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PRCTICA VI

SEPARACIN DE PROTENAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA

OBJETIVO: utilizar la tcnica de la electroforesis en gel para analizar la purificacin de la

enzima lisozima. Se analizar la composicin proteica de las distintas fracciones y se
constatar el grado de pureza de la lisozima.

FUNDAMENTO
La electroforesis es la migracin de iones en un campo elctrico. Es una de las
tcnicas analticas ms importantes dentro de la Bioqumica. Las molculas biolgicas (ADN,
protenas, vitaminas, etc.) poseen cargas elctricas, y por tanto poseen esta propiedad de
movilidad en un campo elctrico. La movilidad depender de la carga que presentan al pH
que trabajemos. La electroforesis en gel es el mtodo ms conveniente para realizar
separaciones de macromolculas (ADN y Protenas). El soporte de la electroforesis (el gel) es
un entramado tridimensional que impide o reduce la difusin. Este gel ha de ser compatible
con los tampones usados y debe permitir la entrada del lquido en los poros (reticulados
hidratables).
Los soportes pueden ser ms o menos restrictivos segn que el tamao de poros
limite o impida el paso de las molculas. Los ms restrictivos, como los geles de acrilamida-
bisacrilamida, oponen impedimento al paso de las molculas, participando as en el proceso
de separacin. Entre los menos restrictivos est la agarosa. El tamao de poro que da unas
dimensiones moleculares de criba de los geles puede ser establecido previamente. El gel en
la electroforesis retarda, en mayor o menor medida, a las molculas mayores respecto a las
de menor tamao. Las separaciones moleculares estn pues basadas en el tamizado
molecular junto a la movilidad electrofortica de las molculas que van a ser separadas.

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PRCTICA VI
Para llevar a cabo la electroforesis se necesita: A) una fuente de Tensin que
proporciona el campo elctrico, mediante dos electrodos, positivo (nodo) y negativo
(ctodo), entre los que se establece la diferencia de potencial. B) una cubeta o recipiente, en
cuyos extremos se sitan los electrodos. C) un soporte electrofortico. D) el tampn de
electroforesis: durante la electroforesis se produce electrolisis del agua, generndose
protones en la proximidad del nodo e iones hidroxilos en la proximidad del ctodo; el
tampn evitar que el entorno andico se acidifique y el catdico se haga ms bsico a lo
largo de la electroforesis.
El polmero utilizado para la formacin del gel es la acrilamida y la bis-acrilamida, los
cuales se polimerizan mediante la adicin de catalizadores (persulfato amnico, TEMED).
En nuestro caso, la separacin de las protenas se ver condicionada slo por su tamao y
no por su carga ya que previamente las protenas sern desnaturalizadas utilizando un
detergente (SDS), el cual despliega a las protenas y se queda pegado a su superficie
confirindole una gran carga negativa. Esa gran carga negativa enmascara la carga intrnseca
de la protena, y las protenas una vez tratadas con SDS presentan todas la misma carga, y
la separacin ser debida solamente a la masa molecular de la protena.

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PRCTICA VI
PROTOCOLO
La separacin electrofortica se lleva a cabo segn el mtodo descrito por Laemmli
en geles de poliacrilamida (al 16% en acrilamida)

A 15 l de las Fracciones F0 F3 se le aaden, en un eppendorf, tampn de carga (x3):
(Tris-HCI 0,125 M, pH 6,8; SDS 4%; glicerol 20%; 2-mercaptoetanol 10%; Azul de
bromofenol 0,008%).

Calentar las muestras a 95C durante 3 min.

Cargar en pocillos 10 l de F3 y 5 l del estndar de protenas

Correr la electroforesis en tampn Tris-HCl 0,025 M, pH 8,8, glicina 0,192 M y SDS

0,1%, a una intensidad de corriente constante de 30 mA hasta que el azul de
bromofenol est aproximadamente a 1 mm del extremo inferior del gel.

Desmontar el gel y teirlo con metanol/actico/H20 (5/1/5) con azul de Coomassie (1

g/l).

Desteir el gel en metanol/actico/H20 (10/10/80).