de ser mantenidos en el laboratorio y de estandarizarse.
A ellos se les puede acoplar prcticamente cualquier tipo ~e ligando. Es
posible utilizarlos frescos (entre una semana y un mes, conservados en una
solucin apropiada como la de Alsever) o bien momificados con fonnaldehdo
o glutaraldehdo, en cuyo caso alcanzan a conservarse hasta aos en conge-
lacin o liofilizados. Los hemates de carnero y humano son comnmente
empicados con estos fines . Los eritrocitos de.pavo, que son nucleados, rin-
den patrones de aglutinacin en tiempos ms cortos .
Solucin de Alsever:
dextrosa .. .. .. .. ....... .. ... .... .. ..... ..... 2,05 g
citrato de sodio ....... .. ............ .... 0,80 g
cloruro de sodio .. .... ........ .. ........ 0,42 g
agua destilada hasta .. ............ 100 mL
182
Ajustar pH a 6, 1 con cido ctrico al
1O % y autoclavcado a 0,5 atmsfera
15 minutos .
Utilizar una parte de solucin de Alsever
por una parte de sangre.
A los eritrocitos se les puede acoplar cualquier sustancia molecular o
macromolecular. La pureza del antgeno es muy importante, ya que las im-
purezas compiten por los sitios de unin durante la sensibilizacin. Casi to-
dos los polisacridos se adsorben espqntncamente al ponerlos en contacto
unos minutos con los eritrocitos. Tratndose de protenas, los glbulos rojos
deben someterse con antelacin al tratamiento con cido tnico. De modo
aparente las protenas ligeramente agregadas o parcialmente desnaturaliza-
das son adsorbidas con preferencia. Despus del tanado y la adsorcin, las
clulas rojas se guardan en solucin de suero al l % para prevenir su agre-
gacin espontnea. Si el tanado no funciona, el tratamiento con cloruro
crmico facilita la adsorcin de algunos antgenos proteicos, aparentemente
neutralizando la carga negativa de las clulas. Para finalizar, la unin de las
protenas puede efectuarse covalentemente a travs de reactivos bivalentes
(de cross-linking) como bisdiazobencidina o glutaraldehido (pgina 48) o a
travs de intermediarios carbodiimidas.
Para asegurar la especificidad de la reaccin, el antisuero debe ser previa-
mente absorbido frente a glbulos rojos no recubiertos, y un control de clu-
las rojas no recubiertas debe incluirse en cada ensayo. Anticuerpos del tipo
aglutininas contra eritrocitos heterlogos se presentan normalmente en la
sangre de varias especies animales. Los conejos poseen aglutininas que
rcaccionari con eritrocitos de curicl, caballo, carnero y humano. El suero
humano contiene anticuerpos contra eritrocitos de conejo, camero, buey,
caballo, curiel y paloma (Carpenter, 1969).
La hemlisis tambin debe ser prevenida descomplementando el suero. Para
ello se coloca en un bao de agua a 56 C durante 30 minutos con agitacin
suave.
La ventaja de la hemaglutinacin pasiva es que es mucho ms sensible que
la inmu noprecipitacin, ya que los eventos moleculares se transforman en la
aglutinacin de una estructura voluminosa: la clula roja. La especificidad
183
de la reaccin es la misma que en la inmunoprecipitacin. Si, por ejemplo,
clulas rojas nucleadas (eritrocitos de pavo) son recubiertas con un antgeno
y clulas rojas no nucleadas (eritrocitos humanos) con otro, la reaccin con
la mezcla de los dos antisueros especficos para cada antgeno da lugar a
dos tipos de agregados, que contiene cada uno un solo tipo de clula roja.
Uno de los problemas de esta tcnica es la variacin que puede haber en el
recubrimiento de antgeno, lo cual tiene un marcado efecto sohre la
detectabilidad de la tcnica. Adems, la IgM es 750 veces ms eficiente
que la IgG para causar aglutinacin. Finalmente, d titulo puede variar por un
factor de 2, simplemente debido a la subjetividad de las estimaciones.
Titulacin de anticuerpos contra un antgeno polisacardico
(de E. co/1) por hemaglutinacin pasiva
Material
- Suero problema
Sangre de camero en Alsever, citratada o heparinizada
2. Calcular el volumen que se necesita de sangre de camero atendiendo
a la cantidad de suero problema para absorber, para la sensibilizacin
y los controles, recordando que un volumen de sangre da aproxima-
damente la mitad de sedimento celular.
3. Lavar los eritrocitos tres veces con SF. Realizar las centrifugaciones
a 2 500 rpm durante 1Ominutos. Eliminar con pipeta el sobrenadante.
Preparacin del suero problema (dcscomplementacin y absorcin) :
4. Colocar el suero problema en bao de agua a 56 C durante Yi hora
con agitacin suave. Al cabo de este tiempo dejarlo 10-15 minutos a
temperatura ambiente.
5. Para la absorcin de posibles aglutininas mezclar en la relacin 1 mL
d sedimento celular: 1 mL de suero, homogeneizando suavemente la
mezcla y mantenindola durante i 5 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugar a 2 500 rpm durante 1O minutos . Extraer cuidadosamen-
te el suero absorbido (no arrastrar clulas; si esto sucede, volver a
centrifugar) .

- Solucin de antgeno polisacardico de E. coli (p. 32) Sensibilizacin:

- Salina fisiolgica 6. Preparar una suspensin de eritrocitos al 10 % en SF.

- Placa Takatsi 7. Mezclar 0,5 mL de la suspensin de eritrocitos al l O% con 0,5 mL de

la solucin de polisacrido de E. coli .
- Tubos de centrfuga
8. Incubar la mezcla J hora a 37 C.
- Tubos de ensayo
9. Lavar los hemates sensibilizados (recubiertos) tres veces con SF
- Pipeta Pasteur
para eliminar el antgeno libre.
Pipetas 1O. Aadir el volumen de SF necesario para hacer una suspensin al 2 %
- Guantes de los eritrocitos sensibilizados (ES) . Aplicar la ley de la volumetra.
Centrfuga Titulacin:
- Bao de agua 11 . Preparar una suspensin al 2 % de eritrocitos normales (EN) (no
recubiertos) para utilizar en los controles .
Mtodo
12. Preparar los siguiente.s controles:
Preparacin de los eritrocitos:
50 L de susp. al 2 % de ES + 50 L de SF
1. Colocarse los guantes y mantenerlos puestos durante toda la tcnica

184 185
 50 L de susp. al 2 % de EN+ 50 L de SF
50 L de susp. al 2 % de EN + 50 L del suero problema sin diluir
13 . Preparar por duplicado una serie de diluciones dobles del suero pro-
blema, aadiendo 50 L de SF a partir del segundo pozo en dos hile-
ras (por ejemplo, A y B) y proceder como se describi en la pgina
123 . Desechar 50 L del ltimo pozo.
14. Aadir a todos los poros de las dos hileras 50 L de la suspensin de ES .
15. Mezclar los inmunorreactantes dando unos golpes laterales a la placa
o rotndola varias veces. Cubrirla con una lmina de cristal y dejarla
en re>Qso a temperatura ambiente durante 1 hora o hasta el otro da .
16.0bservar los resultados, comenzando por los controles. Determinar el
ttulo de aglutininas. Proceder como en el mtodo directo (pgina 181 ) .
Observacin
Las mismas que se sealaron en el mtodo directo (pgina 180). El la\.ado
de los eritrocitos consiste, despus de separado el plasma por centrifugacin,
en aadirles y resuspenderlos con cuidado en 2-5 volmenes de SF u otro
diluente apropiado. A continuacin se centrifuga, se retira el sobrenadante y
se repite la operacin segn el nmero de lavados a realizar. Habitualmente
las centrifugaciones se realizan a 2 500 rpm durante 1O minutos .
Titulacin de anticuerpos contra un antgeno proteico
(lgG humana) por hemaglutinacin pasiva con eritrocitos tanados
Material
- Suero problema, sueros controles positi vo y negativo
- Sangre de camero fresca citratada o heparinizada, o eritroc itos fo n nolados
- IgG humana previamente calentada a 56 C durante 1 hora
- Salina fisiolgica
- Suero de conejo normal al 1 % en SF (SCN 1 %)
- PBS pH 7,2 ( 100 mL de SF :32,2 mL de KHl0 4 O,15 mol/L:76,0 mL de
Na2HP0 4 0,15 mol/L)
186
_ Placa Takatsi
_ Tubos de centrfuga
- Tubos de ensmo
- Pipeta Pasteur
- Pipetas
- Centrfuga
- Bao de agua
- Solucin de cido tnico (5 mg en 50 mL de SF)
Mtodo
1. Tomar los eritrocitos Si son frescos , centrifugarlos y lavarlos tres veces
con SF. El sobrcnadante debe ser incoloro y transparente. Si son
fom10lados , slo hay que centrifugarlos. Es suficiente 1 mL de clulas.
2. Preparar una suspensin al 1O % en SF.
3. Tomar 1 mL de la suspensin para pr~parar el control de clulas norma-
les (EN) y adicionarle 2 mL de SF.
4 . Tomar 4 rnL de la suspensin y adicionarle 6 mL de la solucin de cido
tnico para preparar las clulas tanadas (ET).
5. Incubar ambos tubos (EN y ET) a 37 C durante 15 minutos .
6 . Centrifugar y lavar las clulas una vez con aproximadamente lO mL de SF.
7. Resuspender los EN en 3 mL de SF y los ET, en 6 mL del mismo diluente.
8. Tomar 1,5 mL de la suspensin de ET y adicionarle l,5 mL de SF para
preparar el control de ET.
9. Mezclar los 4,5 mL restantes con 4,5 mL de solucin de lgG humana
previamente calentada, para sensibilizar los eritrocitos (ES) .
10. Incubar los tres tubos (EN , ET y ES) a 37 C en bao de agua durante
30 minutos, centrifugarlos y lavar las clulas tres veces con SF.
11 . Rcsuspendcr los EN y los ET en 4 mL del SCN 1 % v los ES, en 12 mL,
para una concentracin del 2-2 .5 % .
187

12. Para la titulacin preparar con SCN 1 % diluciones dobles del suer
problema (50 L) previamente descomplementado y absorb ido (p
gina 185 ), as como de los sueros controles
13 . Adicionar a todos los pozos 50 L de los ES .
14. Preparar los siguientes controles:
50 L de EN + 50 L de SCN l %
50 L de ET + 50 L de SCN 1 %
50 L de ES + 50 L de SCN l ~
15 . Rotar la placa para mezclar los inmunorreactantes y dejarla en reposo
temperatura ambiente l hora o hasta el da siguiente.
16. Determinar el ttulo de anticuerpo~ . Se puede proceder como en el m
todo directo (pgina 181 ).
Observacin
Se pueden momificar los eritrocitos, lo que permite contar con un lote d
clulas de caractersticas similares por un largo tiempo, y rea lizar 1
hemaglutinacin con estas clulas estabilizadas, las cuales mantienen mu
chas de las propiedades de las clulas frescas . En este caso no es necesari
la descomplementacin de los sueros a titular.
Determinacin de receptores para complemento tipo 1 (CRl)
sobre eritrocitos humanos mediante una mirrotcnica
de hemaglutinacin pasiva
_ Eritrocitos humanos previamente lavados con salina fisiolgica
_ Anti cuerpo monoclonat anti-CRI
_ Antic uerpo policlonal anti-lgG de ratn
- PBS
M todo
l. Preparar diluciones dobles det anticuerpo monoclonal anti -CRl en PBS
para un volumen de 25 L .
2 Adicionar a cada pozo 25 L de una suspensin de eritrocitos al 0,5 %.
3 Incubar 1 hora a 4 "C.
4 Lavar dos veces las clulas con PBS.
5. Rcsuspcndcr los eritrocitos en 25 L del anticuerpo anti-IgG diluido con-
venientemente en PBS .
6. Dejar rex>Sar la placa de microtitulacin 1 hora a la temperatura del cuarto.
7. Registrar la aglutinacin usando los patrones de sedimentacin despus
de inclinar casi a posicin vertical la placa 1O minutos (mtodo de la
lgrima) . Los eritrocitos no aglltinados drenarn dando un patrn pare-
cido a una lgrima y las clulas aglutinadas permanecern adheridas al
fondo de los pozos . Los resultados de actividad de CR 1 alta, intermedia
y baja se darn de acuerdo con la tab la siguiente:
Actividad alta Ttulos >256
Actividad intermedia T tu los 64: 128 y 256

Los receptores para C3b (CR I) han sido demostrados sobre muchos ti Act ividad baja T tu los< 64
celulares, incluyendo los eritrocitos humanos. La actividad sobre eritrocit,
est genticamente regulada y tres fenotipos, caracterizados por el nme Prepa racin de eri trocitos formo,ados
de receptores (alta, intermedia y baja), se han encontrado en poblacion
Materia l
normales. Estos receptores estn asociados con la e liminacin
inmunocomplejos circulantes . La tcnica se lleva a cabo en un equipo - Sangre recin extrada citratada o hcparinizada
rnicrotitulacin y utiliza un anticuerpo monoclonal murino anti-CR 1. - Salina fisi olgica
Material - PBS pH 7,2 (1 00 mL de SF:32.2 mL de KHl0 4 O, 15 mol/L :76.0 mL de
Na:HP0 4 0,15 mol/L)
- Equipo de microtitulacin
189
188
- Solucin acuosa de fonnaldehdo al 3 %
- T1merosal al 10 %
- Tubos de centrfuga
- Pipetas
- Centrfuga
- Zaranda
- Incubadora
- Bulbos de cristal
Mtodo
1. Tomar la sangre recin extrada (en el da), centrifugarla y lavarla cuatro
veces con SF y una vez con el PBS.
2. Preparar una suspensin al 10 % en el PBS .
3. Mezclar la suspensin con un volumen igual de fonnaldehdo al 3 % .
4. Dejar la mezcla en agitacin a 37 C durante 18 horas .
5. Centrifugar y lavar los eritrocitos cinco veces con SF o agua destila-
da .
6. Preparar una suspensin al 1O % en SF o agua destilada y a adi rle
timerosal como preservativo para una concentracin final del 0,02 % .
7. Dispensar a razn de 5 mL en bulbos de cristal y conservarlos a 4 C.
Tambin pueden gua rdarse en congelacin o ser liofilizados .
INHIBICIN DE LA HEMAGLUTJNAC IN
Una vez que el ttu lo de anticuerpos en el suer~ se determin, este ensayo
puede resultar til. Para ello, a cantidades constantes del antisuero (a una
concentracin dos veces mayor que la concentracin limitante para proJu -
cir aglutinacin) se le adic ionan cantidades va1 iablcs de antgeno libre, y sc
incuban 15-30 minutos a temperatura ambiente o a 3 7 C'. A continuacin se
aade la stspcnsin de eritrocitos sensibilizados La aglutinacin se inh1hc
cuando la mitad o ms de los sitios dcl anticuerpo cstan ocupados por antgeno
1(/()
libre . Este es el principio de los ensayos de inhibicin de la aglutinacin, que ~
se caracterizan por una elevada detcctabilidad . Del mismo modo, la agluti-
nacin por anticuerpos de glbulos rojos recubiertos del antgeno especfico
puede inhibirse incubando previamente el anticuerpo con suero anti-idiotpico.
Esto provee de un ensayo sensible para la deteccin y cuantificacin de
anticuerpos anti-idiotpicos, que reaccionan con la regin variable del anti-
cuerpO . bloqueando estricamente la unin del antgeno (Berzofski and
Bcrkower. 1986 ).
AGLUTINACIN CON PARTCULAS DE LTEX -k
Las partculas de ltex son e~fer;ts microscpicas constituidas de polmeros
de estireno.J..as partculas ms empleadas en los ens yos serolgicos son
de 0.8 1ro de dimetr~ son mu~ .lllifonnes en su tamao, Por la presen-
cia en su superficie de grupos sulfato estn cargadas negativamente y se
repelen entre s, mantenindose en suspensin.
La caracterstica ms importante de estas entidades es_g_ue fonnan suspen-
siones estables que puaj~n ser de~estabilizadas...ines.pecftcamentiij:>oreje1-
plo. con cido tricloroacticol ~ es~ ficamcnte y ba~ciones contro-
ladas. como una r~ccin ant~eno-anticuerpo . Cuando estn recubiertas o
sensibilizadas con un ligando, tal como antgeno o anticuerpo, las partculas
asumen las propiedades de este ligando, y fonnan coloides liofilicos estables
que se agregan cuando reaccionan con el reactivo correspondiente.
Los ligandos son umdos a las partculas de ltex por dos mtodos: adsorcin
pasiva o simp le y unin covalente . La adsorcin pasiva se prOduce cuando
csro'n tancamente y al azar las molculas del ligando se unen a la superficie
de la x1 rt cula. recubrindola con una doble capa molecular. La interior se
rnanticnl! firmemente unida por enlaces no covalentes, en la mayora de los
casos por interacciones hidrofbicas entre los aminocidos hidrfobos de la
protena~ las regiones no cargadas de la superficie del policstireno . La capa
1.' \lcnor est dbi lmente u111da . y pt1t.:de ser removid:i por lavado. lo que en
l)C,1.,.1n1K's fl(' es necesario. Esta rcaccion se p roduce tan rpidamente que
en 1 n ' ininutos d 98 % del ligando queda adsorbido Fl ligand~ debe
111 tl11n 1~e lo mis puro posible Adems de su concentracion. otros factores
, n1lln In temperatu ra. d pl I. l;i prcsc11c1;i de sust;inci.:t<; tcns0act1\as ~ b
'l lll"t.1111~ dielctrica del medio pueden alrct;ir la ad'>orc11)1J ,id ti~:i ndo
14 1
La albmina es utilizada frecuentemente, a una concentracin final de O, 1-1 %, .ft /0l<'
1 1

como agente estabilizador de los reactivos de ltex. Las molculas de Por .::ida rnil dm.o de G BS qu..: contiene 500 g de lgG humana, adicionar
albmina ocupan los espacios vacos sobre la superficie del ltex y forman u. 1 m L dt.: la suspcn:,ion de latcx al 1O % .
multicapas de estabilizador que se encuentran en equilibrio con las mol- ..:\!I,Jtar la mezcla vigorosamente durante l hora a 37. Coa temperatura
culas en solucin . Por otra parte, el exceso de albm ina conlleva a un :ur:bi.:ntc
aumento del nmero de multicapas, lo que dificulta la unin del antgeno y el
~ \"1:.i1; a b suspensin de ltex albmina y azida sdica para una con-
anticuerpo.
cc11trac1n fina l del O 2 y O, l % , respectivamente.
La desorcin del ligando casi siempre es mnima o nula si el ltex se lava
Agitar !a suspci~sn 30 minutos de fonna vigorosa .
se guarda en el mismo tampn que se us en la adsorcin y no se somete
cambios bruscos de temperatura. ' E:i'>ayar la estabi lidad de l reactivo. Para ello colocar sobre una lmina o
p<rtaobJdus 25 L de la suspensin de ltex y 50 L de GBS. Mezclar
Se recomienda prevenir el crecimiento microbiano aadiendo azida sdica ..:11 fonnJ c1rcular y obscna r durante 3-5 minutos, manteniendo la agita-
tirnerosal (concentracin final del O, 1 %) a la suspensin de ltex. cin S1 fuera inestable el reactivo, es decir, si aglutinara, aadir al bmina
hasta una concentracin finctl m-x1rna del 0,4 % .
Preparacin de un reactivo de ltex (, Ens:iy:ir d react ivo frente a un suero positi\o (que contenga Ac contra
para anticuerpos anti-IgG humana b l,;(1 humana) ) un suero negati vo.
Materia/ 7 Conscrva r en frio, evitando su congelacin . Estos reactivos pueden man-
tener~: \, ..:n buenas condiciones hasta 2 aos o ms de preparados .
- IgG humana pura en GBS
- Ltex de poliestireno de 0,81 m al 1O % Titulacin de a n tic uerpos median h:: agl u tinacin
- Salina tamponada con glicina (GBS) (glicina 0,2 mol/Len salina fisiolgi con partcu las de ltex
ca, pH 8,2)
Maten al
- Albmina bovina o humana al l O % en GBS
Reactivo de ltex recub ierto con lgG humana
- Azida sdica al l O %
Suero problema anti-IgG humana
Bulbos de cristal
Controles positi vo y negati vo
- Pipetas - Salina tamponada con glicina (GBS) pH 8,2
Incubadora a 3 7 C - Placa de microtitulacin pa ra hacer las diluciones del suero problema
'
Zaranda - Portaobjetos o lminas para aglutinacin
- Portaobjetos - Pipetas

- Varilla o aplicador - Apl icadores o varillas

- Bombillo flu orescente
'\

192 193

Mtodo
l . Sacar los reactivos del fro y dejar que tomen Ja temperatura ambic-nte.
2. Preparar con GBS las diluciones del suero problema ut1hz.a.ndo la placa
multipozos .. Un volu men de 100 L de cada dilucin es suficiente .
3. Agitar el frasco del reactivo de ltex para homogenc1zarlo bien.
4. Dividir un portaobjetos en tres campos de reacc in En uno de ellos
colocar 50 L del control positivo; en el siguiente. 5U L del control
negativo; y en el tercero, 50 L del suero problema si n diluir ( olocar al
lado de cada una de las gotas 25 L de la suspensin de ltex . Mezclar
bien con tres varillas diferentes y rotar la lmina
5. Observar los resultados en 2-3 minutos, pues ms all de este tiempo !as
preparaciones se alteran por la C\aporacin del agua . La observacin se
facilita con luz fluorescente tangencial al mantener la limma sobre un
fondo oscuro.
6 Continuar del mismo modo con el resto d~ las dilu ciones dd suero pro-
blema.
7. Determinar el ttu lo y asignar cruces atendiendo a la intensidad de la
aglutinacin o al tiempo de su aparicin.
Observacin
Puede no haber aglutinacin a concentraciones altas del anticuerpo (fen-
meno de prozona, pgina 166).
Determinacin de la concentracin ptima de sensibilizacin
en un reactivo de ltex para factor reumatoideo (FR)
Los factores reumatoidcos son autoanticuerpos contra la lgG o la lgA lige-
ramente desnaturalizada, usualmente de la clase lgM, encontrados con fre-
cuencia en el suero de pacientes con artriti s rcumatoidea Ellos reaccionan
con la IgG humana o animal que ha sido agregada por calor o combinada
con e l ant geno, pero no con la IgG normal . Para detectar facto res
reumatoideos (FR) se emplean generalmente partculas de ltex recubi ertas
con IgG o IgA que son "glutinadas por esos factores. Los FR humanos
194
n:accionan con lgG de otra::. cspccH.:s animaks Sustancias similares al FR
ht1nK1110 se han encontrado en el suero de carneros y animales de otras
l.SpCC Je~ .
t\ la hora de preparar un reactivo de ltex para un inmunodiagnstico, es
preciso <lctcnn inar l.l c;)lccntracin ptima de inmunorreactante para la
5,:ns1b1 l1za cin , que permita detectar los niveles patolgicos .
Material
Los mismos que para la preparacin de un reactivo de ltex para anticuerpos
anti-lgG humana y, adems, sueros controles positivo y negativo.
:\fr1odo
I. Preparar en GGS las sigu ien1es soiucioncs de IgG humana : l 000; 800;
600: 500: 400: 200 y 100 g/ niL . F.s ~ uficiente 1 mL de cada una.
2 \ adir a 1 mL de todas las diluciones O.! mL de la suspensin de ltex.
3 Agitar los bulbus en zaranda rotatona durante 2 horas a 37 C.
4 Etml\ar la estabilidad de los siete reactivos . Para ello colocar sobre un
portaobj.:!tos 25 L del react ivo y 50 L de GBS ; mezclar las 2 gotas con
una vanlla; rotar la lmina y obsef\/ a r.
:'i. S1 el reactivo es inestable, es decir, si ;:glutina. aadlf albmina al 1O% a
razn de 20 L por frasco.
6. Agitar 15 minutos ms .
7. Ensayar de nuevo la estabilidad .
8. Los reactivos estables se enfrentarn a los sueros positivo y negativo
(50 L del suero y 25 L de la suspensin de ltex) . Medir el tiempo que
demora en aparecer la aglutina<;:in .
9. Seleccionar aquel reactivo que presente la mejor aglutinacin en el me-
nor tiempo.
Observacin
El suero cont rol positivo pa ra FR ya est dilu ido adecuadamente; las mues-
tras a procesar se dilu irn 1:20 para su ensayo.
195
Cuando el reactivo de lte\. debe aglutinar en una gama de co11C1..11trac1011cs 2. Agregar 25 L del reactivo de ltex (por ejemplo, el de mioglobina).
del analito. ser neces:trio ensayar los diferentes r~ct1\ os frente a esas Homogeneizar bien la mezcla. Rotar la lmina y observar el resultado.
concentraciones ~ seleccion:n aqud que sea capaz de disi.ingu1r los ni1 cks
patolgicos de los no pacolgicos. E..;c es el ca~o dd rcact1\ o de btc' para
mioglobina humana, que se recubre con ai1ticuerpos anti-mioglobma. d cual
debe aglutinar por encima de 60- 70 ng de mioglobina por md1htro de suero.
ya que los valores patolgicos estan por encima de l 00

Preparacin de una solucin de absorcin

para factores reumatoideos
Los FR presentes en el suero de los pacientes pucJu1 da r lugar a r~~ult4do~
falsamente positivos en los ensayos scrok>gicos Para.;\ 1ta1 :"tn 1111,', f..:r..::.
cia se preparan soluciones de absown que bloquean L.sto:> fctwes

Material
- IgG humana al 1O %
- Bao de agua a 56 ''C
Centrfuga
- Control positivo del reactivo de ltex para FR (EPB c.J. Finlay")

Mtodo
1. Calentar la IgG en bao de agua a 56 C durante 2 horas .
2. Centrifugarla a 12 000 rpm durante 2-3 minutos. Guardar el sobrenadante
(solucin de a bsorcin) y desechar el precipitado.
3. Comprobar su accin bloqueadora frente al suero control positivo del
reactivo de ltex para FR.

