XVIII Congresso Brasileiro de Automtica / 12 a 16-setembro-2010, Bonito-MS

TECNICAS ALTERNATIVAS PARA ANALISE DO SINAL DE BIOSENSORES

BASEADOS EM RESSONANCIA DE PLASMA DE SUPERFICIE

Carlos Alberto de Souza Filho, Antonio Marcus Nogueira Lima, Helmut Neff

Departamento de Engenharia Eletrica
Centro de Engenharia Eletrica e Informatica
Campina Grande, Paraba, Brasil

CETENE/LINCS
PE,Brasil

Emails: calberto@ee.ufcg.edu.br, amnlima@ee.ufcg.edu.br, heneff@web.de

Abstract This paper proposes the use of new features for analyzing the SPR signal (SPRsig). The mor-
phology analysis of the SPRsig by measuring and asymmetry G is proposed. The energy can also be used to
analyze the SPRsig. Thus, the feature is obtained directly from the raw signal, avoiding the calibration step
of reference signal as well as the need for dividing the measured data by the reference to get the SPR curve.
Besides these features, the noise of the minimum value of the SPR curve is included as an important feature for
measurements based on SPR biosensors.
Keywords biosensor, Surface Plasmon Resonance, Morphology Analysis, line broadening, asymmetry

Resumo Este artigo propoe o uso de novas caractersticas para analisar o sinal dos biosensores baseados
em ressonancia de superfcie de plasma (SPR). Uma analise morfologica, atraves da medicao da largura da
curva e da assimetria G, e proposta como alternativa a convencional analise do angulo ou da frequencia de
ressonancia. A energia do sinal bruto tambem pode ser utilizada, apresentando a vantagem de evitar a etapa de
calibracao do sinal de referencia e diminuir a complexidade computacional. O rudo sobre o angulo de ressonancia
e acrescentado como outra possibilidade para medicao em biosensores SPR.

Keywords biosensores, Ressonancia de Plasma de Superfcie, analise morfologica, largura, assimetria.

1 Introducao funcionalidades de biosensores baseados em

Biosensores que utilizam o princpio da ressonan-
cia de plasma (SPR) usam a condicao de ressonan-
cia para obter a informacao sobre as substancias
absorvidas. Outra alternativa e a utilizacao de
modelos matematicos para estimar, atraves da
curva SPR obtida experimentalmente, os parame-
tros da espessura da camada d3 e o ndice de re-
fracao da substancia analisada n3 .
Nos biosensores SPR, que utilizam a interro-
gacao angular, a curva SPR obtida e uma funcao
da intensidade do sinal de luz refletida pelo an-
gulo de incidencia do feixe de luz. A curva apre-
senta um decaimento que atinge seu mnimo no
angulo de ressonancia res . Atraves do angulo de
ressonancia encontra-se o valor do ndice de re-
fracao efetivo, que geralmente e o unico parametro
fornecido pelos biosensores existentes. Alguns
biosensores sao capazes de fornecer o ndice de re-
fracao absoluto e a espessura da camada formada
pela substancia analisada.
A forma da curva SPR tambem e modifi-
cada de acordo com a substancia a ser medida,
porem, ainda e pouco utilizada. Existem estu-
dos que demonstram que a largura da curva
e afetada pela espessura da camada de ouro do
biochip (Neff et al., 2006). O valor de tambem
pode ser utilizado, em conjunto com a variacao
do angulo de ressonancia, para estimar o valor do
ndice de refracao e da espessura da camada sen-
svel (Koutsiuobras et al., 2007).
Este trabalho propoe a expansao das
Ressonancia de Superfcie de Plasma, atraves
da inclusao de novas tecnicas para a analise
do sinal SPR obtido. A largura da curva e
utilizada para medir a evolucao temporal das
variacoes existentes na camada sensvel. Sao
apresentadas novas alternativas para medicao
como a monitoracao do valor da assimetria e a
variacao do rudo no angulo de ressonancia. A
energia do sinal bruto de imagem e outra forma
analisada para evolucao temporal.
Foi realizado um estudo comparativo anali-
sando a sensibilidade com relacao ao ndice de re-
fracao e a espessura da camada sensvel, alem da
variacao com relacao a temperatura das tecnicas
propostas.
Os novos parametros foram utilizados para
auxiliar na discriminacao de ligacoes reversveis e
irreversveis de protenas na formacao da monoca-
mada do biosensor.
2 Ressonancia de Plasma de Superfcie
Biosensores SPR utilizam um campo evanescente
de um modo especial de propagacao do campo
eletromagnetico em uma interface entre um metal
e um dieletrico (Plasma de Superfcie) para medir
mudancas no ndice de refracao do dieletrico nas
proximidades da interface (Piliarik and Homola,
2009)
O biosensor utilizado foi o CAMBIO
(de Souza Filho, 2008) ilustrado pelo diagrama
da Figura 1. Este biosensor utiliza o princpio

