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Ao del buen servicio al ciudadano

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
Ao del buen servicio al ciudadano
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FACULTAD DE INGENIERA
E. A. P. DE AGROINDUSTRIA
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Informe n2:
Ao del buen servicio al ciudadano

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DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO
CELULAR POR LOTE ALIMENTADO DE
asdfghjklzxcvbnmqwertyuiopas
Ao del buen servicio al ciudadano
Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126

dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdf Docente:

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Ing. Augusto Castillo Caldern
Integrantes:
jklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjkl
CCERES PEREDA MERYSHELL
ENCINAS ESTRADA GREISSY
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LOREO JIMENEZ ESTRELLA
PALACIOS HILARIO ANTONY
cvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcv
VALERIO MOLINA MARIBY
Curso:
bnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbn
LABORATORIO DE BIOPROCESOS

mqwertyuiopasdfghjklzxcvbnm Ciclo:
VII

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Grupo de prctica:
B-1

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Nuevo Chimbote- Per 2017
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NDICE
I. INTRODUCCIN ......................................................................................... 5
II. OBJETIVOS................................................................................................. 6
2.1 Objetivos generales:.............................................................................. 6
2.2 Objetivos Especficos: ........................................................................... 6
III. MARCO TERICO ................................................................................... 7
3.1 BIORREACTOR .................................................................................... 7
3.2 OBJETIVO DE UN BIOREACTOR ........................................................ 7
3.2.1 AGITACIN .................................................................................... 8
3.2.2 CONTROL DE TEMPERATURA .................................................. 10
3.2.3 MTODO DE CONTROL DE PH.................................................. 11
3.2.4 MTODO DE ELIMINACIN DE ESPUMAS ............................... 11
3.2.5 GEOMETRA DE UN REACTOR.................................................. 12
3.3 ESTERILIZACIN ............................................................................... 12
3.3.1 MTODOS DE ESTERILIZACIN ............................................... 12
3.4 MONTAJE DE EQUIPO ...................................................................... 15
IV. INSTRUMENTOS Y REACTIVOS .......................................................... 17
4.1 MEDIO DE MANTENCIN: ................................................................ 17
4.1.1 Materiales e instrumentos: ............................................................ 17
4.1.2 Equipos: ........................................................................................ 17
4.1.3 Reactivos: ..................................................................................... 17
4.2 MEDIO DE ACTIVACIN: ................................................................... 17
4.2.1 Materiales e instrumentos: ............................................................ 17
4.2.2 Equipos: ........................................................................................ 18
4.2.3 Reactivos: ..................................................................................... 18
4.3 MEDIO DE FERMENTACIN: ............................................................ 18
4.3.1 Materiales e instrumentos: ............................................................ 18
4.3.2 Equipos: ........................................................................................ 18
4.3.3 Reactivos: ..................................................................................... 18
4.4 PARA CINTICA DE CRECIMIENTO DE BIOMASA.......................... 19
4.5 DETERMINACIN DE LA CINTICA DE CONSUMO DE LA FUENTE
DE CARBONO .............................................................................................. 19
V. METODOLOGA EXPERIMENRTAL ......................................................... 20
5.1 DISEO DEL MEDIO DE CULTIVO ................................................... 21
5.2 PREPARACION DEL MEDIO: ............................................................ 23
5.2.1 PREPARACIN DEL MEDIO DE MANTENCIN ........................ 23
5.2.2 PREPARACIN DEL MEDIO DE ACTIVACIN .......................... 25
5.2.3 PREPARACIN DEL MEDIO DE FERMENTACIN ................... 27
5.2.4 DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN CELULAR POR
D.O. 35
5.3 DETERMINACIN DE AZUCARES REDUCTORES: METODO DEL
DNS (ACIDO DINITRO SALICLICO). .......................................................... 35
5.4 AIREACIN ........................................................................................ 37
VI. RESULTADOS ....................................................................................... 44
6.1 CINETICA DE CULTIVO CELULAR POR LOTES .............................. 44
6.2 DETERMINACIN DEL CONSUMO DE SACAROSA ........................ 48
6.3 CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO ................................................. 50
6.4 DETERMINACION DEL CONSUMO DE SACAROSA PARA CULTIVO
POR LOTE ALIMENTADO ............................................................................ 54
...................................................................................................................... 58
6.5 DETERMINACION DEL KLa (METODO DINAMICO DE HUMPHREY)
61
VII. DISCUSION............................................................................................ 72
VIII. CONCLUSIONES ................................................................................... 74
IX. ANEXOS ................................................................................................ 76
9.1 CURVA DE CALIBRACIN DE BIOMASA PARA MATRAZ ................... 76
9.2 DETERMINACION DEL CONSUMO DE SACAROSA............................ 78
RESUMEN
En el presente trabajo se ha desarrollado el cultivo celular de la cepa
Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 realizando su manipulacin desde su
estado inactiva en agar. El cual ha seguido una serie de procedimientos
secuenciales tales como la preparacin del medio de mantencin, activacin
denomino medio rico cual tiene todos los nutrientes que esta levadura requiere
para su ptimo desarrollo. Luego de un evidente crecimiento en el medio rico, la
totalidad de este medio es diluido dentro del fermentador con el medio mnimo
que contiene solo los componentes necesarios para que el microorganismo
pueda subsistir, tales como fuente de carbono que en nuestro caso fue sacarosa.

Se trata entonces de observar y comparar como se va produciendo el


crecimiento de la biomasa celular con los nutrientes necesarios para tal accin y
al mismo tiempo como va disminuyendo el sustrato en este caso principalmente
la sacarosa, lo cual fue posible determinar por el mtodo DNS (azcares
reductores) con las muestras tomadas cada hora durante un tiempo de 10 horas.
Se logr la determinacin de uno de los importantes parmetros de crecimiento
celular en cultivo por lote umax = 0.4197 h-1, adems de td=1.962hr. Al igual
que la productividad mxima de biomasa que fue de =0.3805gr/h. y el

rendimiento / = 0.25 . y en cultivo por lote alimentado umax = 0.37 h-

1 h-1, adems de td=1.962hr, Al igual que la productividad mxima de biomasa



que fue de =0.1g biomasa/h. y el rendimiento / = 1.073 .
I. INTRODUCCIN
En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al
manejo y conocimiento del crecimiento de microorganismos. Resulta entonces
importante el conocimiento de las condiciones en que estos microorganismos
puedan optimizar sus productos. Para ello la preparacin de medios de cultivo
para estos microorganismos es un buen punto de partida para conocer sobre
su comportamiento, as como tambin el seguimiento de la cintica nos
proporciona datos mucho ms prcticos y exactos sobre la velocidad y
caractersticas del crecimiento del microorganismo tratado.

La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin


es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los
componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza
qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que deben
cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y
adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el
mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varan
considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar.

Es as que para esta prctica hemos centrado nuestra atencin en el


tratamiento de un microorganismo (Saccharomyces cerevisiae ATCC-
4126), iniciando desde su siembra partiendo desde su estado en cepa
congelada , para luego sembrarlo en medio rico, empleando la glucosa como
fuente de carbono, procurando su rpida activacin, para que luego de un
determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio mnimo;
es decir con los mnimos requerimientos; en el cual es ms factible determinar
la cintica de crecimiento.

Dentro de su importancia en la agroindustria la Saccharomyces


cerevisiae ATCC-4126 es muy valiosa para la conversin de fructosa en
etanol que puede mejorar la economa de una planta transformadora de
azucares naturales de frutas a etanol. Con la conversin de la fructosa, la
potencial reduccin del precio est en funcin de tres parmetros de
fermentacin: el rendimiento, la tolerancia de etanol y la productividad.
Asumiendo altos valores para estos parmetros, la reduccin mxima puede
volverse de 40%. Hoy en da es conocido que un nmero de levaduras
fermenta sacarosa en etanol, siendo Saccharomyces cerevisiae ATCC-
4126 una de las ms eficientes, especialmente en relacin con el rendimiento
y la proporcin volumtrica. Empleando esta levadura para la fermentacin de
la D-xilosa, la reduccin en el precio del etanol alcanza el 70% del mximo
asequible.

II. OBJETIVOS

2.1 Objetivos generales:


Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lote alimentado
(CLA) con alimentacin constante utilizando una cepa de
Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126.

2.2 Objetivos Especficos:


Disear el medio de cultivo.
Realizar la activacin y desarrollo del inoculo.
Identificar y describir las partes, a accesorios y geometras,
conocimiento de la operacin del fermentador, esterilizacin, carga y
descarga y toma de muestra.
Identificar en el fermentador los instrumentos de medicin y control
automtico, as como la calibracin de los sensores
Puesta en marcha del cultivo por lote alimentado y determinar max y
Y x/s.
Obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono y oxgeno
disuelto a travs del tiempo de operacin.
Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitada.
Determinar el Y x/s y Qx del CLA.
III. MARCO TERICO

3.1 BIORREACTOR
Un biorreactor es un recipiente o sistema que
mantiene un ambiente biolgicamente
activo. En algunos casos, un biorreactor es
un recipiente en el que se lleva a cabo un
proceso qumico que involucra organismos o
sustancias bioqumicamente activas
derivadas de dichos organismos. Este
proceso puede ser aerbico o anaerobio.
Estos biorreactores son comnmente
cilndricos, variando en tamao desde
algunos mililitros hasta metros cbicos y son
usualmente fabricados en acero inoxidable.

Un biorreactor puede ser tambin un


dispositivo o sistema empleado para hacer crecer clulas o tejidos en
operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se encuentran en desarrollo
para su uso en ingeniera de tejidos. En trminos generales, un biorreactor busca
mantener ciertas condiciones ambientales propicias (pH, temperatura,
concentracin de oxgeno, entre otros) al organismo o sustancia qumica que se
cultiva. En funcin de los flujos de entrada y salida, la operacin de un biorreactor
puede ser de tres modos distintos:

3.2 OBJETIVO DE UN BIOREACTOR

El diseo del proceso debe permitir que tanto el rendimiento del equipo como la
capacidad de produccin sean los ptimos. Para lograr ambos objetivos, el
diseo del sistema deber garantizar en todo el volumen del equipo los
siguientes aspectos:

Distribucin uniforme de clulas


Temperatura constante y homognea
Mnimo gradiente de concentracin de nutrientes
Ausencia de sedimentacin y de floculacin
Difusin de gases nutrientes fcil y controlada

Para conseguir estos objetivos, que permitirn optimizar los rendimientos


productivos, debern estudiarse los siguientes aspectos del proceso:

Mtodo de mezcla y agitacin


Mtodo de control de temperatura
Mtodo de control de pH
Mtodo de control de [O2] o mtodo de aireacin
Mtodo de eliminacin de espumas

3.2.1 AGITACIN
La agitacin es la operacin que crea o que acelera el contacto entre
dos o varias fases. Una fermentacin microbiana puede ser considerada
como un sistema de tres fases, que implica reacciones lquido-slido,
gas-slido y gas-lquido. La agitacin permite la dispersin del gas en la
solucin de nutrientes, la homogeneizacin de la temperatura, del pH y
de la concentracin de nutrientes en el fermentador. Gracias a la
agitacin se consigue la suspensin de los microorganismos y de los
nutrientes slidos, as como de la dispersin de los lquidos inmiscibles.
Los tipos de agitacin pueden ser: columna de burbujas, agitacin
rotativa o recirculacin.