Ensayo del reactivo de ltex con el empleo

de la solucin de absorcin
Mtodo
1. Colocar en la lmina 50 L del suero problema o de su dilucin y al lado
1O L de la solu cin de absorcin , Mezclar bi en unos segundos para que
ocurra la reaccin entre los posibles FR y la IgG arcg ada .
197
196
 CAPTULO V
INMUNOENSAYOS ENZIMTICOS

Los inrnunocnsayos enzimticos ::e basan en importantes fenmenos biol-

gicos : 1) el extraordinario poder discriminatorio de los anticuerpos y 2) el
poder cataltico y la .:specificidad de las enzimas, que pueden, a menudo, ser
detectadas con gran ~aciliaad .
Los EIA integran una estrategia dual : la reaccin entre los irununorreactantes
(antgeno y su correspondiente anticucrpo) y-id deteccin de esa reaccin al
empicar como indicador una enzima conjugada al antgeno o al anticuerpo
(Figura 48), o a un tercer compuesto como, por ejemplo; la protena A (SpA)
(Figura 49) .

Producto
Sustrato colorea.do
Ag Ac-E o
<>> . E ~
o'
o
J

Reaccin Ag+Ac Reaccin enzima+ sustrato

Figura 48. Estrategia dual de Jos EIA

199
 EIH: del ingls enzyme immunohistochemistry (ensayo histoqumico
inmunoenzimtico).
.
Producto CELISA: del ingls ce/111/ar enzyme l~nked immunosorbent assay (ensa-
Ag SpAE Sustrato coloreado

Ac ,.0 inmunoenzimtico celular sobre fase slida).
o
<>> Cf . O-e
o

ELISA-DAS : del ingls ELISA sandwich double antibody (ELISA sand-
wich de doble anticuerpo).
ELI SA-HADAS : del ingls EL/SA sandwich double antibody with
heterologous antibody (ELISA sandwich de doble anticuerpo con anti-
Reaccin Ag tAc Reaccin ActS~ Reaccin enzima +sustrato cuerpo heterlogo).
Figura 49 . Ensayo irununoenzimtico con protena A (SpA). ELISA-CAB : del ingls ELISA-avidinlbiotin complex (ELISA-complejo
av1dina/biotina).
Los EIA tienen especificidades y detectabilidadcs similares o superiores a ' .
los radioinmunoensayos (RIA), y presentan algunas ventajas sobre estos, PAP : del ingls POase-antiPOase comp/ex (complejo POasa-antiPOasa) ,
aunque tambin tienen sus inconvenier.tes y riesgos. Se emplea fundamentalmente en los EIH.

VENTAJAS DE LOS EIA (Tijssen, 1985) CLASIFICAON DE LOS ETA

1. Sensibilidad, detectabilidad y especificidad muy altas.
2. Equipamiento relativamente barato.
3. Rapidez y simplicidad en su ejecucin.
4. Reproducibilidad elevada y evaluacin objetiva.
5. Factibilidad de ejecucin en condiciones de campo.
6. Ningn riesgo por radiacin.
7. Reactivos relativamente baratos y de larga vida.
8. Versatilidad notable por la gran variedad y especificidad de las enzimas .
9. Todas las ventajas de los anticuerpos monoclonales cuando estos se in-
corporan a los EIA.
Numerosos mtodos inmunoenzimticos han sido desarrollados, algunos de
los cuales se han identificado por siglas:
ELISA : del ingls enzyme linked immunosorbent assay (ensayo
inmunoenzimtico sobre fase ~lida) .
Ls EI A pueden dividirse, de auerdo con sus diferencias esenciales, en:
EIA basados en la amplificacin de la actividad (tipo AA) y en la modula-
cin de la actividad (tipo MA). Aunque no se corresponden siempre con los
ensayos no competitivos y cpmpetitivos, a menudo se relacionan los ensa-
yos tipo AA con los no competitivos y los del tipo ~1A, con los competitivos.
Tanto en los ensayos AA homogneos (de un solo paso) como en los
heterogneos (de varios pasos), se emplea un gran exceso de
inmunorreactante para obtener una seal mxima del compuesto que va a
ser chequeado (analito). Esto est en correspondencia con la ley de accin
de masas e implica que -aun a muy bajas concentraciones de las molcu-
las- una elevada fraccin reaccionar@ ! _inmunorreactante se adiciona
en excesa1 El lmite terico del nmero de molculas detectables por los
mtodos AA es 1, pero en la prctica se detectan hasta aproximadamente
104 molculas.
Por su parte, Jos mtodos MA. dependen de la modulacin de la seal
enzimtica debido a la competencia del analito por el inmunorreactante. A
?iferencia de los mtodos AA, la sensibilidad de los ensayos MA se
mcrementa a concentraciones ms bajas del inmunorreactante, ya que -a

200 201
 bajas concentraciones- una variacin en la cantidad de molculas que co
piten tiene un efecto mayor sobre la interaccin con las especies marca
:Una cantidad constante de anticuerpo requiere menos antgeno para la
1
, tra~in del 50 % de sus sitios de combinacin si su afinidad es mayor.
constante de afinidad es, por tanto, de la mayor importancia en los ensay
del tipo MA. El lmite de det~~... de estos ensayos tan1bin depende d
J\'fTODO ELJSA
Este mtodo fue descrito primeramente por Engwall y Perlman ( 1971 , 1972),
quienes - para titular inmunoglobulinas- utilizaron como inmuno~rben!-CS' .
tubos de pohestireno . .Un paso importante en el desarrollo del ELISA lo
dieron Voller y sus colegas (1974 ), al realizar la tcnica en microplaca de

'
error-..e xpe.rimqltal (Ee) , siendo~ la cantidad mnima de analito que pu
de ~ei: --dete ctada.
La detectabilidad de los EIA tipo AA es potcncialrt1cnce superior a la de 1
mtodos MA. Por lo general la exactitud y detectabilidad de los ensay
MA son menores que las que se obtienen con marcadores radioacti vos e
. pliestireno y sugerir su empleo en la titulacin de anticuerpos inducidos por
agent es infecciosos .
Al estar el antgeno o el anticuerpo mareado con una~ y adems
nsolubifufilio sobre el inmunoadsorbcnt~. Ja reaccin antgeno-anticuerpo
q'tcda inmovilizada y puede ser fcilmente revelada por la adicin del sustrato .

los RIA . Por otra parte, los _!n.todos AA t ie nen potencial me nt que. al actuar la enzima, produce un coJ,or observable a simple vista o
detectabilidades mucho mayores q_ue l9s an lisis de saturacin por RIA. cuant ificable mediante un espectrofotmetro o colormetro. A menudo la
coloracin se logra o amplifica con el empleo de cromgenos.
e!- especificidad de los ensayos inmu'nocnz_ftticps est determinada por 1 Desde 1977 hasta hoy da se observ~ un auge creciente en la aplicacin de
mteraccin Ag~Ac) as como tanlbin por factore&,del medio. La no espec
los EIA y, muy en particular, de los ensayos sobre fase slida (ELISA),
ficidad de la reaccin inmunolgica puede deberse a dos fenmenos : 1
siendo ejecutados y desarrollados en numerosos laboratorios . Ellos constitu-
reactividad compartida y la reactividad cruzada.-1( Figura 50) . La especific
~cn uno de los mtodos de diagnstico de enfermedades, tanto ~n el hom-
dad de un antisuero policlonal es, generalmente, may.o r que la de su
bre. animales y vegetales, ms extensan1ente utilizado en ,fl.Jllisis rutinarios,
anticuerpos individuales .
as como en progran1as de investigacin. Algunas de S.U~ \lah~tes permiten
la cuantificacin de antgenos o anticuerpos con gran exactitud y precisin .
'

>-< >--<
)-(
]~
- }--(
}-[
- )-(
VARIANTES DE ELISA
La variedad de EIA sobre fase slida (ELISA) puede tender a confundir
tanto con respecto a su ordenamiento como a sus requerimientos (chequeo
de antgeno o anticuerpo, con alta especificidad o alta detectabilidad). Sin
Ag especfico Ac contra A Ag con reactivida embargo, un anlisis de los diferentes ELISA revela que, independiente-

HG,
compartida

t}H
mente del diseo, siempre pueden disti nguirse tres etapas :

....__ }-{ - 1. La unin a la fase slida del inmunorreactante de ca ptura.

2. La incubacin con la muestra a chequear para que las molculas del
analito se siten o compitan por la segunda capa .
lntera~cin homloga Ac contra A
Un paso de amplificacin en los ensayos AA, el cual puede contener varias
Figura 50. Reacti viciad compartida (arriba ) y cruzada (abajo). capas de inmunorrcactantes. Este paso de amplificacin es posible tanto en
los ensayos no competitivos como en los competitivos indirectos (Figura 51 ): .
202
203
 ,. dt lw sealar que. con muy raras cxccpc1oncs. slo una capa de antgeno
~~ 5 Lfll~'lca. bien como molcula de captura (R l ), en la muestra (R2) o en el
S'-
]] pJsc Je amplif~cac1on ( R3 ) en los mtodos de captura de clases de
~ r
o
e:
QI
- ~"'
11 n11noglobu lin.1"

<t <t
-
..._

<t
CJI
e: ~i
. .B
! Fi H ISA/ hi.:tcrngn~ que es el ms difundido, tiene vanas etapas Se
rc:1l11:tla acfic1~1cncial de una serie de reactivos. incubacin,. lavados
~~ -~
<t ~ C\I ,,nn..:Jio:. A continuac1011 se presentan slo algunas de las , ariantcs ms
tt: 11

~ < ~ > ttid 1.adas

1
1 1 >-. "' ~
oQ. .(]
u~ ~
-=
... ii ~ . l 1 ISA no competitivo con antgeno fijado .