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de reflexao interna total e modo de interrogacao q

angular. A luz gerada por um diodo Laser, com n2j (n1 sen(1 ))2
comprimento de onda de = 670nm, incide qj = (4)
perpendicularmente no filme metalico de ouro n2j
com espessura d2 = 50nm. O elemento de 2 q 2
acoplamento otico de difracao(DOCE), que forma dj nj (n1 sen(1 ))2
j = (5)

o substrato do meio 1, funciona como um guia de
onda que direciona a luz para regiao central onde Os valores utilizados nas equacoes 3 a 5 sao
esta localizado o elemento sensor. A luz refletida referentes a luz incidente e as camadas do trans-
tambem sai do DOCE perpendicular ao filme dutor ilustrada na Figura 1, de forma que:
metalico e e captada por uma camera CMOS
nj = njre + injim e o ndice de refracao com-
unidimensional de 1024 pixels.
plexo do meio j
No ponto de incidencia do feixe de luz parte
da radiacao penetra no meio 3, criando um campo j e o angulo de incidencia da onda de luz que
eletrico evanescente com amplitude que cai expo- se propaga pelo meio j
nencialmente com a distancia de penetracao. O
campo eletrico excita os eletrons livres do metal e e o comprimento de onda da luz incidente
criando uma onda de superfcie de plasma (SPW) no vacuo.
que se propaga ao longo do filme. A criacao da
SPW provoca uma transferencia de energia do
3 Definicao dos Parametros
feixe de luz para a onda, que pode ser verifi-
cada como um decaimento na intensidade de luz 3.1 Analise Morfologica da Curva SPR
refletida pelo filme. A SPW e criada quando a
componente horizontal do feixe de luz incidente e A analise morfologica da curva SPR, que e pro-
igual ao vetor de onda da SPW. Na interrogacao posta como alternativa a medicao do angulo de
angular este ponto e denominado de angulo de ressonancia, procura identificar alteracoes no for-
ressonancia res . Mudancas na interface causadas mato da curva em funcao de variacoes na camada
por alteracoes da espessura d3 ou do ndice de re- sensvel. A analise proposta e realizada atraves do
fracao n3 provocam um deslocamento do angulo monitoramento dos parametros da largura e da
de ressoancia, permitindo identificar variacoes na assimetria G ilustrados na Figura 2.
substancia analisada.
1

4 n4re d4
3 n3re+in3im d3 0.9
2 n2re+in2im d2
DOCE 1 =+
n1re d1 0.8
G= /
Intensidade

Ajuste Polinomial
0.65

0.7
0.6

qres 0.55
0.6
0.5

0.45
0.5

Res
0.4
67 67.5 68 68.5 69 69.5 70
Diodo Laser Cmera CMOS Curva SPR 0.4
60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80
()