La fase lquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede


existir, en algunos casos, una segunda fase lquida si existe un sustrato
inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos.
La fase slida consiste en clulas individuales, bolitas de micelio,
sustratos insolubles o productos del metabolismo que precipitan.
La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de
oxgeno, para la eliminacin del CO2 o para el ajuste del pH con amonio
gaseoso.

Una adecuada agitacin de un cultivo microbiano es esencial para la


fermentacin ya que produce los siguientes efectos en las tres fases:
Dispersin del aire en la solucin de nutrientes.
Homogeneizacin, para igualar la temperatura, pH y concentracin de
nutrientes, en el fermentador.
Suspensin de los microorganismos y de los nutrientes slidos.
Dispersin de los lquidos inmiscibles.

Bajo estas premisas se podra concluir que cuanto mayor sea la agitacin,
mejor ser el crecimiento. Sin embargo, la agitacin excesiva puede romper
las clulas grandes e incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso
en la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe conseguir un balance entre la
necesidad del mezclado y la necesidad de evitar el dao celular.

La agitacin es una operacin muy importante tanto del punto de vista tcnico
como econmica. La agitacin es importante para:

un mezclado homogneo
Una buena transferencia de masa y de calor, permite disminuir el
espesor de la pelcula lquida esttica.
Diseo del sistema de agitacin

El sistema de agitacin tiene la funcin de generar la potencia necesaria


para producir una mezcla perfecta para el sistema de cultivo y producir un
rgimen de agitacin adecuado que, maximice la difusin de gases en el
lquido y minimice la produccin de esfuerzos cortantes y la presin
hidrodinmica local y global, para optimizar los fenmenos de
transferencia de momentum, calor y masa.

Un sistema de agitacin consta de cuatro partes mecnicas:

Motor Impulsor: suministra la potencia al eje de potencia; debe


ser de corriente alterna (a.c), preferiblemente de induccin y su
potencia debe calcularse para manejar el doble (200%) de la
potencia terica requerida para agitar el fluido y el cultivo a
Re3000. Motor de Induccin (A.C): dado que un biorreactor
debe operar de forma continua durante todo el proceso de
cultivo; se requiere un motor capaz de resistir largos periodos
de operacin continua y trabajo duro; por eso, el motor debe ser
de induccin de corriente alterna (a.c) y debe ser acorazado,
preferiblemente en acero inoxidable.
Eje trasmisor de la potencia: es una barra cilndrica de acero
inoxidable 316L y por lo general se disea en dimetros
estndar: , , etctera para mayor facilidad de ajuste a los
estndares de motores a.c. Su longitud depende de la
profundidad del contenedor (tanque).
Acople del Eje Transmisor: ajusta y fija al motor, el eje
transmisor de potencia. Existen dos tipos de acople:
Acople-adaptador de tipo taladro: el puerto de entrada se
acopla al eje del motor por fijacin directa. El puerto de salida
es un dispositivo que se adapta a varios dimetros de broca y
sujeta o abraza firmemente el eje transmisor de potencia por
presin y abrasin; similar al que utilizan los taladros
mecnicos.
Acople-ajustador de tipo tornillo-rosca: el puerto de entrada
se enrosca o se fija firmemente al eje del motor. El puerto de
salida es un dispositivo que abraza el eje transmisor de
potencia por un mecanismo de tornillo-rosca.

En ambos casos, el dimetro del puerto de entrada del acople que es


la unin de ste con el eje del motor debe ser de dimetro interno igual
al dimetro externo del eje del motor y el dimetro del puerto de salida
que es dispositivo sujetador del eje transmisor de potencia debe ser
el mismo que el dimetro externo del respectivo eje.

3.2.2 CONTROL DE TEMPERATURA


El control de la temperatura en el interior de los fermentadores es un
factor fsico que afecta al rendimiento del proceso. Una temperatura
inferior a la ptima provoca el retardo en el crecimiento y la reduccin
de la produccin celular. Asimismo, una temperatura superior a la
ptima produce choque trmico, induccin a una respuesta de estrs
celular, produccin de proteasas celulares y reduccin de los
productos proteicos. La fermentacin debe llevarse a cabo en un
estrecho margen de temperatura y a ser posible constante. En un
proceso de fermentacin, la produccin de calor deriva de la agitacin
y de la actividad metablica. Este calentamiento puede provocar
evaporaciones. Para evitar- lo, se emplean camisas de refrigeracin
con agua.

3.2.3 MTODO DE CONTROL DE PH


Durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares
son liberados al medio lo que puede originar un cambio de pH del
medio de cultivo. Sin embargo, la mayor parte de los microorganismos
crecen ptimamente a pH comprendidos entre 5,5 y 8,5.
Concretamente, las bacterias crecen a pH neutro y los hongos a pH
cido.

Para mantener constante el pH y que su variacin no perjudique el


crecimiento, debe realizarse la medida de pH in-situ y el ajuste con
reactivos cidos o bsicos, en caso de que sea necesario. Mtodo de
control de concentracin de oxgeno o mtodo de aireacin Otro factor
que afecta al rendimiento de las fermentaciones industriales, esta vez,
qumico, es la concentracin de oxgeno. En el caso de los
microorganismos aerobios, debe asegurarse una perfecta
transferencia gas lquido del oxgeno que se burbujea desde la parte
inferior del biorreactor. En el caso de los microorganismos anaerobios,
deber controlarse la ausencia de este gas, ya sea mediante el
burbujeo de CO2 o de N2.

3.2.4 MTODO DE ELIMINACIN DE ESPUMAS


Se hace necesaria la eliminacin de espumas durante el proceso de
fermentacin porque alteran la transferencia de masa entre la fase
lquida y la gaseosa de la parte superior del recipiente. El mtodo para
el control de espumas se basa, por un lado, en la adicin controlada
de antiespumantes y, por otro lado, en la deteccin de estas espumas
mediante sensores especficos y su eliminacin mediante vaco.
3.2.5 GEOMETRA DE UN REACTOR
Sabiendo que la altura HL es la altura de lquido dentro del recipiente
y que DT es el dimetro total, la relacin geomtrica (HL / DT) habitual
en un biorreactor es la siguiente: Cultivo celular: desde 1 1,5 hasta
1 Microbiolgico: desde 2 2, 5 hasta 1

3.3 ESTERILIZACIN

Esterilizacin significa la eliminacin de toda forma de vida de un medio o


material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios fsicos, por
ejemplo, filtracin, o por muerte de los organismos por calor, productos
qumicos u otra va.

La razn fundamental para efectuar la esterilizacin en Microbiologa


Industrial es para evitar la competicin por los nutrientes en medios de
cultivo y permitir as que el cultivo de microorganismos especficos que se
utilizan en un proceso de fermentacin de los rendimientos esperados en
biomasa y/o metabolitos especficos.

3.3.1 MTODOS DE ESTERILIZACIN


Los mtodos de esterilizacin pueden ser de 3 tipos:

a) Por destruccin total de microorganismos: Por destruccin total se


entiende un proceso muy violento, que casi siempre implica
calentamiento apreciable del material, como ocurre con la aplicacin
de una llama, que es lo que hacemos en el laboratorio cuando
flameamos un ansa de platino olas bocas de tubo de ensayo o erlen
meyers. Otra manera de destruir contaminantes es con el uso de
poderosos agentes oxidantes. Por supuesto sta metodologa,
aunque es efectiva, est muy restringida en su empleo.
b) Por muerte o inactivacin: La muerte o inactivacin significa la
eliminacin de microorganismos sin que exista necesariamente
desintegracin de las clulas. Se puede efectuar por calentamiento,
seco o hmedo, por radiaciones o por agentes qumicos. El calor
hmedo, generalmente en forma de vapor bajo presin, es muy til
y de gran valor en la esterilizacin en el laboratorio, que se efecta
en autoclave, o en la industria cuando se esterilizan los medios de
cultivo y los equipos de fermentacin. En el caso de las autoclaves,
se pueden alcanzar presiones de 1 a 3 atmsferas. En escala
grande el equipo de produccin es esterilizado con vapor saturado
bajo presin, y la presin requerida debe ser alcanzada en todas
las partes del equipo y el aire debe ser purgado totalmente del
sistema (como ocurre tambin en el caso de las autoclaves) porque
la transferencia de calor disminuye mucho en ese caso. Despus
de la esterilizacin se mantienen las condiciones aspticas,
haciendo pasar vapor por las vlvulas y sellos.

c) Por eliminacin con medio fsicos: La eliminacin fsica est


restringida a la esterilizacin de gases lquidos, y es
fundamentalmente llevada a cabo por filtracin mediante filtros
absolutos o filtros fibrosos. Los filtros absolutos son de materiales
cermicos, de vidrio o de metal sinterizado con poros tan pequeos
que la penetracin de los microorganismos no es posible. Los filtros
fibrosos no son absolutos y el material filtrante puede ser lana de
vidrio, amianto y esteres de celulosa, siendo las fibras de un
dimetro variable de 0.5 a 15 micrones.

Cintica de la esterilizacin por calor

La cintica de la esterilizacin por calor hmedo, que es la nica que


consideraremos en este informe por su aplicacin a la esterilizacin de
medios de fermentacin, est caracterizada bastante aproximadamente por
una reaccin cintica de primer orden.
Si No es el nmero de organismos viables presentes inicialmente y N es
nmero viable al final tendremos que la ecuacin de velocidad de muerte
ser:

= (1) 0

=0 = ,
0
= = (2)
0

N/No es la fraccin de organismos viables que sobreviven despus del


tratamiento por calor durante el tiempo t y K = constante de velocidad de
destruccin, que depende de la temperatura segn la clsica ecuacin de
Arrhenius:


= ln = ln (3)

Donde: A = constante
E = energa de activacin
R = Constante general de los gases
T = Temperatura en grados Kelvin

Si se grfica el In k en funcin de 1/T se obtendr una lnea recta, siendo


la inclinacin igual a -E/R y la interseccin de la recta con la ordenada, el
valor de la constante de Arrtherius.

En la prctica de la esterilizacin es necesario tener presente que la


calidad nutriente del medio debe ser preservada todo lo posible, razn por
la cual, es imprescindible disear un ciclo de esterilizacin lo ms efectivo
posible pero al mismo tiempo lo ms corto posible. Podremos definir un
trmino nabla (V) que representa la magnitud de la disminucin del
nmero de organismos viables de manera que:
0
= ln ( ) =

Y por tanto

Sin embargo, como ya dijimos, parte de la destruccin ocurre en la etapa


de calentamiento y otra parte en la de enfriamiento, de manera tal que:

= + . + .

Las partes de calentamiento y enfriamiento son obtenidas a temperatura


variable de manera tal que es necesario integrar la ecuacin:

=

para el perodo de calentamiento y de enfriamiento con el fin de calcular


la cantidad de esporos que se eliminan durante ambos perodos.
Conociendo el valor inicial de esporos presentes en el volumen de medio
considerado es posible calcular el tiempo de mantenimiento a 120 C para
la esterilizacin completa del mismo.