~-
QI
.1 I~ fase slida (mtodo directo)'
~~~
~

...
-~

~ ~:t 1-+- -
. a::
e:
<t
a::
b ., g
i~~
~ g
~ cr u
o .!5

3. Sustrato
g~ ~ o
'O
E J1 ~ s 2. Ac -enzimo

~ l..J.J
:: ! .!!. ..8
e:
~

~ a
"' i] ~
:; e: J.!
O <,,? ~~ J 1. Antgeno

= t.:J - Figura 52 ELISA directo

;;;~~
..2 e~ ~
~ ~ ,
...
o
g ;\~
C0nsta de las siguientes etapas:

ci.' . ~. .
:::>. -e: !:I
u i. F1.1acin del antgeno. Lavado para eliminar el reactivo fijado del>ilmcntc
~ u e:

-~~ ~i :
-

~ ~
u

ij
o no fijado. Bloqueo y lavado.
\

2 Adicin del anticuerpo marcado con la enzima . Si el anticuerpo reaccio-

1 u - ... na con el antgeno, el complejo queda insolubilizado. Lavado para elimi-
L----------1 i5 Q,. "'
Si ~~ nar las molculas de anticuerpo que no reaccionaron
tj

_ 1-~-~a .t .E u -
5 Adicin del sustrato de la enzima. Aparicin del proJucto coloreado
61> sjl
-
-8 ~
o e:
111"'
:s 4 Paralizacin de la reaccin y_lectura .
1 fil :2 Est:i. \ariante .se emplc~ frecuentemente parJ la titulacin de los conjugados
o...; ~9"i.::14 anticuerQo-cnzima.\ Puede utilizarse como mtodo diagnstico para detectar
; >-.:a ~-:.!3 en este caso no se bloquea la placa. Tiene como des\cntaja el alto
00~ ~ hackgrmmd (color de fondo) y su alta dependencia de los factores de ddu -
: ~ :! c111 rc::.ultados ptimos slo se obtienen en una 'gama reducida de di lucio-

205
nes, debido a la competicin por protenas no especficas o a la msuficiencia
de antgeno para cubrir todos Jos sitios disponibles sobre la fase slida.
ELlSA no competitivo con antgeno fijado
a la fase slida (mtodo in di recto)
4 . Sustrato
3 . Anti -1g-enzimo
2. Anticuerpo
1 . Antgeno
Figura 53 . ELISA in<l1n:cto
Consta de las sigui~tes etapas :
1. Fijacin del antgeno. Bloqueo y lavado .
2. Adicin de la muestra. Sus anticuerpos reaccionan con el antgeno inmo
vilizado . A ellos se les denomina primer anticuerpo
3. Adicin de anticuerpos anti-inmunoglobulina conjugados con la enzim
(segu ndo ant icuerp.o) . Ellos reaccionan con el prime r anticuerp
Lavado para eliminar la anti-inmunogl obu li na qu e no haya reacci o
nado .
4. Adicin del sustrato.
5. Paralizacin de la reaccin y lectura.
Este mtodo se emplea para detectar anticuerpos lgG o IgA. Tiene al
detectabilidad, ya que varias molculas de anti-l g ma rcadas reaccion
con cada molc ula del primer ant icuerpo y l Ac ant -Ig st obtiene d
suero hiperinmune. Cuando se buscan anticuerpos del isotipo IgG, el se
gundo anticuerpo puede sustituirse por protena A o protena G conj uga
con la enzima.
206
FLISA no competitivo con anticuerpo fijado a la fase slida
(mtodo .m nrlwich directo o ELISA-DAS)
o o 4 . Sustrato
3. Ac-enz imo
2. An t geno
1. Anticuerpo
Figura 54 . EIJSA sandwich di recto.
Cuida de las siguientes etapas:
F1.1 acin del anticuerpo . Lavado para eliminar los a ntic ue rpos
dcficcntemente adsorbidos o no adsorbidos. Bloqueo y lavado
2 Adicin de la muestra Si contiene el antgeno este es capturado por el
ant icuerpo. Lavado.
~ Adicin del mismo anticuerpo conjugado con la enzima . Lavado.
-t. Adicin del sustrato.
5 Paralisis de la reaccin y lectura .
Los mtodos sandwich se utilizan para detectar y ~~antificar antgenos . Un
requisito que d~ cumplir <?1 antisuero pol iclonal es la presencia de anticuerpos
que reconozcan, al menos, dos ep1topos convenientemente situados en la
molcula de antgeno (epitopos opuestos) Tambin pueden emplearse dos
anticuerpos monoclonaJes que reconozcan taks sitios . Para la cuantificacin
de. antgeno es necesario disponer de una sene de estndares de concentra-
cin conocida del mismo, con vista a establecer la currn de calibracin
ELISA no competitivo con anticuerpo fijado a la fase slida
(mtodo sambvich indirecto o ELISA-HADAS)
Consta de las siguientes etapas:
1 Y 2. Anlogas al ELISA sanchtich directo
Adicin de anticuerpo especfico para el antgeno a detectar obtenido en
una l'SPl'Cic riistinta a la del anticuerpo de captura . Lavado.
20 7
 5 1 la densidad ptima es anloga en aj y en b), el antgeno no est presente
en la muestra . Si hay diferencia. el antgeno est presente. La diferencia de
absorbanc ias es p1 oporcional a la concentracin del analito. Para cuantifi-
5. Sustrato
car se utilizan varias concentraciones del antgeno estndar para hacer la
4, AntiIg-enz1ma curva de titulacin.
3. Ac heterlogo
2. Anti;eno ELJSA de competicin con antgeno fijado a la fase slida
1. Anticuerpo
Figura 55 . EUSA .s1111d>11ch mdmxto

4. Adicin de anti-irununoglobulina espccfica para el anticuerpo di.: b eta-

pa 3 conjugada con enzima. La\ado.
...,...
3. Su3tr.
/dor:z
O
5 Adicin del sustrato.
6. Paralizacin de la reaccin y lectura
,t 2, Ac-E
1. Ag
2.AcE+Ag mueatral

Figura 57. ELISA de competicin con Ag fij ado a la fase s01ida.

ELISA de competicin con anticuer po fijado a la fase slida
Consta de las siguientes etapas :
t. ~ 1. Fijacin del antgeno. Lavado. Bloqueo y lavado.

o 0 o.f o o o 0 o o o
3 . S1;str. o
0
3 . Sus1r. 2. a) Adicin del anticuerpo conjugado con h enzima. Lavado.
2. Ag-E O _ } j 2.Ag-E+Ag b) Adicin simultnea del anticuerpo conjugado con la enzima y la mues-
muest ro tra. Lavado.
1. Ac
...____,..___ 1. Ac 3. Adicin del sustrato.
Figura 56. ELISA de co1npeticin con Ac fijado a la fase slida. 4. Paralizacin de la reaccin y lectura.

Consta de las siguientes etapas: Si la absorbancia es anloga en a) y en b), el antgeno no est presente en la
muestra. La diferencia de absorbancias es proporcional a la concentracin
1. Fijacin del anticuerpo . Lavado. Bloqueo y lavado. del analito. Al igual que en el ELISA de competicin con anticuerpo fijado a
2. a) Adicin del antgeno homlogo marcado con la enzima . Lavado. la fase slida, la densidad ptica disminuye con la concentracin de antgeno.
Los ensayos de competicin no requieren anticuerpos contra dos epitopos
b) Adicin simultnea del antgeno marcado con la enzima y la muestra. diferentes del antgeno, como en los mtodos sandwich, por lo que pueden
Lavado. ser una alternativa cuando slo se dispone de un anticuerpo monoclonal o de
3. Adiciu del sustrato. un policlonal que no rena condiciones para el sandwich. Para cuantificar
se utilizan varias concentraciones del antgeno estndar para hacer la curva
4 . Paralizacin de la reaccin y lectu ra.
de titulacin.
208 209

ELISA amplificado con ti complejo avidina-biotina
Existen varios sistemas de reconocimiento no mmuriolgico qu e se emplean
en los inmunoensayos como sistemas auxiliares . Los ms popu la1 cs :5on el
complejo avidina-biotina,*la protena A y las lectinas .
El sistema avidina-biotina (AB) se ha convertido en una importante herra-
mienta para los EIA debido a que: 1) la avidina tiene una afinidad excepcio-
nalmente alta pvr la biotina (10 1~ M-1). 2) la biotina puede ser flmcntc
acoplada a los anticuerpos y a muchas enzimas sin prdida de su acti\idad .
3) la avidina es muy estable y ti ene varios sitios de unin. por 10 que puede
ser usada, como la protena A, como una molcula puente entre dos rnok:-
cu las biotiniladas (Figura 58) . El empico de l s istema A.B prod uce
detectabilidades superiores y bajos hackgro11nd en los EIA
r 1- igura 59. Recubri miento d.:: los espacios vacos (bloqueo).
Anticuerpo I Enzima
morc".ldo morcada
con
Avidino
O1 cor,
biotina ~ i otin a
Figura 58. Puente con l sistema avidina-hiotina (amplificacin).
ALGUNAS CONSIDERACIONES PRCTICAS
Para la ejecucin de las tcnicas ELISA normalmente se utilizan placas de
poliestireno o cloruro de polivinilo, de fondo plano y 96 pocillos con capaci-
dad de 350 L cada uno.
El tapiz.a.do o recubrimiento de la fase slida debe realizarse con una concen-
tracin adecuada del antgeno o el anticuerpo, previamente seleccionada.
Fijaciones inespecficas pueden producirse en zonas no cubiertas del pocillo
debido al empleo de cantidades inapropiadas del antgeno o del anticuerpo, o
Avidina: Glicoprotena de la clara de huevo que tiene afinidad extremadamente alta por la
biotina (vitamina H, soluble en agua). Consiste de cuatro subunidades idnticas, cada w1a de
las cuales une una molcula de biotina. La estreptavidina, una protena ligeramt:nte ms
pequea aislada de Srreptomy,es avidi11ii, puede usarse en lugar de la avidina .
21 ()
,1 un dcfocto en el volumen a.iiadido, pr evaporacin o por no ha~se man-
t-:n 1do la placa durante la adsorcin en posicin horizontal. Estas interacciones
u11.:spccficas pucd..;n evitarse adsorbiendo la placa con BSA, gelatina o pro-
te nas del suero de leche al 2-4 % en el mismo tampn de fijacin. En esto
cons iste el bloqueo.
U bloqueo de los posibles espacios vac6s se realiza despus del lavado.
..::-.:haustivo de los pozos (tres a seis veces), para eliminar el antgeno o el
:wt1cucrpo que no haya quedado fim1emente adsorbido, siendo ocupados
..;tos sitios por la protena bloqueadora (Figura 59).
looo! ~
Tapizado con el Ag Bloqueo
La placa tapizada ) IJioqucada o simplemente tapizada permanecer reactiva
mucho tiempo siempre qu\, :>e mantenga seca y se guarde a baja temperatu-
ra . Esto pe rmite reducir notabl eme nte el tiempo de ejecucin del
mmunocnsayo.
Es importante utilizr un tiempo correcto de incubacin en las distintas eta-
pas del mtodo. Frecuentemente las incubaciones se realizan a 37 C y a
temperatura ambiente, siendo necesario cubrir bien la placa y mantenerla
en un ambiente hmedo, .para evitar la evaporacin que afecta principal-
mente los pozos situados en los bordes de la placa.
Un aspecto de la mayor importancia es el lavado. Si .e ste es insuficiente
pueden producirse errores, principalmente tras la incubacin del conjugado,
y los lavados muy intensos y a gran presin consiguen ser nocivos en cua-
lesquiera de las etapas . Por ello esta operacin debe estandarizarse al mxi-
mo y, si e$ posible, realizarse en un equipo automtico para este fin .
Los tampones y reactivos deben estar en su pH correcto y no tener conta-
minaciones que posibiliten la presencia de enzimas microbianas y, por tanto,
posibles chores por interferencia o reaccin . -
Deben utilizarse sustratos o mezclas sustrato+cromgeno recin prepara-
dos y comprobar en ellos la ausencia de coloracin. Asimismo equilibrarse
211
peridicamente las micropipetas automticas y los dispensadores para ase-
gurar el volumen que se aplica de cada uno de los reactivos .
RESULTADOS\' FORMA DE EXPRESARLOS
(Voller et al., 1979)
El resultado final de un ELISA puede obtenerse por simple observacin
visual o medido en un fotmetro.
Las lecturas visuales son rriuy consistentes y seguras, particulanncnte cuando
slo se requiere un "s" o un "no". Los resultados positivos se identifican por
la aparicin de color. En el rango amarillo-pardo (400-500 nm) el ojo huma-
no puede distinguir sin dificultad soluciones con absorbancia.s 0. 1-0.2 de !:is
soluciones negativas incoloras. Si lo que se requiere es un titulo, se hacen
diluciones seriadas de la muestra y el ttulo corresponde a la mayor dilucin
que da una reaccin coloreada visible.
Para ensayos de alta precisin los resultados deben leerse fotomtncamente
a la longitud de onda apropiada (para el amarillo ric fosfatasa alcalina.
405 nm y para el rojizo de la peroxidasa, 492 nm) . itos lectores automticos
realizan la lectura de una placa completa en menos de l minuto. Estos resul-
tados pueden registrarse de las siguientes formas :
1. Como "positivo" o "negativo". En este caso todas las muestras que tie-
nen un valor de absorbancia por encima de un nivel umbral (valor de
corte, cut-off), por ejemplo, 0,2-0,4, son consideradas "positivas". El ni-
vel umbral o valor de corte se predetermina ensayando un gran nmero
de muestras negativas; el valor umbral est por encima del valor ms
alto de estos negativos y suele calcularse como la absorbancia media de
las muestras negativas ms dos o tres vees ta desviacin estndar.
2. Como valores de absorbancia, por ejemplo: 0,2; 0,7; 1,2 . Estos valores se
obtienen en ensayos ELISA realizados bajo condiciones controiadas con
la inclusin de muestras de referencia. Estos valores de absorbancia pue-
den emplearse como una medida directa de la reactividad de las muestras .
3. Como una relacin, por ejemplo: absorbancia de la muestra/absorbancia
media de muestras negativas. Un valor dos o tres veces superior a la
media de las muestras negativas a menudo se considera positivo.
212
~. Como un titulo (dilucin lmite). Las muestras se diluyen seriadamente y
todas las diluciones se ensayan El titulo es la mayor dilucin que rinde
un valor supenor al de un grupo de muestras negativas conocidas o al
valor de corte establecido.
~ En unidades de concentracin, por ejemplo: mg/mL . Se ensayan junto
con las muestras una serie de estndares de concentracin conocida. Se
construye una curva de calibracin con la absorbancia de los estndares
y con ella se calcula el contenido de las muestras. Este mtodo se utiliza
con antgenos o haptenos bien definidos y es menos adecuado para en-
sayos de anticuerpo, debido a las variaciones de la afinidad de estas
molculas en los sueros.
ENZIMAS Y CONJUGADOS
Las enzimas ms utiliiadas en las tcicas ELISA para el marcado de
antgenos o ms frecuentemente de anticuerpos, son la fosfatasa alcalina
(PA) de mucosa intestinal de ternera, y la peroxidasa (PO) de rbano pican-
te (HRPO). Esta ltima er la favorita de muchos tcnicos por su bajo costo,
su fci l conjugacin y la amplia variedad de sustratos que posee.
El objetivo de la conjugacin es unir la e.iZima con el anticuerpo o el antgeno
de tal forma que cada uno retenga la cantidad mxima de su reactividad. En
el caso de la conjugacin de la PO por el mtodo del periodato, la oxidacin
de la enzima por este ltimo rinde peroxidasa-aldehdo sin prdida significa-
tiva de la actividad enzimtica. El peroxidasa-aldehdo forma bases de Schiff
con los grupos a- o &-amino disponibles de la molcula JgG con una elevada
eficiencia. Estas bases de Schiff son luego estabilizadas con el borhidruro
de sodio (Nakane y Kawaoi, 1974).
El glutaraldehdo (GA), un reactivo bifuncional (dialdehdo), reacciona irre-
versiblemente con los grupos &-amino de la lisina, formando bases de Schiff.
El mtodo del GA de un solo paso es ms adecuado para la PA, mientras
que con la PO se emplea el procedimiento de dos pasos .
Se recomienda la filtracin de los conjugados a travs de una columna de
Sephadex G- 100 o G-200 para la separacin de los anticuerpos no marca-
dos que podnan competir con los conjugados por los antgenos,' interfiriendo
en los inmunoensayos o en las determinaciones RZ del conjugado.
213
Las actividades inmunolgica y enzim tica de la preparac in deben ser c\a -
- NaIO, 0. 1 mol/ L (prepa rado al momento: 10, 7 mg para 0.5 mL de agua:
luadas . La titulac in combina ambas .a ctividades y con frecuencia el ttulo destilada)
se expresa por la mayor dilucin del conjugado con densidad pti ca igua l a
la unidad . Tampn acetato 0,00 l mol/!., pH 4,4(O, 136 g de acetato de sodio para
l L: ajustar pH a 4.4 con HCI 1 mol/L)
La concentracin ptima del conjugado depende li geramente del tipo de
- HCl l mo l/L (83 mL de HCI concentrado para 1 L)
ELISA. En aquellas variantes que cmple:an conjugados de anti-inmunoglobUlinas
o protena A se deben ensayar diferentes diluciones del w njugado (desde - Tampn bicarbonato 0.05 mol/L, pH 9,5 (4,20 g para l L)
1/100 hasta 1/2 000) frente a sucesivas dil uciones del antisucro ..:n placas .. l\a ~ CO i 0,2 mol/L (0,212 g para 10 mL de agua destilada)
tapizadas con una concentracin apropiada del ant1gcno. La dilucin del con-
- NaBH 4 0,5 % (preparado a l momento y en agua destilada fra, 5 mg para
jugado que produzca menor reaccin ini:_-specfic.a (background) con .muc!:- l mL)
tras negativas , e implique una clara distmcin de las muestras positivas, ser la
ptima. El conocimiento del ttulo de un conjugado no sustituye la determina- - Tampn f'ns-HCl 0,0 1 mol/ L NaCI 0,9 %, pH 7,4 ( 1,2 g de Tris-HCI y
9 g de "iaCI para 1 L)
cin de su concentracin ptima en el sistema de trabajo .
Papel de pH
El conjugado se conserva mezclado con igual volumen de glicerol (para e"itar
su congelacin) a -20 C en alcuots convenientes, con BSA ( l O mg/mL de - BSA al 10 %
conjugado) y timerosal o azida sodica al O.O 1 % . Puede aadrscle un inhibidor - Azida sdica al 1 %
de proteasa (por .e jemplo, PMCF a una concentracin final de 0,0 l mmol/L)
- PMCF
La no congelacin del conjugado durante sUl'conscrvacin permite tomar cada
vez la cantidad requerida sin desechar el resto . El preparado puede mantener- - Cnstalera
se activo al menos 2 aos y por lo general mucho ms tiempo . - Columna de Sephadex G-200 (2.6 x 100 cm)
En el easo de la PO su sustrato es el H 2 0 2 y uno de los cromgenos ms - Glicerol
empleado es el ortofenilendiamina (OPD) a pH 5. En el de la PA se emplea - Pipetas automticas
con mayor frecuencia el p-nitrofenilfosfato (sustrato) en dietanolamina (DEA)
apH 9,8. . - Membrana de dilis is
- Agitador magntico
El tiempo ptimo de incubacin es aquel en el que se obtiene la mayor diferen-
cia de color entre muestras positivas y negativas. Al cabo de este tiempo la - Tubos Eppcndorf
reaccin puede ser frenada con H,SO 4 12,5 % en el caso de la peroxidasa y PBS pH 7,2
con Na OH 1O mol/L, en el de la fosfatasa alcalina. Se deben esperar unos
M todo
5 minutos para que se estabilice la coloracin antes de proceder a la lectura .
1. Tomar 5 mg de HRPO y disol ver en 1, 1 mL de agua destilada. A 100 L
Conjugacin mediante rl mtodo del periodato adicionar le 2 ,9 mL de agua des tilada (dilucin 1:30) . Leer en e l
es pectrofotmetro. Calcular RZ y la concentracin (C ) de la enzima,
Material empicando las siguientes frmulas :
- Peroxidasa de rbano picante (Sigma grado V I)
- Anticuerpos (6-10 mg/mL) DO 403 nm = (debe dar 3)
RZ = DO 280 nm
2 14 -~ -
2"15
 C (mg/mL) =DO 403 nm K dilucin Conjugaci n de un solo paso con glutaraldehdo
siendo K = 0,44 y dilucin = 30 Mate n o/
2. Adicionar a 1 mL de la solucin de HRPO 0,2 mL del periodato O, 1 moVL - Enzima
preparado al momento. El color debe cambiar a verdoso. Incubar la mez-..
cla durante 29 minutos a temperatura ambiente. Agitar1a dos o tres veces . Anticuerpos
Dializarla toda la noche contra el tampn acetato a 4 C (500 mL). - Tampn fosfato 100 mmol/L, pH 6,8
3. Dializar los anticuerpos (6-1 Omg/mL) en el tampn bicarbonato (500 mL) - GA al 1 % (para microscopa electrnica)
a 4 C.
- L-lisina 1 mol/ L
4. Despus de las dilisis, llevar a temperatura ambiente y mezclar las dos
Cristalera. pipetas, membrana de dilisis
soluciones en la proporcin 1: 1. Segudamente ajustar el pH a 9,5 con
unas gotas de la solucin de Na 1 C03 {de forma rpida). FI pi 1 c;c toma /1.1i:todo
con papel de pH. Proteger de la luz.
Dializar en forma exhaustiva (separadas o juntas) las soluciones de enzi-
5. Incubar la mezcla 2 horas a tem~ratura amb1rnte y moverla cuidadosa- ma y anticuerpo contra el tan1pn fosfato . Las proporciones recomenda-
mente cada 15 minutos, ma~tcni ndola siempre en la oscuridad. das se dan en la siguiente tabla:
6. Enfriar la mezcla a 4 C y adicionarle la solucin di) borhidrato prepara- TABLA XII. Cantidades de protena y GA para la conjugacin
da al momento y fra. Incubar 2 horas a.t "C . de un solo paso (Anameas et al., 1978)
7. Poner a dial izar el conjugado frente al tampn Tris-NaCI pH 7,4. Reali-
zar tres cambios con un volumen cada uno de 500 mL . Volumen Enzima IgG Fab GA 1 %
Enzima
total (mL) (mg) (mg) (mg) (mL)
8. Para la purificacin, aplicar el conjugado a una columna de Sephadex
PO 1 JO 5 2,5 0,05
G-200 equilibrada con PBS . Leer las fracciones a 280 y 403 run . Selec-
cionar aquellas con RZ entre 0,3 y 0,45 . AP 2 JO 5 2.5 0.05

9. Para su conservacin, aadir al conjugado: BSA, timerosal (o azida GO l 10 5 2.5 O, 15

sdica) y PMCF (inhibidor de proteasa) hasta una concentracin final BG 2 10 5 2,5 O.JO
del 1 %; 0,01 % y 0,01 mmoVL, respectivamente. Mezclar con un volu-
GO-glucosaoxidasa
men igual de glicerol. Homogeneizar, alicuotar y conservar el conjugado BG-heta-galactosidasa
bien rotulado a -20 C.
2. Adicionar a la mezcla enzima-anticuerpo la solucin de GA gota a gota .
Para calcular los volmenes de BSA y preservativo, y la cantidad de
3. Incubar 2-3 horas a temperatura ambiente. '
PMCF puede utilizar las siguientes frmulas :
4. Adicionar un exceso de L-lisina l mol/L (1/20 volumen) para bloquear
V de BSA al l O % = 0,22 V del conjugado
los sitios reactivos .
V de azida o timerosal al l % = Q,02 V del conjug.
5. Dializar exhaustivamente contra el tampn apropiado, purificar, titular y
g de PMCF = 0,0015 V del conjugado en mL conservar.

216 217
Mtodo de dos pasos para conjugar peroxidasa Tit ulac in del conjugado anticuerpo-peroxidasa
a protenas (lgG. Fab) con glutaraltJehdo
,H ot1rwl
Ma te ria l - Conjugado
- Peroxida sa Placa de m1crotttu lac in
- Anticuerpo o fragmentos Fab Ant geno en tampn carbonato-bicarbonato 0.05 11101/L. pH Q_6 (Na:CO.i
- Tampn fosfato 100 mmol/L, pH 6.8 1.59 g: NaC O,H 2.93 g: agua destilada hasta l L)

GA - BSA al 3 % (o protenas de l suero de leche) en el mi smo tampn carbo-

nato-bicarbonato (solu cin de bloqueo)
- Tampn carbonato de sodio 500 mmol/L. pH 9.5
- PBS (N aCI 3 g. KPO.,H: 0.2 g: Na POJH: 2.9 g: KCl 0.2 g : agua desti-
- Salina fi siolgica lada hasta l L)
- L-lisina 1 mo l/ L Sol ucin de lavado (NaCI 8.5 g: Twccn 20 0.5 mL agua destilada hasta
- PBS 1 L)

Cristalera , pipetas , membrana'1e dili sis
M todo
l. Activar la peroxidasa (1 O mg de enzima en 0. 2 mL del tam pn fosfa to)
con un exceso de GA durante 18 horas a temperatura ambiente.
2. Remover el exceso de GA por di lisis exhau sti va o por filtrac in a travs
de una columna de Sephadex G-25 equilibrada con SF Concentrar la
PO hasta 1 mL .
3. Adicionarle 5 mg de anticuerpo o 2,5 mg de Fab (en 1 mL, equilibrado
con SF) y 0,2 mL del tampn carbonato de; sodio 500 mmol/ L, pH 9,5.
(Note que la relacin molar de PO/lgG es aproximadamente 7/ 1 y la de
PO/Fab, 4/1 .)
4. Incubar durante 24 horas a 4 C y bloquear los grupos que pem1anecie-
ron activos con lisina 1 mol/L durante 2 horas .
5. Dializ.ar tcxia la noche contra PBS y filtrar a travs de membrana Milliporc
(0,22 m) . Purificar, titular y conservar.
- Mezc la sustrato + cromgeno (-W mg de O PD en 100 mL de solucin
tampn + 40 ~L L de HP: al 30 % )
- Solucin tampn pa ra el cromgeno 2. 1-+ g de c ido ctrico en 100 mL
de agua dest + >.54 g de fo sfat o di sdico en l 00 m L de agua desti-
lada + 200 mL de agua destilada
- Solucin acuosa de 11..SO., al 12.5 %
- Cmara hmeda
- Pipetas de precisin y pipeta multi canal
- Incu badora
- Lector de micro-ELISA
- Frasco lavador o la vador automtico
Mtodo
Tapi zar los pozos de la placa de mi crm itulacin con la concentracin
seleccionada del antgeno. Pa ra titul a r conjugados d(' anti -lg se puede
ut ili za r la Ig a 2-1 O g/mL . Aadir l 00 ~1 L de (a solucin de antgeno e
incuba r la placa 2 horas a 3 7 ''C o toda la nocllC' a 4 ''( ~n cma ra
h m~da ~- posi c in hori zontal

2 18 2 l lJ
2. Eliminar el contenido de los pozos y lavar la placa tres veces corr .la
solucin de lavado. Para esto llenar los pozos con la solucin y dejarla en
contacto con la placa durante 2-3 minutos.
3. Bloquear los posibles espacios vacos aadiendo a cada pozo 150 L de
la solucin bloqueadora. Incubar 1 hora a 37 C. Decantar y lavar la
placa tres veces, de la forma en que se indic en el paso anterior.
4. Preparar diluciones del conjugado (por ejemplo, desde 1I 100 hasta
1/5 000) utilizando el PBS y aadir por duplicado 100 L de cada dilucin
en la placa de microtitulacin. lncubar 1 o 2 horas a 3 7 C. Decantar los
sobrenadantes y lavar tres veces la placa con el PBS-Tween .
5. Preparar la mezcla sustrato+ cromgeno. Observar que no tiene color y
aadir 100 La cada pozo. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente
y en la oscuridad.
6. Parar la reaccin con 50 L del 8:SO 4 al 12,5 %. Esperar 5 minutos.
Secar el fondo de la placa y proceder a su lectura en el lector de micro-
ELISA a 492 run .
7. Expresar el ttulo como la mayor dilucin con absorbancia igual o mayor
que l .
Observacin
Emplear como control el PBS, aadiendo 100 La dos pozos.
ELISA indirecto para la titulacin
de anticuerpos anti-IgG humana
Esta t<;nica permite estimar semicuantitativamente anticuerpos anti-IgG
humana en el suero. Los resultados pueden expresarse como la mayor dilu-
cin del antisuero con una absorbancia mayor al valor de corte (cut off).
Este se determin ensayando un nmero de muestras positivas y negativas,