Figura 1: Estrutura dos componentes e Modelo de

Camadas do Biosensor CAMBIO
Figura 2: Caractersticas da Morfologia da Curva
O CAMBIO pode ser representado atraves do SPR
modelo de 4 camadas ilustrado na Figura 1. O co-
eficiente de reflexao pode ser calculado atraves da A largura da curva e calculada no valor de in-
equacao de Fresnel na formulacao matricial (Neff tensidade media representado pela reta da Figura
et al., 2006) exposta na equacao 1. 2. Este valor e obtido atraves do valor medio entre
o ponto maximo e o ponto mnimo da curva SPR.
(m11 + m12 qm )q1 (m21 + m22 )qm O valor de e entao obtido atraves da distancia
r= (1) entre a borda esquerda e a borda direita da curva.
(m11 + m12 qm )q1 + (m21 + m22 )qm
Para encontrar a assimetria G e preciso ini-
sendo, cialmente determinar a abscissa do valor mnimo
da curva que corresponde ao angulo de ressonancia

m11 m12 res . Em seguida e determinada a distancia entre
Mtot = M2 M3 . . . Mm1 = (2) o mnimo e a borda esquerda da curva SPR ,
m21 m22
assim como a distancia entre o mnimo e a borda
" # direita . Estes valores sao obtidos no valor de
i.sen(j )
cos(j ) intensidade media da curva. O valor da assimetria
Mj = qj (3)
i.qj sen(j ) cos(j ) e definido atraves da razao entre as duas metades