3.4 MONTAJE DE EQUIPO

El biorreactor ser puesto en marcha con un volumen inicial igual a 1 Lt para


llegar a un volumen final de 2 Lt y utilizando la siguiente formula:

V=V0+Ft

Se determin q el tiempo de fermentacin ser de 6 h para un flujo constante


de alimentacin de (0,16)Lt/h.
Se trabajara con 1,5 vvm y 200 rpm como ser un cultivo por lote
alimentado aireado no habr flujo de salida.
F(t)
SR(t)

Vf, Xf
VR = Vf - V0
V0, X0, S0

RESERVORIO BOMBA
BIORREACTOR

Para esta experiencia se utilizar un El sistema Liflus GX fermentacin es un


fermentador a escala de laboratorio, que est diseado para la fermentacin
de usos mltiples. Varios esquemas de fermentacin, tales como feedbatch
e incluso el cultivo de clulas animales pueden ser pertalined con la serie
BioGM. El monoltico monitor LCD se instala en el cuerpo de la torre
controlador de tamao medio y se puede visualizar todos los valores medidos
y los parmetros de control.

El biorreactor del laboratorio posee las siguientes partes:

Determinacin de PH (4.2)
Sensor de PH
Sensor de T
Sensor Oxgeno Disuelto.
Antiespumante
Condensador
Motor de rotor
Posee cuatro bombas peristaticos: acido- base-
alimentacin- espumante
2 Sensores de aire (1%)

1. Sensor de espuma
2. Condensador
3. Motor
4. Sensor de O.D
5. Sensor de PH
6. Sensor de T
IV. INSTRUMENTOS Y REACTIVOS
4.1 MEDIO DE MANTENCIN:

4.1.1 Materiales e instrumentos:


Guantes.
Capachos de papel.
Vasos precipitados 250ml.
Esptula.
Probeta graduada.
Matraz Erlenmeyer.
Tubos de ensayo
Pipetas.
Mechero bunsen
Varilla de vidrio.

4.1.2 Equipos:
Balanza analtica.
Olla a presin. Balanza analtica

4.1.3 Reactivos:
Extracto de malta (3 g/l)
Peptona (5 g/l)
Agar (20 g/l)
Extracto de levadura (3g/l)

4.2 MEDIO DE ACTIVACIN:

4.2.1 Materiales e instrumentos:


Algodn.
Gaza.
Capachos de papel.
Guantes.
Esptula
Matraz de 125ml
2 tubos de ensayo con tapa
Pinzas.
Mechero bunsen.
Trpode.
Rejilla

4.2.2 Equipos:
Balanza analtica.
Olla a presin.
Shaker.
Bunsen
pHmetro.

4.2.3 Reactivos:
Glucosa (5 g/l)
Extracto de levadura (3 g/l)
Extracto de malta (3 g/l)
Soluciones de sales (5 ml/L)

4.3 MEDIO DE FERMENTACIN:

4.3.1 Materiales e instrumentos:


Gaza.
Capachos de papel.
Laminillas porta y cubre objeto.
Probeta graduada.
Varilla de vidrio.
Matraz 1L.
Matraces de 125 ml.

4.3.2 Equipos:
Balanza analtica.
Espectrofotmetro.
pHmetro.
Incubadora.
Microscopio.
Micropipeta.

4.3.3 Reactivos:
Extracto de levadura.(10g/l)
MgSO4.7H20 (0.386g/l)
(NH4)2SO4(10g/l)
KH2PO4 (2 g/l)
Cascarilla de arroz

4.4 PARA CINTICA DE CRECIMIENTO DE BIOMASA


Capachos de papel aluminio
Gasa y algodn
Tubo de ensayo
Matraz de 500 ml

4.5 DETERMINACIN DE LA CINTICA DE CONSUMO DE LA


FUENTE DE CARBONO

Materiales

Viales conteniendo el sobrenadante


Instrumentos e Equipos

Espectrofotmetro
Reactivos

Sacarosa
Agua destilada
V. METODOLOGA EXPERIMENRTAL

A la hora de disear un medio de cultivo no slo hay que tener en cuenta


los nutrientes sino tambin las condiciones fsicas que permitan el crecimiento
de los microorganismos, asimismo nos interesa cuanto de biomasa se desea
producir tambin es importante conocer las caractersticas de los
microorganismos con el que se va a trabajar.

Microorganismo
La levadura usada es Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126, siendo
el sustrato sacarosa

Condiciones del medio:


o Sustrato limitante: SACAROSA (C12H22O11)
o Duracin: 6 horas de la etapa de CLA
o Usar el fermentador automtico Biotron Modelo Liflus G X de 2
litros
o Control de pH mediante electrodo
o Medicin de oxgeno disuelto mediante electrodo: 1,0 vim ; 200
rpm
o La existencia de las zonas de crecimiento exponencial y
limitado.
o Utiliza macro nutrientes como: C.N.Mg,K,P
o Utiliza micro nutrientes como: Ca,Na,Fe,Cu,Mn,Mo,Co,Zn
5.1 DISEO DEL MEDIO DE CULTIVO

Para disear el medio de cultivo se realizar de acuerdo a los


alcances que nos proporciona la gua de prctica, en el cual
podemos conocer los requerimientos del microorganismo, para su
mantencin, activacin y para la fermentacin del cultivo por lote
alimentado. Otro modo de operar un biorreactor es empleando la
tcnica de batch alimentado (BA) o feedbatch. Esta tcnica se define
como un cultivo en batch donde se alimenta continuamente medio
nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente que se
alimenta es el limitante del crecimiento, esta tcnica permite
controlar la velocidad de crecimiento () del microorganismo. El BA
es particularmente til en procesos en los que el crecimiento celular
y/o la formacin de producto son sensibles a la concentracin del
sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la
productividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven
afectados. As, este mtodo se emplea cuando se quieren evitar
fenmenos de inhibicin por sustrato y se requiere alcanzar una alta
concentracin de biomasa.

F(t)
SR(t)

Vf, Xf
VR = Vf - V0

V0, X0, S0

RESERVORIO BOMBA
BIORREACTOR

Grfica N1: Esquema de la experiencia


Donde:

F(t): caudal de alimentacin:


Sr(t): concentracin de sustrato de la alimentacin
Vf: volumen final de trabajo
Vo: volumen al inicio de la alimentacin
Xo: concentracin de biomasa al inicio de la alimentacin
So: concentracin de sustrato limitante al inicio de la alimentacin

El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch, por lo que Vo, Xo y So


son las condiciones finales de dicho batch.

Es posible elegir distintas condiciones de alimentacin, ya sea mediante


el empleo de caudales variables (F = F(t)), o bien mediante la variacin de la
concentracin de sustrato limitante (Sr=Sr(t)). En el caso del Trabajo Prctico se
utilizar el sistema ms simple, es decir F=cte y Sr=cte.

Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las


condiciones halladas.

S0'
X.V = X0.V0 + F.SR.YX/S.t
X0.V0 < max
X.V

= max

X0'.V0' S0 = 0

BATCH t = t0 BATCH ALIMENTADO t

Grfica N2: Esquema de la experiencia


Al obtener valores de Sf y F, se ha DISEADO una alimentacin para el cultivo
en batch alimentado. El caso descrito hasta aqu tiene en cuenta que tanto F
como Sf sean constantes. Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o Sr = Sr(t),
dicha funcionalidad habr de ser tenida en cuenta para resolver las ecuaciones
planteadas

5.2 PREPARACION DEL MEDIO:

5.2.1 PREPARACIN DEL MEDIO DE MANTENCIN


La preparacin de este medio se realizar de acuerdo a los
componentes que se encuentran en la tabla N 01.

Tabla N1: Composicin de medio slido de mantencin (para 50


ml de solucin)

Nutriente So (g/l) So (g/50ml)

Extracto de Levadura 3 0.15


Extracto de malta 3 0.15
Peptona 5 0.25
Agar 20 1
Glucosa 10 0.5

Procedimiento:
La preparacin del medio de mantencin se inicia de acuerdo a las
concentraciones de la tabla N 01.
Los nutrientes se pesan en cantidades requeridas para 50ml. De
la tabla N 01, por lo que el medio de mantencin se necesita en
cantidades menores a 50 ml.
Medir en una probeta graduada 50 ml de agua destilada.
Mezclar todos los compuestos en un matraz Erlenmeyer
adicionando el agua destilada.
Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz;
agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio,
hasta la aparicin de la primera burbuja, a partir de lo cual se
controla de 1 a 2 minutos.
Preparar 8 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 6ml
de la mezcla a cada tubo, e inmediatamente taparlos.
Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla a
presin, previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio
de gases.
Calentar hasta que la temperatura alcance los 121C y a partir de
ello controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la esterilizacin.
Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla,
luego colocarlos en posicin inclinada y dejarlos a temperatura
ambiente.
Luego preparamos nuestra rea de trabajo, desinfectando con
alcohol. para tener un rea estril prendemos el mechero cinco
minutos antes de realizar la resiembra con el Saccharomyces
cerevisiae ATCC 4126.
Abrimos los tubos de ensayo cerca al mechero bunsen, flameando
para evitar la contaminacin, teniendo la aza bacteriolgica
calentada al rojo vivo esperamos un momento que se enfre.
Sacamos 2 a 3 azadas y colocamos en el tubo con agar,
flameamos y cerramos el tubo y as en los 8 tubos con agar.
5.2.2 PREPARACIN DEL MEDIO DE ACTIVACIN

Tabla N 2: Composicin de medio de Activacin (para 15 ml de


solucin)

NUTRIENTE CONCENTRACIN (G/L) PESAR (G)

Sacarosa 15 0.225

Extracto de
3 0.045
Levadura
Extracto de
5 0.075
Malta
Solucin de
5 ml/L 0.075ml
Sales

Procedimiento:
Pesar los componentes descritos en la tabla N 2.
En un matraz Erlemenyer se coloc la cantidad pesada de
sacarosa ms 8 ml de agua destilada.
El extracto de levadura se coloc en tubo de ensayo y se agreg
10 ml de agua destilada
En cuanto a la solucin de sales tambin se coloc en tubo se
ensay y se agreg 7 ml de agua.
Se esterilizan: la mezcla de extracto de levadura y sales en un tubo
de ensayo cada uno, la sacarosa en un matraz de 125 ml todo esto
en un vaso precipitado colocado dentro de una olla a presin.
Despus de haber esterilizado se dej enfriar para luego mezclar
y realizar la activacin con el microorganismo.
Al mezclar estos componentes (las sales y la levadura con la
sacarosa) se procedi a activar el microorganismo bajo mechero
para evitar la contaminacin.
Sacamos dos azadas y colocamos en el medio de activacin,
luego tapamos con el tapn previamente elaborado.
Colocar en el shaker por un tiempo de 12h.
Sacarosa 0.225g Extracto de malta: 0.045g Solucin de sales: 0.0775ml
Extracto de levadura: 0.075g Agua destilada : 0.925ml

8ml 10ml 7ml

Este procedimiento se realiz por duplicado.


A la solucin de sales y al extracto de malta + extracto de levadura se le agreg 10ml
de agua destilada a cada tubo.
Al matraz de glucosa se le agreg 8 ml de agua destilada para completar los 15 ml de
volumen requerido.
5.2.3PREPARACIN DEL MEDIO DE FERMENTACIN
Composicin del Medio de Cultivo de Saccharomycescerevisiae-
ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 1.8 g/l. para un
volumen de 100ml. El diseo del medio se realiz en un matraz
Erlenmeyer de 500ml.

