Identificacin de agentes etiolgicos que causan diarrea en comunidades ecuatorianas de bajos ingresos

Gabriela Vasco, Gabriel Trueba, Richard Atherton, Manuel Calvopia, William Cevallos, Thamara Andrade,
Martha Eguiguren, and Joseph N. S. Eisenberg*
Microbiology Institute, Universidad San Francisco de Quito, Quito, Ecuador; Centro de Biomedicina, Universidad Central del Ecuador,
Quito, Ecuador; Department of Epidemiology, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan; Centro de Salud de Guaman,
Ministerio de Salud Pblica, Quito, Ecuador

Abstract. El xito continuo en la disminucin de la carga de enfermedades diarreicas requiere intervenciones especficas. Para desarrollar tales
intervenciones, es crucial entender qu patgenos causan diarrea. Usando un diseo de caso-control evaluamos muestras de heces, recogidas en
zonas rurales y urbanas del Ecuador, para 15 microorganismos patgenos. Los patgenos estuvieron presentes en el 51% de los casos y el 27% de
las muestras de control de la comunidad urbana, y el 62% de los casos y el 18% de las muestras de control de la comunidad rural. Rotavirus y
Shigella se asociaron con diarrea en la comunidad urbana; Las coinfecciones fueron ms patgenas que las infecciones nicas; Campylobacter y
Entamoeba histolytica se encontraron en gran nmero en casos y controles; Y Salmonella no typhi y Escherichia coli enteropatgena no se
encontraron en ninguna muestra. En consonancia con el Estudio Global Multicntrico Entrico, centrado en el sur de Asia y frica subsahariana,
encontramos que en Ecuador un pequeo grupo de patgenos representaba una cantidad significativa de la carga de enfermedades diarreicas.

INTRODUCCIN la diversidad de patgenos de estos casos diarreicos. De

A pesar de la disminucin de la mortalidad infantil
asociada a la diarrea durante las ltimas cuatro dcadas,
las enfermedades diarreicas siguen siendo la segunda
causa de muerte entre los nios menores de 5 aos en los
pases en desarrollo. Para continuar reduciendo la
mortalidad asociada a la diarrea, se necesitan
intervenciones objetivas. Informar sobre el desarrollo de
estas intervenciones requiere una comprensin de los
factores sociales, ambientales y biolgicos de las
enfermedades diarreicas. Para ello, se realiz el Estudio
Global Multicntrico Enteric (GEMS) para determinar los
agentes etiolgicos causantes de la diarrea en nios <5
aos de edad. Los sitios de estudio GEMS se localizaron en
el frica subsahariana y el sur de Asia, donde la carga de
enfermedades diarreicas es la ms alta del mundo.
Desafortunadamente, el estudio GEMS no incluy sitios de
estudio en Amrica Latina, donde falta agua y saneamiento
y la enfermedad diarreica es una gran preocupacin. Para
complementar el estudio GEMS, se realiz un estudio de
casos y controles en una comunidad rural y urbana del
Ecuador.
Las investigaciones clnicas de los agentes
microbianos que producen diarrea consumen mucho
tiempo, son caras, difciles de conseguir en el contexto
clnico y los resultados rara vez benefician al paciente; Sin
embargo, la comprensin de qu agentes causan
enfermedades puede proporcionar informacin
epidemiolgica til para disear estrategias de
intervencin. Por ejemplo, la infeccin con Vibrio spp se ha
asociado con crustceos crudos o poco cocidos y
Salmonella spp no-typhi est relacionada con brotes de
origen alimentario. Adems de los modos de transmisin
especficos de patgenos, la transmisin de la diarrea
tambin vara segn el contexto social y ambiental. Por
ejemplo, se ha observado que la tasa de salmonelosis
disminuye cuando el nivel de desarrollo aumenta en un
pas.