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da curva em relacao ao ponto mnimo, podendo
ser calculado atraves das equacoes 6 e 7
GR =
GL =
Existe uma relacao direta entre os valores de
e G. A largura da curva pode ser determi-
nada em funcao dos valores de e de de acordo
com a equacao 8. Utilizando-se as equacoes 6 e 8
encontra-se a relacao entre a assimetria e a largura
da curva atraves da equacao 9.
=+ (8)
GR = 1 (9)
3.2 Energia e Rudo
Variacoes na camada sensvel provocam um deslo-
camento no angulo de ressonancia assim como
tambem uma variacao no decaimento da curva.
Desta forma a area total da curva tambem e al-
terada. O aumento da espessura d3 assim como
mudancas no valor do ndice de refracao da ca-
mada n3 , fazem com que a energia absorvida para
criar a onda de superfcie de plasma tambem seja
modificada. Isto permite medir variacoes da ca-
mada sensvel atraves da energia do sinal de luz
refletido.
A energia total do sinal bruto obtido, denom-
inada aqui por Esig e definida como sendo o so-
matorio de todos os pontos do sinal de imagem
para a substancia analisada. A determinacao do
valor de Esig nao necessita do sinal de referencia,
como acontece no calculo do angulo de ressonan-
cia, evitando a etapa de calibracao e tornando
mais rapido o processamento. Uma soma ponde-
rada de pontos ja foi utilizada para gerar um sinal
de tensao correlacionado ao ndice de refracao e
concentracao do analito (Hansen et al., 2005).
Alem dos parametros da morfologia da curva
e da energia e proposto o monitoramento do
rudo sobre o pixel correspondente ao angulo de
ressonancia. Cada amostra do sinal da curva SPR
e obtida atraves da media de quadros do sinal de
imagem. A partir desta media e calculado o valor
do angulo de ressonancia res . O rudo e entao
calculado pelo desvio padrao do valor do pixel,
correspondente ao angulo de ressonancia, para os
quadros utilizados na obtencao da curva SPR.
4 Analise da Sensibilidade
Para avaliar a utilizacao de , G e Esig na medicao
de uma substancia com biosensores SPR, foi rea-
lizada uma analise da sensibilidade destes para-
metros em funcao do ndice de refracao n3 , da
espessura da camada sensvel d3 e da variacao em
relacao a temperatura. O sensor utilizado foi o
CAMBIO simulado com o modelo de 4 camadas
atraves da equacao 1.
(6)
4.1 Variacao com o Indice de Refracao
(7)
Para avaliar a sensibilidade dos parametros em re-
lacao a variacao do ndice de refracao, o valor da
espessura da camada sensvel d3 foi mantido cons-
tante em 10nm. Para cada ndice de refracao n3 ,
variando dentro da faixa de 1, 33 a 1, 7 com um
incremento de 1 103 , obteve-se uma curva SPR
atraves das equacoes de Fresnel. Utilizando-se a
curva obtida foram calculados os valores de res ,
, G e Esig .
Como os parametros apresentam valores em
ordem de grandezas diferentes, foi realizada uma
normalizacao para permitir uma comparacao en-
tre eles. Cada parametro foi normalizado em
funcao do seu primeiro valor, que e referente ao
ndice de refracao de 1, 33, para comparar a sen-
sibilidade relativa dos parametros. O comporta-
mento obtido para os valores normalizados estao
ilustrados na Figura 3.
1.4
G E
1.35 res R sig
resN , N, Assimetria GN, Energia EsigN
1.3
1.25
1.2
1.15
1.1
1.05
1
0.95
0.9
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
Variao do ndice de Refrao da camada sensvel n3
0.35 0.4
Figura 3: Variacao dos parametros em funcao do
ndice de refracao da camada sensvel
Os parametros apresentaram um taxa de vari-
acao relativa de res = 1, 466 104 , =
1, 1 103 , GR = 1.0319 104 e Esig =
1.7365 104 . A largura foi o parametro mais
sensvel a variacao do ndice de refracao, apresen-
tando maior taxa de variacao relativa. A ener-
gia do sinal Esig foi o segundo parametro mais
sensvel seguido por res e por ultimo GR . A as-
simetria e a energia apresentaram taxa de variacao
negativa indicando que com o aumento do ndice
de refracao existe um decrescimo nos valores de
GR e Esig .
Os coeficientes de correlacao entre os para-
metros res e em relacao ao ndice de refracao
foram unitarios. Para a assimetria GR o valor foi
de 0, 9333 e para Esig de 0, 999. Estes valo-
res indicam que todos os parametros podem ser
utilizados para detectar variacoes no ndice de re-
fracao da camada sensvel.
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4.2 Variacao com a Largura
A sensibilidade dos parametros em relacao a vari-
acao da espessura foi analisada para um ndice