Tabla N 3: Composicin Del Medio De Fermentacin I

% en % en pesar
Elemento Nutriente Y x/s (g/g) S`0 (g/l) S0 (g/l)
Celula nutriente (gr)
Sacarosa
C 45 42,105 0,4678 3,8478 3,8478 0.3847
(C12H22O11)
Sulfato de
N Amonio 9 21,21 2,3567 0,7638 1,1457 0.1146
(NH4)2SO4
Fosfato
K Potasico 0,5 28,676 57,352 0,0314 0,0471 0.0047
(KH2PO4)
Sulfato de
Magnesio
Mg 0,4 9,86 24,65 0,0730 0,1095 0.0195
Heptahidratado
(MgSO4.7H2O)
Fosfato
P Potasico 2 22,79 11,395 0,1580 0,2369 0.02369
(KH2PO4)
Extracto de
- - - - - 1,8 0.18
Levadura
Solucin de
- - - - - 10 ml/L 1
sales

Condiciones de Cultivo :

pH inicial : 4,2
SHAKER
Temperatura: 35C
Velocidad de agitacin : 200 rpm

La fermentacin se realizar en un matraz de 500 ml.


Solucin de sales: 1ml
Sacarosa: 0.3847gr Sulfato de amoniaco: 0.1146gr Extracto de levadura 0.18gr
KH2PO4: 0.047gr
Sulfato de magnesio: 0.0195 gr

Tabla N 4: Composicin Del Medio De Fermentacin I


Composicin del Medio de Cultivo de Saccharomy cescerevisiae ATCC 4126
para un crecimiento en biomasa de 1.8 g/l. para un volumen de 800ml

% en % en
Elemento Nutriente Y x/s (g/g) S`0 (g/l) S0 (g/l)
Celula nutriente
Sacarosa
C 45 42,105 0,4678 3,8478 3,8478
(C12H22O11)
Sulfato de
N Amonio 9 21,21 2,3567 0,7638 1,1457
(NH4)2SO4
Fosfato
K Potasico 0,5 28,676 57,352 0,0314 0,0471
(KH2PO4)
Sulfato de
Magnesio
Mg 0,4 9,86 24,65 0,0730 0,1095
Heptahidratado
(MgSO4.7H2O)
Fosfato
P Potasico 2 22,79 11,395 0,1580 0,2369
(KH2PO4)
Extracto de
- - - - - 1,8
Levadura
Solucion de
- - - - - 10 ml/L
sales
Condiciones de Cultivo :

pH inicial : 4,2
SHAKER
Temperatura: 35C
Velocidad de agitacin : 200 rpm

La fermentacin se realizar en el fermentador de 2000 ml.

5.2.3.1 INOCULACIN
INOCULACIN SOLIDO-LIQUIDO
1. El asa bacteriolgica se somete al fuego del mechero hasta alcanzar
el rojo vivo.
2. Se debe dejar enfriar por unos segundos, del tubo de ensayo que
contiene las clulas desarrolladas en medio slido, se extrae una
azada, se flamea el tubo para cerrarlo.
3. El procedimiento de resiembra se hace en los tubos de ensayos
preparados con medio slido (con agar).
4. La azada se realiza en el tubo desde adentro hacia fuera.
5. Se llevan a la incubadora a 35 C durante 48 horas. Luego se refrigera
para parar el crecimiento
Matraz de 1L
El asa bacteriolgica

COLOCAR Bajo el mechero hasta


alcanzar el color rojo vivo

ENFRIAR
Tubo de ensayo que contiene
las clulas desarrolladas en
medio slido

EXTRAER Una azada.

FLAMEAR

En los tubos de ensayos


RESEMBRAR preparados con medio
slido (con agar)

INCUBAR A 35 C durante 48 horas

5.2.3.2 ACTIVACIN CELULAR Y DESARROLLO DEL INCULO


Se tuvo el lugar bien desinfectado, se colocaron los mecheros se prosigue de la
siguiente manera:

1. Para la inoculacin partimos con la


cepa incubada en medio slido
Saccharomyces cerevisiae ATCC
4126

2. Se toma una azada y se inocula en el


matraz con los 25 ml del medio de
activacin
3. Tapamos el tubo con un tapn de gasa y algodn.

4. Llevamos al Shaker a 200 rpm, T = 30 C y un t = 10 hasta


alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por el
incremento en la turbidez del medio.

5. El procedimiento de inoculacin se har por duplicado es


decir 2 azadas.

Cepa incubada en medio slido


Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126

TOMAR Una azada

Matraz con los 25 ml. De


INOCULAR
medio de activacin.

TAPAR Con un tampn

A 200 rpm, T = 30 C y un t =
SHAKER 10 hasta alcanzar un
desarrollo celular suficiente.
FERMENTACIN DEL CULTIVO:

Inocular el caldo (medio rico + biomasa) a un matraz conteniendo


medio de fermentacin, para el la adaptacin del crecimiento
Durante el desarrollo del cultivo, para las evaluar el crecimiento de
biomasa, tomar una muestra inicial, al que se le mide la absorbancia
y se centrfuga, guardando el sobrenadante en viales y la masa
sedimentada en capachos que sern expuestos a la estufa.
Una vez iniciado el crecimiento de biomasa se manipula el flujo de
alimentacin de tal manera que, en tiempos determinados, se
provoque en el comportamiento del crecimiento.
Luego se llevar a cabo la alimentacin, se llevar a cabo una
segunda fermentacin para un volumen final del medio a 1600 ml de
solucin

Tabla N 5: Composicin Del Medio De Fermentacin II

Composicin del Medio de Cultivo de Saccharomycescerevisiae- ATCC 4126


para un crecimiento en biomasa de 3.65 g/l. para un volumen de 1600ml.
Entonces se tendr: X=3.425gr/l

So So
Elemento Nutriente YX/S Pesos (g)
(gr/l) (gr/l)
Extracto de
1.800 2.880
levadura
N (NH4)2SO4 2.36 1.454 2.181 3.489

P KH2PO4 11.38 0.301 0.451 0.722

K KH2PO4 57.47 0.060 0.089 0.143

Mg MgSO47H2O 24.66 0.139 0.208 0.333


Extracto de sales 10.000 16.000
Condiciones de Cultivo :

pH inicial : 4,2
SHAKER
Temperatura: 35C
Velocidad de agitacin : 200 rpm

La fermentacin se realizar en el fermentador de 2000 ml.

5.2.3.3 CRECIMIENTO POR LOTE

Despus de hechas las inoculaciones, se pone en marcha el


biorreactor.
Extraemos una cantidad inicial que eliminamos a nuestro desage
(vaso precipitado cubierto con papel aluminio).

Ahora sacamos 4 ml. Y lo agregamos a la celda para hacer la medicin


de la absorbancia y lo restante lo colocamos en un tubo de ensayo.
Medimos absorbancia y centrifugamos.

Este procedimiento se realiz 4 veces de los cuales


se obtuvieron las siguientes absorbancias:
5.2.4 DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN CELULAR
POR D.O.
El mtodo se basa en el aumento de la turbidez del medio, al
incrementarse la concentracin de microorganismos a medida que
avanza el tiempo, esto puede ser detectado fcilmente por
espectrofotometra a 640nm. Para sta determinacin es necesario
que previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las
concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas
por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:

Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a


1200rpm. Durante 20 minutos.
Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con
agua destilada.
Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar
restos de sustrato que pudiera alterar la determinacin.
Se elimina el sobrenadante, se redisueIve el precipitado y se seca en
la estufa a 80C hasta peso constante.

5.3 DETERMINACIN DE AZUCARES REDUCTORES:


METODO DEL DNS (ACIDO DINITRO SALICLICO).
La preparacin del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:

10 g/l de cido 3.5 dinitrosaliclico (DNS)


200 ml/l de NaOH 2N
300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado.

Para la preparacin d este reactivo, se disuelve el tartrato en


aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el
cido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1
litro y se agita hasta la completa disolucin de todos los componentes,
para posteriormente aforar hasta un litro.

1. Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la


muestra:
2. Se aade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a
analizar.
3. Se mantiene la mezcla en un bao de agua a ebullicin durante 5
minutos para luego dejar enfriar.
4. Se aade volmenes de agua destilada.
5. Se mantiene la mezcla en un bao de agua a ebullicin durante 5
minutos para luego dejar enfriar.
6. Se aade volmenes de agua destilada.
7. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.
8. La concentracin se obtiene interceptando la medida de
absorbancia en la curva de calibrado.
La curva de calibrado para sacarosa se obtiene a partir de muestras de
concentracin conocida y analizadas segn este procedimiento, previo
hidrlisis cida de cada muestra.
5.4 AIREACIN
Algunas consideraciones que se debe tomar son:

Proporcionar a los microorganismos el oxgeno necesario para


llevar a cabo su proceso respiratorio.

La solubilidad del O2 es baja < 30mg/l se necesita alimentar en


forma continua este nutriente, dado que su demanda es
aproximadamente de 3g/l.

Se pueden tener sistemas donde los microorganismos crecen con


mltiples sustratos, pero en el caso que todos son limitantes. Ej, C, N, O2 ,
luego la cantidad de cada uno de ellos afecta la cintica de crecimiento.

G N O
max
G
K G N K N o K O

5.4.1 TRANSFERENCIA DE OXGENO


El comportamiento de las fermentaciones est fuertemente
influenciado por una serie de operaciones de transferencia.

Es posible que una determinada fermentacin, en especial las


aerbicas, est limitada en sus posibilidades de mejorar su
rendimiento y productividad, no por razones propias de las
caractersticas de las clulas sino que por problemas en el diseo
que permita satisfacer la alta demanda de transferencia de masa,
y en especial de oxgeno.

Necesidades de Diseo
Se dise de un sistema de aireacin-agitacin debera satisfacer que:

DEMANDA DE OXIGENO = OFERTA DE OXIGENO

Por otra parte, el crecimiento microbiano se puede representar por:

1CaHbOC + m NH3 + n O2 q CdHeOfNg + r CO2 + t H2O + u ChHiOjNk

CdHeOfNg: Biomasa

ChHiOjNk: Metabolito extracelular


De acuerdo con la ecuacin anterior, el rendimiento de oxgeno en clulas
se puede calcular por medio de la relacin entre n y q

Si no se producen Metabolito extracelular, u igual a cero

32a 8b 16c
YO 2 0.01 f 0.03d 0.02 g 0.08e
x Yx mws
s

mws: Peso molecular de la fuente de carbono y energa

PROCESO DE TRANSFERENCIA DE OXGENO


(OFERTA)

Etapas
a. Del seno de la burbuja a una capa interna de gas
b. Difusin en la capa interna de gas.
c. Difusin a travs de una capa externa de lquido que rodea
a la burbuja Etapa limitante!
d. Transferencia al seno del lquido
e. Difusin a travs de la capa de lquido que rodea a los
microorganismos Etapa limitante!
f. Difusin en el interior de los microorganismos
VELOCIDAD DE TRANSFERENCIA DE OXGENO
POR REA INTERFACIAL

La velocidad de transferencia por unidad de rea interfacial, W, est dada


por:

W = kl (Ci C)

Como en la interface se supone que hay


equilibrio entre el oxgeno en el gas y el
disuelto.