A pesar de la importancia de la comprensin de la
epidemiologa de las enfermedades diarreicas, se sabe
poco sobre los agentes etiolgicos causantes de la diarrea
en Amrica Latina. Por ejemplo, en Ecuador la incidencia
reportada de enfermedades diarreicas aument de 17 /
1,000 habitantes en 1994 a 46 / 1,000 habitantes en 2012,
sin embargo, hay investigaciones limitadas que describen
los 12 estudios publicados sobre enfermedades diarreicas
en Ecuador durante los ltimos 30 aos (Cuadro 1), siete
estudios presentaron datos de prevalencia que contenan
escasa informacin etiolgica, mientras que cinco estudios
analizaron datos de estudios caso-control que resaltaron la
relacin etiolgica entre enfermedad y patgenos. Cada
estudio se centr en al menos un patgeno, con algunos
estudios que identifican las causas virales de diarrea (por
ejemplo, rotavirus y norovirus) y otros que describen las
causas bacterianas y parasitarias. Adems, cada estudio se
limit a un entorno rural o urbano.
Algunos estudios ms antiguos proporcionan
datos etiolgicos relevantes. A principios de los aos
ochenta, un estudio prospectivo en el noreste rural del
Brasil encontr que el rotavirus, ETEC, STEC, Shigellae y
Giardia lamblia eran causas importantes de la enfermedad;
Rotavirus fue ms frecuente durante las estaciones secas y
ETEC durante las estaciones lluviosas. A mediados de los
aos ochenta, un estudio de casos y controles en el Brasil
urbano revel que EPEC, rotavirus, Salmonella, Shigellae y
ETEC y co-infecciones con ms de un patgeno estaban
asociados con la enfermedad. Ms recientemente, una
vigilancia pasiva en Lima, Per, mostr que los agentes
ms comunes asociados con la diarrea en nios <1 ao de
edad fueron EAEC, EPEC, Campylobacter y rotavirus;
EAEC, EPEC y Campylobacter se encontraron
frecuentemente en individuos asintomticos.
Aqu presentamos datos de un estudio
comparativo de casos y controles que describen la
etiologa de las enfermedades diarreicas en un entorno
urbano (barrio de bajos ingresos en Quito) y rural
(comunidad de bajos ingresos en el noroeste de Ecuador).
Dentro de cada comunidad, se recolectaron muestras de
heces de los participantes del estudio y se evaluaron 15
patgenos importantes entre virus, bacterias y
protozoarios.
MATERIALES Y MTODOS
Sujetos. Se realiz un estudio de casos y controles
en el que se reclutaron participantes de dos localidades:
Guaman; Un barrio urbano de bajos ingresos en la capital
ecuatoriana de Quito, y Borbn, una comunidad rural de
bajos ingresos en el noroeste de Ecuador. Guaman se
encuentra en la provincia de Pichincha a una altitud de
2.700 metros sobre el nivel del mar (m.a.s.l.). La poblacin
se compone de 65.065 individuos; Casi todos los hogares
(98%) de esta zona tienen acceso a una fuente de agua
potable que se considera mejorada por los criterios de la
Organizacin Mundial de la Salud (OMS). Borbn es un
pequeo pueblo en la provincia de Esmeraldas, al noroeste
de Ecuador, a una altitud aproximada de 15 m.a.s.l. Borbn
tiene una poblacin de 7,696 personas. En contraste con
Guaman, <3 de cada 5 hogares en Borbn (58%) tienen
acceso a una fuente de agua potable mejorada.
Estudio en Guaman. Un caso se defini como
cualquier persona que acudi al centro de salud local
sufriendo diarrea (tres heces sueltas en 24 horas) y no
haba tomado antibiticos o medicamentos similares en las
2 semanas antes de la inscripcin. Los controles se
definieron como aquellos que acudieron al centro de salud
por otra razn y no tuvieron sntomas diarreicos durante
las ltimas 2 semanas y no tomaron antibiticos en las 2
semanas antes de la inscripcin. Cada uno de los casos
inscritos fue pareado por edad (dentro de un mes para
aquellos <1 ao de edad, dentro de 6 meses para aquellos
entre 1 y 10 aos de edad, y dentro de 1 ao para los > 10
aos de edad) y sexo a un control apropiado . El
reclutamiento tuvo lugar entre marzo y mayo de 2012
durante la temporada de lluvias (la precipitacin media es
de 145,8, 372 y 55 mm en marzo, abril y mayo
respectivamente, la temperatura media es de 13,9, 13,9 y
15,5 C durante marzo, y mayo, respectivamente).
