PROCESSAMENTO DE AMOSTRA SEPARAO DE PLASMA

1. Introduo
O plasma sanguneo componente lquido do sangue, no qual as clulas sanguneas encontram-
se suspensas. Apresenta colorao amarelada e corresponde a aproximadamente 55% do
volume sanguneo total. Uma das tcnicas mais simples para separar a parte lquida do sangue
(plasma) da parte slida, atravs da centrifugao. O soro, obtido por meio da coagulao
sangunea, corresponde ao plasma sanguneo sem os fatores de coagulao, como, por exemplo,
a fibrina. Esta poro do sangue tipicamente utilizada em testes sorolgicos que visam
pesquisar a presena de determinados anticorpos.

2. Objetivo
Processar a amostra de sangue para a separao do plasma.

3. Materiais
EPIs; Seringa de 3 mL com agulha descartvel; Garrote; Tubos de ensaio; lcool 70%;
Algodo; Centrfuga; Pina; Grade.

4. Procedimentos
4.1 Coleta de sangue
- Primeiramente observou-se se o paciente estava em condies de mobilidade normais, o
mesmo sentou-se confortavelmente em cadeira com descanso para o brao, deixando-o
acessvel para a coleta;
- Antes de iniciar a coleta, lavou-se as mos, calou-se luvas, identificou-se os tubos, encaixou-
se a agulha na seringa, inspecionou-se a ponta da agulha (no deve estava rombuda ou torta) e
moveu-se o mbolo da seringa;
- Colocou-se o torniquete (garrote) para que as veias ficassem mais salientes, em seguida
inspecionaram-se as veias cuidadosamente e verificou-se a mais adequada para a puno;
- Foi feita a assepsia do local com algodo embebido em lcool 70%, em seguida, puncionou-
se a veia e coletou-se o sangue;
- A presso do torniquete no deve ser mantida mais que 60 segundos, porque produz aumentos
na concentrao de clulas sanguneas;
- Colocou-se o sangue, cuidadosamente nos tubos prprios, deixando escorrer suavemente pela
parede interna do tubo;

4.2 Preparo da amostra

4.2.1 Separao do soro ou plasma
- Calaram-se as luvas;
- Foi aberta a centrfuga, colocaram-se os tubos com o sangue nas caapas, tomando o
cuidado de equilibr-los;
- Fechou-se a tampa da centrfuga, marcou-se 3000 a 4000 RPM e foi ligada por 5 minutos;
- No se deve abrir a tampa da centrfuga antes de parar totalmente de rodar e nem tentar parar
com a mo ou instrumentos (recomenda-se no abrir a centrfuga imediatamente aps parar,
devido formao de aerossis que podem ser infectantes, por isto, deve-se esperar alguns
minutos para que as partculas sedimentem);
- Os tubos foram retirados das caapas com auxlio de uma pina e colocou-os na grade;
- Verificou-se o aspecto da amostra. O soro ou plasma estava livre de resduos de hemcias;
- Caso o soro estivesse fortemente hemolisado ou lipmico, uma nova coleta deveria ser
providenciada;
4.2.2 Identificao da amostra
 - A amostra estava identificada com etiqueta autocolante, em letra legvel, contendo: nome do
paciente, idade, sexo, tipo de exame, local de procedncia.

5. Resultado
Na prtica obteve-se a separao do plasma e o soro a partir da centrifugao do sangue, o
mesmo foi utilizado para a prtica posterior.

HAI - CHAGAS

Mtodo
hemaglutinao indireta (HAI)

Finalidade
Quite para determinao qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos anti-trypanossoma cruzi
no soro por aglutinao indireta.
Somente para uso diagnstico in vitro.

Reagentes
1. Suspeno se hemcias:
Contem suspenso de hemcia de ave sensibilizada com componentes antignicos do
trypanossoma cruzi em soluo tampo salina formalizada. Potencialmente infectante. Pronta
para uso.
2. Diluente :
Contem tampo fosfato salina
3. Mercaptoetano :
Soluo concentrada de 2-mercaptoetanol. Pronta para uso. Conservar ao abrigo da luz.
P- controle positivo- soro de carneiro anti-T.cruzi em tampo fosfato salino e azida sdica 15,4
mmol/L. pronto para uso.
N- controle negativo- soro humano em tampo fosfato salino em azida sdica 15,4 mmol/L.
pronto para uso.