W = kl (Ci C)= kG (P Pi)

Las cantidades Pi y Ci resultan difciles de determinar en la prctica, se


prefiere hacer uso de las relaciones de equilibrio, trabajando con las
concentraciones y presiones de equilibrio C* y P*. Con ello se trabaja con
la Velocidad de transferencia de oxgeno volumtrica, NA

VELOCIDAD DE TRANSFERENCIA DE OXGENO


VOLUMTRICA
Cuando el control de la transferencia de O2 se encuentra en el film lquido
que rodea a la burbuja o a los microorganismos, la velocidad de
transferencia de oxgeno, NA se puede expresar como:

NA = kLa (C* - C) = H kLa (P P*)

Se supone que hay equilibrio entre el oxgeno del gas y el disuelto en el


lquido.

kL: Coef volumtrico de transferencia de O2 a la fase lquida (cm/hr)

a : Area interfacial especfica (cm2/m3) Resulta difcil de medir (kLa)

C*: Conc. de O2 en el equilibrio (mM/L) (Hipottico)

C : Conc. de O2 disueltro en el seno de la fase lquida (Este valor no puede


ser inferior Ccrtico 1mg/l)

P* : Presin de O2 en el equilibrio

P : Presin de O2 en el seno de la fase gas.

H : cte. de Henry..
BALANCE DE OXGENO
Se puede plantear una ecuacin de balance de oxgeno en el fermentador:

FO2

O2 que entra O2 que sale O2consumido por unidad de volumen =


Acumulacin.

O2 que entra O2 que sale = O2 que se transfiere = NA

x dC
k L a (C * C )
Yo 2 dt
x

Para que el cultivo pueda crecer sin limitacin de Oxgeno, el suministro


debe ser igual a la demanda.
x
k L a (C * C )
Yo 2
x

MTODOS DE DETERMINACIN KL A
Para la adecuada operacin de un fermentador se hace necesario conocer
el valor del coeficiente volumtrico de transferencia de O2
kL = f (Sc, Sn, GR)
kL a a = f (D32, H)
Medicin de los flujos de Oxgeno
o Titulacin
o Oxidacin de sulfito de sodio
o Eliminacin del O2
o Mtodo Dinmico.
o Balances de masa
o Medicin Directa con analizador de O2
Estimado mediante Correlaciones.

o Mtodo del sulfito de sodio

Se basa en la rpida reaccin qumica de oxidacin del


sulfito a sulfato mediante O2.

Se reemplaza el medio por solucin de sulfito de sodio


(sulfato cprico como catalizador) y se burbujea aire por un
cierto tiempo.

Sulfito + O2 Sulfato

Sulfitoinicial Sulfito final


kLa C*
t

kLa C* : Representa la mxima velocidad


volumtrica de transferencia de O2 en un sistema
dado (fermentador).

o Mtodo dinmico

En este caso la medicin se realiza en el fermentador


durante el crecimiento de un cultivo activo, registrndose el
oxgeno disuelto. El proceso tiene 2 etapas.

Etapa 1: Durante la fermentacin se corta el suministro de


aire (T1) y se registra la disminucin de O2 disuelto. En este
caso el suministro es nulo.

x dC

Yo 2 dt
x

k L a (C * C ) 0
La pendiente de la curva es la demanda de O2:

x dC

Yo 2 dt
x
El flujo de aire se repone antes que se alcance la
concentracin crtica de oxgeno, Cc (bajo este valor la
velocidad de metabolismo se hace dependiente de la
concentracin C, pudindose causar daos irreversibles en
los m.o.).

Cc 0.1*Concentracin de Saturacin

Bajo estas condiciones se cumple:


1 x dC
C C *

k L a Yo 2 dt
x

Desde la cual se despeja el trmino (-1/kLa)

Depende de la velocidad de respuesta de los electrodos

o Mtodo medicin directa

Para aplicar este mtodo se utiliza un electrodo de oxgeno


disuelto y sistemas para determinar oxgeno en la fase
gaseosa.

En este mtodo se calcula la demanda de oxgeno midiendo


el flujo de aire y la concentracin de oxgeno en las
corrientes gaseosas de entrada y salida.

Con estos valores y la lectura de oxgeno disuelta, se calcula


kLa.

O2 que entra O2 que sale = O2 que se transfiere = kL a (C*


- C)

Mtodo de alto costo debido al equipamiento analtico requerido.


PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL KLA

Para poder analizar el


KLa, debemos tener
instalado nuestro sistema
as como el programador,
para determinar el 02 .

PARA EL KLa, vamos a analizar tanto


la desgasificacin y la gasificacin,
quitndole O2, para luego inyectarle,
as poder obtener una grfica
caracterstica del KLa.

Tener en cuenta el control del tiempo,


al tomar dato, tanto en la
desgasificacin y gasificacin.
VI. RESULTADOS

En el desarrollo del crecimiento microbiano se tuvo un CULTIVO POR LOTE (que duro
aproximadamente 4 horas) y un CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO (que duro
aproximadamente 6 horas).

Entonces, para su mejor estudio, analizaremos estas dos zonas de crecimiento


microbiano, de la siguiente manera:

tiempo ABS (640


N Hora DESCRIPCION PH %OD
(hr) nm)
1 09:51 0 0.376 4.4 100
Cultivo 2 10:51 1 0.521 4.16 64.5
por 3 11:51 2 0.762 4.1 54.5
lote 4 12:51 3 0.723 dilucin 1:2 3.95 36.6
5 01:40 4 0.882 dilucin 1:2 3.9 10.9
inicio del cla F=2.78
6 01:50 0 0.882 3.9 9.1
ml/min
7 02:50 1 0.646 dilucin 1:4 3.69 0.5

Cultivo por 8 03:20 01:30 0.685 dilucin 1:4 3.56 0.1


lote 9 03:50 2 0.709 dilucin 1:4 3.44 0
alimentado 10 04:50 3 0.774 dilucin 1:4 3.2 2.1
11 05:20 03:30 0.827 dilucin 1:4 3.07 1.7
12 05:50 4 0.816 dilucin 1:4 2.96 0
13 06:20 04:30 0.856 dilucin 1:4 2.88 0
14 07:20 05:30 0.912 dilucin 1:4 2.72 0
15 07:50 06:00 0.951 dilucin 1:4 2.66 0

6.1 CINETICA DE CULTIVO CELULAR POR LOTES

A continuacin, se darn a conocer los datos obtenidos en todo el desarrollo


fermentativo de la levadura Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126 utilizando
como fuente de carbono a la SACAROSA. Para esta experiencia se utiliz 1 matraz
durante 6 horas de fermentacin, pero debido a la falta de tiempo en la prctica
realizada, se tomaron 4 horas de fermentacin.
El Cultivo por Lote se inicia mediante la adicin de un inculo de fermentacin y
estaba dirigida a estudiar el crecimiento de Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126
y la formacin de biomasa. A continuacin, realizaremos un anlisis del estudio
del consumo de Sustrato y la cintica de crecimiento.

Ordenando los datos:

_
= =
.

N Hora tiempo ABS (640 DESCRIPCION X (g/l)


(hr) nm)
1 09:51 0 0.376 0.285324
2 10:51 1 0.521 0.395356
3 11:51 2 0.762 0.578236
4 12:51 3 0.723 dilucin 1:2 1.097283
5 01:40 4 0.882 dilucin 1:2 1.338595

CURVA DE CRECIMIENTO X(g/l) vs tiempo (hr)


1.6

1.4

1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Luego linealizando la cintica:

tiempo ABS (640 LN


N Hora DESCRIPCION X (g/l)
(hr) nm) (X/Xo)
1 09:51 0 0.376 0.285324 0.0000
2 10:51 1 0.521 0.395356 0.3262
3 11:51 2 0.762 0.578236 0.7064
4 12:51 3 0.723 dilucion 1:2 1.097283 1.3470
5 01:40 4 0.882 dilucion 1:2 1.338595 1.5458

LN (X/Xo) vs tiempo
1.8000
1.6000
1.4000
1.2000
1.0000
0.8000
0.6000
0.4000
0.2000
0.0000
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

Identificando la zona de crecimiento exponencial, tenemos:

LN (X/Xo) vs tiempo
1.8000
1.6000 y = 0.4197x - 0.0594
1.4000 R = 0.9155
1.2000
1.0000
0.8000
0.6000
0.4000
0.2000
0.0000
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
De la ecuacin de la recta obtendremos

= .
El tiempo de fermentacin es:

X
ln M t
X0

1.339
Reemplazando: ln 0.3532t
0.285

Despejando

1.547 = 0.3532 (t)

t = 4.3804 hr

El tiempo de duplicacin:

td= ln (2) /0.3532= 1.962 h-1


6.2 DETERMINACIN DEL CONSUMO DE SACAROSA

DATOS OBTENIDOS POR EL MTODO DNS


A continuacin, se darn a conocer los datos obtenidos en el consumo de
sustrato por parte de la levadura Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126,
utilizando como fuente de carbono a la SACAROSA.

.
[ ]=
.
= [ ]

ABS
tiempo factor sustrato
TUBOS (540 [ ] X (g/l)
(hr) dilucin (g/l)
nm)
0 1 0.187 1.09000584 4 4.36002338 0.285324
1 2 0.659 3.84862653 1 3.84862653 0.395356
2 3 0.53 3.09468147 1 3.09468147 0.578236
3 4 0.023 0.13150205 4 0.52600818 1.097283
4 5 0.01 0.05552309 2 0.11104617 1.338595

CONSUMO DE SUSTRATO (g/l) EN EL TIEMPO


5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
CURVA DE CRECIMIENTO VS CONSUMO DE SUSTRATO
EN EL TIEMPO (CL)
sustrato (g/l) X (g/l)

5 0.8
4.5 0.7
4
0.6
3.5
3 0.5
2.5 0.4
2 0.3
1.5
0.2
1
0.5 0.1
0 0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

En la presente grafica se puede observar la relacin que existes entre el


crecimiento microbiano y el consumo de sustrato podemos observar que el
microorganismo cuando consume ms rpido el sustrato ah se da el crecimiento
exponencial.

El crecimiento exponencial depende parcialmente de la concentracin inicial del


sustrato limitante, esto implica que el cultivo pasa de un estado en el cual crece
con exceso de sustrato a otro de carencia de sustrato, de manera que los
periodos a velocidades menores que la mxima no son suficientemente largos
para permitir al organismo ajustar su estructura interna a las nuevas condiciones.

Ahora se observa un decaimiento en el consumo rpido del sustrato, en las 4


primeras horas, ahora, pero se observa que el microorganismo sigue creciendo,
esto se debe al extracto de levadura, una fuente rica en aminocidos, vitaminas,
minerales. Asimismo, vemos que se llevara a cabo a la produccin de etanol la
que tambin sirve de medio para esta levadura para producir otros cidos, en
otro proceso fermentativo.
Determinamos el rendimiento de la produccin de biomasa con respecto al
consumo de sustrato:

1.339 0.578
/ = = = 0.25
0.111 3.095

De igual manera calculamos la productividad de biomasa:

1.339 0.578
= = = 0.3805 /
42

6.3 CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO

CINETICA DE CLA CON VELOCIDAD DE ALIMENTACION CONSTANTE (F=0.166L/h=cte)


A continuacin, se darn a conocer los datos obtenidos en todo el desarrollo
fermentativo de la levadura Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126 utilizando como
fuente de carbono a la SACAROSA.