Estudio en Borbn. Utilizando una cohorte de 400
hogares que fueron seguidos en un estudio observacional
de varios aos, cada hogar fue visitado diariamente por un
perodo de 2 semanas. Durante cada visita, se pregunt a
un encuestado si algn miembro del hogar tena diarrea
(tres heces sueltas en 24 horas). Si ms de un miembro del
hogar eran candidatos a casos, slo se incluy en el estudio
un caso seleccionado al azar. Para cada caso identificado,
se seleccionaron tres controles seleccionados al azar
(individuos sin sntomas diarreicos durante la ltima
semana) entre los 400 hogares de la cohorte. Las muestras
de heces se recolectaron entre julio y agosto de 2012, lo
que corresponde a la estacin seca (la precipitacin media
es de 18,2 y 25,6 mm en julio y agosto, respectivamente, la
temperatura media es 25,7 y 25,6 C en julio y agosto,
respectivamente). Todos los participantes declararon que
no tomaron antibiticos en la semana pasada. Antes de
inscribirse en los estudios de Guaman y Borbn, todos los
individuos firmaron un documento de consentimiento en
el que se describen los procedimientos de estudio
aprobados por los Comits de tica de la Universidad de
Michigan y la Universidad de San Francisco de Quito,
Ministerio de salud.
Procedimientos de laboratorio. Todos los
participantes proporcionaron muestras de heces al equipo
del estudio dentro de 1 hora de la evacuacin intestinal;
Las muestras se colocaron en un refrigerador si el
transporte al laboratorio tardaba ms de una hora. Todas
las bacterias que cultivadas y la preservacin de la
muestra comenz <8 horas despus de la coleccin.
Identificacin de las bacterias. Para identificar
enterobacterias diarregenas, las muestras de heces se
cultivaron en cuatro medios de agar: agar MacConkey
Lactosa (Difco, Sparks, MD); agar MacConkey Sorbitol
(Difco); Agar Salmonella-Shigella (Difco); y agar Xilosa
Lisina Deoxycholate (Difco). Para investigar
Campylobacter sp., Las muestras se cultivaron en agar
Campylobacter Oxoid (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire,
Inglaterra) usando CampyGen CO2 (Oxoid Ltd.). Las
colonias sospechosas de Campylobacter jejuni-coli fueron
marcadas con Gram, probadas para la oxidasa y
confirmadas por genes de reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) (hippresacasa y aspartoquinasa). Para
clasificar Vibrio spp., Las muestras se cultivaron en agar de
TCBS (Difco) sacarosa positiva y las colonias negativas de
sacarosa fueron sometidas a ensayos API-20E (bio
Merieux, Marcy I'Etolie, Francia). Las colonias
fermentadoras de lactosa y b-D-glucoronidasa positivas
(usando agar Chromocult de Difco) fueron sometidas a
PCR por la presencia de los genes ipaH, estA, eltA, bfpA,
stx-1, stx-2 para detectar serotipos de E. coli,
enteroinvasivos (EIEC), Enterotoxgenos (ETEC),
enteropatgenos (EPEC) y shiga-toxignicos (STEC),
respectivamente. La E. coli negativa para b-D-
glucuronidasa tambin se evalu en cuanto a la presencia
de genes stx-1 y stx-2. Las colonias negativas a la lactosa y
negativas a la xilosa se evaluaron usando pruebas API 20E
para determinar si las colonias eran Shigellae y Salmonella
spp. Los Shigellae sospechosos fueron confirmados por la
presencia del gen ipaH.