Materiais utilizados
Tubo de ensaio; pipeta; ponteiras; placa de microtitulao .

Amostra: Soro

Procedimento
1. colocar a placa de microtitulao sobre um pano mido para neutralizar as foras eletrosttica;
2. Usar uma cavidade da placa por amostra, incluindo sempre os controles positivos e negativo;
3. Diluir em tubo de ensaio (diluio 1/32) : 10 microlitos L do soro + 310 microlitos L de diluente
de uso;
4. Pipetar 50 microlitos L de controle positivo (p), controle negativo (n) e da diluio 1/32 de
cada amostra nas respectivas cavidades da placa;
5. Adicionar 25 microlitos L da suspenso de hemcia, homogeneizar em cada cavidade ;
6. Deixar a placa em pouso por 1 a 2 horas temperatura ambiente em local libre de libraes;
7. Fazer a leitura.

Resultados

SEROLATEX AEO

Introduo
Os Streptococcus pyogenes (estreptococo -hemoltico do grupo A) so importantes
bactrias patognicas gram-positivas, que colonizam principalmente a orofaringe e a pele,
sendo responsveis por processos infecciosos supurativos e no supurativos. A febre reumtica
(FR) e a glomerulonefrite ps-estreptoccica (GN) so sequelas no supurativas da infeco
causada por S. pyogenes.
A Estreptolisina O uma exoenzima imunognica txica produzida pelos estreptococos -
hemolticos do grupo A. A determinao da resposta dos anticorpos frente presena de
Estreptolisina O um procedimento rotineiro para o diagnstico e tratamento da febre
reumtica, glomerulonefrite aguda, escarlatina, amigdalite, erisipela, spsis puerperal e outras
infeces estreptoccicas do grupo A. O exame consiste basicamente em partculas de ltex que
so revestidas com Estreptolisina O, estveis e puras que desenvolvem uma aglutinao visvel
quando so misturadas com um soro contendo nveis elevados de anticorpos Antiestreptolisina.

Objetivo
A determinao qualitativa e semi-quantitativa da Antiestreptolisina O em amostras de
sangue til na abordagem diagnstica e classificao das artropatias.

Materiais
1. Pipetas para medir amostras e reagentes.
2. Cronmetro.
3. Lmina e bastes misturadores.
4. Amostra (soro sem hemlise).

Procedimento

Mtodo qualitativo
1. No necessrio que os reagentes atinjam a temperatura ambiente para us-los.
2. Em uma rea da lmina colocar 0,04 mL da amostra e uma gota de cada controle em
outras reas.
3. Colocar 1 gota (0,04 mL) do Ltex AEO (previamente homogeneizado) ao lado da
amostra e dos controles. Misturar em forma de crculo com o auxlio do basto.
4. Inclinar a lmina para frente e para trs, com movimentos oscilatrios em vrios planos
durante 2 minutos e, imediatamente, verificar a presena ou no de aglutinao macroscpica,
comparando o resultado da amostra com os padres obtidos com os controles.
 5. Proceder interpretao da reao:
Negativo: Suspenso homognea semelhante ao padro obtido com o controle negativo.
Positivo: Aglutinao macroscpica que varia desde a formao de grumos finos at
grumos grosseiros, caracterizando uma concentrao maior que 200 UI/mL. As caractersticas
da aglutinao no devem ser usadas como indicadoras da concentrao de AEO na amostra.
Para isto deve-se diluir a amostra utilizando o mtodo semi-quantitativo.
Significado clinico
A antiestreptolisina O um anticorpo decorrente da interao imunolgica entre o
organismo e produtos extra celulares do Estreptococo. A resposta imunolgica depende da
idade do paciente, localizao geogrfica e da frequncia das infeces estreptoccicas. Como
as infeces estreptoccicas so comuns, a AEO est presente em baixos ttulos na maioria das
pessoas. Ttulos elevados e crescentes, atingindo um nvel mximo em 4-6 semanas aps a
infeco, sugerem infeco estreptoccica recente. Portanto, as determinaes seriadas que
documentam a elevao da AEO, so evidncias mais significativas de infeco recente que o
resultado de um teste isolado.
Quando um paciente tem sinais que sugerem febre reumtica, muito importante verificar
a ocorrncia de uma infeco recente. O teste um importante marcador para diagnstico
diferencial entre febre reumtica e artrite reumatide quando o quadro clnico no decisivo,
visto que a AEO no se eleva na artrite reumatide.
Em pacientes com suspeita de glomerulonefrite ps estreptoccica, a evidncia de infeco
recente pode ser encontrada nos ttulos em elevao da AEO. Tambm nas infeces
estreptoccicas da faringe observam-se ttulos de AEO maiores que 200 UI/mL.
A maioria das crianas com infeco estreptoccica da pele no desenvolvem ttulos
significativos da AEO.
importante enfatizar que a AEO um marcador de infeco estreptoccica e no deve ser
utilizada como uma prova de atividade reumtica. Como a AEO um anticorpo, sua elevao
se processa no mnimo aps 7 dias do inicio do processo infeccioso, no sendo um marcador
de processo inflamatrio com elevao to precoce quanto a Protena-C Reativa.