De la curva de Calibracin Anterior:

_
= =
.

tiempo ABS (640


CLA Hora DESCRIPCION X (g/l)
(hr) nm)
inicio del cla F=2.78
1 01:50 0 0.882 1.3386
ml/min
2 02:50 1 0.646 dilucion 1:4 1.9608
3 03:20 01:30 0.685 dilucion 1:4 2.0792
4 03:50 2 0.709 dilucion 1:4 2.1521
5 04:50 3 0.774 dilucion 1:4 2.3494
6 05:20 03:30 0.827 dilucion 1:4 2.5102
7 05:50 4 0.816 dilucion 1:4 2.4769
8 06:20 04:30 0.856 dilucion 1:4 2.5983
9 07:20 05:30 0.912 dilucion 1:4 2.7683
10 07:50 06:00 0.951 dilucion 1:4 2.8866
CURVA DE CRECIMIENTO X(g/l) vs tiempo
(hr)

3.5000
3.0000
2.5000
2.0000
1.5000
1.0000
0.5000
0.0000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

luego linealizando la cintica:

CLA Hora tiempo ABS (640 DESCRIPCION X (g/l) LN


(hr) nm) (X/Xo)
1 01:50 0 0.882 inicio del cla F=2.78 1.3386 0
ml/min
2 02:50 1 0.646 dilucion 1:4 1.9608 0.381755
3 03:20 01:30 0.685 dilucion 1:4 2.0792 0.440374
4 03:50 2 0.709 dilucion 1:4 2.1521 0.474811
5 04:50 3 0.774 dilucion 1:4 2.3494 0.562527
6 05:20 03:30 0.827 dilucion 1:4 2.5102 0.62876
7 05:50 4 0.816 dilucion 1:4 2.4769 0.615369
8 06:20 04:30 0.856 dilucion 1:4 2.5983 0.663226
9 07:20 05:30 0.912 dilucion 1:4 2.7683 0.726595
10 07:50 06:00 0.951 dilucion 1:4 2.8866 0.768469

LN (X/Xo) VS TIEMPO
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10
Identificando la zona de crecimiento exponencial, tenemos:

LN (X/Xo) vs tiempo
0.9
0.8
y = 0.0523x + 0.3014
0.7 R = 0.9944
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10

De la ecuacin de la recta obtendremos:

= , (CLA)

N Hora tiempo ABS DESCRIPCION PH %OD X (g/l)


(hr) (640
nm)
1 09:51 0 0.376 4.4 100 0.285
Cultivo
2 10:51 1 0.521 4.16 64.5 0.395
por
3 11:51 2 0.762 4.1 54.5 0.578
lote 4 12:51 3 0.723 dilucion 1:2 3.95 36.6 1.097
5 01:40 4 0.882 dilucion 1:2 3.9 10.9 1.339
6 01:50 0 0.882 inicio del cla 3.9 9.1
F=2.78 ml/min 1.339
7 02:50 1 0.646 dilucion 1:4 3.69 0.5 1.961
8 03:20 01:30 0.685 dilucion 1:4 3.56 0.1 2.079
Cultivo por 9 03:50 2 0.709 dilucion 1:4 3.44 0 2.152
lote 10 04:50 3 0.774 dilucion 1:4 3.2 2.1 2.349
alimentado 11 05:20 03:30 0.827 dilucion 1:4 3.07 1.7 2.510
12 05:50 4 0.816 dilucion 1:4 2.96 0 2.477
13 06:20 04:30 0.856 dilucion 1:4 2.88 0 2.598
14 07:20 05:30 0.912 dilucion 1:4 2.72 0 2.768
15 07:50 06:00 0.951 dilucion 1:4 2.66 0 2.887
CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
saccharomyces cerevisiae ATCC 4126
3.500

3.000 CLA
2.500
CL
2.000

1.500

1.000

0.500

0.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16

Del grfico se puede observar que el cultivo por lote duro aproximadamente 4 h,
y cuando este alcanzo una concentracin cercana a 0.67 g/l, despus se inici
con la alimentacin de la sacarosa dando el inicio al cultivo por lote alimentado
que duro aproximadamente 6 h.
6.4 DETERMINACION DEL CONSUMO DE SACAROSA PARA
CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO
De la curva de calibracin de azucares reductores anteriormente obtenida, tenemos:

.
[ ]=
.
tiempo ABS (540 factor
TUBOS [ ] sustrato (g/l)
(hr) nm) dilucin
0 1 0.187 1.0900058 4 4.3600
1 2 0.659 3.8486265 1 3.8486
2 3 0.53 3.0946815 1 3.0947
3 4 0.023 0.131502 4 0.5260
4 5 0.01 0.0555231 2 0.1110
0 6 0.02 0.1139684 2 0.2279
1 7 0.04 0.2308591 1 0.2309
01:30 8 0.05 0.2893045 1 0.2893
2 9 0.038 0.2191701 1 0.2192
3 10 0.048 0.2776154 1 0.2776
03:30 11 0.035 0.2016365 1 0.2016
4 12 0.034 0.1957919 1 0.1958
04:30 13 0.05 0.2893045 1 0.2893
05:30 14 0.076 0.4412624 1 0.4413
06:00 15 0 falto ABS 1 ---

CONSUMO DE SACAROSA (g/l)


5.0000
4.5000
4.0000
3.5000
3.0000
2.5000
2.0000
1.5000
1.0000
0.5000
0.0000
0 2 4 6 8 10 12 14 16

CRECIMIENTO DE BIOMASA CELULAR VS CONSUMO DE SACAROSA


ABS
tiempo factor
TUBOS (540 [ ] sustrato (g/l) X (g/l)
(hr) dilucin
nm)
0 1 0.187 1.090 4 4.3600 0.285
1 2 0.659 3.849 1 3.8486 0.395
2 3 0.53 3.095 1 3.0947 0.578
3 4 0.023 0.132 4 0.5260 1.097
4 5 0.01 0.056 2 0.1110 1.339
0 6 0.02 0.114 2 0.2279 1.339
1 7 0.04 0.231 1 0.2309 1.961
01:30 8 0.05 0.289 1 0.2893 2.079
2 9 0.038 0.219 1 0.2192 2.152
3 10 0.048 0.278 1 0.2776 2.349
03:30 11 0.035 0.202 1 0.2016 2.510
4 12 0.034 0.196 1 0.1958 2.477
04:30 13 0.05 0.289 1 0.2893 2.598
05:30 14 0.076 0.441 1 0.4413 2.768
falto
06:00 15 0 1 --- 2.887
ABS

CURVA DE CRECIMIENTO VS CONSUMO DE SUSTRATO


EN EL TIEMPO
SUSTRATO X (g/l)

5.0000 3.5000
4.5000 CL CLA 3.0000
4.0000
3.5000 2.5000

3.0000
2.0000
2.5000
1.5000
2.0000
1.5000 1.0000
1.0000
0.5000
0.5000
0.0000 0.0000
0 2 4 6 8 10 12 14

0 2 4 6 8 10 12 14 16
De la figura se puede comprender, como el microorganismo va consumiendo el
sustrato para poder crecer y as aumentar su biomasa.

Determinamos el rendimiento de la produccin de biomasa con respecto al


consumo de sustrato:

2.598 2.510
/ = = = 1.073
0.196 0.278

De igual manera calculamos la productividad de biomasa:

2.598 2.510
= = = 0.1 /
4.30 3.30
BIOMASA INICIAL(XoVo)= (2g/l)(1L)=2gr

De acuerdo a la bibliografa revisada, hemos credo conveniente trabajar con


un volumen final de 1.60L (80% del volumen total), entonces se tendr:

Como el tiempo total del CLA = 6horas

0 2 1
= : = = = 0.16/ = 2.67/
6

T (hr) X (g/l) xv
2.000
0 0.28532402
2.895
1 0.3953559
4.192
2 0.57823645
6.069
3 1.09728335
8.786
4 1.33859463
12.720
5 1.96084383
15.304
5.5 2.07922295
18.415
6 2.15207163
26.659
7 2.34937016
32.077
7.5 2.51024435
38.596
8 2.47685537
46.439
8.5 2.59826984
67.232
9.5 2.76825011
80.894
10 2.88662923
Condiciones de transicin

Como se tiene dos zonas de crecimiento, por teora sabemos que se


debe cumplir:

Biomasa producida en la zona de crecimiento exponencial

= Biomasa producida en la zona de crecimiento limitado

Entonces debemos calcular el tiempo de transicin, a partir de:

(XV) crecimiento exponencial= (XV) crecimiento limitado

Asimismo, se debe cumplir, para un buen desarrollo del microorganismo,


teniendo un tiempo de transicin =2.5horas

Entonces, sabemos que:

BIOMASA ZONA CRECIMIENTO EXPONENCIAL= BIOMASAZONA CRECIMIENTO LIMITADO

XoVo eumax.t = FSfYX/S t + SoVo + XoVo


Despejando Sf, obtenemos que:

.
(XoVo SoVo XoVo)
=
F/
Reemplazando:

=
(2 1 0.372.5 0 0.8 1.8 0.8)
0.16 0.56 2.5

= 13.06/

En la zona de crecimiento limitado de masa celular

Tendremos que:

XV= FSfYX/S t + SoVo + XoVo. ()

Como segn la bibliografa revisada, se tiene que Xf=

Entonces en Vf= 1.60L, se tendr:

Asimismo, Sf=? y So=0gr/l

De la ecuacin (), reemplazamos los datos obtenidos:

XV= (0.16)*(13.06)*(0.56)*(6) + 2*1

XV=9.02 gr de biomasa

Como: Vf=2L

Xf= (9.02/2)=4.51 gr/L

ASIMISMO:
Sf=?
A partir de:

Sabiendo que:

umax=0.37h-1

Yx/s= 0.56 g/g


Reemplazando:

(0.16 13.06 0.56 0.01)