de refracao de 1, 45, que corresponde ao valor do
ndice de refracao da protena BSA (Bovine Serum
Albumin). O BSA foi escolhido por ser o elemento
que forma a primeira camada do biocatalizador.
Os valores da espessura foram analisados no in-
tervalo de 3 109 m a 17 109 m com incre-
mentos de 1 109 m. Para cada valor de d3 , foi
obtida a curva SPR e calculados os parametros ,
G, Esig e res . Os parametros foram normaliza-
dos em funcao do primeiro valor apresentando um
comportamento ilustrado na Figura 4.
1.25
resN , N, Assimetria GN, Energia EsigN
1.2
1.15
1.1
1.05
1
0.95
2 4
Figura 4: Variacao dos parametros em funcao da
espessura da camada sensvel
A largura da curva e o angulo de ressonancia
apresentam uma caracterstica de comportamento
linear em relacao a espessura, com uma taxa de
variacao positiva. A assimetria GR e a energia do
sinal Esig , da mesma forma como na variacao do
ndice de refracao, assumem um comportamento
com taxa de variacao negativa em relacao a espes-
sura.
As taxas de variacao relativa para cada 1nm
da espessura sao res = 0, 0018, = 0, 012,
GR = 0, 0011 e Esig = 0.0021. Isto indica
que o parametro e o mais sensvel em relacao a
variacao da espessura, seguido de Esig ,res e por
ultimo GR .
Os coeficientes de correlacao de e res em re-
lacao a espessura apresentaram valores unitarios,
enquanto que para a assimetria GR o valor foi de
0, 9725 e para Esig foi de 0.9997. Isto demons-
tra que todos os parametros podem ser utilizados
com precisao para medicao de d3 .
4.3 Sensibilidade com Relacao a Temperatura
A temperatura e um fator que afeta fortemente
o desempenho de um biosensor, podendo ser o
limitante para a precisao do equipamento. O seu
valor influencia no nvel de potencia otica do diodo
laser, no rudo termico e na sensibilidade do foto
detector, nos componentes oticos existentes, no
ndice de refracao dos materiais e ate mesmo na
fixacao de substancias sobre a camada sensvel. O
efeito da dilatacao do biochip tambem pode provo-
car um deslocamento na curva SPR e consequente-
mente no angulo de ressonancia calculado.
Existem estudos que demonstram a influen-
cia da temperatura sobre a resposta do biosen-
sor SPR. A sensibilidade de um biosensor SPR
com interrogacao angular em relacao a tempera-
tura pode chegar a 1, 4 104 RIU/ C. Pode-se
encontrar na literatura tecnicas para minimizar
ou compensar o efeito da temperatura . A mais
comum e a utilizacao da medicao do sinal de um
canal de referencia em paralelo com o canal sen-
sor. Como a temperatura afeta os dois canais,
realiza-se a diferenca entre a resposta do canal sen-
sor e o do canal de referencia para retirar o efeito
da temperatura(Naimushin et al., 2003). Outra
res
GR Esig
possibilidade e a utilizacao da medicao do sinal
em valores inferiores ao angulo crtico (Chinowsky
et al., 1999).
Para avaliar o efeito da temperatura sobre a
forma da curva SPR foi considerado a influencia
sobre o valor ndice de refracao do metal n2 , do
substrato n1 e da agua n3 . Os efeitos sobre a fonte
de luz, o foto detector e sobre os componentes oti-
cos nao foram includos nesta analise.
6 8 10 12 14 16 18 Os valores dos ndices de refracao foram cal-
Espessura d3 (nm)
culados atraves de polinomios interpolados da res-
posta de cada material em funcao da tempera-
tura (Moreira et al., 2008). O metal apresenta
uma funcao dieletrica complexa, de forma que foi
utilizado um polinomio para a parte real mr e
outro para a parte imaginaria mi de acordo com
as equacoes 10 e 11.
mr = a4 T 4 + a3 T 3 + a2 T 2 + a1 T 1 + a0 (10)
mi = b4 T 4 + b3 T 3 + b2 T 2 + b1 T 1 + b0 (11)
sendo,
a4 = 1, 9895 1014 , a3 = 6, 4089 1011 ,
a2 = 4, 2999 107 , a1 = 7, 4367 104 ,
a0 = 15, 3332
b4 = 1.3989 1012 , b3 = 2, 3246 109 ,
b2 = 1, 3486106 , b1 = 0, 0022, a4 = 0, 2287
O ndice de refracao do substrato foi calcu-
lado atraves do polinomio da equacao 12. Os va-
lores dos coeficientes sao: c4 = 2, 1091 1022 ,
c3 = 5, 8455 1012 , c2 = 1, 1017 108 ,
c1 = 3, 4756 106 , c0 = 1, 5142
n1 = c4 T 4 + c3 T 3 + c2 T 2 + c1 T 1 + c0 (12)
O analito utilizado foi a agua com ndice de
refracao calculado atraves do polinomio descrito
pelo equacao 13. Os valores dos coeficientes sao:
d4 = 4, 1330 1011 , d3 = 5, 8331 108 , d2 =
3, 1701 105 , d1 = 0, 0076, d0 = 0, 6560
4212
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4
x 10
14
res / T
12
/T
4 3 2 1
n3 = d4 T + d3 T + d2 T + d1 T + d0 (13) 10 GR / T