y calculando la media y desviacin estndar de los sueros negativos. El
valor de corte correspondi a ~N + 2SD (Figura 60). Como ya se explic
(pgina 213), la cuantificacin exacta de anticuerpos es dificil y lo que gene-
ralmente se hace es un estimado, como en la tcnica que se describir a
continuacin.
220
o,9r.
o
o
e
"....
.s:J
1i1 Valor de
.J:J :....~.....__....,,..-w-~--.--~-..------.---~-----------corte
<:
Muestras
Figura 60 . R~ s ultados de un ELISA para Ac anti-Ig en sueros positivos y negativos.
La cuanv ficacin exacta de anticuerpos puede realizarse, en el caso de
anticuerpos monoclonales o policlonales purificados, a partir de sus caracte-
rsticas isotipicas con anticuerpos anti-isotpicos en un mtodo sandwich . El
empico de diferentes diluciones de un anticuerpo estndar de concentracin
conocida y de la misma clase (o subclase) del anticuerpo a valorar, permite
construir una curva de calibracin para la cuantificacin de anticuerpos en
las muestras.
Ma teria/
lgG humana (10 g/mL) en tampn carbonato pH 9,6
- Muestra a titular (suero anti -lgG humana)
- Sueros controles positivo (CP) y negativo (CN)
- Materiales relacionados en la tcnica anterior
Mtodo
1. Tapizar la placa de microtitulacin con lgG hunuia aadiendo l 00 La
cada pozo. Incubar 2 horas a 37 C, a temperatura ambiente o toda la
noche a 4 C. Desechar sobrcnadante y lavar seis veces la placa.
2. Aadir 150 Len cada pozo de la solucin bloqueadora. Incubar 2 horas
a 37 Coa temperatura ambiente. Decantar y lavar seis veces la placa.
Secarla bien.
22 1
3. Aadir por duplicado 100 L de cada d1luc1n de los sueros controles y
de las muestras en los pozos . Incubar 1 hora a 3 7 C. Decantar y la var
tres veces la placa.
4. Aadir en cada pozo 100 L de l conjugado an ti-irunu noglobulina-
peroxidasa diluido convenientemente. Incubar 1 hora a 37 C. Decantar
y lavar tres veces la placa.
5. Aadir a cada pozo 100 L de la mezcla HP ~ + OPD recin preparada .
Incubar en la oscuridad 30 minutos a temperatura ambiente .
6. Agregar 50 L del HzS 4 al 12,5 % a cada pozo. Esperar 5 minutos .
7. Leer en el lector de micro-ELISA a 492 nm .
8. Promediar las absorbancias de cada una de las diluciones . Determinar el
ttulo de anticuerpos en el suero problema .
Observacin
Todas las incubaciones se realizan en cmara hmeda y los lavados con
salina-T\veen o PBS-Tween . Todos los tampones deben prepararse con
agua bi- o tridestilada y se les puede aadir timcrosal pa ra su conservacin.
Las diluciones de los sueros v dems reactivos se realTzan en PBS o salina
que contenga BSA al 3 %. Las placas recubiertas con antgeno (o anticuer-
po) y bloqueadas pueden conservarse a 4 Cuna semana o indefinidamente
a -20 C. t>ara lograr resultados reproducibles es importante sistematizar
los lavados cuando se realizan manualmente. La seal es posible incrementarla
con tiempos de incubacin ms largos . Para ensayos semicuantitativos rpi-
dos los tiempos pueden reducirse a 30 minutos y aun a menos . El segundo
anticuerpo debe aadirse en exceso para asegurar buenos resultados . Para
determinar su concentracin saturante se \!nfrentan diluciones del conjuga-
do a cantidades saturantes del primer anticuerpo.
ELISA de competicin para cuantificar mioglobina srica
(Juronen et al., 1988)
Materia/
- Anti-mioglobina policlonal
Conjugado anti-mioglobina-peroxidasa
222
_ M1oglobina estndar (Mb)
- SHN libre de mioglobina (previamente absorbido en una columna de
a fi.nidad con anu-m1oglobina)
- Suero problema
Placa de mic rolitulacin de cloruro de poli vi nilo
PBS (SF tamponada con fosfato 0.0 1 mol/L) pH 7.2
Materiales relacionados en la titulacin del conj ugado
.\ fero do
Tapizar la placa aadiendo a cada pozo 200 L del anti suero anti-Mb
( 1O ~rnL en el PBS) . Incubar toda la noche a temperatura amb iente.
Lavar dos veces la placa .
, Preparar los siguientes estndares de Mb: 0, 1; 2; 4; 8; 16; 32; 63; 125;
250; 500 y 1 000 ng/mL en suero libre de mioglobina.
Aadir 20 L de cada estndar y del suero problema por duplicado o
tn plicado y simultneamente 200 pL del conj ugado anti-mioglobina-
peroxidasa diluido de modo conveniente. Incubar la placa a 3 7 C duran-
te QO minutos . Decantar y lavar cuatro ve.ces la placa.
-+ A11adir 200 L en cada pozo de la mezcla sustrato-cromgeno prepara-
da en el momento de su uti lizacin . Incuba r en la oscuridad 30 minutos a
temperatura ambiente
5. Aadir 100 L del H2SO 4 al 12,5 % a cada pozo. Esperar 5 minutos y
leer la absorbancia a 492 nm .
6. Promediar las lecturas correspondientes a cada estndar y suero proble-
ma . Trazar la curva DO vs log de la concentracin de Mb . Determ inar
las concentraciones de Mb en el suero problema. uti lizando la cu rva de
calibracin .
Obse rvqcin
Este ensayo fue denominado por sus autores ELISA de captura" para
mioglobina. Este trmino es ampliamente utilizado en los inmunoensayos e
indica que el analito es capturado por el inmunorreactante que ta piza la fase
22 3
slida (pgina 203) . En el ELISA de captura de anticuerpo el antgeno recubre
la placa y en el de captura de antgeno, el anticuerpo. En el primer caso se
encuentran los ELISA cijecto, indirecto y de competicin con antgeno fija-
do a la fase slida. En ef"Segundo caso, los mtodos sandwich y de compe-
ticin con anticuerpo fijado a la fase slida (este ltimo es el caso que se
describi) .
Dot-ELISA (dot-blot)
Los antgenos proteicos y los anticuerpos se unen con facilidad a la nitroce-
lulosa. Este material puede fijar aproximadamente 1 000 veces ms prote-
na que las placas convencionales de microtitulacin, y constituye una de las
fases slidas ms tiles en los inmunoensayos y la matriz de elecci0n para
los dot-b/ots .
En esta tcnica, como lo indica su nombre (dot , punto y blot, mancha), los
resultados se observan como manchas esfricas cuya intensidad est en
correspondencia con la concentracin del analiti:> inmunorreactante (Figura 61 ).
En este caso el producto de la reaccin enzimtica es i1\soluble.
1/4 1/16 1/64
Figura 61 . Dot-ELISA para anticuerpos anti-Ig con diferentes diluciones del antisuero.
Dot-ELISA para anticuerpos anti-IgG humana
Material
- Los mismos empleados en el ELISA indirecto
- Membrana de nitrocelulosa en vez de placa multipozos
- Mezcla sustrato-<:romgeno: 10 L de I-Ip 2
+ 4 mg de diaminobencidina +
+ 10 mL de PBS
- No lector de micro-ELISA
- Zaranda
224
M I: todo
1. La solucin prn.teica (en este caso, la lgG) a una concentracin no me-
nor de 1 g/mL se adiciona a la membrana de nitrocelulosa a razn de
0. 1 mL/cm=. Dejar 1 hora a temperatura ambiente para que ocurra la
unin del ligando. Ma~ores concentraciones de la protena proporcionan
una seal ms fuerte, po.r 10 que -si hay suficiente antgeno- se reco-
mienda emplear concentraciones de 1-50 g/mL . La nitrocelulosa pue-
de unir aproximadamente 100 g de protena por cm= .
2 Lavar la membrana tres veces con PBS-Tween.
3. Bloquear los espacios vacos colo.;ando la tira de nitroceluloSa en la so-
lucin de BSA al 3 % durante 2 horas o toda la noche.
.+ . Lavar tres veces la tira con PBS-Tween . Si se desea conservar, colo-
carla a 4 C con az ida sdica o timerosal al 0,02 % en PBS .
5 Aplicar 1 L de cada una de las diluciones de las muestras y de los
controles e incubar a la temperatura del cuarto en cmara hmeda
30 minutos .
6 Lavar tres veces . Demorar 5 minutos en cada lavado.
7. Adicionar el conjugado anti-inmunogld mlina-peroxidasa convenientemen-
te diluido (alrededor de 2 mL/cm~) e incubar 30-60 minutos con agitacin
a temperatura ambiente.
8. Lavar como en el punto 6 .
9. Aadir la mezcla sustrato-cromgeno e incubar hasta la aparicin de las
manchas .
Observacin
Las operaciones se realizan colocando las tiras de nitrocelulosa dentro de
tubos de ensayo con tapa de rosca.
MARCAJE DE ANTICUERPOS CON BIOTlNA
La unin covalcnte de grnpos biotina a protenas es una tcnica simple. La
biotinilacin normalmente no tiene efectos adversos sobre el anticuerpo Y
las condiciones de acoplamiento son suaves . Los anticuerpos biotinildos se ~
225

detectan con avidina o estreptavidina marcada Ambos rcacti\'Os pueden
adquirirse comercialmente, marcados con enzimas, luorgenos o yodo La
altsima afinidad de la avidina por la biotina (Kn = l0 14 M1 ) hace que l!Sla
unin sea prcticamente irreversible . Se prefiere la estreptavidina en la
mayora de las aplicaciones porque tiene un punto isoclctrico ms favora-
ble. Los anticuerpos biotinilados son estables bajo condiciones nonnales de
conservacin .
La detectabil idad de los ensayos con el empleo de reactivos marcados con
avidina o estreptavidina es similar a las detcctabilidades con anticuerpos
anti-Ig marcados . No obstante, detectabilidadcs ms bajas puedi..:n obtenerse
con complejos multimtricos . Tanto la avidina como la cstrepta vidma son
tetravalentes, as que sitios adicionales de unin putden utilizarse pa ra in-
crementar el tamao del complejo a detectar y consecuentemente la inten-
sidad de la seal.
La mayora de las biotinilaciones emplean un ster !>ucc inmida de biotina .
El acoplamiento se realiza a travs de los gmpos amino libres del anticucrpu
o de otra protena, normalmente residuos lisil. Si un grupo amino libre fonna
parte del sitio activo de la protena. por ejemplo, del sitio de combinacin del
anticuerpo, la biotinilacin con el ster succinimida disminui r o destruir la
actividad de la protena, por lo que en esos casos deber utilizarse ot ro
mtodo de marcaje.
~
\. \
') Adicionar el ster de biotma al amicuerpo en una relacin de 25-250 g \
del ster por miligramo de anticuerpo. Mezclar bien e incubar 4 horas a
la temperatura del cuarto. Las concentraciones elevadas del ster de
b1otina conducirn a la unin de mltiples grupos b1otina al anticuerpo e
incrementarin la probabilidad de que todos los anticuerpos se marquen.
Las relaci ones menores darn un grado menor de biotinilacin. Por ejem-
plo, 25 g de ster por miligramo de anticuerpo da una relacin molar de
aproximadamente l O: 1.
3. Adicionar 20 L de NH 4 CI por 250 g de ster. Incubar 10 minutos a la
temperatura del cuarto .
4 Dializar la solucin de anticuerpos contra PBS u otro tampn para remo-
ver la biotina libre. La biotina se dializa muy lentamente por su tamao
pequeo (<500 Da), por io que se necesita efectuar la dilisis
exhaustivamente.
5 Conservar.

Material
N-hidroxisuccinimida biotina
- Dimetil sulfxido
- Solucin de anticuerpo
- Tampn borato O, 1 mol/L
NH4 Cl 1 mol/L
- PBS u otro tampn

Mtodo
l . Preparar una soluin del anticuerpo de al menos 1-3 mg/mL en tampn
borato". Si los anticuerpos estaban conservados en azida sdica debern
dializarse exhaustivamente contra el tampn borato para su remocin .
221)
227
 CAPTULO VI
RADIOINMUNOENSAYOS

Los ra.dioinmunoensayos (RIA), como los inmunoensayos enzimticos (EIA),

se fundamentan en una estrategia dual : la reaccin antgeno-anticuerpo,
altamente especfica, y su '.l mplificacin con el empleo de istopos radioac-
tivos conjugados a uno de los dos inmunorreactantes, generalmente el
antgeno.
Entre las ventajas de los RIA se encuentran : su alta especificidad (dada por
la calidad del anticuerpo), su bajo lmite de deteccin (10-12 g/mL), rapidez,
e levada sensibilidad (pendiente de la curva dosis/respuesta), alta
rcproducibilidad de los resultados y elevada capacidad de procesamiento de
muestras .
Tienen como limitaciones los costos relativamente altos' del equipamiento y
los istopos radioactivos; adems, en el caso de estos ltimos, su corta vida
media y Jos riesgos que presuponen para la salud.
A pesar de sus limitaciones, los RIA son ampliamente utilizados en el diag-
nstico clnico y las investigaciones biomdicas; constituyen un instrumento
analtico valioso para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran a
muy bajas concentraciones en mezclas complejas como los fluidos biolgi-
cos . Las dimensiones de Jos istopos radioactivos Jos convierten en marca-
dores excelentes para sustancias de baja masa molecular, como las hom10-
nas .

229

Al igual que en los inmunocnsa~os enzimticos . existen RIA no compct1ti-
vos y competiti\OS . El radioinmunocnsayo de competicin. t.;crnca introdu-
cida por Bcrson et o/. en 1959, constituye una de las \:Hiantes ms popula-
res. Con ella es posible cuantificar con gran exactitud tanto antgenos como
anticuerpos .
El principio de este RIA es la comp e tencia cntrl un antgeno
radioactivamente marcado (trazador o antgeno caliente) y uno 110 m::i1c;1d c
(antgeno competidor o fro) por una cantidad limitada de anticu..:rpos espe-
cficos de gran avidez (Figura 62). Si se emrtean cantidades conocidas de
antgeno no marcado (estndar) que compitan con una misma cant1daci de
trazador, se genera una curva de calibracin con la q1te se: detcnmna n la ~
concentraciones del analito en las 1~1uestras (Figura 63 ).
Ag no en
Qrnorcado _:x.ceso
competido1~ ~Qconreo
Oc lo anterior se dcsprc11dc que para He\ar a cabo el RIA de competicin
si..: deb..: disponer de tres rcacti\'os fundamentales : anticuerpos de alta afini-
dad. antgeno raJiumarcado y :mtigeno estndar. Es necesario determinar
las wncent racion(.;s ptimas de anticuerpo y trazador para tener una sensi-
bilidad mx.inu .
Los RIA de competicin pu ~dcn efectuarse en solucin y sobre fase slida.
l.Jno de los requerimientos tcnicos ms crticos de los ensayos en solucin
es distinguir el traz.ador radioactivo unido al anticuerpo del trazador libre,
para poder ci:)ntar uno u otro o ambos . Si una fraccin est contaminada con
la otra, los errores en los conteos pueden ser muy altos.
El nomb11;! de la variante del RJA de competicin viene dado por el mtodo
que empica para separar el trazador libre del unido al anticuerpo. Estos
rndodos no deben alterar el equilibrio alcanzado por el sistema de reaccin
~ pueden agruparse en tres c:uegorias : 1) precipitacin dei antgeno unido al
anticuerpo. dejando el antgeno libre en solucin: 2) precipitacin del antgeno
~O Meno r libre. dejando los inrnunocomplejos en solucin; 3) separacin del antgeno
unido y el libre por filtracin en gel. Estos ltimos resultan muy engorrosos y

--< +
lentos cuando se procesan muchas muestras.

--<
Ag rnor- en Los mctodos que precipitar. ~l antgeno unido al anticuerpo son rriuy popula-
Anticuerpo de
alto afin idad
O codo
t rozador
ex.ceso Mayor
o.conteo
res . Si et'a ntgeno es mucho ms pequeo que el anticuerpo (masa molecular
menor que JO 000 Da), pennanecer en se ~ucin a concentraciones de sulfato
en defecto de amonio y de pol ictiknglicol (PEG) 6 000 del 10 % (W:W), precipitando
rigura 62. Fundamento del RI /\ de competicin El /\g marcado\"el no marcaJC> compi1.:n funda.mentalmente todo el anticuerpo. Si la masa molecular del antgeno es
por d anticcierlO especifico de alta afinidad y cn dct~cto . En e:.;ccso rclal irn de uno u otro. los mucho mayor o no es globular, las concentraciones de PEG que precipitan
comp!cjc< . '\~-Ac que predominan contienen..:! /\g cn e'Xceso. el anticuerpo completamente pueden insolubilizar ms del 1O% del antgeno
libre, y se produce un bockground inaceptable. En estos casos el anticuer-
o 100 po puede precipitarse con un segundo anticuerpo, o sea , una anti-
"O
e: inmunoglobulina . Este mtodo es muy utilizado aunque ,requiere un tiempo
::i
.... relativamente largo (24-48 horas) en comparacin con unos pocos segun-
o dos que demora la precipitacin con el PEG . Si se utiliza el segundo anti-
"O
o cuerpo mezclado con bajas concentraciones de PEG, el tiempo se reduce
N
....o
+-
notablemente . Otra forma de precipitar el anticuerpo (cuando se trate del
Q)
i:J
isotipo lgG) es la protena A unida ~Sepharosa o S. aureus muertos (en
cu~ a superficie est la protena A). ~
o~
10 20 40 "
El otro tipo de separacin es la adsorcin ~I antgeno libre a una partcula
Concenfrocin del Ag
para dejar los inmunocomplcjos en solucin.' Los materiales ms utilizados
Figura 63 Cur\'a de \:<1libraci11 de un RI/\ de c0mp,'tici0n
\ . e'
- DO 231
son el carbn activado y el talco. Ya que la unin del antgeno a estos agen-
tes est determinada por la hidrofobicidad y tamao del antgeno, estos
mtodos slo se utilizan en ciertos sistemas . Ellos son baratos y rpidos.
pero requieren un cuidadoso ajuste y monitoreo del pH. fuerza inica y tem -
peratura para obtener resultados reproducibles, y evitar la adsorcin de los
complejos Ag-Ac . Estos agentes tienen una alta afinidad por el antgeno y
pueden competir con anticuerpos de baja afinidad, alterando el equilibrio. El
carbn amortigua el centelleo beta. por lo que deben utilizar!>e istopos que
emitan radiaciones gamma,, como el m 1, o empicar lquidu de centelleo para
amplificar la seal beta.
RIA SOBRE FASE SLIDA
Estos inmunoensayos tienen la ventaja de facilitar el procesamiento de un
gran nmero de muestras e incrementar la a finidad deb ido a los efectos de
la interfase slido-lquido (pgi na 111 ). Por este motivo no rr.iden la verda-
dera afinidad infrnseca como los inmunoen~ayos en solucin.
Los RIA sobre fase slida utilizan peri~ de Sepharo!'.a , las paredes de tubos
o los pozos de una placa de microtitulacin a los que se une el anticuerpo .
Los espacios vacos se cubren con una protena irrelevante como BSA , de
fonna similar que en los ELISA. Una vez recubierta y bloqueada la fase
slida se incuba con la mezcla antgeno marcado + antgeno competidor, :ie
lava y se cuenta la radioactividad unida a las paredes plsticas o la
Sepharosa. Para medir concentraciones de un analito en muestras descono-
cidas se utilizan, como en el RIA en solucin, diferentes concentraciones
del antgeno estndar y se construye la curva de calibracin.
Los anticuerpos marcados con istopos radioactivos se utilizan en los dot-
blots, de forma similar a Jos anticuerpos marcados con enzimas (pgina 224) .
El revelado de la mancha se realiza por autorradiografia .
OPTIMIZACIN DE LAS CONCENTRACIONES
DEL ANTICUERPO Y DEL TRAZADOR
La afinidad y concentracin de los anticuerpos en los ensayos de competi-
cin son dos importantes factores a tener en cuenta para lograr resultados
sensibles y precisos . En general, a mayor afinidad del anticuerpo, ms sen-
232
s1blc es el ensayo. Una vez que se preparan los anticuerpos de mayor afini-
dad. este parmetro limita la extensin a la cual los otros parmetros pueden
ser manipulados . Por ejemplo, ya que el antgeno no marcado en la muestra
desconocida va a competir con el trazador, a menores concentraciones del
trazador menores concentraciones del analito podrn medirse , hasta un cierto
lmite. Este viene dado por la afinidad (K). La parte ms empinada de la
curva de calibracin (Figura 63) estar en el rango de concentraciones cer-
canas a 11K. Concentraciones del trazador muy por debajo de 1/ K dejarn
la mayora de los sitios del anticuerpo sin ocupar y la competencia ser
menos efectiva . Aunque en general es til incrementar la radioactividad
especfica del trazador y reducir su concentracin, es importante hacer uso
del lmite 1/K. Debe sealarse que el incremento exagerado de la actividad
es pecfica puede conducir a la desnaturalizacin del antgeno, y su disminu-
cin. a tiempos de conteo demasiado largos .
Similarmente. bajando la concentracin de anticuerpos se incrementa la sen-
si bilidad. hasta un lmite. Este tambin depende de L'K y del background
producido por las uniones no especficas . En general, la fraccin del trazador
unido en ausencia de competidor debe mantenerse entre 0,2 y 0.5.
Para optimizar las concentraciones de trazador y anticuerpo lo primero es
elegir la concentracin ms baja del trazador que d tiempos de conteo y
precisin del conteo satisfactorio. para unir 0.2-0,5 del trazador total. Enton-
ces, manteniendo esta concentracin del trazador constante se diluye el
anticuerpo hasta que la relacin trazador unido/trazador libre. en ausencia
de competidor, sea cercana a 1 (unido/total = 0,5). Esta concentracin de
anticuerpos con la seleccionada del trazador, por lo general rinde
detcctabilidades cercanas a la ptima, dentro de los limites referidos arriba.
Es importante tener en cuenta que, si se cambia de tra?..ador, hay que reajus-
tar la concentracin del anticuerpo para optimizar el sistema.
PROCESAMfENTO DE LOS DATOS
Al realizar el ensayo de competicin se debe conocer:~.
1. El total de radioactividad en el sistema (7).
2. La capacidad mxima que ti ene el anticuerpo de unir antgono marcado
(RJ Da la mxima radioactividad pos ible en el ensayo.
2)~
son el carbn activado y el talco. Ya que la unin del antgeno a estos agen-
tes est determinada por la hidrofobicidad y tamao del antgeno, estos
mtodos slo se utilizan en ciertos sistemas . E.llos son baratos y rpidos.
pero requieren un cuidadoso ajuste y monitoreo del pH, fuerz.a inica y tem-
peratura para obtener resultados reproducibles, y evitar la adsorcin de los
complejos Ag-Ac . Estos agentes tienen una alta afinidad por el antgeno y
pueden competir con anticuerpos de baja afinidad, alterando el equilibrio. El
carbn amortigua el centelleo beta. por lo que deben utiliz.ar!>e istopos que
emitan radiaciones gamma, ,como el 1 ~ 5 1, o empicar liquidu de centelleo para
amplificar la seal beta.
RIA SOBRE FASE SLIDA
Estos inmunoensayos tienen la ventaja de facilitar el procesamiento de un
gran nmero de muestras e incrementar la afinidad debido a los efectos de
la interfase slido-lquido (pgina 11 l ). Por este motivo no rr.iden la verda-
dera afinidad intrinseca como los inmunoens~yos en solucin.
Los RIA sobre fase slida utilizan perlas de Sepharo!>a, las paredes de tubos
o los pozos de una placa de microtitulacin a Jos que se une el anticuerpo.
Los espacios vacos se cubren con una proteina irrelevante como BSA , de
forma similar que en los ELISA. Una vez recubierta y bloqueada la fase
slida se incuba con la mezcla antgeno marcado + antgeno competidor, se
lava y se cuenta la radioactividad unida a las paredes plsticas o a la
Sepharosa. Para medir concentraciones de un analito en muestras descono-
cidas se utilizan, como en el RIA en solucin, diferentes concentraciones
del antgeno estndar y se construye la curva de calibracin .
Los anticuerpos marcados con istopos radioactivos se utilizan en los dot-
blots, de forma similar a los anticuerpos marcados con enzimas (pgina 224) .
El revelado de la mancha se realiza por autorradiografia .
OPTIMIZACIN DE LAS CONCENTRACIONES
DEL ANTICUERPO Y DEL TRAZADOR
La afinidad y concentracin de los anticuerpos en los ensayos de competi-
cin son dos importantes factores a tener en cuenta para lograr resultados
sensibles y precisos . En general, a mayor afinidad del anticuerpo, ms sen-
232
51
bk es el ensayo . Una vez que se preparan los anticuerpos de mayor afini-
dad. este parmetro limita la extensin a la cual los otros parmetros pueden
ser manipu lados Por ejemplo, ya que el antgeno no marcado en la muestra
desconocida va a competir con el trazador, a menores concentraciones del
trazador menores concentraciones del analito podrn medirse, hasta un cierto
lmite Este viene dado por la afinidad (K). La parte ms empinada de la
curva de calibracin (Figura 63) estar en el rango de concentraciones cer-
canas a 11 K Concentraciones del trazador muy por debajo de 1/ K dejarn
Ja mayora de los sitios del anticuerpo sin ocupar y la competencia ser
menos efecti va . Aunque en general es til incrementar la radioactividad
espec fica del trazador y reducir su concentracin, es importante hacer uso
dd lmite l/K. Debe sealarse que el incremento exagerado de la actividad
especifica puede conducir a la desnaturalizacin del antgeno, y su disminu-
cin. a tiempos de conteo demasiado largos .
Similannente. bajando la concentracin de anticuerpos se incrementa la sen-
sibilidad. hasta un lmite. Este tambin depende de l/K y del background
producido por las uniones no especficas En general, la fraccin del trazador
unido en ausencia de competidor debe mantenerse entre 0,2 y 0.5.
Para optimizar las concentraciones de trazador y anticuerpo lo primero es
elegir la concentracin ms baja del trazador que d tiempos de conteo y
precisin del conteo satisfactorio. para unir 0.2-0,5 del trazador total. Enton- .
ces, manteniendo esta conce ntracin del trazador constante se diluye el
anticuerpo hasta que la relacin trazador unido/trazador libre. en ausencia
de competidor, sea cercana a l (unido/total = 0,5) . Esta concentracin de
anticuerpos con la seleccionada del trazador, por lo general rinde
dctectabilidades cercanas a la ptima, dentro de los lmites referidos arriba