=
0.16 13.06 0.56(0.37 6 1) + (0 + 2 1) 0.37

= 0.0025/
6.5 DETERMINACION DEL KLa (METODO DINAMICO DE
HUMPHREY)
tiempo %PO2 235 65 465 74
(seg) 240 65.6 470 74.1
3 91 245 65.9 475 74.1
6 91 250 66.1 480 74.2
8 90.2 255 66.3 485 74.2
11 89 260 66.6 490 74.3
15 89.5 265 67 495 74.3
20 88.8 270 68.1 500 74.4
25 88 275 69 505 74.4
30 87 280 69.7 510 74.5
35 86 285 69.6 515 74.5
40 86 290 69.7 520 74.6
45 85 295 69.7 525 74.6
50 84.5 300 69.9 530 74.6
55 83 305 70 535 74.6
60 83.1 310 70.4 540 74.7
65 82 315 70.6 545 74.8
70 81 320 70.8 550 74.9
75 80 325 71.1 555 75
80 80 330 71.3 560 75
85 79 335 71.4 565 75
90 78 340 71.7 570 75
95 77 345 71.8 575 75.1
100 76 350 72.1 580 75
105 75.9 355 72.2 585 75.1
110 75 360 72.3 590 75
115 74 365 72.4 595 75.1
120 73 370 72.4 600 75.1
125 73 375 72.5 605 75.1
130 72 380 72.5 610 75.1
135 71 385 72.6 615 75.1
140 70 390 72.6 620 75.1
145 69 395 72.7 625 75.1
150 68 400 72.7 630 75
155 65 405 72.8 635 74.9
160 63 410 73 640 74.9
175 61 415 73.1 645 74.9
180 61 420 73.2 650 74.9
185 61 425 73.3 655 74.9
190 61 430 73.4 660 74.9
195 61.8 435 73.5 665 74.9
200 62 440 73.6 670 74.8
205 62.5 445 73.7 675 74.9
210 62.8 450 73.9 680 75
215 63 455 74 685 75
220 63.6 460 74 690 75
225 64
230 64.7
695 75 925 75.2
700 75.2 930 75.1
705 75.2 935 75.2
710 75.1 940 75.2
715 75.1 945 75.2
720 75 950 75.2
725 75 955 75.3
730 75 960 75.2
735 75.1 965 75.1
740 75.9 970 75.1
745 75.9 975 75.4
750 75.9 980 75.6
755 75.8 985 75.6
760 75.7 990 75.6
765 75.7 995 75.5
770 75.6 1000 75.5
775 75.6 1005 75.5
780 75.5 1010 75.3
785 75.4 1015 75.3
790 75.4 1020 75.3
795 75.3 1025 75.3
800 75.2 1030 75.2
805 75.3 1035 75.1
810 75.3 1040 75
815 75.4 1045 75
820 75.4 1050 75
825 75.4 1055 74.9
830 75.3 1060 74.9
835 75.3 1065 74.8
840 75.2 1070 74.7
845 75.2 1075 74.8
850 75.2 1080 74.7
855 75.2 1085 74.8
860 75.1 1090 74.8
865 75.2 1095 74.9
870 75.2 1100 74.8
875 75.1
880 75.1
885 75.1
890 75.2
895 75.2
900 75.2
905 75.2
910 75.1
915 75
920 75.1
Con los valores de porcentaje del consumo de oxgeno y el tiempo en
segundos los convierto a las unidades que necesitamos.
Entonces graficamos la fase de gasificacin y desgasificacin

O2
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0.00000 0.05000 0.10000 0.15000 0.20000 0.25000 0.30000 0.35000

Reconocemos las zonas de desgasificacin y las graficamos:

DESGASIFICACION
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5 y = -5.9811x + 0.9237
0.4 R = 0.9894
0.3
0.2
0.1
0
0.00000 0.01000 0.02000 0.03000 0.04000 0.05000 0.06000

uX/Y 5.5029
As como tambin la zona de Gasificacin

GASIFICACION
0.9
0.8
0.7
0.6
y = -3.889x2 + 1.712x + 0.5737
0.5
R = 0.8774
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0.00000 0.05000 0.10000 0.15000 0.20000 0.25000 0.30000 0.35000

Con esta ecuacin polinomial la derivamos para obtener:


= 3.889 + 1.712

Y obtenemos el siguiente cuadro:

ux/Y +
tiempo (hr) O2 dC/dt dC/dt
0.00083 0.910 1.7088 7.2117
0.00167 0.910 1.7055 7.2084
0.00222 0.902 1.7034 7.2063
0.00306 0.890 1.7001 7.2030
0.00417 0.895 1.6958 7.1987
0.00556 0.888 1.6904 7.1933
0.00694 0.880 1.6850 7.1879
0.00833 0.870 1.6796 7.1825
0.00972 0.860 1.6742 7.1771
0.01111 0.860 1.6688 7.1717
0.01250 0.850 1.6634 7.1663
0.01389 0.845 1.6580 7.1609
0.01528 0.830 1.6526 7.1555
0.01667 0.831 1.6472 7.1501
0.01806 0.820 1.6418 7.1447
0.01944 0.810 1.6364 7.1393
0.02083 0.800 1.6310 7.1339
0.02222 0.800 1.6256 7.1285
0.02361 0.790 1.6202 7.1231
0.02500 0.780 1.6148 7.1177
0.02639 0.770 1.6094 7.1123
0.02778 0.760 1.6040 7.1069
0.02917 0.759 1.5986 7.1015
0.03056 0.750 1.5932 7.0961
0.03194 0.740 1.5878 7.0907
0.03333 0.730 1.5824 7.0853
0.03472 0.730 1.5770 7.0799
0.03611 0.720 1.5716 7.0745
0.03750 0.710 1.5662 7.0691
0.03889 0.700 1.5608 7.0637
0.04028 0.690 1.5554 7.0583
0.04167 0.680 1.5500 7.0529
0.04306 0.650 1.5446 7.0475
0.04444 0.630 1.5392 7.0421
0.04861 0.610 1.5230 7.0259
0.05000 0.610 1.5176 7.0205
0.05139 0.610 1.5121 7.0150
0.05278 0.610 1.5067 7.0096
0.05417 0.618 1.5013 7.0042
0.05556 0.620 1.4959 6.9988
0.05694 0.625 1.4905 6.9934
0.05833 0.628 1.4851 6.9880
0.05972 0.630 1.4797 6.9826
0.06111 0.636 1.4743 6.9772
0.06250 0.640 1.4689 6.9718
0.06389 0.647 1.4635 6.9664
0.06528 0.650 1.4581 6.9610
0.06667 0.656 1.4527 6.9556
0.06806 0.659 1.4473 6.9502
0.06944 0.661 1.4419 6.9448
0.07083 0.663 1.4365 6.9394
0.07222 0.666 1.4311 6.9340
0.07361 0.670 1.4257 6.9286
0.07500 0.681 1.4203 6.9232
0.07639 0.690 1.4149 6.9178
0.07778 0.697 1.4095 6.9124
0.07917 0.696 1.4041 6.9070
0.08056 0.697 1.3987 6.9016
0.08194 0.697 1.3933 6.8962
0.08333 0.699 1.3879 6.8908
0.08472 0.700 1.3825 6.8854
0.08611 0.704 1.3771 6.8800
0.08750 0.706 1.3717 6.8746
0.08889 0.708 1.3663 6.8692
0.09028 0.711 1.3609 6.8638
0.09167 0.713 1.3555 6.8584
0.09306 0.714 1.3501 6.8530
0.09444 0.717 1.3447 6.8476
0.09583 0.718 1.3393 6.8422
0.09722 0.721 1.3339 6.8368
0.09861 0.722 1.3285 6.8314
0.10000 0.723 1.3231 6.8260
0.10139 0.724 1.3177 6.8206
0.10278 0.724 1.3123 6.8152
0.10417 0.725 1.3069 6.8098
0.10556 0.725 1.3015 6.8044
0.10694 0.726 1.2961 6.7990
0.10833 0.726 1.2907 6.7936
0.10972 0.727 1.2853 6.7882
0.11111 0.727 1.2799 6.7828
0.11250 0.728 1.2745 6.7774
0.11389 0.730 1.2691 6.7720
0.11528 0.731 1.2637 6.7666
0.11667 0.732 1.2583 6.7612
0.11806 0.733 1.2529 6.7558
0.11944 0.734 1.2475 6.7504
0.12083 0.735 1.2421 6.7450
0.12222 0.736 1.2367 6.7396
0.12361 0.737 1.2313 6.7342
0.12500 0.739 1.2259 6.7288
0.12639 0.740 1.2205 6.7234
0.12778 0.740 1.2151 6.7180
0.12917 0.740 1.2097 6.7126
0.13056 0.741 1.2043 6.7072
0.13194 0.741 1.1989 6.7018
0.13333 0.742 1.1935 6.6964
0.13472 0.742 1.1881 6.6910
0.13611 0.743 1.1827 6.6856
0.13750 0.743 1.1773 6.6802
0.13889 0.744 1.1719 6.6748
0.14028 0.744 1.1665 6.6694
0.14167 0.745 1.1611 6.6640
0.14306 0.745 1.1557 6.6586
0.14444 0.746 1.1503 6.6532
0.14583 0.746 1.1449 6.6478
0.14722 0.746 1.1395 6.6424
0.14861 0.746 1.1341 6.6370
0.15000 0.747 1.1287 6.6316
0.15139 0.748 1.1232 6.6261
0.15278 0.749 1.1178 6.6207
0.15417 0.750 1.1124 6.6153
0.15556 0.750 1.1070 6.6099
0.15694 0.750 1.1016 6.6045
0.15833 0.750 1.0962 6.5991
0.15972 0.751 1.0908 6.5937
0.16111 0.750 1.0854 6.5883
0.16250 0.751 1.0800 6.5829
0.16389 0.750 1.0746 6.5775
0.16528 0.751 1.0692 6.5721
0.16667 0.751 1.0638 6.5667
0.16806 0.751 1.0584 6.5613
0.16944 0.751 1.0530 6.5559
0.17083 0.751 1.0476 6.5505
0.17222 0.751 1.0422 6.5451
0.17361 0.751 1.0368 6.5397
0.17500 0.750 1.0314 6.5343
0.17639 0.749 1.0260 6.5289
0.17778 0.749 1.0206 6.5235
0.17917 0.749 1.0152 6.5181
0.18056 0.749 1.0098 6.5127
0.18194 0.749 1.0044 6.5073
0.18333 0.749 0.9990 6.5019
0.18472 0.749 0.9936 6.4965
0.18611 0.748 0.9882 6.4911
0.18750 0.749 0.9828 6.4857
0.18889 0.750 0.9774 6.4803
0.19028 0.750 0.9720 6.4749
0.19167 0.750 0.9666 6.4695
0.19306 0.750 0.9612 6.4641
0.19444 0.752 0.9558 6.4587
0.19583 0.752 0.9504 6.4533
0.19722 0.751 0.9450 6.4479
0.19861 0.751 0.9396 6.4425
0.20000 0.750 0.9342 6.4371
0.20139 0.750 0.9288 6.4317
0.20278 0.750 0.9234 6.4263
0.20417 0.751 0.9180 6.4209
0.20556 0.759 0.9126 6.4155
0.20694 0.759 0.9072 6.4101
0.20833 0.759 0.9018 6.4047
0.20972 0.758 0.8964 6.3993
0.21111 0.757 0.8910 6.3939
0.21250 0.757 0.8856 6.3885
0.21389 0.756 0.8802 6.3831
0.21528 0.756 0.8748 6.3777
0.21667 0.755 0.8694 6.3723
0.21806 0.754 0.8640 6.3669
0.21944 0.754 0.8586 6.3615
0.22083 0.753 0.8532 6.3561
0.22222 0.752 0.8478 6.3507
0.22361 0.753 0.8424 6.3453
0.22500 0.753 0.8370 6.3399
0.22639 0.754 0.8316 6.3345
0.22778 0.754 0.8262 6.3291
0.22917 0.754 0.8208 6.3237
0.23056 0.753 0.8154 6.3183
0.23194 0.753 0.8100 6.3129
0.23333 0.752 0.8046 6.3075
0.23472 0.752 0.7992 6.3021
0.23611 0.752 0.7938 6.2967
0.23750 0.752 0.7884 6.2913
0.23889 0.751 0.7830 6.2859
0.24028 0.752 0.7776 6.2805
0.24167 0.752 0.7722 6.2751
0.24306 0.751 0.7668 6.2697
0.24444 0.751 0.7614 6.2643
0.24583 0.751 0.7560 6.2589
0.24722 0.752 0.7506 6.2535
0.24861 0.752 0.7452 6.2481
0.25000 0.752 0.7398 6.2427
0.25139 0.752 0.7343 6.2372
0.25278 0.751 0.7289 6.2318
0.25417 0.750 0.7235 6.2264
0.25556 0.751 0.7181 6.2210
0.25694 0.752 0.7127 6.2156
0.25833 0.751 0.7073 6.2102
0.25972 0.752 0.7019 6.2048
0.26111 0.752 0.6965 6.1994
0.26250 0.752 0.6911 6.1940
0.26389 0.752 0.6857 6.1886
0.26528 0.753 0.6803 6.1832
0.26667 0.752 0.6749 6.1778
0.26806 0.751 0.6695 6.1724
0.26944 0.751 0.6641 6.1670
0.27083 0.754 0.6587 6.1616
0.27222 0.756 0.6533 6.1562
0.27361 0.756 0.6479 6.1508
0.27500 0.756 0.6425 6.1454
0.27639 0.755 0.6371 6.1400
0.27778 0.755 0.6317 6.1346
0.27917 0.755 0.6263 6.1292
0.28056 0.753 0.6209 6.1238
0.28194 0.753 0.6155 6.1184
0.28333 0.753 0.6101 6.1130
0.28472 0.753 0.6047 6.1076
0.28611 0.752 0.5993 6.1022
0.28750 0.751 0.5939 6.0968
0.28889 0.750 0.5885 6.0914
0.29028 0.750 0.5831 6.0860
0.29167 0.750 0.5777 6.0806
0.29306 0.749 0.5723 6.0752
0.29444 0.749 0.5669 6.0698
0.29583 0.748 0.5615 6.0644
0.29722 0.747 0.5561 6.0590
0.29861 0.748 0.5507 6.0536
0.30000 0.747 0.5453 6.0482
0.30139 0.748 0.5399 6.0428
0.30278 0.748 0.5345 6.0374
0.30417 0.749 0.5291 6.0320
0.30556 0.748 0.5237 6.0266