8 E /T
sig

A faixa de variacao da temperatura utilizada

6

para analise foi de 273, 16K a 376, 16K, com um 4

incremento de 1K. Para cada valor de tempe- 2

ratura foram calculados os respectivos ndices de 0

refracao atraves das equacoes 10 a 13. Estes valo- 2

res foram utilizados nas equacoes de Fresnel para 4

obter a curva SPR correspondente ao valor de 6

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temperatura (C)
temperatura. Com a curva foram calculados os
valores de res , , G e Esig .
Figura 6: Taxa de variacao dos parametros res ,
Para comparar a sensibilidade em relacao a
, GR , Esig em funcao da temperatura
temperatura realizou-se a normalizacao dos para-
metros em funcao de seus valores na temperatura
de 25 C. O comportamento dos parametros em
5 Resultados Experimentais
relacao a temperatura esta ilustrado na Figura 5.
O biosensor utilizado para realizacao dos ex-
1.07
perimentos foi desenvolvido anteriormente
1.06
1.005

res
(de Souza Filho, 2008) e utiliza o princpio
1.05
1 da interrogacao angular. Inicialmente foram
GR

1.04
0.995 Esig
realizados sucessivos ciclos de limpeza atraves da
passagem de hipoclorito seguido de agua, para
1.03 0.99
20 25
Temperatura (C)
30
remover impurezas presentes no biochip. Em
seguida obteve-se o sinal de referencia sem a
1.02

1.01
1
0.99
0.98
0.97
0 10 20 30 40 50 60
Temperatura (C)
Figura 5: Variacao relativa dos parametros res ,
, GR , Esig em funcao da temperatura
No intervalo entre 20 C e 30 C todos os para-
metros apresentam um comportamento linear em
relacao a temperatura. Neste intervalo a variacao
relativa da assimetria e da largura sao pratica-
mente iguais.
O comportamento de res , e Esig e nao li-
near, apresentando taxa de variacao dependente
da temperatura. A assimetria apresenta um com-
portamento linear com taxa de variacao fixa em
relacao a temperatura. A Figura 6 ilustra a taxa
de variacao dos parametros de acordo com a tem-
peratura.
Em temperaturas baixas a Largura e o
parametro mais sensvel apresentando taxa de
variacao maxima de /T = 1, 272 103 / C.
Quando a temperatura atinge valores superiores
a 29, 27 C a largura passa a ser menos sensvel
do que a assimetria. A assimetria possui taxa de
variacao relativa constante de GR /T = 6, 54
104 / C. Os valores de res e de Esig apresentam
taxas de variacao negativa com relacao a tempe-
ratura. A largura atinge uma taxa de variacao
relativa menor do que a energia a uma tempera-
tura de 51 C e menor do que res a 52 C.
presenca de substancia lquida no sensor, ou seja,
o ar sendo considerado a substancia de referencia.
A curva SPR, ilustrada na Figura 2 e calculada
dividindo-se o sinal de imagem pelo sinal de
70 80 90 100 referencia armazenado. Cada amostra do sinal
foi obtida atraves da media de 12 quadros do
sinal de imagem adquirido. A media e realizada
tanto na aquisicao do sinal de referencia quanto
na analise da substancia.
O angulo de ressonancia Res e calculado
atraves da tecnica do Ajuste Polinomial. Esta
tecnica, ilustrada na Figura 2, consiste na apro-
ximacao da regiao de pontos proximos ao mnimo
a um polinomio de grau n. O valor de Res e
determinado encontrando-se o ponto referente ao
mnimo do polinomio. O polinomio utilizado foi
de segundo grau.
Os valores de Res e de sua intensidade sao
utilizados na determinacao de e G como descrito
anteriormente.
Para analisar a qualidade da medicao dos pa-
rametros propostos, foi realizado um sensorgrama
com a absorcao de BSA na formacao da mono-
camada do biosensor. O sensorgrama realizado e
composto de 5 etapas:
1. Inicialmente coloca-se agua pura para ser
analisada pelo equipamento.
2. Em seguida e colocada uma solucao de BSA a
1% e espera-se atingir um regime permanente
no valor do ndice de refracao
3. Na terceira etapa coloca-se agua novamente
para remover as ligacoes fracas de BSA sobre