Es importante tener en cuenta que, si se cambia de trazador, hay que reajus-
tar la concentracin del anticuerpo para optimizar el sistema .
PROCESAMfENTO DE LOS DATOS
Al realizar el ensayo de competicin se debe conocer:...
1. El total de radioactividad en el sistema (11
2 La capacidad mxima que tiene el anticuerpo de unir antgeno marcado
(BJ Da la mxima radioactividad posible en el ensayo.
..,..,..,
L.'-'
 3. Las uniones no especficas (hac/.:gm1111cl) d1..'. la 1..:cnica ( f ,'i\'F o IJ)
p 3 rJ cJ k11lar el por ciento de union de antgeno marcado en los tubos co-
Para ello se pre p~ran por duplicado (o triplicado) tres tu bos qu e contengan rr1..s pondi cntes a los est ndares (!-.) . controles de calidad. (C ) y muestras
los siguientes rcactantcs (figura 64 ): (.A f) . se utili za la fmrnla

0 de unin de Ag marcado = cpm E e .H - cpm 8 . 100

cpm fln - cpm 8
Tampon
Tampn Con los por cientos de unin de Ag marcado correspondientes a los est.in-
d::ircs ' sus concentraciones respectivas se construye la curYa de calibra-
Trazador Trazador c1on (Figura 63) .
T B Bo
F1gtua 64 . Pr.:par~1 n <lo: los tubos total ({). u111oncs no c~ p..:t:1l i..:a s 1! \ i: o /Jl ' u n1 0 11 .\ l ..\RCAJE DE ANTICUERPOS co~ IODO
rnax.ima (8 J. Conu.:ncn la misma .:m1t1<la<l <le tr;.11,a<lor
0

L1 icxbcin de prote nas es un mtodo efccti,o de marcaje. Los istopos

Los otros tubos del ensayo son:
- Los del estndar(/:), en los que el anugeno cornpt:11dor es el estndar del
ensayo. Con ellos se construye la curva de calibracin.
- Los de los controles de calidad (C), en los que d antgeno com;ct1dor
est presente en muestras de concentracin conocida. Si\cn par..i con-
trolar la calidad del ensayo.
- Los de las muestras desconocidas (!vi). en los que el compet1~or es d
antgeno disuelto en la muestra (analito) .
Esta'ndar
' : : Muestra
Anticuerpo
Trazador Trazador
E e
Figura 65 . Tubos de cstn<lan:s, curllrolcs y mucstras.
Todos los tubos, con excepcin de los totales. se incuban com cnicniemcntc:
se procede a separar los c9mplcjos Ag-Ac del antgeno !ibrc ~ se realiza el
conteo de las radiaciones .
r::id1oact1\os de iodo estn disponibles en el mercado en forma de soluciones
lt bres de portadores y el uso de estos prod uctos permite obtener protenas
con relaciones amplras de sustituci n qum ica . El 1=> es el mis utilizado en
los i nm un ocn s::i~ os Su decl inacin rinde rad iacin gamma de baja energa.
qui: es fcil de detecta r: su vida med ia es de aproximadamente 60 das y es
harato El probl ef!~ principa l del i : 5 es su peligro potencial para la salud.
por lo que slo deber trabajarse donde existan las condiciones que exige la
man ipulacin de istopos radioact ivos .
Dos procedimientos son los ms utilizados para marcar protenas con iodo.
En uno el 1=51. en forma de NaL se oxida y ataca los grupos disponibles
mediante una reaccin de halogenacin. En las protenas, el blanco ms
frecuente es la tirosina. pero algunos residuos de histidir\a tambi~n pueden
ser iodados . Estas reacciones son simples de mampular ~ controlar. Su prin-
cipal problema es el dao oxidativo a las protenas o la modificacin de un
residuo de tirosina crtico. En la tcnica de la cloramina T. esta es el agente
Trazador oxidante y se adiciona a una solucin que contiene la protena y el yoduro.
M La reaccin se tem1ina adicionando un agente reductor y tirosina libre o
realizando rpidan1ente la separacin ce los re<.1ctantes a travs de una co-
lumna de .filtracin en gel.
En el segundo procedimiento un reactivo iodado. que contiene un grupo de
acople reactivo. es unido a la protein::i . El ms empicado c:s el reactivo de

234 235

Bolton-Hunter. Bajo condiciones suaves este reactivo se une a los grupos
amino libres sobre residuos lisil o el grupo amino tcnninal.
PURIFICACIN RPIDA DE ANTICUERPOS
PARA IODACIN
A menudo un gran nmero de preparaciones de anticuerpo necesitan ser
iodadas a la vez. Este mtodo utiliza perlas recubiertas con prcotena A y
pennite la purificacin de anticuerpos de fom1a r pida y senc illa.
Mtodo
1. Ajustar el pH de Ja preparacin cruda de anticuerpos (suero. sobrcnadante
de cultivo, ascitis) a 8,9, adicionando O, 1 volumen de borato 1 mo l/L,
pH 8,9 . Adicionar NaCI hasta 3 mol! L . Chequear el pH y ajustarlo si
fu era necesario.
o
2. Adicionar 1 mL del sobrenadante de cultivo 1O L de suero o ascitis a
un tubo cnico de 1,5 mL . Para el suero o la ascitis adicionar 1 mL de
borato 100 mmolfL, pH 8,9. Adicionar 1O L de las perlas de protena A.
Estas unen aproximadamente 10-20 mg de anticuerpo por mililitro de
perlas hmedas.
3. Agitar 1 hora manteniendo la mezcla a 4 C.
4. Lavar las perlas dos veces con borato JO mmol/L, pH 8,9; NaCI 3 mol/L .
5. Despus del segundo lavado, adicionar 100 L de fosfato de sodio
100 mmol!L, pH 2,8. Incubar 5 minutos a la temperatura del cuarto.
Centrifugar y remover el sobrcnadante a ocro tubo cnico de 1,5 mL, que
contenga JO L de fosfato de sodio 1 mol/L, pH 7,5. Mezclar suavemen-
te. Los anticuerpos estn listos para la iodacin .
MTODO DE LA CLORAMINA T
- Cloramina T
- Fosfato de sodio 0,5 mol!L, pH 7.5
- Tubos cnicos de 1.5 mL
- Columna de filtracin en gel (Sephadex G-25)
J..f,;rodn
Pre,io a laiodacin preparar la columna de filtracin en gel para separar
el anticuerpo marcado.
2. Adicionar 10 g de protena en un volumen total de 25 L de fosfato
sodico en un tubo cnico de 1,5 mL .
3. Adici?nar 500 Ci de Na 1 ~~ 1.
.f Adicionar 25 L de cloramina T a 2 mg/mL rec in preparada . Si la
oxidacin daa mucho la protena. reducir la concentracin de cloramina
T a 0,02 mg/mL .
.:; Mezclar con una pipeta e incubar 60 segundos a la temperatura del cuar-
to .
6. Aplicar inmed iatamente en la columna de filtracin en gel.
Obs ervac in
El iodo producido por oxidacin es voltil. por lo que la iodacin debe reali-
zar.se bajo una campana ventilada. El anticuerpo u otra protena marcada
puede conservarse a 4 C. El anticuerpo marcado podr ser usado durante
las 6 semanas posteriores a su preparacin. Ms del 90 % del iodo se incor-
pora por este mtodo y rendir actividades sobre 5-45 C i/g . Estos nive-
les pueden ajustarse variando las concentraciones de iodo y protena .
RIA DE COMPETICIN PAR<\ SEROALBMINA
HUMANA (HSA). MTODO DEL DOBLE ANTICUERPO

Material Mate rial

- Solucin de anticuerpo o de otra ~rotena - Juego
... de RIA para HSA (Instituto de Endocrinologa)
- Na1~ s 1 - Muestras

23 7
236
 '

,cz concluido el ensayo. La fom1a de proceder con los datos es similar en

- Incubadora o bao de agua
Jos inmu nocnsayos enzimticos de competicin descritos en el captulo an-
- Centrifuga de ngulo mvil terior Puede aplicarse y resulta com eniente la transformacin Logit que
- Contador de radiaciones gamma pc nrntc linealiz.ar los resultados . pues se incrementa con ello su exactitud y
prcc1s1n.
- Papel scmilog y papel de filtro
- Gradilla y tubos
Mtodo
l. Preparar los tubos, tal como se indica a continuacin:
Ti1bos T B Bo E e M
Tampn - 400 200
E - - - 200 - - (Volme
e - - - - 200
-
M - - - - - 200
Anticuerpo - - 200 200 200 200
Trazador 100 100 100 100 100 100
El traz.ador es HSA- 1 ~ 5 1.

2. Mezclar e incubar a 37 C durante 2 horas .

3. Aadir a todos los tubos (menos a los totales) 100 L del agente prccipi
tante: anticuerp0s anti-irununoglobulina en PEG al 8 % + ~ ucro normal
4. Mezclar e incubar l hora a 37 C.
5. Centrifugar a 2 500 rpm durante 30 minutos . Decantar, secar el intcrio
de los tubos con papel de filtro y efectuar el conteo.
6. Calcular los por cientos de trazador unido y hacer la curva de calibra
cin. Determinar en la curva, las concentraciones de los controles d
calidad y las muestras .

Observacin
Se deben cumplimentar todas las medidas de bioseguridad establecidas para1
el trabajo con istopos radioactivos y la eliminacin de los materiales una
23 9
238
 CAPTULO VII
\....

INMUNOFLUORESCENCIA

La inmunofluorescencia es esencialmente una tcnica histoqumica o

citoquimica para la identificacin y locaJiz.acin de antgenos (en ocasiones,
para detectar anticuerpos) El anticuerpo especfico se conjuga con sustan-
cias fluorognicas, y se convierte en un traz.ador sensible con reactividad
inalterada frente al antgeno. El anticuefl'\() conjugado se aade a las clulas
o a los tejidos y se fija a los antgenos, enton\:es se fonna un complejo Ag-
Ac estable. Las protenas no fijadas se eliminan mediante lavados y la pre-
paracin resultante se observa en w1 microscopio fluorescente.
Virtualmente cualquier antgeno puede ser descubierto en cortes de tejido
fijado o en suspensiones de clulas vivas mediante inmunofluorescencia.
Esta tcnica fue introducida en 1941 por Coons, quien emple J3-antraceno,
un compuesto fluorognico de color azul, conjugado con antisuero
antineumoccico, para describir los antgenos bacterianos en cortes de te-
jido. Poco despus su grupo emple antisueros conjugados con fluorescena,
la cual emite una luz verde que puede ser diferenciada de la fluorescencia
azul de muchos tejidos .
La fluorescencia es la emisin de luz de un color, es decir, de una longitud de
onda, cuando una sustancia se irradia con luz de un color diferente. La
longitud de onda de la luz emitida est necesariamente a un menor nivel de
energa que la luz absorbida (Figura 66).

241
' ,. " vl.'0-1o \
~<) ' ... ~ \
"S ........
'-< ~ ,
\(lf:I f\1"
,_ BIDL .......
l.}~ ...........
e
~~-
~- excitacin se enfoca direct.amente sobre la muestra de tejido a travs de la .
~c~'-
i>&ir.qp \:I~~-:'--------:-::-
f:.J"
tente del objetivo. La luz fluorescente emitida a partir de la muestra
i -
epluminada es transmitida al ojo a travs del espejo dicroico. Este permite
Flourescencio
g 11- Excitacin . el paso de la luz seleccionada en una direccin a travs del ojo, pero en

-
Q.
o
"O
\.~misin
.'.
sentido opuesto.

TABLA XllL Principales propiedades de los fluorgenos

o ms empleados
~
"'e
Q)
o . .
Fl uorgeno Excitacin Emisin Color
DAPI 365 nm 420 nm Azul
Longitud de onda creciente
fl uoreSCt" na .t95 525 Verde
Figura 66. Espectros de absorcin y em1s1n de w1luorgl!flo.
Hoechst 33258 360 470 Azul
Los fluorgenos (o fluorocromos) tienen espectros caractersticos de ab- R-ficocianina 555 ; 618 634 Rojo
sorcin (excitacin) y emisin (Tabla XIII). La fluorescen.a. rodamina y
ficoeritrina son muy populares. El isotiocianato d~ fluorescena (FITC) es B-ficoeritrina 545; 565 575 Naranja, rojo
u:ia forma de fluorescena que se fija fcilmente a I~ protenas mediant R-ficoeritrina 480; 545; 565 578 Naranja, rojo
enlaces covalentes a pH alcaljno Su absorcin mxima es a 495 nm y emite Rodamina 552 570 Rojo
su color verde caracterstico a 525 nm . El isotiocianato de tetrametilrodamina,
Rojo Texas 596 620 Rojo
que emite luz roja, tiene una absorcin mxima a 552 nm y una emisin
mxima a 570 nm . Consecuentemente, se deben emplear excitaciones y
filtros de barrera diferentes para visualizar el color verde o rojo de estos Posee varias ventajas el sistema de Ploem . La fluorescencia puede combi- '
colorantes. Por lo general, se puede lograr una longitud de onda excitante narse con la luz transmitida para el examen por contraste de fases de los
casi igual a la que produce la excitacin mxima del colorante. De manera tejidos, lo cual pennite una mejor definicin de la morfologa y la fluorescen-
semejante debe eliminar el filtro de barrera toda la emisin de longitudes de cia. Tambin el sistema de filtros intercambiables posibilita el examen rpi-
onda del espectro, salvo la emitida. De esta forma se obtiene un fondo do de la muestra a diferentes longitudes de onda para la tincin doble. Esto
oscuro y una imagen de alta resolucin. ha proporcionado a la tcnica una sensibilidad superior para el estudio de la
fluorescencia de la membrana celular en los linfocitos vivos.
Como existen fluorocrornos cuyos espectros de emisin no se solapan, pue-
den utilizarse para teir una misma muestra. Esta fluorescencia doble per-
mite el estudio de dos antgenos diferentes en la muestra, aunque tengan VARIANTES DE LA INMUNOFLUORESCENCIA
distribuciones celulares parecidas .
La inmunofluorescencia puede ser directa o indirecta. Al igual que en los
Los microscopios empleados para visualizar las muestras fluorescentes son EIA, en la directa el fluorgeno se conjuga al anticuerpo de inters . En la
simples modificaciones de los microscopios con transmisin estndar de la segunda, a un segundo anticuer:po que--reconoce las inmunoglobulinas de la
luz. En 1967 Ploem introdujo un sistema de epiiluminacin que emplea un especie de donde proviene el anticuerpo de inters . La primera variante se
iluminador vertical y un espejo dicroi co. En este sistema el haz luminoso de utiliza con anticuerpos policlonales y monoclonales. Al conjugar con .dife-

242 243
rentes fluorgenos anticuerpos monoclonales que reconocen varios marca-
dores sobre una misma clula, puede hacerse su dob le marcaje. En la
citometra de flujo el empleo de anticuerpos monoclonales conjugados a
fluorgenos diferentes permite clasificar y(o) separar estirpes celulares dis-
tintas. La variante indirecta permite amplificar la seal de la reaccin Ag-
Ac y ofrece la ventaja de que un mismo conjugado puede emplearse con
muchos Ac monoclonales.
Muestr o
CITOMETRA DE FLUJO Y FACS
fluoresc;nd~
. Detect
i:11tro
La citometria de flujo es una tcnica analtica que permite distinguir y cuan- op.t ic o o : = c 10
tificar tipos celulares sobre la base de diferentes caractersticas como: ta-

~ - ----------8'""'_::._-~Q-
mao, granulosidad, viscosidad, propiedades qumicas y fl uorescencia, con- '-.._Envo! u ra Abert ura ,
forme pasan a gran velocidad a travs de un orificio. Existen instrumentos de o1uo J.: _.. .,
que ~rmiten, adems, la clasificaci.:m y separacin de clulas vivas .
,,' ," ... , , ... ,,., . 2
El analizador o separador de clulas activadas por florescencia (FACS) es "" , , ,.

un equipo que posibilita el anlis\s y(o) la separacin d~ partculas, de acuer- ' -- -- ,

e': -......'~...,,
l~exin:~ ','{S:
do con su fluorescencia y sus propiedades de dispersin de la luz, permitien- p loc
1d 1 osd ' "----- Ob et1vo
' d '
e microsco .e.
do el empleo de hasta tres fluorgenos diferentes. Las clulas no se daan
al pasar por el FACS. I.
1 .
3 ... ,' ' ...
P IO

i' closifi~od';P
1 ' ... ' '
i, ' ' --:-
' Ro yo loser
'
La variante analtica es el FACS scanning y la preparativa, el FACS sorter
: ... . - . -->-
(Figura 67). .
El anlisis hecho por este equipo es computariz.ado y complejo. Los resulta-
dos se expresan en forma de histogramas. Requiere parmetros de control
{}4 ~
muy estrictos.
El FACS se ha empleado para estudiar las funciones de diferentes poblacio-
nes de linfocitos en la respuesta inmune. Las clulas se separan despus de Tub os de recolecc in
marca:se co11 reactivos fluorescentes que reconocen un antgeno .especfi-
co de la superficie celular. Por ejemplo, linfocitos T CD4+ se hacen reac-
cionar con AcM anti-CD4 y se marcan cori anti-inmunoglobulina de ratn Figura 67. Separacin de clulas en el FACS. 1, las clulas de la muestra teftidas con colorantes
t1uorescentes espc;:cficos para detectar molculas de superficie celular se introducen en una
conjugada con fluorescena. Despus se pasan por el FACS (sorter) y los
camara de flujo vibratoria y pasan a presin a travs de una lxxuilla. 2, la corriente se iltunina
linfocito.; 1 CD4+ (qm contienen la mayora de las clulas T helper) se con lser yen cada ce lula se mide la fluorescencia, quedando clasificada. 3, el chorro pulveri-
separan. Estas clulas se utilizan en diferentes experimentos. mdo se separa en gotitas. Aquellas que contienen las clulas seie!\:cionadas se cargan en un
campo de alto voltaje entre las placas de del1exin. 4, las gotitas cargadas se desvan a los
tut>os de rewlecc1n.

244
 PREPARACIN DE UN CONJUGADO Observacin
ANTICUERPO-FLUORESCENA Esta tcnica pu cd~ ser utilizada para conjugados con is0tiocianato de
tctrametilrodamina (TRJTC) : En este caso las lecturas se realizan a 575 y
Materia/
280 nm, y la relacin debe estar entre 0,3 y O, 7. Si el conjugado queda muy
- Solucin de Ac de al menos 2 mg/mL en carbonato de sodio O, 1 mol/L, diluido puede concentrarse por ultrafiltracin, extraccin de agua o liofilizacin.
pH9,0

- Isotiocianato de fluoresceila en dimctil sulfxido (del mc.:jor grado, sm INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
agua) a l mg/mL, preparado al momento P\ RA DETERJ\.'tlNARSUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS
- NH 4 Cl l mol/L
Mate rial
- Cinalol xileno
Sangre perifrica hepariuizada
- Glicerol
- Ficoll-Urovideo*
- Columna de Sephadex G-200 - PBS o salina fisiolgica
- Cristalera - Cmara de Neubaer
- Pipetas - Solucin azul Tripn O, l %
Mtodo - AcM : lOR-Tl (anti-CD6)
1. Por cada mililitro de la solucin de anticuerpo adicionar muy lentamente IOR-T3 (anti-CD3)
(en alcuotas de 5 L) 50 L del colorante, agitando gentilmente durante IOR-T4 (anti-CD4)
la adicin .
IOR-T8 (anti-CDS)
2. Dejar reposar la mezcla en la oscuridad 8 horas a 4 C .
IOR-DR (anti-HLA-DR)
3. Adicionar NH4 Cl para una concentracin 50 mmol/L. Incubar 2 horas a
4 C . - BSA O, l %; NaN 3 0,02 % en PBS
- PBS-glicerol l :9
4. Aadir cinafol xileno y glicerol para una concentracin final del O, l y
5 %, respectivamente. - Placa multipozos fondo U

5. Separar el conjugado del colorante libre por gel filtracin. - Portaobjetos y cubres

6. Conservarlo a 4 C protgido de la luz. Adicionar azida sdica al O, 02 %. - Centrfuga ngulo mvil

Cuando la concentracin de anticuerpo sea menor de 1 mg/mL es con-
veniente aadir BSA para una concentracin del l %.
-
.
Microscopio de fluorescencia

7. La relacin fluorescena/protena se d~tennina leyendo las absorbancias El medio de separacin puede ser comercial (Lymphoprep, Ficoll-Paque) o "casero"
a 495 y 280 nm . La relacin debe estar entre 0,3 y 1,0. (Yisotrast, Yerografin, Urografin, Urovideo, Telebrix con o sin Ficoll). Lo fundamental es
que su densidad sea 1,077 g/mL .

246 247
Mtodo , JJ,,,no c .<1n

l . Diluir la sangre heparinizada l: 1 con PBS o SF Lo!> :11Hgcnos de mcrnbr:.uu. sobre tcx:lo al unirse a los ancucrpos. pueden
:,i.:r cndocit:idos (o d1.~sprcndid05) o cambiar su ubicacin en la membrana.
2 . Depositarla suavemente sobre el Ficoll-Uro-video, aproximadamente f~1 rinando un .. go rro (co 1p111~:0 en uno de los polos de la cdula . Por ello es
35 mL de sangre por 15 mL del Ficoll . nportank usar inhibidores metablicos. como la azida sJica, y tempcratu-
11
3 . Centrifugar a 2 500 rpm 30 minutos a temperatura ambiente . r:is fria s durante tcx:l:i la t0cnica .
4. Ext raer cuidadosamente el anillo de clulas mononuclcares
5 . Lavar las clulas tres veces a 1 200 rpm durante 1O minutos .
6. Contar las clulas en la cmara de NeubaUcr y aj ustar su ~nc.ent rac ion
a 0,5-1 106 clulas/mL con PBS-BSA-azida .
7 . Dispensar 200 L de la suspensin celular por pozo. Se calcula un pozo
por muestra ms un control negativo.
8. Centrifugar la placa a 800 rpm 5 n:inutos a 4 C.
9. Eliminar cuidadosamente el sobrenadantc. disgr-;:gar el sedimento sua -
vemente y aadir los AcM en las diluciones apropiadas. Al control ne-
gativo se le aade PBS-BSA-azida.
10. Incubar la placa 30 minutos a 4 C en cmara hmeda.
11. Lavar la placa tres veces, centrifugando como en el punto 8 y aadiendo
200 L de PBS-BSA-azida cada vez.
12. Aadir el segundo anticuerpo conj ugado con fluorescena en un volu-
men de 50 L .
13. Lavar como en el punto 11 , pero co.n PBS-azida.
14. Aadir al p elle! una gota de PBS-glicerol, resuspenderlo y colocarlo
sobre la lmina portaobjetos .
15. Colocarle cuidadosamente un cubreobjeto y sobre este depositar una
gota de dimetil-ftalato (o de glicerol) para la lectura con lente de inmer-
sin.
16. Leer al microscopio de fluorescencia. Contar al menos 200 clulas tota-
les y calcular el por ciento de clulas que fluorescen .

248 249
 CAPTULO VIII
IMMUNOBLOTTING*

Esta tcnica combina la resolucin de la electroforesis en gel con la especi-

ficidad de la reaccin Ag-Ac . Mediante la electroforesis se separan los
componentes individuales de una mezcla, generalmente de protenas, que se
transfieren a una membrana para hacerlos reaccionar con anticuerpos es-
pecficos .
Las protenas, qu e constituyen los antgenos, son usualmente separadas
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsu lfato de
sodio (SDS-PAGE) . La transferencia se lleva a cabo por electroblotting
a una hoja de nitrocelulosa o nylon, la cual se incuba con el anticuerpo
especfico para el (o los) antgeno(s) de inters . Los anticuerpos deben
estar marcados con una enzima o radi oistopo, y aquellos que no se
unen se eliminan mediante lavados . La unin de los anticuerpos marca-
dos se revela por una tcnica aprop iada (adicin del su strato o
autorradiografia, Figura 68) . Pueden emplearse los anticuerpos espec-
fico s sin marcar y revelarst: la uni n Ag-Ac con un segundo anticuerpo
anti-inmunoglobulina marcado .

rnotting: Estrictamente hablando, b/011i11g se retien: a la transferencia desd.:: d gd a la

membrana de nitrocelulosa, pero se utiliza para describir to.lo t.!l procedimiento.

25 1
La tcnic::i 1mmunoblotting tambicn s~ conoce como Western blomng debi-
do a su similitud con el Southcm blottrng** y el 1\orthem blottmg .. .
Cualquier mezcla de protenas puede ser analizada mediante immunoblonmg,
como lisados de cdulas y tejidos. sobrenadantes de cduias productoras de
proten::is rccombinantes y 'encnos de ongen animal El immunoblotting
pcm1ite detectar l::i presencia de un Ag. as como la masa molecular de sus
cadenas po!ip\.Ttdicas y la dirn;ncia de su e:-..traccion. Es particularmente
til para caracterizar mezclas compkJ<IS como los \cncnos de serpiente. Es
tambi0n una tcn1c:i poderosa para ensa~ ar la presencia. canudad y especi-
ficidad de anticuerpos en muestras diferentes de antisueros poltclonalcs.
El factor principal que determinad xito de un immunoblonmg es la natura- 1. Preparacin 2.Resolucin 3 . Transferencia
leza de los ep1topos reconocidos por !os a1111cucrpos Las tcnicas de mayo d~ lo rtlu estra. de l o muutro de los polippti-
resolucin de Ja electroforesis en gel conlJc,an la dc..:snaturahzac1n de la por e lectrofo- dos o uno membro
res i s en SDS- no de nitrocelu-
muestra de Ag. de ah que slo resultan tiles ios :inticucrpos que reconocen PAGE . losa.
cpicopos resistentes a la di.:snaturaliz.acin kpitopos no dependientes de la
confom1acin) . La mayora de los antisueros policlonah::s contii.:nen J.l me-
.

LJ ~ D
nos algunos anticuerpos de este tipo. pero muchos anticuerpos monockmalcs
no reaccionan con antgenos desn:iruraiizados.
El immunoblotting no requic1 e de anticuerpos de alta :ifin1dad .-\lgunos
anticuerpos que funcionan dbilmente en la inmunoprccipll:icin rccu ltan
s:iti sfactorios en esta tcnica. Esto se debe a la exposicin de algunos ep1topos
des pus de la desnaturalizacin y a la concentracin ele' ada de Ag sobre la 4. Bloqueo de 5. Adicin Jel 6 . Revelado.
membrana. tos sitios de anticuerpo mor-
unin no espe cado.
cfico.

Figura 68. J>:ocedimiento del irnmw10blotting.

** Southem blolling: Tcnica descrita por E.M. Southern para Jetc:ctar secuencias particu-
lares en una mezcla de fragmentos Je DNA, usWtlmente obtenida por digestin con
en<lonucleasas Je restriccin, que se separan tkspues por electroforesis en gel. Los
fragmentos resultantes S<: dr...'Snaturalizan y se transf:ren a una hoja de nylon o mtrocdu-
losa . El ON/\ transferido es hibnJ1zado con un apropiado lJNA o RN/\ radioman.:aJo, el
cual se hibri<lim a las secuencias wmplemr...1\tarias en los fragmentos. Las sondas 4ue no
se UJ\\.11 se eliminan por lavado' la lcx;lizacin U.: los hibriJos se re~da por :mtorrn<lto::'-Ialia.
Northem blotting: Tl:cnica para detet:Wr secu.:m:ias <le RNA dentro Je una poblac1on <le
mol::ulas !U 'A que han sido separadas por electroforesis. El tennmo Northern blottmg
se acuiio porqu.: el mdo<lo es s1r111 lar al Southem blottmg
La detectabilidad del immunoblotting est detenninada por el mtodo de detec-
cin o revelado. En la mayora de los sistemas este lmite puede ser aproximada-
mente 20 femtomoles (1 fino! = 1 1015 mol). Para una protena de 50 kDa
esto es aproximadamente 1 ng . Debido a que las capacidades de carga de los
geles son limitadas, u~ualmellte no puede ser detectada ~ protena si su con-
centracin en la muestra es menor que 1 ng . L1 capacidad de transferencia de