Resultado
Negativo (no houve aglutinao na amostra do soro do paciente).
 TIPAGEM SANGUINEA

INTRODUO
A Tipagem Sangunea um teste realizado para estabelecer qual tipo sanguneo e
Fator Rh (positivo ou negativo) uma pessoa possui. muito importante saber o tipo de sangue
antes de se fazer uma transfuso sangunea, pois pode haver incompatibilidade entre o
doador e o receptor e, em casos de emergncia, pode haver necessidade desta transfuso.
Pessoas dos grupos A, B e O produzem naturalmente anticorpos que causam reaes
graves se receberem por transfuso sangue incompatvel. Se uma pessoa Rh-negativa
receber sangue (for transfundida) Rh-positivo, ela comea a produzir anticorpos anti-Rh. Estes
causaro problemas se essa pessoa voltar a receber outra transfuso de sangue Rh-positivo.
A tipagem do grupo Rh importante durante a gravidez, porque pode haver
incompatibilidade entre a me e o feto. Se a me for Rh-negativa e o pai for Rh-positivo, o
feto pode ser Rh-positivo e a me pode desenvolver anticorpos que atravessam a placenta e
destroem as hemcias do feto.

OBJETIVO
Determinar o grupo sanguneo de uma pessoa e que tipos de sangue ou derivados de sangue
ela pode receber.

MATERIAIS
Tubo de ensaio;
Pipeta;
Ponteira;
Grade;

PROCEDIMENTO DO EXAME
Em um tubo de ensaio colocar 500l de sangue total e 4,5 ml de soluo salina;
Centrifugar a 1500 RPM por 2 minutos;
Desprezar o sobrenadante;
Repetir o mesmo procedimento por 3 vezes;
Obter uma suspenso 5%
Retirar 100 l da e adicionar no tubo A, B e Rh
Adicionar no tubo A 2 gotas de anti-A
No tubo B, 2 gotas de anti-B
E no Rh, 2 gotas de anti-Rh.
Centrifugar por 2 minutos
 Observar se houve aglutinao ou no.

RESULTADO
Tabela 1: Grupo sanguneo

GRUPO SANGUNEO E PODE RECEBER SANGUE

FATOR RH

A positivo A positivo, A negativo, O positivo, O negativo

A negativo A negativo, O negativo

B positivo B positivo, B negativo, O positivo, O negativo

B negativo B negativo, O negativo

AB positivo AB positivo, AB negativo, A positivo, A negativo, B

positivo, B negativo, O positivo, O negativo

AB negativo AB negativo, A negativo, B negativo, O negativo

O positivo O positivo, O negativo

O negativo O negativo

O paciente obteve o grupo sanguneo tipo O e o Rh negativo (-)

LAVAGEM DE HEMCIAS
 O procedimento de lavagem de hemcias requer pelo menos trs lavagens sucessivas com
soro fisiolgico, deixando uma taxa residual de plasma de aproximadamente 0,8%. Tem
tambm a finalidade de remover, ao mximo possvel, as protenas plasmticas, os leuccitos e
as plaquetas.