Identificacin de virus. Se utilizaron pruebas
inmunocromatogrficas para la deteccin de norovirus
(Rida Quick Norovirus, r-Biopharm, Darmstadt, Alemania)
y rotavirus (Rida Quick Rotavirus, r-Biopharm).
Identificacin de parsitos. Se utiliz un ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas para detectar Giardia
lamblia (Ridascreen Giardia, r-Biopharm) y
Cryptosporidium parvum (Ridascreen Cryptosporidium, r-
Biopharm). la identificacin de amebas: Se realiz con PCR
a partir de muestras de heces para detectar Entamoeba
histolytica. Tambin utilizamos microscopa para detectar
protozoos (incluyendo la tincin cido-rpida de Kinyoun).
Anlisis estadstico. Los anlisis estadsticos se
realizaron utilizando Microsoft Office Excel 2010
(Microsoft Corp., Redmond, WA) y el Centro de Control y
Prevencin de Enfermedades (CDC) Epi Info 7.1.0.6. Se
calcul el odds ratio (OR) para comparar los patgenos
presentes en el caso y las muestras de control. Se calcul
un par igualado OR y los intervalos de confianza exactos
(ICs) para los anlisis de Guaman. Para los anlisis de
Borbn, se calcul un OR estratificado ponderado de
Mantel Haenszel utilizando tres grupos de edad: 0 a 4,9
aos, 5 a 13 aos y > 13 aos de edad.
RESULTADOS
Participantes. En Guaman', el tamao de la
muestra fue de 200 (100 casos y 100 controles). La
mediana de edad fue de 14 aos tanto para los casos como
para los controles (DS = 15,6 y 16,2 para los casos y
controles, respectivamente). Los nios <5 aos de edad
representaron 49 casos y 49 controles y los hombres
representaron 54 casos y 54 controles. En Borbn, el
tamao de la muestra fue de 151 (39 casos y 112
controles). La mediana de edad fue de 13 (DE = 19) y, 24
(DE = 19) aos entre los casos y controles,
respectivamente. Los varones representaron 23 casos y 57
controles.
Patgenos. Los patgenos se aislaron de las
muestras de casos con ms frecuencia en Borbn (62%)
que en Guaman' (51%). Por otra parte, entre las muestras
de casos, las co-infecciones fueron ms prevalentes en
Borbn (23%) en comparacin con Guaman' (16%) resultado de las diferencias de diseo del estudio entre los
(Tabla 2]. Las probabilidades de diarrea asociada con
patgenos, incluidas tanto las infecciones nicas como las
co-infecciones, tambin fueron mayores en las zonas
rurales que en las urbanas (Borbo'n OR 7,36, IC 95% 3,2-
16 y Guaman' OR 4,4, IC 95% 1,9 -12). La presencia de
cada microorganismo especfico, como agente de una sola
infeccin y co-infeccin, aislada de las zonas urbanas y
rurales se muestra en la Tabla 3. Los patgenos asociados
con la diarrea fueron Shigellae y rotavirus en Guaman y
rotavirus y Giardia Lamblia en Borbn. Salmonella spp y
EPEC no se encontraron en ninguna muestra de heces
recogida de ninguna de las dos localizaciones, mientras
que Cryptosporidium se encontr en cuatro muestras de
casos en Borbn y dos casos en Guaman, y no se encontr
en ninguna muestra de control. Todos los casos positivos
de Cryptosporidium se encontraron en nios <5 aos de
edad (4 de 21 en Borbn y 2 de 49 en Guaman'). Se
encontraron mayores tasas de Campylobacter y
Entamoeba histolytica en muestras del sitio urbano tanto
en los casos como en los controles, en comparacin con el
sitio rural.
Co-infecciones. Las co-infecciones, definidas
como la presencia de dos o ms patgenos en una muestra
de heces, se encontraron tanto en las comunidades
urbanas como rurales. La presencia de ms de un patgeno
aument las probabilidades de tener diarrea en Borbn
para cualquier infeccin OR 7,36, IC 95% 3,2-16, una
infeccin con un solo patgeno OR 3,5, IC 95% 1,5-8 y una
infeccin con 2 patgenos OR 16,95% IC 3,2-86 (Tabla 2).