la membrana puede constituir un factor limita nte cu~o la msa mokx:ular del
Ag de inters es similar al de una protena abundante en la mezcla.

252 2:' 3
Tres tipos de anticuerpo pueden empicarse : anticuerpos policlonales,
anticuerpos monoclonales y una mezcla de estos ltimos . Los primeros son
los ms utilizados y como -por lo general- contienen concentraciones
elevadas de anticuerpos especficos, pueden diluirse extensamente. Esta
dilucin permite reducir el fondo no especifico (background) sin afectar la
detectabilidad . En algunos casos resulta conveniente prcincubar los sueros
poli clonales con antgenos contaminantes (absorcin) para evitar
interacciones especificas no deseadas en el immunoblotting que podran afec-
tar la interpretacin de los resultados.
La ventaja principal de los anticuerpos monoclonales es la especificidad de
su interaccin. Debido a que ellos se unen a un solo epitopo, constituyen una
herramienta ideal para identificar una regin particular del Ag . Los
anticuerpos monoclonales que funcionan bien en iriununoblotting son usual-
mente aquellos que interactan con eptopos no dependientes de la confor-
macin, llamados epitopos secuenciales . Sin embargo, muchos anticuerpos
monoclonales reconocen epitopos que s dependen de la conformacin o
epitopos conformacionales .. que se destruyen por los reactivos que se uti-
lizan para desnaturalizar las protenas en la preparacin de la muestra .
El empleo de mezclas de anticuerpos monoclonales combina las mejores
propiedades de los anticuerpos monoclonales y policlonales: especificidad y
detectabilidad. Obviamente, la mezcla debe componerse de anticuerpos que
reaccionen con epitopos diferentes resistentes a la desnaturalizacion y que
no muestren reacciones cruzadas indeseables .
PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ANTGENO
La mayora de las soluciones proteicas pueden mezclarse con el tampn de
muestra y analizarse mediante immunoblotting. El tampn debe ser compa-
Epitopo secuencial: Epitopo dependiente de la secuencia de unos pocos residuos conti-
guos en la macromolcula, que no debe ser afectado por la desnatura!izacin.
Epitopoconformacional: Epitopo dependiente de la esuuctura tridimensional de la mol-
cula de Ag. Los residuos de aminocidos que lo constituyen no son contiguos, pero se
encuentran yu>ctapuestos en la superficie por el plegamiento de la protena. Estos epi topos
usuahnente son afectados por la desnaturali7..acin.
254
tibie con el gel. Para geles SDS-PAGE Tris/glicina, el pH de la solucin
proteica debe estar cercano a la neutralidad y las concentraciones salinas
aproximadamente por debajo de 200 mmoVL, a menos que se vaya a utilizar
una dilucin grande de la muestra.
Materia/
- Muestra de protenas
- Tampn de la muestra: H1 0 destilada 20 mL; tampn Tris 5 mL (ver
abajo): gliccrol 4 mL: SOS al 10 % 8 mL; 2-mercaptoetanol 2 mL: azul
de bromofenol 50 mg/mL 0,2 mL
- Tampn Tris: Tris-HCl 6,0 g y llevar a 100 mL con 8i0 destilada
- Bao .de agua hirviente y centrifuga
Mtodo
1. Mezclar la solucin proteica con el tampn de muestra. La menor rela-
cin tampn:muestra debe ser 4: l (ejemplo, 80 L de tampn:20 L de
muestra) .
2. Colocar la muestra en bao de agua hirviente. Para muestras sencillas
puede ser suficiente 1 minuto y para muestras complejas, 10-15 minutos.
Despus de la centrifugacin las muestras pueden congelarse a -20 C,
siendo estables durante meses.
ELECTROFORESIS EN GEL SDS-PAGE
Dos factores deben tenerse en cuenta para la electroforesis: la cantidad de
protenas que puede cargar el gel y las dimensiones fsicas y la concentra-
cin de acrilamida del gel separador. Si se utiliza un extracto tota.1 de clulas,
la cantidad de protenas no deber exceder los 30 ~Lg/nun 2 de supertice de
gel. Para bandas individuales, la carga de ms de 0,3 g/mm 2 provoca dis-
torsin .
Ya que las tcnicas de bloning requieren de una buena transferencia de
protenas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa, debe tenerse en cu..:nta
que los por cientos de acrilamida y entrecruzamiento bajos facilitan la trans-
ferenci~. Por tanto, se deber utilizar el gel ms blando que rinda la r~solu -
255
cin deseada. En general, las protenas que corren ms lentamente son ms
dificilcs de eluir. La transferencia ser ms rpida y completa en geles del-
gados, aunque los geles ultrafinos son difciles de manipular. En la prctica.
una anchura de 0,4--0,5 nun constituy~ casi siempre el limite superior permi-
sible. Se debe recordar que durante la transferencia todas las protenas en
la anchura de una barida se concentran en la superficie de la membrana, as
que la corrida de muestras ms concentradas sobre geles muy finos mejora
la detectabilidad. Las transferencias desde geles con ms de 2 mm de an-
chura son ineficientes.
Material
- Muestra de protenas desnaturalizadas y equipo de electroforesis
- Soluciones de acrilamida para geles separador y concentrador (ver Ta-
bla XIV) preparadas al momento
- Isobutanol en Tris-HCl pH 6,8 (VN)
- Solucin de pironina
- Micropipeta ajustada con una punta estrecha y larga (o un similar para
aplicar las muestras)
- Tampn de corrida: Tris-HCI 15 g; glicina 72 g; SOS 5 g; ajustar pH a 8,3
y llevar a 1 L con ~O destilada
Mtodo
l . Ensamblar las placas de cristal del equipo de electroforesis, segn las
instrucciones del fabricante. Las placas deben estar limpias y libres de
detergente.
2. Preparar la solucin de acrilamida para el gel separador.
3. Verter la solucin de acrilamida entre las placas. El menisco de la solu-
cin debe quedar a una distancia que permita na buena altura para la
separacin de la mezcla molecular, quedando espacio para el gel
concentrador y los pozos. Cubrir cuidadosamente la solucin de acrilamida
con isobutanol. Esta solucin sobrelapante sirve de barrera al oxigeno,
ya que este inhibe la polimerizacin de la acrilamida. Colocar el gel en
posicin vertical a la temperatura del cuarto.
256
4. Despus que el gel se ha asentado (20-30 minutos), decantar la capa
sobrelapnte y lavar el tope del gel separador varias veces con agua
destilada. Decantar bien.
5. Preparar la solucin de acrilamida para el gel concentrador y verterla
directamente sobre el gel separador polimerizado. Colocar el peine apro-
piado en la solucin de gel, con cuidado pala no atrapar burbujas. Colo-
car el gel en posicin vertical a la temperatura del cuarto. El gel
concentrador se asienta en unos 1O minutos.
6. Remover cuidadosamente el peine. Lavar los pozos inmediatamente con
agua destilada para remover la acrilamida no polirnerizada. Enderez.ar
los dientes del gel concentrador, si fuera necesario. Ensamblar la cma-
ra de electroforesis y adicionarle el tampn de corrida. Cualquier burbu-
ja entre las placas en el fondo del gel debe ser removida.
7. Colocar las muestras en el fondo de los pozos utiliz.ando una micropipeta
con una punta estrecha y alargada u otro dispositivo apropiado.
8. Conectar la fuente de voltaje para comenz.ar la electroforesis. El voltaje
requerido estar en func1on del tamao del gel. Para los minigeles puede
ser suficiente 60 V. Despus que el frente coloreado se ha movido en el
gel separador, incrementar el voltaje' 120 V en los minisistemas).
9. Cuando el frente coloreado alcance el fondo del gel, apagar la fuente de
voltaje y aadir a cada pozo l OL de la solucin de pironina. Conectarla
unos minutos hasta que el colorante haya penetrado en el gel separador.
Suprimir la corriente y proceder a remover el gel con sumo cuidado,
utilizando una esptula o algo similar, nunca algo puntiagudo. Cortar un
ngulo de gel en el extremo superior izquierdo para identificar la posicin
de las muestras. El gel est listo para fijar, teir o transferir.
257
 TABLA XIV. Solucion o p8ra rlf'ctroforub rn SDS-PAG E T r l1.1 i llcin a
T RANSFERENCIA DE PROTENAS DEL GEL
6% S mL 10 mL IS mL ::O mL 15 m L 30 mL 40 m i. ~1 mL
A LA MEMBRANA (BLOITING)
H O 2,7 5,3 8,0 10.6 13.3 15.9 ; 1.1 :!'i}\
Mezcla de 1cril1m Kla 30 % 1.n 2,0 3,0 4.0 s.o 6.0 8 ,, 11\()
3,8 5,0 7, 5 JO.O 12.5
Para la transferencia de protenas se utiliza la nitrocelulosa, adems del
Tris l ,S mol/I.., pH 8.8 1,3 2.S 6 .3
sos 10 %' o.os 0,1 0, 15 0.2 0 ,25 0, 3 0 .4 o.s papel y el nylon activados . La nitrocelulosa es la ms usada aunque tiene
APS 10 %' o.os 0,1 O. I S 0.2 o.:s 03 0,4 0.5 ciertas desventajas, como S<in que no une C<?valentemente las protenas y
TEMED' 0,004 0 ,008 0.012 0 ,0 16 0,02 0.0:4 0.032 0.04
8% 5 mL 10 mL 15 mL :o ml. ~S t1 1L 3\J m!. 40 mL ~ l m~
su fragi lidad, especialmente cuando se seca. El papel activado (con grupos
HO 2,3 4/i 7,0 9,3 11 ,6 13,9 IS.6 23 .~ diazo) puede adqui rirse comercialmente y une covalentemente las prote-
Mezcla de acrilam ida 30 % ' l.l 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,1 13.4 nas. Tiene, adems. buena resistencia mecnica, pero el mtodo de acopla-
Tris 1,5 mol/I.., pH 8,8 1,3 2,S 3,8 s.o 6 .3 7,S 10.C 12. ~ .
miento que utiliza es incompatible con muchos sistemas de electroforesis en
sos 10 %' o.os 0.1 O.IS 0 ,2 0, 25 0, 3 O.< o. ~

APS 10 %' o.os 0,1 0,15 0, 2 0.2( C, 3 0 ,4 0,5 gel. La unin es a travs de grupos amino primarios, as que tienen que
TEMED' 0,003 0,006 0.009 0.012 0,015 0,0 18 0.021 1).03 empk arse con este material tampones sin grupos amino. El papel es caro y
10 ~~ S mL 10 mi. 15 mL :O m L 25 m l. JO mL 40 rn L ~ mi.
1 ~.8
los g rupo~ reactivos tienen vida limitada una vez que es activado. El nylon
H O 2,0 4,0 S,9 7,9 9.9 11.9 20.0
Mezcla de acrilamida 30 % ' 1. 7 3,3 s.o 6,7 8,3 10,0 13.3 16,1' puede unir slo una pequea cantidad de protenas y no es adecuado para
Tris l ,S mol/I.., pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6 ,3 i. ~ 10.0 1: .s muchas aplicaciones 1 aunque tiene propiedades mecnicas excelentes y no
sos 10 %' o.os 0,1 015 \J,l 0. 25 0, 3 0 ,1 0.5
cambia su tamao durante d lavado o secado. El nylon activado resuelve
APS 10 %' o.os 0 ,1 o.IS o,: 0. 2~ 0, 3 0.4 0.5
TEMED' 0,002 0,004 0,006 0,008 0.01 1).012 0 ,016 o.o: algunos de estos problemas. pero da altos fondos . Debido a todo esto, las
12 o/t S mL 10 f1'L I S mL 20ml. 25 mL 30 mL 4\'I mL 511 m L membranas de nitrocel ulosa son las ms empleadas.
H O 1, 7 3,3 5,0 6,6 8 ,3 9.9 IU 16,4
Me zcla de acrilam1da 30 4 2.0 4,0 6,0 8.0 10.0 lZ.O 14,0 200 La transferencia de protenas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa
Tris 1,S m ol/I.., pH 8,8 1,3 2,S 3,8 5,0 6,3 7,S 10,0 i :.s se puede realizar de tres formas : por difsin simple, por flujo de solvente al
sos'"" o.os 0,1 O,lS 0,2 0,2S 0,3 0, 4 0,5
APS 10%' o.os 0,1 0,15 0,2 0 ,2S 0,3 0 ,4 0,5 vaco y por elucin electroltica. La difusi.1 simple tiene pocas ventajas y
TEMED' 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,0 12 0 ,014 'o.Ol se empica raramente. El flujo de solvente al vaco tiene un nmero de
l S y, S mL 10 mL lS mL 20mL 25 J11L 30 m L 40 m L 50 m L
ventajas y es fcil y rpido. Sin emba rgo, las tcnicas de electrotransferencia
H, O 1,2 2.3 3,5 4,6 5.1 6,9 9,2 11 ,4
Mezcla de acrilamida 30 % ' 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20.0 25,0 o elucin e/ectrofortica son los mtodos ms utilizados. Su ventaja princi-
Tris l ,S mol/I.., pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6 .3 7,5 10,0 12,S pal es la rapidez y la calidad de la transferencia. Existen dos modalidades: la
sos 10 %' 0,05 0,1 0, 15 0 ,2 0,25 0,3 0.4 0.5 transferencia semiseca y la mojada. En la primera, el gel-membrana se
APS 10%' o.os 0, 1 0, 15 0 ,2 0,2S 0, 3 0.4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0 ,008 0.01 0,01 2 0,0 16 0.01
coloca entre el papel absorbente mojado en tampn de transferencia y entre
Oel concenindoc 1 mL 2 mL 3 mL 1 mL S mL 6 mL 8 mL 10 m i. dos electrodos de placa de carbn. En la transferencia mojada el empareda-
HO 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4, 1 5,5 6,8
do o sandwich se coloca en un tanque que contiene tampn con electrodos
Mezcla de acrilam ida 30 'lt' 0, 17 0,33 0,5 0,67 0.83 1,0 1,3 1,7
Tris 1,0 motil, pH 6,8 0,13 0. 25 0,38 0,5 0,63 0,7 5 1.0 1.2 5
de alambre de platino. Los aparatos para ambos tipos de transferencia es-
SDS 10 %' 0,01 0,02 0,03 0 ,04 0,05 0,06 0 ,08 0.1 tn disponibles comercialmente. Ambos trabajan bien, aunque el transferidor
APS 10 %' 0,01 0,02 0,03 0 ,04 0,05 0,06 0,08 0,1 semiseco es ms rpido y a menudo realiza transferencias ms completas.
TEMED 0,001 0,002 0,003 0 ,004 0,005 0,006 0,008 0,0 1

'Comnmente acrilamida 29,2 o/o y N, N-metileno-bis-acrilamida 0,8 %; bDodecil sulfato de Material

sodio; cpersulfato de amonio; <IN, N, N', N'-tetrametiletib1odiamino; Tris 1,5 mol/L, pH 8,8:
Tris-HCI 18, 15 g y llevar a 100 mL con agua destilada; Tris 1 mol/L, pH 6,8: Tris 12,0 g y - Equipo para transferencia semiseca (transfer semi~c:co)
llevar a 100 mL con agua destilada.
- Gel de SDS-PAGE

259
- Hoja de nitrocelulosa
- Papel absorbente
- Tampn de transferencia: Tris 5,8 g; glicina 2,9 g; SOS 0,37 g; metano!
200 mL y llevar a 1 L con J-1,0 destilada
Mtodo
l. Enjuagar los electrodos de placa con agua destilada.
2. Cortar 6-8 hojas de papel absorbente y una hoja de nitrocelulosa del
tamao del gel. Si el papel sobresale del borde del gel la corrienlt: har
cortocircuito y desviar el gel, impidiendo una transferencia eficiente.
3. Empapar la membrana de nitrocelulosa en tampn de transferencia. Para
ello, colocarla cuidadosamente sobre la superficie del tampn. Permitir
que la hoja se moje por capilaridad durante varios minutos y despus
sumergirla 2 minutos. Me>,iar el papel absorbente empapndolo con el
tampn.
4. Ensamblar el gel, la membrana de nitrocelulosa y el papel absorbente
sobre la placa inferior del equipo, de la siguiente forma:
- electrodo inforior (nodo)
- 3-4 capas de papel absorbente mojado en tampn de transferencia
- la membrana de nitrocelulosa embebida en el tampn
- el gel de poliacrilamida ligeramente mojado en el tampn
- 3-4 capas de papel absorbente mojado en el tampn
5. Chequear cuidadosamente si hay burbuj~ de aire y, si las hubiera, remo-
verlas rodando una pipeta sobre el emparedado o sandwich. Secar el
tampn que pueda quedar alrededor del emparedado.
6. Colocar cuidadosamente el electrodo superior (ctodo) sobre la superfi-
cie del emparedado. Conectar los electrodos para comenzar la transfe-
rencia. El tiempo de corrida es de 45 minutos a 1,5 horas con una co-
rriente de 0,8 mNcm2 de gel. Evitar la extensin del tiempo de corrida
pues podra haber desecacin.
260
7. Desconectar la fuente de voltaje . Desamblar cuidadosamente el apara-
to. Marcar la membrana para poder orientarse. Usualmente se recorta
un ngulo en el extremo superior izquierdo (como en el gel de
pohacrilamida).
8. Teiiir el gel de poliacrilamida con azul Coomassie o tincin de plata para
verificar la transferencia.
TlNCIN DEL GEL CON AZUL COOMASSIE
Ma terial
- Gel de polia<;rilamida
- Solucin de colorante: azul Coomassie O, l g; metanol 20 mL; cido ac-
tico 40 mL y llevar a l 00 mL ~on agua destilada
- Solucin decolorante: igual que la anterior, pero sin el colorante
M todo
l . Transferir el gel a un recipiente limpio de cristal o plstico. Adicionar
colorante hasta cubrirlo.
2. Incubar unos 15-20 minutos con agitacin a la temperatura del cuarto . .
3. Decantar el colorante y recuperarlo. Lavar el gel con agua destilada
para remover el colorante que no penetr en el gel.
4. Adicionar varios volmenes del decolorante. Cambiarlo las veces que
sea necesario . La decoloracin puede acelerarse por calentamiento a
60 C.
TINCIN DE LA MEMBRANA DE NITROCELULOSA
CON ROJO PONCEAU
El Ponceau S se aplica en solucin acuosa cida. La tincin es rpida pero
no permanente, por tanto, puede emplearse para verificar la transferencia y
localizar los marcadores de masa molecular. Sin embargo, la tincin no es
muy sensible y es dificil de fotografiar.
261
Ma te rial TABLA XV. Soluciones de bloqueo
- Solucin de tmcin: rojo Ponccau S 0,5 g y llevar a 100 mL con cido
tricloroactico (TCA) al 5 % Soluciont>s Ventajas Desventajas
- Solucin decolorante: PBS
Deterioro rpido
Lec he seca descre mada ' ! Bara ta
Enmascara algunos
M todo '.!%en Pl3S F1' ndo claro
antgenos
1. Transferir la membrana de nitrocelulosa a un recipiente de c1 istal o pl::.- Deterioro rpido
tico limpio. Cubrirla con la solucin del colorank. Leche s~ca de sc re mada al 13u m ta
Enmascara algunos
2 %, Twccn 20 al J,2 % Fondo :;!aro
antgenos
2. Incubarla unos minutos a temperatura ambiente.
l3arn1a
3. Enjuagarla unos minutos con varios cambios de PBS . Posibilidad de fondo
Twecn 20 al 0,2 % Pcrrrnte teir despus
residual
4. Marcar con lpiz la posicin de los marcadores de masa molecular. para jete1:1<1r antgeno
lS.!\ al 3 % t librc de lgG , Scl'lal fuerte Relativamente cara
fracci n V de Cohns)
BLOQUEO DE LOS SITIOS DE UNIN NO ESPECFICA .
Suero de caballo al 10 % Fondo claro Moderadamente cara con
. Antes de procesar la membrana para la deteccin de los antgenos es esen- alguna deteccin de
cial. su bloqueo para prevenir la adsorcin no especfica de los reactivos anticuerpos anti-IgG
inmunolgicos. La Tabla XV resume las soluc1onc.:s ms empleadas. Aun-
que todas son satisfactorias, en algunas circunstancias es necesario la se- Mtodo
leccin para asegurar la compatibilidad con el analito a detectar. Por ejem- 1. Enjuagar la m~mbrana varias veces con PBS .
plo, el empleo de suero completo resulta inapropiado si se utiliza la protena A 1

para la deteccin. La compatibilidad con el sistema de deteccin puede 2. Adic ionar la solucin de bloqueo.
chequearse tomando un pedazo de membrana fresca, bloquendolo y tra- 3. Incubar a la temperatura del cuarto con agitacin suave 1 hora.
tndolo con el sistema de deteccin. Dos soluciones bloqueadoras que son
4. Lavar con PBS dos veces durante 5 minutos cada vez.
compatibles con la mayor parte de los sistemas de deteccin, son la leche
seca descremada y la BSA. Si las soluciones de bloqueo dan un fondo exce-
sivo, se puede ensayar el bloqueo con Tween 20. ADICIN DEL ANTICUERPO

Materia/ La deteccin del antgeno en un immunoblotting se realiza por la unin de

anticuerpos a las protenas inmovilizadas sobre la membrana. Los anticuerpos
Membrana de nitrocelulosa
pueden estar marcados con una enzima o un istopo radioactivo, lo cual
- Solucin de bloqueo permite la deteccin del antgeno (mtodo directo); o pueden estar no mar-
cados para ser localizados a su vez por un segundo reactivo marcado, como
- PBS
anti-Ig o protenas A o G (mtodo indirecto) . La deteccin directa tiene la
ventaja d producir un fondo menor, es ms rpida y fcil, y disminuye la

262 263
oportunidad de detectar reacciones cruzadas indeseables . Su principal des-
ventaja es que se requiere la purificacin y marcaje de cada Ac . El 'm todo
indirecto pennite el empleo de un lote de reactivos para detectar un rango
amplio de anticuerpos . La mayora de los immunoblotting usan el mtodo
indirecto, excepto cuando se requiere Ja especificidad del mtodo directo.
Material
- Membrana de nitrocelulosa bloqueada
- Solucin del anticuerpo marcado (mtodo directo)
- Solucin del anticuerpo especfico y del reactivo marcado (mtodo indi-
recto)
Mtodo
l. Remover la membrana de la so~ucin de bloqueo y lavarla dos veces
du.rante 5 minutos con PBS .
2. Adicionar la solucin del anticuerpo primario. Todas las diluciones deben
hacerse en PBS que contenga protena como BSA al 3 %. Las
incubaciones pueden efectuarse en bolsas selladas, en bandejas de poca
profundidad o en tubos con tapa de rosca. Para anticuerpos primarios no
marcados utilizar sobrenadantes de cultivo sin diluir o diluidos hasta l O.
Esto rinde una concentracin de anticuerpos entre 1 y 50 g/rriL . Para
anticuerpos policlonales, 'fluido asctico o anticuerpos purificad0s, la con-
centracin de anticuerpos deber estar en este rango. Si se desconoce
su concentracin, se pueden probar diluciones diferentes para determi-
nar la ms apropiada. Para anticuerpos primarios marcados la concen-
tracin adecuada debe detenninarse previamente. Con anticuerpos mar-
cados con 1251, puede probarse adicionando aproximadamente 106 cpm
por 15 x 15 cm 2 de blot. Para anticuerpos marcados con enzima, adicio-
nar O, 1-1 g de anticuerpos por ' 15 x 15 cm 2 de blot.
3. Incubar la membrana con el Ac al menos 1 hora a . la temperatura del
cuarto con agitacin suave o 12-18 horas a 4 C.
4 . Lavar la membrana con cuatro cambios de PBS durante 5 minutos cada
vez. Si se emple el mtodo directo ya la membrana est lista para su
deteccin . En el mtodo indirecto continuar con los pasos siguientes :
264
5. Adicionar el reactivo secundario marcado. Hacer las diluciones en el tam-
pn que contiene protena. Para reactivos secundarios marcados con iodo:
remover la membrana del ltimo lavado y adicionarle aproximadamente
1O" cpm de reactivo secundario marcado con 125 1 (protenas A o G o
anticuerpos anti-lg) en aproximadamente 1O mL de tampn de bloqueo
por 15 x 15 cm 2 de membrana. Para reactivos secundarios marcados con
enzima utilizar concentraciones de 5-0,5 g/mL (usualmente una dilucin
de 1/200 a 1/2 000). Los reactivos marcados con peroxidasa deben diluirse
en tampn sin azida sdica, y los marcados con fosfatasa alcalina deben
diluirse y lavarse la membrana con tampn Tris-salina y no con PBS .
6 Incubar 1 hora a la temperatura.del cuarto con agitacin suave.
7 Lavar la membrana con cuatro cambios de PBS durante 5 minutos cada
vez para proceder entonces a su desarrollo o revelado .
Ohservaciim
Cuando se prueban las carrileras con anticuerpos primarios diferentes, las
mismas debern manipularse por separado. Cuando se emplea fosfatasa
alcalina la membrana deber lavarse dos veces con NaCl 150 mmol/L;
Tris 50 mmol/L, pH 7,5 antes de la adicin del conjugado enzimtico.
DETECCIN CON REACTIVOS MARCADOS CON ENZIMA
Los reactivos marcados con fosfatasa alcalina y desarrollados con el
bromocloroindolil fosfato/nitroazul tetrazolium (BCIP/NBT}, son probable-
mente la mejor eleccin para immunoblotting, pues rinden un intenso. color
negro-prpura con poco fondo . Resultados satisfactorios pueden obtenerse
con peroxidasa de rbano picante desarrollada con 4-cloro- i-naftol, 3-amino-
9-etilcarbazol (AEC) o diaminobencidina (DAB) .
FOSFATASA ALCALINA
El sustrato BCIP/NBT genera un precipitado negro-prpu ra intenso en el
sitio donde est la enzima unida. La solucin de sustrato es estable en au-
sencia de enzima. La reaccin tiene lugar a un ritmo unifonne, lo que penni-
te controlar'su desarrollo. Hay otros sustratos cromognicos para la fosfatasa
alcalina, pero para los immunoblonings el BCIP/NBT es el mejor.
265
Material ,\ 1aterial

- Solucin de NBT: NBT 0,5 gen 1O mL de dimctilfonnamda al 70 % Solucin de cloronaftol : cloronaftol 0,3 gen 1O mL de etanol absoluto. La
solucin es estable a -20 C al menos 1 ao
- Solucin de BCIP: BCIP (sal disdica) 0,5 g en 1O mL de dimctil-
fonnamida al 100 % l'ris 50 mmol/L, pH 7,6
- H,O, al 30 %
Tampn para fosfatasa alcalina : NaCI 100 mmol/L; MgCI , 5 mmol/L:
Tris 100 mmol/L, pH 9,5 - - Pss
1
- Las tres soluciones son estables a 4 C al menos 1 ao ' Mtodo
- EDTA 20 mmol/L en PBS 1. Inmediatamente antes de desarrollar el imrnunoblotting adicionar O, 1 mL
de la solucin de cloronaftol a 10 mL de Tris 50 nunol/L , pH 7,6. Se
Mtodo
fom1a un copioso precipitado blanco.
1. inmediatamente antes del desarrollo del imrnunoblotting, preparar la so- '
2. Remover el precipitado filtrando la preparacin a travs de papel
lucin de sustrato . Para ello, adicionar 66 L de N BT a 1O m L del tam-
Whatman # 1 (o su equi valente) .
pn para fosfatasa alcalina . Mezclar bien y adicionar 33 ~1L del BCIP.
Usar en l hora. 3 Adicionar 1O L del H2 0 2 al 30 ~-

2. Colocar la membrana lavada en un recipiente adecuado. Adicionar la 4. Colocar la membrana en un recipiente adecuado y adicionarle la solu-
solucin de sustrato y desarrollarla a la temperatura del cuarto con agita- cin de sustrato. Desarrollar el immunoblotting a Ja temperatura del cuarto
cin suave hasta que las baildas estn suficientemente oscuras . F.s to con agitacin suave hasta que aparezcan las bandas. Esto demora aproxi-
puede demorar aproximadamente 30 minutos. madamente 30 minutos.

3. Parar la reaccin enjuagando el blot con PBS que contiene EDTA, el 5. Para parar la reaccin, remover el Hp1 enjuagando con PBS .
cual acompleja los iones Mg....
Aminoetilcarbazol (A'f'C) .
,
PEROXIDASA DE RABANO PICANTE Este sustrato (3-amino-9-etilcarbazol) rinde un producto de reaccin rojo.