PROCEDIMENTO
Adicionar soro fisiolgico no tubo contendo as hemcias;
Homogeneizar lentamente at que as hemcias fiquem bem misturadas ao soro, tendo o
cuidado de no provocar hemlise.
Centrifugar a 3000 Rpm, a 10C durante dez minutos;
Aps a centrifugao, decantar o sobrenadante para um frasco. Este primeiro
sobrenadante apresentar um aspecto hemolisado.
Repetir a operao, at que o sobrenadante apresente um aspecto lmpido. Normalmente
tornam-se necessrias 3 lavagens.
Na ltima lavagem deixar um pouco soro fisiolgico no tubo que contm as hemcias
lavadas.
A lavagem do concentrado de hemcias remove quase todo o plasma.

Indicaes:
Hemoglobinria paroxstica noturna;
Reaes transfusionais do tipo alrgico ligadas presena de anti-corpos anti-IgA;
Insuficincia renal grave.

PREPARO DA SUSPENSO DE HEMCIAS A 5%

PROCEDIMENTO
- Em um tubo cnico colocar 1 mL de sangue total homogeneizado colhido com anticoagulante
+ 9mL de soro fisiolgico (NaCl 0,85%).
- Centrifugar a 2.500 rpm durante 2 minutos.
- Desprezar o sobrenadante.
- Repetir este procedimento mais 2 vezes.
- A partir do sedimento de hemcias lavadas, preparar uma suspenso a 5% (50L do sedimento
de hemcias + 950L de soro fisiolgico).

INTERPRETAO
Grupo Sanguneo Anti-A Anti-B
AB + +
 A + -
B - +
O - -

Sinal + indica presena de aglutinao

Sinal indica ausncia de aglutinao

PROVA CRUZADA

FUNDAMENTO
Consiste na pesquisa de incompatibilidade entre receptor e doador, mediante a mistura dos dois
sangues. Se ocorrer reao antgeno-anticorpo (incompatibilidade), esta poder ser visualizada
atravs da aglutinao ou hemlise.

PROCEDIMENTO
Centrifugar as amostras de sangue do doador e receptor.
Tomar 4 tubos de hemlise e numer-los de 1 a 4.
 Nos tubos 1 e 3 colocar 2 gotas do plasma do receptor e uma gota de hemcias do doador.
Nos tubos 2 e 4 colocar 2 gotas de plasma do doador e uma gota de hemcias do receptor.
Colocar os tubos no banho-maria por 5 minutos.
Centrifugar.
Realizar a leitura.

INTERPRETAO
No poder ocorrer hemlise ou aglutinao em nenhum dos tubos. O teste de Coombs tambm
dever apresentar resultado negativo. Caso contrrio, a transfuso no poder ser realizada.

GRUPO AGLUTINOGENIO AGLUTININA

A A Anti-B
B B Anti-A
AB AeB ---
O --- Anti-A e Anti-B

TOXOPLASMOSE

INTRODUO
A toxoplasmose uma infeco causada por um protozorio, o toxoplasma gondi. Ele pode
parasitar todas as clulas nucleadas, as manifestaes clnicas podem ser muito variveis, tais
como: coriorretinites, miocardites, pericardites, pneumonias, miosites, meningo encefalites,
hepatites, ocorrendo isoladamente ou combinadas, certas vezes difusas, vistas em pacientes
portadores de imunodeficincias ou recebendo teraputica imunossupressora.

AMOSTRA
Usar soros frescos ou conservados a -20C (mximo de 4 a 6 semanas) de pacientes em jejum.
As amostras devem estar a temperatura ambiente antes do uso e no necessitam de qualquer
tratamento prvio. No usar soro hemolisado, contaminado ou lipmico. Evitar o congelamento
e descongelamento repetidos das amostras. Os soros envelhecidos tendem a se gelificar ao
contato com o 2-Mercaptoetanol.

MATERIAIS
Tubos de ensaio
Pipetas sorolgicas
Estante de tubos e rack
Recipiente para descarte de material

PROCEDIMENTO
Objetivo: para triagem e eliminao dos soros no reagentes.
1. Colocar a placa sobre um pano mido para neutralizar as foras eletrostticas.
2. Usar 1 cavidade da placa por amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo,
prontos para uso.

ATENO: No diluir os soros controles. Estes so fornecidos prontos para uso.