Se encontr que el rotavirus tena mayores probabilidades
de causar diarrea en ambos sitios (OR 12, IC 95% 1,23 358
y OR 14,8, IC 95% 1,7-132, respectivamente) si la muestra
estaba coinfectada. Esto fue tambin cierto para las
muestras de Giardia lamblia del sitio rural (OR 8, IC 95% 2
32). Dentro de las co-infecciones en Borbn, rotavirus/G.
Lamblia se asociaron con diarrea (OR 24, IC 95% 1.9 -
302). La Tabla 4 presenta una lista completa de
coinfecciones identificadas en las muestras de heces de las
poblaciones estudiadas.
DISCUSIN
Un gran nmero de agentes patgenos puede
causar enfermedades diarreicas; Sin embargo, la mayora
de los estudios sugieren que slo unos pocos patgenos
representan la mayora de la carga de la enfermedad. En
general, estos mismos agentes etiolgicos se han asociado
constantemente con la enfermedad a travs del tiempo,
aunque hay algunos patgenos emergentes importantes
como el norovirus y Cryptosporidium parvum. Nuestro
estudio en el Ecuador rural y urbano complementa la
informacin proporcionada por el GEMS realizado en
frica subsahariana y Asia.
De acuerdo con GEMS, rotavirus se asoci con
enfermedades diarreicas tanto en nuestra comunidad
urbana y rural de bajos ingresos, mientras que Shigellae
slo fue importante en nuestro entorno urbano. Giardia se
encontr en un gran nmero de muestras tanto en nuestro
entorno urbano y rural y en casos y controles. La mayor
prevalencia de Giardia en Borbn es probablemente un
sitios. Las muestras de Guaman procedan de personas
que asistan a un centro de salud; Mientras que las
muestras de Borbn provienen de una vigilancia activa
dentro de la comunidad. Por otra parte, una sola infeccin
con Giardia no se asoci con diarrea en ninguno de los dos
escenarios, lo cual es consistente con los hallazgos de una
revisin sistemtica publicada recientemente. A diferencia
de las infecciones nicas, una coinfeccin con Giardia y
rotavirus se asoci con diarrea en nuestro entorno rural.
Esto est de acuerdo con dos estudios previos, uno
realizado en nuestra regin de estudio y el otro en Israel.
Las infecciones por Giardia tambin ocurren en una alta
proporcin de individuos con sntomas subclnicos o leves.
Campylobacter coli y C. jejuni se aislaron en mayor
nmero en la comunidad urbana tanto en los casos como
en los controles, y por lo tanto no se asociaron con diarrea.
Ni ETEC ni Shigellae y EPEC se asociaron
significativamente con diarrea en nuestro medio rural. Los
datos recolectados de los ltimos 10 aos en el mismo sitio
rural mostraron asociacin consistente de estos tres
patgenos con diarrea. Los factores ambientales, como el
clima o la virulencia reducida de los patgenos que
circulaban en el momento del estudio, tambin podran
proporcionar una explicacin para la presentacin de estos
datos. El mayor papel de Shigellae en Guaman' puede ser
causado por la alta densidad de poblacin en el medio
urbano.
Curiosamente, no encontramos ninguna
Salmonella no-typhi. Aunque esto es consistente con el
estudio GEMS, nuestro bajo tamao de muestra no excluye
el hecho de que Salmonella no typhi ocurre en niveles ms
bajos. De hecho, estudios similares en Brasil encontraron
Salmonella no-typhi spp en muestras de heces diarreicas.
Estas discrepancias pueden deberse a diferencias en la cra
del ganado, o de otras caractersticas ambientales que
pueden afectar la transmisin de este patgeno intestinal.