Es ligeramente ms sensible que el cloronaftol, pero ms dificil de fotogra- .
Tres sustratos resultan adecuados para desarrollar los immunoblottings con fiar.
reactivos conjugados a la peroxidasa de rbano picante : cloronaftol ,
aminoetilcarbazol y diarninobencidina. Materia l
- Solucin de AEC : 3-amino-9-et il carbazo l 0,4 g en 100 mL de
Cloronaftol dimetilfom1amida . Es estable a la temperatura del cuarto al menos le ao
El 4-cloro-l-naftol (cloronaftol) es relativamente insensible, pero da un pro- - Acetato de sodio O, 1 mol/L, pH 5,2
ducto de intenso color negro-azul en una reaccin fcilmente controlable.
Estos blots deben ser rpidamente fotografiados, pues el color se desvane-
- Hp2 al 30 %
ce rpidamente. El color de fondo es bajo. - PBS

267
266
Me todo
1. Inmediatamente antes del desarrollo del immunoblotting adiciona
0,67 mL de la solucin de AEC a 10 mL de la solucin de acetato d
sodio. Puede fonnarse un pequeo precipitado, que se puede eliminar
por filtracin a travs de papel Whabnan # 1.
2. Adicionarle al filtrado 1O L del ~O: al 30 % .
3. Colocar la membrana lavada en un recipiente adecuado y cubrirla con
la solucin de sustrato. Desarrollar la reaccin a la temperatura del
cuarto con agitacin suave hasta que las bandas estn suficientemente
oscuras .
4. Parar la reaccin removiendo el ~0 2 con PBS .
Diaminobencidina (DAD)
El 3,3 ,4,4 -tetraminobifenil es un sustrato excepcionalmente sensible, que
rinde un producto de color pardo. Su sensibilidad puede ser incrementada
aadiendo iones cobalto o nquel a su solucin . En presencia de estos iones
el producto de la reaccin es de. color negro pizarra, ms fcil de fotografiar.
El inconveniente del DAB es que la reaccin es tan rpida que puede
sobredesarrollarse el blotting, dando una fuerte coloracin de fondo .
Materia/
- Solucin de DAB : DAB tetrahidrocloruro 6 mg en l O mL de Tri
50 mmol/L, pH 7,6
- Puede fonnarse un precipitado que se elimina por filtracin a travs d
papel. Aadir 10 L de ~0 2 al 30 %. Esta solucin se prepara irunedia
tamente antes de usarse
- PBS
Mtodo
l. Colocar la membrana en un recipiente adecuado y cubrirla con la solu
cin dr. sustrato recin preparada. Desarrollar d immunoblotting a 1
temperatura del cuarto y con agitacin suave hasta que las bandas dcsa
rrollen el tono adecuado.
268
. Parar la reaccin removiendo el ~0 2 con PBS.
Diaminobencidina facilitada con iones metlicos (DAD/metal)
Material
- Solucin de sustrato: DAB tetrahidrocloruro en 9 mL de Tris 50 mmol/L,
pH 7,6. Filtrar por papel Whabnan # 1 si se forma precipitado. Adicionar
1 mL de NiC1 2 o CoCl 2 al 0,3 % (peso/volume~ y 10 L de "20 2 al
30 %. Prepararla en el momento de su empleo
- PBS
M todo
1. Colocar la membrana en un recipiente adecuado y cubrirla con la solu-
cin' de sustrato recin preparada . Desarrollar el immunoblotting a la
temperatura del cuarto y con agitacin hasta que las bandas desarrollen
el tono adecuado.
2. Parar la reaccin sumergiendo la membrana en PBS .
DETECCIN CON REACTIVOS MARCADOS .
CONfADIOISTOPOS
Estos mtodos tienen dos ventajas : la medicin es fcil y la imagen
autorradiogrfica es clara y exacta para su publicacin. Sus principales des-
ventajas son que requieren de un equipamiento y condiciones especiales, as
como el riesgo que presupone el trabajo con istopos radioactivos.
Materia/
- Membrana de nitrocelulosa
Pelcula de rayos X
- Cassette de autorradiografia con pantalla amplificadora
'V
- Reactivos para el revelado
Mtodo
1. Despus del ltimo lavado, drenar la membrana de nitrocelulosa colo-
cndbla sobre una pieza de papel absorbente.
269
2. Envolver la membrana en una envoltura plstica. Alinear la pcleula
rayos X y la membrana, colocndolas y fijndolas convenientemente
el cassette de autorradiografia.
3. Exponer la membrana a la pelcu la de rayos X a - 70 C con una pantall
amplificadora .
4 . Realiz.ar el revelado .

Observacin
La cubierta plstica bloquear el contacto con los istopos radioactivos.
Cuando no sea necesario su empico, la membrana de nitrocelulosa deber,
estar seca para que no se pegue a la pelcula. Si quedara adherida, se su
mergir el emparedado en PBS para que la nitrocelulosa se hidrate y pod
ser separada de la pelcula.
OTRA FORMA DE REVELADO
Actualmente se dispone en el mercado de membranas cubiertas con el sis:
terna de deteccin (Web) que se colocan sobre la membrana de nitrocelul
sa, las cuales dan en unos pocos segundos una banda coloreada en el siti
donde est presente la enzima. Esta deteccin rpida y sensible ocurre,
el caso de la peroxidasa, por un proceso de transferencia de electrones
sistema de deteccin, iniciado por la peroxidasa, que produce una color,
cin verde-azul. Esta Lcnica es similar en principio a la de la pelcul
autorradiogrfica, con la diferencia de que esta detecta reactivos marcad
radioactivamente en la oscuridad y el Web detecta enzimas bajo la luz ordi
naria. Este mtodo tiene mejor detectabilidad que los mtodos radioactiv
que utilizan anticuerpos o protenas A o G marcados co 125 1 aplicand
deteccin autorradiogrfica y que los mtodos de deteccin colorimtric (plasmacitoma) con un similar estadio de diferenciacin. El hibridoma resul-
que emplean peroxidasa o fosfatasa alcalina.
Este sistema evita la manipulacin de materiales radioactivos, elimina 1
preparacin de sustratos enzimticos, algunos de los cuales so
carcinognicos, y la manipulacin de solventes orgnicos utiliz.ados comn
mente con los sistemas de deteccin colorimtricos .
CAPTULO IX
PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
MONOCLONALES. TECNOLOGA
DEL HIBRIDOMA
Se coryoce desde hace bastante tiempo que es posible fusi onar clulas de
difer9'1tcs tipos y especies para fonnar hbridos. Sin embargo, la retencin
de caractersticas altamente diferenciadas se pierde si los parentales no
provienen de un linaje igual o muy relacionado y en un estadio similar de
distincin (Yelton et al., 1980).
Una linea celular productora de anticuerpos generada por esta va proviene
de la integracin fsica, mediante un agente fusgeno, de .clulas B produc-
toras de anticuerpo de un animal inmunizado y clulas de una lnea de mieloma
tante puede preservar la capacidad de producir y secretar inmunoglobulinas
especficas y la posibilidad de reproducirse in9efinidamente (Figura 69) .
La tecnologa del hibridoma fue iniciada por Gcorge Kohler y Cesar Milstein
en 1975. El xito de la tcnica dependi del desarrollo de lneas de nueloma
que podan crecer en medio de cultivo normal, pero no en un medio de
seleccin definido por carecer de un gen funcional necesario para la sntesis
de DNA en este medio selectivo. Las clulas B normales que se fusionan

271
270
 con el mieloma deficiente proveen al hibridoma de este gen, y posibijitan as ) timidi na . Este es el ll amado medio. selecti vo HA T (hipoxanti na/
su crecimiento en el medio selectivo. aminoptcrinaltimidina) . Las lneas celulares carentes de HGPRT o TK no
pueden usar la v1a de salvamento y mueren en el medio HAT. Cuando las
Cl!lulas B normales se fusionan con clulas de mielorna HGPRT- o TK-
Mielomo HGPRT- provcen a los hfridos de la enzima necesaria, de forma tal que estos sinte-
tizan DNA y .., r1,,'\.:en en el medio HAT, a diferencia de las clulas de mieloma
progenitoras (Figura 70) (Ab bas eta/., 1994)

No secretor
de l9 \Hibridizoci6n e
Hibridomo HGPRT + VA SNTESIS
11

Fosfor ri bosil pirofos f oto

Urid~oto
DE NOVO" VAS DE SALVAMENTO

Timidino

i T~
Hipoxont i no

HGPRT:
Inmortal ~1 ' Enzimot ou-
1
Secretor de I9 sentes en t
r
L-
'11 de
los lneos .
mielomo 1
- - t empleados t
Mortal
Secretor de 19 ~---- ~~
NU{:LETIOOS
Figura 70. Vas di! sntl!sis <le ptirinas.
Figura 69. Fwidamento de la tecnologa del hibridoma por fusin celular para obtener
anticuerpos monoclonales.
cltc principio se a~hc a la generacin de lubrido~
productores de anti-
Las lneas de mieloma empleadas como progenitoras de hibridoma se obtie cuerpo. Khler y Milstein fusionaron una inea de mieloma de ratn HGPRT-
nen induciendo defectos en las vas de sntesis de nucletidos. Las clulas a clulas B normales de ratones inmw1izados con un antgeno conocido, usan-
animales normales sintetizan de novo nucletidos pricos y timidilato a par do el virus Sendai, el cual expresa una protena que fusiona las clulas. Los
tir de fosforribosil pirofosfato y uridilato, respectivamente, en varios pasas, hbridos fueron seleccionados en medio HAT; bajo estas condiciones las clu-
uno de los cuales involucra la transferencia de un grupo metil o fonnil del las de rnieloma no fusionadas murieron porque no pudieron emplear la va de
tetrahidrofolato activado. Las drogas anti-folato, tales como la aminopterina, salvamento y las clulas B no sobrevivieron por ms de 1 o 2 semanas, ya que
bloquean la reactivacin del tetrahidrofolato, e inhiben as la sntesis de purinas ellas no estaban inmortalizadas. Slo los. hbridos crecieron. Entre las modifi-
y timidilato. Ya que estos son componentes necesarios del DNA, la caciones ms sobresalieqtes realizadas a la tcnica de fusin de Khler y
aminopterina bloquea la sntesis de novo de DNA. Las clulas tratadas con Milstein se encuentran el uso de lneas de mieloma no productoras de
aminopterina tienen la alternativa de usar na va de salvamento en la que la irununoglobulina y el empleo del polietilenglicol, en vez del virus Sendai, como
purina es sintetizada a partir de hipoxantina suplementada exgenamente, al agente de fusin , lo que hace ms sencillo el procedimiento.
utilizar la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil transferasa (HGPRT): y La tecnologa del hibridoma ha resultado muy exitosa con clulas de ratn y
el timidilato es sintetizado a partir de timidina exgena al emplear la enzima de rata, menos efectiva se ha mostrado con clulas humanas y poco se ha
timidina quinasa (TK). Por ~to, ta5 clulas crecen normalmente en pre experimentado con otras especies. Una va alternativa para la obtencin de
sencia de aminopterina si el medio de cultivo es suplementado con hipoxantina hibridomas humanos es la inmortalizacin de linfocitos de sangre perifrica
272 273
con virus Epstein-Barr (EBV) . El principio de la h1bndi z..acin ha sido- utiliza-
do para generar hbridos de clulas T de ratn, fu s ionando clulas T con ;~ -::~~~, .
~I;' \~\ > [v;j ''.
clulas de una lnea tumoral sens ible a l medio HAT. f!f ~" ~
.... ~,, \
Hoy da la ingeniera gentica ha irrumpido exi tosamente en el can1po de los

'.A
irr:;;.. ~~ '(!,\\)\_\()
~ ,,.. ---
-~---~''t.c"' ~ ~
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o
anticuerpos monoclonales y ya se han obtenido anticuerpos qui mricos, hu- '
tn mun i zocion ~1> ?!;::: . de celulos
Cultivo '
manizados (ratn/humano) y fragmentos de anticuerpos expresados en fagos 4'~,. .. . .~<::i-.: de mieloma
(scFv) que permiten el clonaje y la manipulacin de repertorios de 1111focitos ~ "L~AP'.:_~ ,

B murinos y humanos . Con esta potencial1dad pueden obtenerse ant icuerpos

~~ . ~
que no existen en la naturaleza, como los cataliticos . , . es posible pro\.ocar
maduracin in vitro de la afinidad de los anticuerpos recom binantes (Win ter
y Milstein, 1991 ).
Clulas
esplenicos
HGPRT+ Ig+
C"'\,
\!..@)
@
y e
fi' Clulas de
\:../ mielomo
HGPRT-Jg-
~

7
Este captulo tratar de la tecnologa del hibridom<i obtenido por ti.J s in celu- ( 10f') J.... ).... {10 )
lar (Figura 71 ). {. -,} V ,, .,,
l ' ... .I' ~ '"''

LNEAS CELULARES DE MIELOM A .--. ~: ;~;:ccin de hbridos

Ens ayo de/ -()... en medio HAT
Las clulas de mi eloma que se util izan en la fu sin c~ l ula r son defic ientes anticue rpos
en la enzima HGPRT y, por tanto, incapaces de crecer en un medio que
contenga aminopteri na . Ellas crecen en medio RPMI J640 o med io esen- Clon de hbrido
productor del
cial mnimo de Eagle, modificado por Dulbecco y suplementado con anticuerpo
glutamina y suero fetal bovino (FBS) al 10 %. Aunque algunos autores C) deseado
recomiendan el uso de antibiticos, cultivadores de clulas experimenta-
Induccin
dos prefieren no utilizarlos para no enmascarar contaminaciones, por lo que
, \ de tumor

~
resulta ms adecuado su empleo en el momento de la fusin ( 100 000 g/mL asctico
/
de penicilina y' I 00 000 g/mL de estreptomicina) . Las lneas de mieloma ~~~ecimiento masivo
ms utilizadas son laP3X63Ul , P3X63Ag8 .653, Sp2Agl4 y la P3-Ns1Ag4- l , ~ del cltivo
que son variantes de la lnea onginal MOPC21 no secretora de Ig y sensi-
i .'
ble al medio HAT. Estas lneas crecen como tumor asctico en ratones
isognicos Balb/c.
j'r~ ..............
\~
..,.....,.,.
Hibridoma
con ge lado Anti cuerpo An f'icuerpo
paro uso monoclonal monoclonal
FUSGENO
futuro
Se utiliza el polietilenglicol (PEG) 4000-6000 que se prepara al 50 % (p/v)
Figura 71.. Produccin de anticuerpos monoclonales por la tecnologa del hibridoma por
en medio de cultivo sin suero y se esterjliza en autoclave . fusin cd ular.
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O;- -:$;';-
/;",,,,V -~.<:::t
MEDIO SELECTIVO HAT
Contiene los mismos componentes ya mencionados para el medio de cultivo
del mieloma, con la diferencia de que el suero fetal bovino se utili za al 20 %
y se le adiciona hipoxantina 100 mol/L , timidina 16 ..unol/L y aminoptcrina
0,5 mol/L . En la prctica se prepa ran soluciones concentradas 1Ox de
cada uno de estos aditivos o se compran estas soluciones ya preparadas La
adicin de 2-mercapto etanol (50 mol/L) , muy utilizado en los pri meros
tiempos de la tecnologa, ha cado en desuso. Se prepara una solucin con-
centrada, se filtra y se conserva a - 80 C .
SUPLEMENTO DE SUERO FETAL .BOVINO
Usualmente se inactiva en bao tennostatado a 56 C durante 30 minutos
Los lotes de suero varan de modo conside1 a ble en su capacidad para pro-
mover el crecimiento de los hibridomas, por lo que rcsult.\ conveniente
probar diferentes lotes antes de comprar Se pueden adquirir productos : a
probados para este fin como Hibnmax de Sigma . Se utilizan aditi vos qu.:
contienen factores de crecimiento como suero de cordn umbilical humano,
medio condicionado por macrfagos o lneas de macrfagos trans fomlados
MEDIO TAMPONADO HEPES
Resulta habitual el empleo de un tampn combinado: el sistema bicarbonato
de sodio (2 g/L) y atmsfera de co2al 5 % con el tampn zuiternico
HEPES (15-18 mmol/L) que tiene unpKa ms fisiolgico que el bicarbona-
to. Concentraciones de HEPES mayores de 18 mmol/L pueden resultar
txicas para las clulas .
INMUNIZACIN DE RATONES
Animales de 3-4 meses ( 15-18 g), preferibl ement~ hembras, son adecua-
dos. Deben inmunizarse varios ratones por protocolo. Es muy importante
determinar el ttulo de anticuerpos para seleccionar los animales que se
emplearn en la fusin . Un punto debe quedar claro: la tecnologa de
hibridomas requiere de animales respondedores y, por tanto, no sustitu ye la
falta de respuesta.
276
Es usual el cmploo de un mmum.1'!nsa~o s1m1la r al que se utthzar en la
e' aluacion de los hbndos {:I sist::ma de ensayo de los h1bridomas debe
l.!star mu~ b1~n diseado y listo antes de la fusin. Despus que esta se
produce y en un mtcn.alo entre l 0- 14 das ser necesario evaluar entre 150
~ 300 sobrcnadantcs cri 48 horas, as como tomar una decisin que implica
desechar los h1b11domas no posl!ivos en el primer ensayo. Esto significa que
NO PUEDE ESPERARSE ESE MOMENTO PARA PENSAR EN EL
ENSAYO
t:.n el caso de inmungcnos pamculados o clulas completas, el protocolo de
mmunizacion podna ser: dos inyecciones i.p. de l 0' -8 clulas en solucin
salina ta.mponada (PBS, separadas 4 semanas y un booster 3 das antes de
!a fusin P1ra molculas solubles 1.1r1 inyeccin s .c. de 100 g de antgeno
~mul s1ficado en ad~ .ivante compkto de Frcund en 0. 1 mL seguida de un
';ooster i.p . a los 30 das (0,5 mL). Cuando el anima l alca.nU; el ttulo apro-
piado, se reactiva finalmente por va iY. Algunos autores evitan el CFA que
puede inducir granulomas o causar interfcre,1cias despus de la fusin . En
su lugar se puede utihz=ir el precipitado de almjna con Bordetella pertussis
como inmunocstimulante.
Si uno o varios animales muestran un titulo adecuado (por ejemplo, 1/10 000
por ELISA con respecto a animales nu 1nm11nizados) se procede, si estn
creadas todas las conJiciones para la fusin, el cultivo y clonaje, a adminis-
trar el booster final, el cual a los 3 das pem1itir disponer de una gran
cantidad de clulas B en trnsito a blastos, que son las requeridas para la
fusin con las clulas de miclorna.
METODOWGA DE FUSIN CELULAR
El mieloma parental puede estar en fase exponencial de crecimiento; para
ello se dben sembrar 3-4 frascos de 75 cm 2 con 2 l 05 clulas por mililitro
2 das antes de la fusin . Veinticuatro horas despus (un da antes de la
fusin) se cambian a medio sin antibiticos pa"ra evitar el enmascaramiento
de alguna contaminacin que sera conveniente detectar antes de empren-
der la fusin .
La metajologa original de Kohler y Milstein ha sufrido muchas modifica-
ciones . Las ms importantes son: la sustitucin del virus Sendai por el PEG
277
y el empleo de mielomas no secrerorcs de inmunoglobulinas . Son muy popu-
lares los protocolos de Galfr y Kennett . Por lo general , cada labo ra to rio
elabora su propia metodologa siguiendo dctcnninados principios bsicos S1
un protocolo no resulta exitoso. es recomendable repet irlo. ya que la expe-
riencia obtenida en la primera oportunidad repercutir fa vorablemente en
las subsiguientes .
Es importante tener en cuenta que slo se obtendrn hbridos si
1. Se aplica una tcnica rigurosamente asptica para evila r contam inacio-
nes .
2. Se controla y evala previamente la no tox icidad de los componentes
aditivos.
3. Se siguen los principios bsicos de la fu sin celular.
Protocolo tipo de fusin celular (Otero et al., 1991)
l . Resuspender las clu las de mieloma y la varlas tres veces en med io RP M 1
con sus aditivos, incluyendo antib iti cos, sin FBS . C ~ntrifuga r a 1 000 rpm
1O minutos. Despus del ultimo lavado rcsuspcnder en 1O mL y cinta r el
nmero de clulas por el mtodo de exclusin con azu l Tripano .J
2. Sacrificar el(los) ratn(es) y sumergirlo(s) brevemente en etanol al 70 %.
En el gabinete de flujo laminar, realizar un corte en la parte inferior del
abdomen (perpendicular a la lnea de alba) y abrir el animal hasta que
quede expuesto el peritoneo. Con un j uego de instrumental estril cortar
la membrana y con las pinzas (sin tocarlo) localizar el bazo. Cambiar el
inst rumental por otro limpio y tomar el bazo, cortarlo y liberarlo de grasa.
Pasarlo a una caja Petri con 1O mL de megio sin suero y con el doble de
la concentracin de antibiticos . Mantenerlo en ella 5 minutos y cam-
biarlo a otra caja con igual contenido. Repetir la operacin .
3. Perfundir el bazo con una jeringuilla de 10 mL y aguja No . 20 hasta
que la decoloracin indique una buena cosecha de esplenocitos . La-
varlos tres veces en las mismas condiciones que el mieloma y contar-
los por exclusin con azul Tripano. Los linfoblastos son mayores que
los linfocitos nq estimulados y los ~ ritrocitos se ven amarillentos y de
menor tamao .
278
4. Mezclar 1O" clulas de micloma y 108 lnfocitos en un tubo plstico de 50 mL
y centri fu ga r igual que en el punt9 l . Si no se alcanzan esas cantidades
de cl ulas, S\': debe mantener la proporcin l : 1O en la mezcla .
5 Decantar el sobrenadante y remover el pellet contra la meseta ranurada
del gabinete para aflojar la masa celular. Adicionar lentamente 0,5 mL
de PEG al 50 % en medio sin suero, gotcndolo por las paredes del tubo
durante 2 minutos. Ad1c1onar lentamente, en iguales condiciones, 5 mL
de medio si n suero dura nte 5 minutos . Completar a l O mL en otros
2 mi nutos. Tapar el tubo e incuba rlo l O minutos a 3 7 C.
6. Centrifugar a 1 000 rpm l O minutos y resuspender en n 1O mL de
~
medio con S FB 20 % (n == nmero de millones de clulas de mieloma en
la proporcin 1: l O y tambin el nmero de placas que se sembrarn) .
7. Sembra r 100 L de suspensin cel ular en placas de 9G pozos en las que
se s\!mbraron, 24 horas antes. macrfagos peritoneales de ratn a razn
de 5 mL de lavado peritoneal por placa. Si se prefiere la promocin del
creci miento a base de esplenocitos, se sacrifica un animal y se extraen
los linfocitos de bazo sie,-uiendo la metodologa descrita. Sembrar l l 06 c-
lulas al imentadoras por placa.
8. Al d a siguiente remover la mitad uel ml'dio a cada pozo y adicionarle
50 L de medio I IAT 2x para inicia r la seleccin .
Observacin
Entre l O ) 15 das los hibridomas se vern crecer a simple vista. No obstan-
te, se deben evaluar al microscopio y seleccionar para su ensayo aquellos
que hayan llenado ms de un 60 % de la superficie disponible. En la medida
que pase el tiempo, habrn nuevas oleadas de hibridomas que coexistirn
con los que ya fueron evaluados y seleccionados . La tcnica asptica debe
L . . . . .
ser muy ngurosa para evitar contammac1ones .
EVALUACIN DE SOBRENADANTES
La tcnica que se seleccione debe estar muy relacionada con aquella en la
cual se desea que funcione el anticuerpo monoclonal , sobre todo si este se
destina al diagnstico. Por lo general, se realiza una evaluacin primera
279
 contra el inmungeno y una secundaria para detectar posibles rca~cioncs
cruzadas u otras propiedades del anticuerpo monoclonal, como capacidad
aglutinadora o neutralizantc
Un ensayo para evaluar los sobrcnadantcs de hibridorna debe satisfac;(:r los
siguientes requerimientos.
1. Ser sencillo y factible de realizar con las condiciones tcn icas de que s..:
dispone.
2. Tener un grado conveniente de automatizacin para hacerle frc111 c a una
gran cantidad de sobrenadantes smmltncamenrc
3. Capaz de detectar 1- 10 g/mL de anticuerpo.
4. Los resultados deben demorar como mx imo hasta el da s1gu1cntc de la
cosecha de los sobrenadantes, para poder establecer la conducta a sc-
gu_ir con los hibridomas .
5. Contar en su diseo con controles positi vos~ nc.:gat1\os
6. Si se incluye anti-IgG de raton, este debe reconc...:cr todo::. lo!' 1sot1pos
De no ser as, se debe tener en .:ucnta sus hm1tac1oncs.
7. Ser econmica J monoclonalidad del hbrido, ya que colonias y poblaciones concomitantes de
ELISA para evaluacin de sobrenadantes
l. Recubrir placas de cloruro de poli vinilo (PVC) con 100 L de anticuerpo
policlonal monoespecfico que reconozca el antgeno con que se inmuniz
(10 g/mL) en tampn carbonato de sodio O, 1 mol/L, pH 8,9. Incubar
toda la noche a 4 C .
2. Lavar la placa cuatro veces con PBS-Tween 0,05 % (PBS-T).
3. Bloquear con 150 L de BSA l % en PBS 1 hora a 37 C.
4. Lavar cuatro veces con PBS-T.
5. Aadir 100 L de antgeno a una concentracin saturante del anticuerpo 2. Distribuirlas en una placa a ra2n de 1Oclulas por pozo en la fila A :
de recubrimiento en PBS-T (previamente determinada) . Incubar 1 hora
a 37 C.
6. Lavar cuatro veces con PBS-T.
280
7 Aadir 100 L de sobrcnadantc de hibridoraa, PBS-T como blanco,
sobrcnadantc de monoclonal no relacionado como control negativo. y
control positivo . Si no se dispone de este ltimo, hacer una dilucin del
suero de ratn positivo 115 000-1I1 O 000 y entonces incluir tambin una
dilucin similar de suero nonnal de ratn . Incubar 1 hora a 37 C.
8 Lavar cuatro \'cces con PBS-T.
9. Aadir 100 L del conjugado de pcroxidasa con anti-lgG de ratn (mol-
cula completa) a una dilucin recomendada por el proveedor en PBS-T
que contiene FBS 4 %. Incubar l hora a 3 7 C .
10 lavar seis veces con PBS-T.
! 1 Aadir 100 L de solucin de sustrato: 1O mg de OPD. 1O L de HP:
30 % y 25 mL de tampn citrato fosfato pH 5. Incubar 30 minutos .
12. Leer absorbancia en lector de micro-ELISA a 492 ron .
CLONAJE DE LOS HIBRIDOMAS
El clonaje de los hibridomas positivos es indispensable para garantizar la
1.:xcrecin no relacionadas pueden hacer desaparecer en pocas generacio-
nes a la poblacin de inters . Se han descrito dos mtodos principales: el
clonaje en agar scmislido y el de dilucin lirnitante en medio liquido. El
primero se utiliza poco y se basa en el : ~slamiento de las colonias en medio
solidificado, la que pueden capturarse con un asa de platino y llevarse a
pozos independientes de una placa de 96 . El segundo mtodo se describe a
continuacin.
Clonaje de clulas por dilucin limitan te (Otero et al, 1984)
1. Resuspcnder las clulas y contarlas por exclusin con azul Tripano.
5 clulas por pozo en la fila B; 1 clula por pozo en las filas C , O y E:
Y2 clula por pozo en las filas F, G y H, rcsuspcndidas en medio con FBS