3. Utilizar diluio do soro 1/32 com a soluo diluente (2). Recomenda-se diluir em um tubo
de ensaio 10l da amostra + 310l da soluo diluente.
4. Pipetar 25l do soro controle positivo, negativo e da diluio 1/32 de cada amostra nas
respectivas cavidades da placa. Sugere-se: A1 controle positivo, A2 controle negativo eA3, A4,
A5... soros a serem testados.
5. Adicionar 25l da suspenso homognea de hemcias (1) em cada cavidade.
6. Agitar a placa por vibrao mecnica (agitador de placa) ou batendo com os dedos nas bordas
da placa por 3 a 4 minutos.
7. Deixar em repouso por 1 a 2 horas em temperatura ambiente, em local livre de vibraes
(IMPORTANTE).
8. Fazer leitura (ver procedimento semi quantitativo).

INTERPRETAO
Soros que do reao negativa so informados como NO REAGENTES significam ausncia
de infeco atual ou pregressa para toxoplasmose.
Nos casos em que ocorre reao negativa, mas com suspeita clnica de toxoplasmose, deve-se
repetir o teste aps alguns dias, pois pode tratar-se de perodo pr-sorolgico.
Todos os soros que apresentam reao positiva devero ser testados quantitativamente para
determinao da fase da doena.
TESTE SEMI QUALITATIVO
1. Partir de uma diluio do soro de 1/32 conforme item 3 do teste qualitativo.
2. Pipetar 25l da soluo diluente (2) a partir da segunda cavidade da placa at a diluio que
se pretende estudar. Ex.: Se pretende diluir o soro at 1/512, pipetar 25l do diluente nas
cavidadesA2, A3, A4 eA5. No pipetar naA1.
3. Transferir 25l da diluio do soro 1/32 para a primeira (A1) e segunda (A2) cavidades.
Homogeneizar bem o soro com diluente na segunda cavidade diluio 1/64) e transferir 25l
para a terceira cavidade (diluio 1/128) e assim sucessivamente, desprezando 25l no final.
4. Pipetar 25l da suspenso homognea de hemcias (1) em todas as cavidades.
5. Agitar a placa por vibrao mecnica (agitador de placas) ou batendo com os dedos nas
bordas da placa por 3 a 4 minutos.
6. Deixar em repouso por 1 a 2 horas na temperatura ambiente, em local livre de vibraes
(IMPORTANTE).
7. Fazer leitura.

Reao negativa: Quando as hemcias se depositam no fundo da cavidade

Formando um boto.

Reao positiva: Quando as hemcias se depositam no fundo da cavidade como um tapete, s

vezes com bordas irregulares.

Ttulo da amostra: Maior diluio que mostra uma reao positiva. O ponto final quando o
tapete de hemcias cobre 50% do fundo da cavidade.

Determinao de infeco recente (IgM) ou presena de anticorpos inespecficos: O uso do

2-Mercaptoetanol possibilita a diferenciao, nos testes de hemaglutinao, de infeco recente
ou presena de anticorpos inespecficos.

PROCEDIMENTO
1. Realizar o teste do soro tratado com 2-Mercaptoetanol paralelo ao Teste
Semi Quantitativo.
2. Tratamento do soro: pipetar em um tubo de ensaio 10 l de soro inativado ou no, 310 l da
soluo de 2-Mercaptoetanol diludo (corresponde a uma diluio 1:32). Incubar a 37C por 1
hora.

INTERPRETAO:
Teste Negativo: paciente no imune ou em fase pr-sorolgica. Se houver suspeita clnica,
repetir aps 1 ou 2 semanas.
Ttulos do soro tratado e no tratado com 2-ME semelhantes (menos de 2 diluies): Provvel
toxoplasmose pregressa.

ATENO: este resultado no exclui infeco recente (presena de IgM) e, portanto, tcnicas
mais sensveis como a imunofluorescncia ou ELISA para detectar IgM devem ser usadas.
Queda de 2 ou mais ttulos do soro tratado em relao ao no tratado: provvel infeco recente
(presena de IgM).

ATENO: se os ttulos forem baixos e o tratado negativar, deve-se afastar a presena de

anticorpos inespecficos, repetindo-se o teste aps 1 a 2 semanas e observando se ocorre
aumento do ttulo.