Determinando as la ltima grafica de donde obtendremos el valor

ux/Y + dC/dt
7.4000
7.2000
1
7.0000 y = -3.889x + 7.2149 = 3.889
6.8000 R = 1

6.6000
= 0.2571
6.4000
6.2000
6.0000
5.8000
0.00000 0.05000 0.10000 0.15000 0.20000 0.25000 0.30000 0.35000
VII. DISCUSION

El metabolismo de Saccharomyces cerevisiae est fuertemente


influenciado por las concentraciones de glucosa y de oxgeno en el medio
de cultivo. El crecimiento de la levadura, y por lo tanto la mayor o menor
produccin de biomasa, responden a la presencia del oxgeno y la glucosa
en el medio de cultivo del siguiente modo: manteniendo concentraciones
de oxgeno disuelto relativamente elevadas en el medio de
cultivo(mediante biorreactores con un sistema eficiente de transferencia
de oxigeno), y controlando la glucosa para conservarla a baja
concentracin en el medio lquido, se obtiene alta concentraciones de
biomasa del cultivo y produccin reducida de etanol, en condiciones de
cultivo de concentraciones importantes de glucosa y suministro de
oxgeno limitado, el producto principal del cultivo celular es el etanol, con
formacin escasa de biomasa. Por otro lado si se activa el rgimen
metablico denominado metabolismo oxidativo, lo que implica el consumo
de oxigeno; la produccin de biomasa aumenta significativamente
respecto al metabolismo oxidativo-reductor, pero su produce poco etanol.
(Wang H., 1979). Sin embargo, Saccharomyces cerevisiae produce etanol
an en presencia de oxgeno si la concentracin de glucosa en el medio
de cultivo es relativamente alta. (Wang H., 1979). En nuestra experiencia
realizada utilizamos como sustrato limitante sacarosa lo cual contiene
glucosa ms fructosa en su composicin y el porcentaje de oxgeno
disuelto disminuy relativamente con el paso del tiempo llegando a 0%
oxgeno disuelto a lo que implica tericamente que hubo un aumento en
la produccin de biomasa y una produccin mnima de etanol, pero no
pudimos comprobar si hubo una produccin de etanol en la experiencia
realizada debido a que no se pudo realizar el anlisis de produccin de
etanol en IITA.

La temperatura en las fermentaciones aerbicas afecta tanto la solubilidad


del oxgeno C*LA cmo al coeficiente de transferencia de masa kLa-
Un aumento de temperatura produce una disminucin drstica de C*LA y,
por tanto, de la fuerza impulsora de la transferencia de materia (C*LA - CLA).
Al mismo tiempo aumenta la difusividad de oxgeno en la pelcula liquida
que rodea las burbujas, lo que produce un incremento en k L. (Hussain,
2002)En la experiencia realizada la temperatura fue de 35C lo cual se
mantuvo constante a lo largo del tiempo que se realiz la prctica.

En las fermentaciones, generalmente hay un valor de pH del medio para


el cual la velocidad de un bioproceso es mxima. Este vara entre 6,5 y
7,5 para bacteria, entre 5 y 7 para mohos y entre 4 y5 para levaduras.
Valores de pH menores que l mximo estimulan la velocidad y valores
mayores la inhiben. (T, 1995)En nuestra experiencia realizada utilizamos
la cepa Saccharomyces cerevisiae que corresponde a una levadura, para
lo cual su pH vara entre 4 y 5 pero en la prctica realizada esto fue de
2,66 y 6,90. Lo cual comenz con un pH de 4,5 y termin con un pH de
2,66 en el transcurso de 10h que dur la prctica realizada.

En la experiencia realizada hubo una disminucin del pH esto se produjo


debido a un aumento de produccin de cidos formados durante el
proceso, puesto que las clulas de las levaduras, toman los nitrgenos de
los aminocidos y estos pierden as su carcter anftero, trayendo como
consecuencia una disminucin del pH. (J, 2004)
VIII. CONCLUSIONES

Se dise el medio de cultivo con los requerimientos mnimos de nutrientes


el cual debe poseer una fuente de carbono, fuente de nitrgeno y sales en
cantidades adecuadas para as satisfacer los requerimientos nutricionales
de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126.

Se logr la activacin celular permitiendo as, poner en funcionamiento


nuevamente todas las actividades metablicas de la levadura
Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126.y con el desarrollo del inculo se
alcanz la suficiente biomasa para iniciar la fermentacin.

En la cintica de biomasa no logramos obtener resultados tan favorables ya


que no se puede identificar con exactitud las fases del crecimiento de la
Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126. pero al trmino de la fermentacin
obtuvimos hasta 0. 721657 g/l, a esto se le puede agregar la velocidad
mxima de crecimiento de 0.0.77 h-1 que comparando con bibliografa
podemos decir es relativamente alto.
Podemos concluir que nuestro microorganismo en concentraciones de
oxgeno disuelto altas se tiene una mayor concentracin y crecimiento de
biomasa; pero al disminuir el %OD por el aumento de biomasa entran a una
fase estacionaria incluso pudiendo llegar a la fase muerta sin embargo
algunos microorganismos quedan vivos y estos se adecuan a las
condiciones de OD bajo, lo cual podemos demostrar con la grfica obtenida.

Se procedi a la determinacin de la cintica de consumo de la fuente de


Carbono que es la sacarosa lo cual observamos en las cuatro primeras
horas hay un decaimiento por el consumo rpido de sustrato, pero tambin
se observa que le microorganismo sigue creciendo, esto se debe al extracto
de levadura, una fuente rica en aminocidos, vitaminas, minerales.

Se logr la determinacin de uno de los importantes parmetros de


crecimiento celular en cultivo por lote umax = 0.4197 h-1, adems de
td=1.962hr. Al igual que la productividad mxima de biomasa que fue de

=0.3805gr/h. y el rendimiento / = 0.25 . y en cultivo por lote
alimentado umax = 0.37 h-1 h-1, adems de td=1.962hr, Al igual que la
productividad mxima de biomasa que fue de =0.1g biomasa/h. y el

rendimiento / = 1.073 .

BIBLIOGRAFA

Hussain, H. a. (2002). Comparative evaluation of various schemes for fed-


batch fermentation. Bioprocesos and biosystems engineering, XXIV, 309-
318.

J, A. (2004). Produccin de biomasa de Saccharomyces cerevisiae cells.


Biochem Eng., 120-140.

T, D. (1995). Introduccin a la ingeniera bioquimica. Colombia:


Publicacin Universidad Nacional de Colombio.

Wang H., C. C. (1979). Computer control of baker`s yeast. Biotecnology


and bioengineering(21), 975-995.
IX. ANEXOS

9.1 CURVA DE CALIBRACIN DE BIOMASA PARA MATRAZ


Debido a errores en los clculos durante la prctica realizada para la curva
de calibracin de biomasa, tomamos como referencia la curva ya hecha del
caldo de clulas de pichia stipitis NRRL 7124.

Volumen de muestra 8 ml diluido 1.8 Caldo de clulas Saccharomyces Cerevisiae


ATCC 4126, crecidas en un medio de activacin de 20 ml de volumen, fermentado
en matraz de 125 ml

g de
Ncapacho peso (g) peso+celulas X(g/l)
celulas
1 0.1907 0.1958 0.0051 0.6375
2 0.1817 0.1879 0.0062 0.775
3 0.2424 0.2487 0.0063 0.7875
X prom. (g/l) 0.73333333

x(g/L) ABS640
0.73 0.962
0.65 0.854
0.47 0.613
0.36 0.475
0.15 0.200
0.12 0.157
0.00 0.000
CURVA DE CALIBRACION BIOMASA (ABS VS X)
1.200

1.000 y = 1.3178x + 3E-16


R = 1
0.800

0.600

0.400

0.200

0.000
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80

PENDIENTE 1.3178
INTERSECTO 3E-16

_
= =
.

OBTECIN DE LOS DATOS DE LA CINTICA

tiempo ABS (640


N Hora DESCRIPCION PH %OD
(hr) nm)
1 09:51 0 0.376 4.4 100
2 10:51 1 0.521 4.16 64.5
3 11:51 2 0.762 4.1 54.5
4 12:51 3 0.723 dilucion 1:2 3.95 36.6
5 01:40 4 0.882 dilucion 1:2 3.9 10.9
9.2 DETERMINACION DEL CONSUMO DE SACAROSA

Curva de Calibracin para determinacin de Azucares Reductores


De una solucin Estandar de 2g/L

N Tubo Sol. Estan. Agua Dest. (ml) Concentracin (g/L) Abs.


(ml) (540nm)
1 2 0 2 0.335
2 1.75 0.25 1.75 0.310
3 1.5 0.5 1.5 0.249
4 1.25 0.75 1.25 0.229
5 1 1 1 0.167
6 0.75 1.25 0.75 0.121
7 0.5 1.5 0.5 0.090
8 - blanco 0 2 0 0.000

CURVA DE CALIBRACION DNS (ABS vs


Azucares reductores)
0.400
0.350
y = 0.1711x + 0.0005
0.300
R = 0.9941
0.250
0.200
0.150
0.100
0.050
0.000
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

Con esta grfica hallamos la siguiente ecuacin:

= . + . = . [ ] + .
El cual nos permitir encontrar la
.
concentracin de sacarosa [ ]=
consumida durante el tiempo de .
fermentacin.