20 % .. Las placas pueden contener clu las alimentadoras como se des-
cribi en la pgina 266.
281
3. Evaluar los sobrcnadantes .
PRODUCCIN DE CANTIDADES PTIMAS
DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse en cultivo celular o a par-
tir de tumores ascticos en ratones . En el primer caso se deben hacer crecer
los hibridomas hasta una alta densidad celular que acidifique el medio pero
sin que haya sobrecrecimiento, ya que esto provoca la muerte celular muy
rpidamente. Centrifugar a 1 000 rpm 1O minutos, separar el sedimento y
aadir azida sdica en conentracin del O, 1 %. Conservar el sobrenadante
a 4 C.
Fluido asctico
1. Inyectar i.p. ratones Balb/c de 3-4 meses con 0,5 mL de Pristane (2, 6,
10, 14-tetrametil pentadecano), aceite mineral o adyuvante incompleto
de Freund, 1-3 semanas antes de inocular los hibridomas .
2. Inyectar a cada ratn J06-8 clulas de hibroma en PBS . Estas crecern
como tumores ascticos y el fluido contendr 10-500 veces ms anti-
cuerpo que los sobrenadantes de cultivo.
3. Para colectar la ascitis manipular los animales e introducirles una aguja
No. 18 en la zona baja del abdomen hinchado y dejar gotear el lquido en
un tubo.
4. Centrifugar, decantar y congelar a -70 C en alcuotas de 1 mL .
Observacin
De los animales se puede obtener ascitis generalmente una vez ms .
CONGELACIN DE HIBRIDOMAS
L Utilizar clulas en fase exponencial. Centrifugar a razn de l 0 7 clulas
por criovial.
2. Remover el sobrenadante y resuspender las clulas en 1 mL de FBS 95 %,
dimetil sulfxido 5 % fro .
282
3. Transferirlas a viales de criopreservacin debidamente rotulados con
marca y i'ccha .
4. Ubicar los viales en cajas de polipropileno de paredes de 1 cm de ancho
e introducirlas en un congelador de - 80 C . A las 72 horas pasar el
contenido a nitrgeno lquido: evitar aumentos de temperatura.
DESCONGELACIN DE HIBRIDOMAS
l . Tomar el mpula del nitrgeno lquido y depositarla en un recipiente con
agua tibia. Lo ms rpidamente posible desinfectarla en su exterior y
pasar el contenido a un frasco de 25 cm" con 1O mL de medio.
2 .. Vci11Licuatro horas ms tarde centrifugar las clulas a 1 000 rpm 1O mi-
nutos 'y resembrarlas en iguales condiciones a las ya descritas .
r>bservacin
Tanto los hibridomas como los sobrenadantes y ascitis deben ser evaluados
peridicamente para conocer si la actividad de los anticuerpos se mantiene.
Si esta disminuye en los hbridos, se debe proceder a efectuar series de
clonaje.
CARACTERIZACIN .Y PURIFICACIN
La caracterizacin primaria consiste en la determinacin del isotipo de lg
(clase y subclase), para lo cual se debe disponer de antisueros clasificado-
res que pueden emplearse en la tcnica de Ouchterlony para sobrenadantes
concentrados, o en ELISA. Una vez conocido el isotipo se procede al dise-
o de la estrategia de purificacin, que puede tener un paso previo de preci-
pitacin salina en dependencia del grado de pureza deseado y de la suscep-
tibilidad del anticuerpo monoclonal a este tratamiento . En general, la
cromatografia de afinidad con protena A rysulta ventajosa en cuanto a
rendimiento, pureza y actividad biolgica de los anticuerpos.
APLICACIONES DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES
La tcnica de producir cantidades ilimitadas de un anticuerpo de especifici-
dad particular ha revolucionado la inmunologa y ha tenido un impacto cada.
283
vez mayor en diversos campos . Dos caractersticas de la h1bnd1...ac1on celu- cios Las regulaciones establecidas por las organizaciones internaciona-
lar somtica la hacen extremadamente valiosa. Primero, es el mejor mctodo les para la aceptacin de cualquier producto teraputico nuevo son muy
para producir un anticuerpo monoclonal contra un determinante antigcmco rigurosas . En los ltimos aos la FDA de Estados Unidos ha rechazado
conocido. Segundo, puede ser usada para identificar antgenos desconoci- varios ensayos clnicos de anticuerpos monoclonales teraputicos.
dos presentes en una mezcla, porque cada hibridoma es especfico para un 4. El control del rechazo de trasplante. En este sentido se ha utilizado con
determinante antignico. Por ejemplo, si se obtienen varios hibridomas que xito el anticuerpo monoclonal anti-CD3 en Cuba y otros pases .
secretan anticuerpos que se unen a la superficie de una clula particular,
cada clon de hibridoma secretar un anticuerpo especifico para un determi- 5. El anlisis funcional de molculas de superficie celular y secretadas . En
nante antignico. Estos anticuerpos es posible emplearlos para purificar di- la investigacin inmunolgica, los anticuerpos monoclonales que se unen
ferentes molculas de superficie, algunas de las cuales pueden ser incluso a molculas de superficie y estimulan o inhiben funciones celulares par-
desconocidas (Abbas et al., 1994). ticulares son importantes para definir las funciones de molculas de su-
perficie, incluyendo receptores para antgeno. Anticuerpos que neutrali-
Entre las aplicaciones ms frecuentes de los hibridomas y anticuerpos L.an citocinas son usados rutinariamente para detectar la presencia y las
monoclonales se encuentran : funciones de estas hormonas proteicas in vitro e in vivo . As, los
l. La identificacin de marcadores fenotpicos mcos de tipos celulares anticuerpos monoclonales constituyen herramientas valiosas para la elu-
particulares. La base de la moderna clasificacin de linfocitos y dems cidacin de la fisiologa del sistema inmune y en la investigacin biomdica.
leucocitos es mediante anticuerpos monoclonales especficos de pobla-
ciones . Ellos han sido usados para defin~as molculas CD* (c/usters
of differentiation) (Tabla XVI).
. .
2. En el diagnstico de muchas enfermedades infecciosas y si~tcmicas .
Los anticuerpos monoclonales han desplaz.arlo en muchos casos las prc-
paracioos policlonalcs, ms dificiles de estandarizar, y se han converti-
do hoy da en una opcin rutinaria para las grandes empresas
comercializadoras de juegos diagnstico. Se debe hacer notar que ac-
tualmente muchos sistemas utilizan ambos tipos de anticm:rpos y que, en
algunos casos, el anticuerpo policlonal contina siendo el reactivo de
eleccin.
3. El diagnstico y la terapia tumoral . Anticuerpos monoclonales especfi-
cos de tumor se utilizan para la deteccin de tumores por tcnicas de
imagen y para la nmunoterapia in vilro de tumores. Se debe hacer notar
que la terapia pasiva con anticuerpos monoclonales est an en sus ini-

Molcula CD: Molcula de superficie celular que permite identificar el linaje o estado de
diferenciacin de linfocitos y otros leucocitos, a travs de su reaccin especfica con el
anticuerpo monoclonal especfico.

284 28 5
) - 1 "'
1 ', i

r::
.i1 TA BLA XVI (continuaci6n)
TABLA XVI. Principales molcula!I CD 1
1

,;i'
1!

.' I~.
Molcula Clulas que la
Molcula Clulas que lit :, Sinnimo Funcin
Sinnimo Funcin ! i~
CD npttsan
CD tlpttsan
1 La mayora o todas
Molcula de adhesin CD20 Bl ')
CD2 TI 1/LFA-2 Clulas T y N K li /. las clulas B
(se une a LFA-.3) 1
Receptor para C 3<l y
Transduccin de sea l CD21 CR2/B2 Clulas 13 maduras
como rpsultado del ' EBV
CD3 T3/Leu-4 Clulas T
.
rcconQ<'. im.iento del
ant1gcno
CD2~ C lul as 13 ?

Clulas 13 ac tivadas,
Clulas T Molcula de adhesin Cln .l FccR l lb ?
t mac r fa gos
CD4 T4/Leu-3 restringidas por (se LIDe a MHC clase 11 );
MHC clase JI transduccin de sea l Clul as T ,. 13 Receptor para IL-2 ,
CD25 TAC ac ti\'adas, macr- proliferacin de
CDS Tl /Lyt-1
Clulas T v un
subset ~e clulas B
( ..,
fagos actirndos clulas;J'

Subset de clul as T La mayora de las Receptor para la mo -

'I
CD6 Tl2 CD28 Tp44 clulas T CD4+ y lcula eoestimuladora
y algunas clulas 13
algunas CD8+ 13-7
Molcula de adhesin
Clulas T Gra nulocitos ,
T8/Leu-2/ (se u n ~ a MHC clase Fagoci tosis de part-
CD8 restringidas por CDJS CRl mo nocitos, eritro-
Lyt-2 I ); transducci n de culas recubie rta s de C3 h
MHC clase I 1
citos , clula s 13
seal 1

LFA-1 cadena Molcula de' adhesin Clulas plasmati-

COila Leucocitos CD38 Tl O ca s, timocitos, c - ?
alpha (se une a ICAM- 1)
lulas T acti v.
Granulocitos, Adhesin ; fagocitosis
CR3 (receptor CD39
CDllb monocitos, clulas de partculas C lulas B maduras ?
para C3bi)
NK opsoniza<las con C3bi
Activacin de c lul as B
CD40 Clulas B
Monocitos, Adhesin ; fagocitosi s inducida por c lulas T
CDllc CR4 granulocitos, clulas de partcula s
NK opsonizadas con C3bi CD45RA C lulas T vrgenes Transducc in de sena!

Clulas NK, CD45RO C lul a ~ T memnria "

ADCC , ac ti vacir;i de '
CD16 FcyRIII granuloci tos,
clulas NK Receptor ho ming de
macrfagos VLA cadena Clulas T, monoc i-
' CD49d placas de Peyer (se une
alpha 4 tos, clulas 13
CD19 84
La ma}(ora de las
clulas B
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TABLA XVI (conti nuaci(m) I

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Molcula
CD
Sinnimo
CHula1 qu ~ la
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Funcin l-. J
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Muchas clu las
Adhesin (Se une a .i
CD 54 ICAM- 1 activada s (inducible
LFA- 1) ' 1 111
REFERENCIAS
por citocinas ) 1
'
' '
Regulaci n ac tivacin
CD55 DAF Muchas clulas
del e
1 '
CD56 Leu-1 9 C lulas NK Adhesin !i ABBAS, A.K .; A.H. L1cH'rMAN and J.S. PoBER: Cel/ular and Molecular
CD5 7 Lcu-7
C lulas NK, subset
de clulas T
? ~l lmmunology, Second edition, W.B. Saunder Co., 1994.
/ AVRAMEAS, s.; T. TERNYNCK and J.L. UESDON: Scand J lmmunol., 8 (suppl. 7),
CD58 LFA-3 Muchas clula s
A~hcsin , ligando de l 7, 1978.
CD2 1

BERSON, S.A. nd R.S . YALow: J. C/in. /nvest., 38: 1996, 1959.

Regulacin del MAC
CD59 MIRL Muchas clula s ~ BERZOFS1'Y, J.A. and I.J. BERKOWER: In: Fundamental lmmunology, Chapter
de l complemento
J 23, First edition, Ed. William E. Paul, 1986.
CD79a Iga, MBI Clulas B maduras
Componente del J Bovo, W.C. : Fundamentals oflmmunology, 3ro ed., Interscience Publishers
receptor para .Ag
Inc., 1956.
Componente del recep-
CD79b Igp, 829 Clulas B maduras
tor para Ag BCrrrNER, H. ; D. Med. Wschr. 95, 1970. En: Principios de Metodologa
._ en Bioqumica C!nica de Klaus Thielmann, Ed. Organismos, Instituto

t
', J
Ji
Cubano del Libro, La Habana, 1973.
CARPENTER, P.L.: Jmmunology and Serology, Chapters l and 5, Instituto
Cubano del Libro, La Habana, 1969.
i CooNs, A.H.; H.J. CREECH and R.N. JoNEs : Pro. Soc. Exp. Biol. Med.,
rn 47: 200-205, 1941.
, 1
'l1 'I' CusmNG, J.E. and D.H. CAMPBELL: Principios de Inmunologa, Captulos 1,
XIV y XV, Ed. Acribia, Zaragoza, 1960.
1
,i
. DRESSER, D.W.: In: HandbookofExperimental lmmunology, Fourth edition,
vol. 2, Chapter 64, Ed. Weir D.M., Blackwell Scientific Publications,
"'( I 1986.
~
,( 289
1
:,, i

j:),
 -----------: In: Handbook of Experimental fmm11nology, Fourth cdi tion.
vol. 1, Chapter 8, Ed. Weir D.M., Blackwell Scicntific Publications. 1986.
ENGVALL, E. and P. PERLMANN: Immunochemistry, 8, 871 , 1971 .
----------: J. Immunol ., 109: 129-235, 1972 .
Ev, P.L. ; S.J. PRowsE and C.R. JENKIN: Biochemi.stry, 15 429-436, i 978 .
FARR, R.S .: J. /nfect. Dis., 103 : 239, 1958 .
~ FASQUELLE, R.; P. BARBIER; G . DAGUET y P. GouLLET: Elementos de
Inmunologa General, Captulo VI, Instituto Cubano del Libro. L:i
Habana, 1970.
ALFR, G.; S.C. HoWE; c. MILS'IEIN; G.W. BlrrC HER and .l r 11. 1\\.:, Rj )
Nature, 266: 550, 1977.
. HARL<?w, E. and D. LANE: AntibodiPs: A LuboratorJY:!_anual, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1988.
HEIDELBERGER, M. and F.E. KENDALL: .! Exp. Med. , 62 : 467, 1935 .
HuosoN, L. and F.C. HAv: Practica/ Immunology, Second edition, Chapter 5,
Blackwell Scientific Publications, 1980.
JEsKE, D.J. and J.D. CAPRA: In: Fundamenta/ lmmunologj. Fir.st cdition.
Chapter 7, Ed. William E. Paul, Raven Press, 1986.
JURONEN, E.I.; M.H. VIIKMAA and A.N . MIKELSAAR: J. Immuno/." Methods ,
111 : 109-115, 1988.
KENNETT, R.H .; K.A. DAv1s; A.S . TUNG and N.R. KLIMANN: Om. Top.
Microbio/. Immunol. , 81: 77, 1978.
Kl-ll.ER, G. and C. MILSTEil-i: Nature, 256: 495 , 1975 .
KURSTAK, E. : In: Enzyme Immunodiagnosis, Chaptcr 2, Academic Press,
1986.
MANCINI, G. et al.: lmmunochemistry, 2: 235, 1965 .
MARGNI, R.A .: Inmunologa e lnmunoqumica, tercera edicin, Edicin
Revolucionaria, Cuba, 1983 .
MITCHISON, N.A. : Eur. J. lmmunol., 1: 18, 1971.
290
N. u.:A....,E, P.K. and A. KAwA01: Histochem. Cytochem ., 22: 1084, 1974 .
NERF.:-.'BERG, S.T. : Electroforesis. Manual Prctico de Laboratorio, Ed.
Jims, Barcelona, 1968 .
NEw R.R.C. : Liposomes: a practica/ approach, pp. 33-104_, Oxford
University Press, 1990.
TERO, A.J. ; J. SARRAcENr; J. FERN.,UEZ YERO e l. RODRGUEZ: Hybridoma,
3: 391 , 1984.
TERO, AJ .; l. RODRGUEZ y G. fALERo: Cytotechnology, 6: 137, 1991.
OucHTEkLONY, O. and L.A. N1LssoN : In: Handbook of Experimental
Immunology, Second edition, vol. l, Chapter 19, Ed . Weir D.M.,
Blackwcll Scientific Publications, 1973 .
PLOEM, J.S .: Z. wiss. Mikr ., 68 : 129, 1967 .
Ro1rr, l. : Inmunologa Esencial, tercera edicin, Editorial Jims, 1978 .
Ro1TT, l. ; J. BROSTOFF and MALE DAVID: Immunology, First edition, Chap-
ter 25, Gower Medical Publishing, 1985 .
SnTEs, O.P.; J.D. Sroeo; H.H. FuoENBERG y J. V1v1AN WELLs: Inmunologa
Bsica y Clnica, quinta edici~, ~d . El Manual Moderno S.A., 1985.
THIELMANN, K. : Principios de Metodologa en Bioqumica Clnica, Ed.
Organismos, Instituto Cubano del Libro, La Habana, 1973 .
TssEN, P.: Praclice anrj Theory oj Enzyme Immunoassays. Laboratories
in Biochemistry a;d Molecul~r Biology, Ed. Burdon R.H. and Van
Knippenberg P.H., Elsevicr, N.Y., 1985.
VAITl!KAITIS, J.L. and J.B . RoBBINS: J. C/in. Endocrino/. Metab ., 33 : 988,
1971 .
WEIR, D.M.: Handbook of Experimental Immunology, Fourth edition,
volumes 1 and 2, Blackwell Scientific Publications, 1986.
W1LLIAMS, C .A. and M.W. CHASE : Methods in Jmmunology and
Immunochemistry, vol. 111, Academic Press, 1971 .
W1NTER, G. and C. MILSTEIN: Nature, 388: 58, 1991 .
291
 ..
\:1

VoLLER, A.; O.E. BIDWELL; G . Huwr and E. ENGVALL: World Health Organ. ,
51 : 209, 1974.
,< L
VoLLER, A.; O.E. BIDWELL and A. BARTLETT: A Guide with Abstracts of ,<,_,,. .-r:'1,~;~,;->~
ici:i.~~f.n
Microplate Applicalions. Dynatech Europe, Borough House, 1979.
YELTON, O.E.; D.H . MARGULIEs ; B. D1AMOND and M.O. Sc HARFF :
"Plasmacytomas and hybridomas". In: Monoclonal Antihodies. ?-.
;. .
g I.
#\t~
NDICE 1.;_;, ~,!'
Hybridomas. A New Dimension in Biological Analyses. Editores : l TJJP. ;i \~~<)
R.H. Kennett, T.J . McKearn and K.B. Bechtol, Ed. Plenum Prcss;
N.Y., 1980, p. 3.
AVILONOO, J.: "Aspectos bsicos y avances recientes en la tecnologa de
produccin de anticuerpos monoclonales", lnterfern y Biotecno!ogfa. PREFACIO/ 5
4: 1-16, 1987.
CAPTULO l. PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
MATRE, R. and CH.A. VEDELER: "Demonstration of h~an er)throc~1c C3b POLICLONALES / 7
receptors (CRl) by haemadsorption and indircct:'-haemagglutination
techniques", J lmmunol. Methods., 96 : 139-144, 1987. Respuesta inmune humoral I 13
Fagocitosis del antgeno I 15
Activacin de clulas Th. Interaccin APC-Th / 16
Activacin de clula B. Interaccin Th-B / 17
Diferenciacin de la clula B, cambio de clase y antfouerpos de ma-
yor afinidad / 20
Control de la respuesta inmune / 20
Manipulacin de las interacciones APC-Th-B en la produccin de
anticuerpos / 23
. ", '>.
\ '- /'. Factores que deben tenerse en cuenta en la produccin de anticuerpos
". ,,,.t'.'"~ policlonales I 26
l. Antgeno/Inmungeno / 27
Aislamiento y purificacin del antgeno/ 27
Aplicacin de los preparados antignicos I 29
Antgenos bacterianos / 29

292 293
 Preparacin de antgeno O de Sa/monella / 31 Va intravenosa (o endovenosa). Vena marginal de la oreja I 60
Extraccin de un antgeno soluble de E. co/i / 32 Va intramuscular / 61
Anticuerpos como antgenos/ 33
Va subcutnea I 62
Potenciacin de inmungenos / 36
Va intradrmica (dentro de la piel) . Mtodo de Vaitukaitis / 63
Inmunopotenciacin por el efecto carrier / 36
Depilacin I 64
Conjugacin con hemocianina empleando glutaraldehdo (GA) / 38
Va intraperitoneal / 65
Conjugacin con BSA empleando carbodiimida / 39
Inmunopotenciacin. Empleo de adyuvante/ 39 Sangrado por la vena marginal del conejo / 65

Liposomas como carrier y adyuvante/ 42 Sangrado del conejo por la arteria central de la oreja I 66

Preparacin de liposomas multilaminares (MLV, mu/ti/aminar n!s1cle) Obtencin del suero sanguneo / 68
por dispersin simple y por congelacin--descongelacin (FAT-MLV, Obtencin de plasma y clulas sanguneas I 69
freeze and thawy-MLV) / 43 ""- (

Induccin de ascitis con adyuvante de Freund ! 70

Preparacin de la mezcla inmungeno-adyuvante de Freund I 45
Preparacin de un antgeno proteico con alumbre I 4 7 4 . Titulacin de anticuerpos/ 71

Adsorcin de un antgeno proteico al gei de Al(OH)/ 47 5. Purificacin de anticuerpos/ 74

Adsorcin de un antgeno proteico a eritrocitos eon GA / 48 Aislamiento de IgG del suero sanguneo por precipitacin con sulfato
2. Animal de~ experimentacin / 49 de amonio I 75
3. Programa de inmunizacin I 5 3 Purificacin de IgG mediante cromatografia de intercambio inico I 79
Dosis del inmungeno I 54 Separacin batch sobre intercambiadores aninicos I 83
Vas de administracin del inmungeno / 57 Cromatografia de afinidad con protena A I 84
Va intramuscular/ 58 Purificacin de anticuerpos por cromatografia de afinidad con antgeno
Va subcutnea I 58 .i como ligando (inrnunoafinidad) / 85
Va intradrmica I 58 Preparacin de un inmunoadsorbente con GA. Inrnunoabsorcin / 87
Va intravenosa I 58 Purificacin de IgY a partir de la yema del huevo / 89
Va intraperitoncal / 58
Absorcin de antisueros frente a antgenos particulados heterlogos I 89
Cojines de las patas I 59
Cuantificacin de anticuerpos / 90
Boosters e intervalo entre las dosis/ 59
Mtodo espectrofotomtrico / 90
Desangrados I 5 9
Mtodo de Lowry I 91
Utilizacin de las vas de inoculacin en el conejo / 60

294 295
 Micromtodo de Lowry / 93 Precipitacin cuantitativa en medio lquido/ 129
Evaluacin de fa pureza de los anticuerpos I 93 lnmunodifusin / 131
Electroforesis de zona de las protenas del suero sanguneo I 94 lnmunodifusin radial simple o cuantitativa (mtodo de Mancini) / 134
Preparacin de fragmentos Fab / 97 lnmunodifusin doble bidimensional o tcnica de Ouchterlony / 139
Digestin con papana / 99 , Electroforesis / 146

D.i gestin con pepsina / 99 Electroforesis de z.ona de las protenas del suero sanguneo humano / 146

Digestin con tripsina / 100 lnrnunoclectroforesis (IEF) / 149

Purificacin de fragmentos F ab y Fab / 1O1 Elcctroinmunodifusin / 155

6. Conservacin de los anticuerpos / 1O1 Contrainmunoelectroforesis (CIE) / 155

Electroforesis en cohete o tcnica de Laurell / 15 7
CAPTULO 11. LA REACCIN ANTGENO-ANTICUERPO / l 03
Lectura y registro de los resultados / 160
Teora del enrejado/ 104 ~ ~.
......
~ .
C APTULO IV. REACCIONES Y TCNICAS
Condiciones para la reaccin serolgic;a / 106
DE rNMUNOAGLUTINACIN / 165
._.
Afinidad y avidez / 11 O
T-cnicas de aglutinacin directa. Aglutinaciihac~eriana / 168
Tcnica de Farr para medir la C(\pacidad d~uqi<?.Q 'd~ ahtgeno . ..~" Prueba rpida. para aglutinacin bacteriana (mtodo de almina) / .169
de un antisuero / 112 .. ... 9of':"..: .. . ..
""'~1f-,"!! ~. . .
"Prueba de aglutmac1on directa con entroc1tos humanos / 169
Tcnica de precipitacin cuanti~tiva en medioJfqjgo 'para medir l~ can- . .... '~:;
.:..,

tidad de anticuerpos ~n un suero / 114 Reactivos hemoclasi ficadoTes / 175

- Tcnicas serolgicas o inmunoensayos / 11'6 Tipificacin ABO y Rh de eritrocitos humanos / 176

Sensibilidad, detectabilidad, exactitud, precisin y especificidad / 119
Confiabilidad de la tcnica / 122
Preparacin de diluciones dobles / 123
Preparacin de diluciones aplicando la ley de la volumetra / 124
Deteccin de aloaglutininas para antgenos del sistema ABO / 177
Microtcnica para titular anticuerpos anti-A y anti-Ben suero huma-
no ("naturales" o inmunes)/ 178
Prueba indirecta de Coombs para titular anticuerpos incompletos
anti-O/ 180

CAPTULO III. REACCIONES Y TCNICAS Hemaglutinacin pasiva / 182

DE INMUNOPRECIPITACIN / 127 . Titulacin de anticuerpos contra un antgeno polisacardico (de E. coli)
Irununoprecipitacin en medio lquido/ 127 por hemaglutinacin pasiva / 184

Precipitacin rpida semicuantitativa en medio lquido para determi- Titulacin de anticuerpos contra un antgeno proteico (lgG humana)
nar RO/ 128 por hemaglutinacin pasiva con eritrocitos tanados / 186

296 297

Detenninacin de receptores para complemento tipo 1 (C R I) sob re
eritrocitos humanos mediante una microtcnica de hemaglutinacin
pasiva/ 188
Preparacin de eritrocitos fonnolados / 189
Inhibicin de la hemaglutinacin / 190
Aglutinacin con partculas de ltex / 19 1
Preparacin de un reactivo de ltex para anticu erpos anti-IgG hu-
mana / 192
Ti.tulacin de anticuerpos mediante agluti nacin con part culas de
ltex/ 193
Detenninacin de la concentracin ptima de sens ibili zacin en un
reactivo de ltex para factor reurnatoideo (FR) / 194
Preparacin de una solucin de absorcin pira factores reuma-
toideos / 196
Ensayo del reactivo de ltex con el empleo de la solucin de ab -
sorcin I 196
e CAPTULO V, INMUNOENSAYOS ENZIMTICOS / 199
Ventajac; de los EIA I 200
Clasificacin de los EIA / 201
Mtodo ELlSA / 203
Variantes de ELISA I 203
ELISA no competitivo con antgeno fijado a la fase slida (mtodo
directo ) / 205
ELISA no competitivo con antgeno fijado a la fase slida (mtodo
indirecto) I 206
ELISA no competitivo con anticuerpo fijado a la fase slida (mtodo
sandwich directo o ELlSA-DAS) / 207
ELISA no competitivo con anticuerpo fijado a la fase slida (mtodo
sandwich indirecto o ELISA-HADAS) / 207
298
'
FUSA de competicin con anticuerpo fij ado a la fase slida / 208
ELISA de competicin con antgeno fijado a la fase slida / 209
ELISA amplificado con el complejo avidina-biotina I 21 O
Algunas consideraciones prcticas / 21 O
Resultados y forma de expresarlos / 212
Enzimas y conjugados / 213
Conjugacin mediante el mtodo del pcriodato / 214
Conjugacin de un solo paso con glutarnldehdo / 2 l 7
Mctodo de dos pasos para conjugar peroxidasa a protenas (lgG, Fab)
con glutaraldchdo / 218
Titulacin del conjugado anticucrpo-peroxidasa i 219
ELISA indirecto para la titulacin de anticuerpos anti-lgG huma-
na I 220
ELISA de competicin para cuantificar mioglobina srica / 222
Dot ELISA (dot-blot) / 224
Dot ELISA para anticuerpos anti-lgG humana/ 224
Marcaje de anticuerpos con biotma / 225
CAPTULO VI. RADIOINMUNOENSAYOS / 229
RlA sobre fase slida / 232
Optimizacin de las concentraciones del anticuerpo y del trazador / 232
Procesamiento de los datos/ 233
Marcaje de anticuerpos con icxio / 235
Purificacin rpida de anticuerpcs para iodacin / 236
Mtodo de la cloramina T / 236
RIA de competicin para seroalbmina humana (HSA). Mtodo del do-
ble anticuerpo / 23 7
290
CAPTULO VII. rNMUNOFLUORESCENCIA / 24 l f-~ tJ 2- Inmunizacin de ratones / 276
Variantes de la inrnunofluorescencia I 243 Metodologa de fusin celular/ 277
Citometra de flujo y FACS 1244 Evaluacin de sobrenadantes / 279
Preparacin de un conjugado anticuerpo-tluorescena I 246 Clonaje de los hibridomas / 281
Inmunofluorescencia indirecta (IFI) para determinar subpoblaciones Produccin de cantidades ptimas de anticuerpos monoclonales I 282
linfocitarias 1241 C . (-..
~'.:z
,_/', 4a Congelacin de hibridomas / 282
CAPTULO VIII . IMMUNOBLOTTJNG / 25 l
/')\' " ' \
i }~;, '":',,,,,
..,, '
V .
7
c/.1-Q
\
Descongelacin de hibridomas / 283
. \ n
\) \<\ .. .
~
Preparacin de la muestra de antgeno I 254 ~ Qlf Caracterizacin y purificacin/ 283
Electroforesis en gel SDS-PAGE / 255 ~
llt rp i
;-.'<..<::!_
,.. Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales I 283
Transferencia de protenas del gel ~ la membrana (blotting) - REFERENCIAS I 289
Tincin del gel con azul Coomassie I 26 l
~
Tincin de la membrana de nitrocelulosa con rojo Ponceau I 261
Bloqueo de los sitios de unin no especfica I 262
Adicin del anticuerpo I 263
Deteccin con reactivos marcados con enzima I 265
Fosfatasa alcalina / 265
Peroxidasa de rbano picante / 266
Deteccin con reactivos .marcados con radioistopos I 269
Otra forma de revelado/ 270
CAPTULO IX. PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
MONOCLONALES. TECNOLOGA DEL HIBRIDOMA / 271
Lneas celulares de mieloma / 274
,J
Fusgeno / 274
Medio selectivo HAT / 276 '
Suplemento de suero fetal bovino/ 276
Medio tamponado HEPES / 276 . ~~l Lt
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