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o chip de ouro. Estas ligacoes sao denomi-
nadas de ligacoes reversveis por serem facil-
mente removveis.
4. Na quarta etapa e colocada uma solucao
de limpeza com Hipoclorito para remover
a monocamada de BSA. O Hipoclorito e
necessario para remover as ligacoes fortes, de-
nominadas irreversveis, de BSA com o ouro.
5. Na ultima etapa coloca-se novamente agua
pura para retirar o hipoclorito e voltar a
condicao inicial do experimento.
O sensorgrama descrito foi realizado diversas
vezes para avaliar a reprodutibilidade do ciclo. A
Figura 7 ilustra o comportamento para dois ciclos
do sensorgrama. Pode-se verificar que os para-
metros monitorados apresentam comportamentos
similares em ambos os ciclos.
Para avaliar as ligacoes reversveis e irrever-
sveis, foi tracada uma reta no ponto que o ndice
de refracao efetivo nef f atinge um valor esta-
cionario ao final da terceira etapa de cada ciclo.
Este ponto indica que as ligacoes reversveis foram
removidas, pois circulou apenas agua durante a
terceira etapa. A agua e capaz de remover ape-
nas as moleculas de BSA fracamente fixadas. A
evolucao da variacao do ndice de refracao efetivo
nef f , em relacao ao ndice de refracao da agua de
1, 33, esta ilustrada no primeiro grafico da Figura
7.
6
x 10
3
1 2 3 4
neff
4 A B A
2
0
1500 2000
5
4.5
4
1.8
1500 2000
G
1.75
1.7
1.65
1500 2000
1250
Esig
1200
1500 2000
74
Rudo
72
70
68
66
64
1500 2000
Figura 7: Sensorgrama da absorcao de BSA
O aumento do ndice de refracao efetivo nef f ,
durante a segunda etapa do ciclo, indica que as
moleculas de BSA estao sendo fixadas na camada
de ouro. O ponto A de cruzamento com a reta
tracada indica o momento em que e formada a
monocamada com as ligacoes irreversveis. A par-
tir deste momento o ndice de refracao continua
aumentando, indicando um acrescimo na espes-
sura da camada formada. Porem, as ligacoes for-
madas sao fracas e facilmente removveis. As liga-
coes irreversveis so sao removidas apos a realiza-
cao da etapa de limpeza. O instante de remocao
da monocamada pode ser verificado no ponto de
cruzamento B, quando o valor do ndice de re-
fracao volta a ser menor do que ao final da terceira
etapa.
5.1 Analise da Largura da Curva
A largura da curva obteve um comportamento
semelhante ao do ndice de refracao. Quando a
espessura da camada absorvida cresce pode-se ve-
rificar que existe um aumento no valor de . Isto
indica que o aumento da camada fixada sobre o
ouro provoca a absorcao de mais energia da fonte
de luz incidente.
Pode-se observar, no grafico da Figura 7, que
o valor de atinge o regime permanente mais ra-
pidamente. Este resultado esta de acordo com
os valores simulados na secao 4.2, onde a largura
apresentou a maior taxa de variacao relativa. Ate
o instante da formacao da monocamada, marcado
pelo ponto A na curva, o valor da largura cresce
rapidamente. A partir deste momento verifica-
se apenas pequenas variacoes sobre o valor de ,
que correspondem a formacao das ligacoes rever-
sveis. Quando as ligacoes irreversveis sao removi-
das o valor de decresce rapidamente indicando
a diminuicao da espessura da camada.
5.2 Analise da Assimetria
A evolucao da assimetria esta ilustrada no terceiro
grafico da Figura 7, apresentando um comporta-
mento de variacao negativa em relacao as modifi-
cacoes na camada.
5
Quando a espessura da camada cresce o valor
B
2500 3000 3500 4000 de GR diminui, enquanto que a diminuicao da es-
pessura provoca um aumento no valor de GR . Este
comportamento esta de acordo com os resultados
2500 3000 3500 4000
simulados.
Durante o instante de formacao da monoca-
2500 3000 3500 4000 mada pode-se verificar um pico no valor de GR .
O mesmo fenomeno foi encontrado para o valor da
2500 3000 3500 4000