Aunque solo se aislaron C. parvum en dos
muestras en Guaman y cuatro muestras en Borbn, es
interesante que las seis muestras fueran de nios menores
de 5 aos. Por lo tanto, en Borbn, 4 de los 21 casos fueron
positivos para C. parvum. En comparacin, con 3 de los 21
casos que fueron positivos para rotavirus, lo que sugiere
que C. parvum es un importante patgeno en esta zona
rural del Ecuador. Esto es en general coherente con el
estudio GEMS, que se centr en los nios <5 aos de edad.
La importancia de C. parvum como causa de diarrea se
redujo significativamente despus de los 2 aos de edad en
los datos de GEMS, lo que demuestra que este patgeno es
menos probable que cause enfermedad en los nios
mayores. Una distincin importante entre el estudio de
GEMS y el nuestro es que no usamos una escala de
gravedad para aislar casos; Sin embargo, asumimos que los
casos clnicos de Guaman (urbanos) fueron generalmente
ms severos que los de la comunidad Borbn (rural).
Se observaron altas tasas de portadores
asintomticos de patgenos intestinales en los dos lugares
(27% en Guaman y 18% en Borbn). El estado de
portador asintomtico puede ser causado por varios
factores, incluyendo la patogenicidad de la cepa, la
inmunidad del husped contra factores patgenos, la
microbiota intestinal y la inmunidad. El portador
asintomtico de Campylobacter spp entre las personas que
viven en los pases de Amrica Latina ha sido
documentado desde finales de los aos ochenta;
Especficamente, el portador de C. coli ha sido
documentado entre personas que viven o manejan cerdos,
ovejas o pollos. Estos hallazgos apoyan la hiptesis de que
Campylobacter spp est presente en entornos donde las
personas viven en estrecha proximidad con animales y en
condiciones de saneamiento deficientes.
Algunas de las discrepancias entre los entornos
rurales y urbanos podran explicarse por diferencias
ecolgicas. Guaman' se encuentra en los Andes a una
altitud de 2.700 m, tiene baja humedad, y las muestras
fueron recolectadas durante la temporada de lluvias.
Borbn se encuentra cerca de la costa, (baja elevacin y
alta humedad) y se obtuvieron muestras durante la
estacin seca.
Tabla 1
Resumen de los datos publicados sobre la presencia de patgenos entricos en el Ecuador
La tasa de deteccin de patgenos entre los casos
en este estudio, 51% en el medio urbano y 62% en el rural,
es consistente con estudios similares en Amrica del Sur
(13,1% a 62,2%) y Ecuador (27% a 65% . Hay una
variedad de razones para no poder explicar el 100% de los
casos de diarrea. En primer lugar, no todos los casos eran
de origen infeccioso. En segundo lugar, utilizamos
procedimientos diagnsticos que tenan limitaciones de
sensibilidad. Nuestros resultados difirieron de GEMS,
posiblemente porque nuestros procedimientos y reactivos
(tales como kits de EIA) eran diferentes y nuestros
tamaos de muestra eran significativamente ms
pequeos. Adems, no se investigaron todos los patgenos
potenciales incluidos en el estudio GEMS tales como
adenovirus, Yersinia enterocolitica, infecciones por
Clostridiu perfringens o enterotoxinas (Staphylococcus
aureus o Bacillus cereus).
Este estudio confirma que en Ecuador, un
subconjunto pequeo y consistente de patgenos,
incluyendo rotavirus y E. coli patgena, son las principales
causas de diarrea. El conjunto especfico de agentes
etiolgicos importantes, sin embargo, vara dependiendo
del entorno urbano / rural, nivel socioeconmico y otros
factores ambientales importantes. Por lo tanto, los
estudios etiolgicos especficos del sitio pueden ayudar a
informar las intervenciones dirigidas y las estrategias de
control.
 Tabla 2
Nmero de infecciones por estatus de caso/control y odds ratios para la diarrea en relacin a los casos en Guaman y borbn, Ecuador

Tabla 3
Distribucin de patgenos y odds ratio para diarrea reportada con estimacin y estratificada por una sola infeccin y co infecciones (dos o ms infecciones( en
Guaman y Borbn

Tabla 4
Co infecciones encontradas en Guaman y Borbn