largura. Esta variacao abrupta nos valores de GR
e e atribuda a consolidacao da formacao da ca-
mada. O valor do pico em GR pode ser utilizado
2500 3000 3500 4000
para detectar previamente o instante da formacao
da monocamada com as ligacoes irreversveis de
BSA.
5.3 Analise da Energia
A energia do sinal obtida apresentou um compor-
tamento ilustrado no quarto grafico da Figura 7.
O comportamento obtido e similar ao do ndice
de refracao. A medida que o BSA comeca a ser
absorvido o valor de Esig aumenta ate o instante
que atinge o valor de regime permanente. Quando
a camada e retirada o valor da energia diminui.
O valor de Esig apresentou uma dinamica in-
vertida com relacao aos valores simulados. Apesar
deste resultado ser contraditorio pode-se verificar
que a energia do sinal varia conforme a modifi-
cacao da camada.
4214
878
XVIII Congresso Brasileiro de Automtica / 12 a 16-setembro-2010, Bonito-MS
5.4 Analise do Rudo do Angulo de Ressonancia
Alem dos parametros da morfologia da curva foi
analisado o rudo sobre o pixel correspondente ao
angulo de ressonancia. Cada amostra do sinal
da curva SPR foi obtida atraves da media de 12
quadros do sinal de imagem. A partir desta me-
dia foi calculado o valor do angulo de ressonan-
cia res . O rudo e entao calculado pelo desvio
padrao do valor do pixel, correspondente ao an-
gulo de ressonancia, para os doze quadros utiliza-
dos na obtencao da curva SPR. O comportamento
do rudo e ilustrado no quarto grafico da Figura
7.
O rudo apresenta um comportamento inverso
ao ndice de refracao efetivo nef . Quando o BSA
comeca a ser fixado existe um aumento de nef
enquanto que verifica-se uma diminuicao no valor
do rudo. No momento que a espessura da camada
diminui observa-se um aumento no valor do desvio
padrao do rudo.
O comportamento do rudo pode ser atribudo
ao fato de que o aumento da espessura da camada
sensvel provoca o aumento da energia absorvida.
Isto faz com que as diferencas causadas por per-
tubacoes contribuam menos no efeito SPR, conse-
quentemente o rudo obtido e menor. Para espes-
suras menores a energia necessaria para alcancar
a condicao de ressonancia e menor, logo qualquer
variacao no sinal pode provocar uma alteracao sig-
nificativa na curva SPR.
Outra maneira de se analisar o rudo e atraves
da forma da curva SPR. O valor da largura da
curva cresce de acordo com o aumento da espes-
sura da camada fixada. Logo, para pequenas es-
pessuras a largura da curva e pequena o que leva
a um decaimento rapido na intensidade da curva.
Uma deslocamento horizontal no sinal causaria
uma diferenca maior na intensidade do pixel de
ressonancia do que para larguras maiores. Isto
porque comparando-se o sinal do mesmo pixel,
para curvas mais suaves a diferenca de intensidade
e menor.
6 Conclusoes
Os resultados experimentais obtidos demon-
straram a viabilidade da utilizacao dos parame-
tros propostos na analise do sinal SPR. O estudo
comparativo demonstrou que a Largura da curva
foi o parametro com maior taxa de variacao rela-
tiva, indicando que e capaz de detectar mais ra-
pidamente modificacoes na camada sensvel. Em
contrapartida a largura tambem e mais sensvel a
variacoes de temperatura.
A utilizacao do rudo e da energia do sinal
evita a necessidade da normalizacao pelo sinal de
referencia, diminuindo a complexidade computa-
cional.
Com os novos parametros e possvel iden-
tificar mudancas no comportamento do sinal
nao observadas no monitoramento de res e de
4215
879
nef f . Isto permite a discriminacao de ligacoes
reverssveis e irreverssveis de protenas, com a
possibilidade de identificar o ponto de formacao
e remocao da monocamada.
Agradecimentos
Os autores agradecem a CAPES e ao CNPQ pelo
apoio financeiro disponibilizado.
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