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C) Gastos de transporte
La proximidad de la industria usuaria al lugar de produccin de las materias
primas es un factor de gran importancia, ya que el coste de las materias
primas y del material acabado y, por tanto, su competitividad en el mercado,
pueden verse afectados por los costes de transporte. Cuanto ms prxima
sea la fuente de la materia prima al punto de uso, ms adecuada ser para
el uso, si todas las dems condiciones son satisfactorias.
INTRODUCCIN
Los microorganismos necesitan
de condiciones bioqumicas y
biofsicas apropiadas para su desarrollo.
El principal objetivo de los
medios de cultivos es crear un ambiente
adecuado para el crecimiento,
simulando las condiciones lo ms
cercanas posibles a las naturales,
asegurando as el apropiado funcionamiento
de la maquinaria enzimtica
de los microorganismos (1), lo cual
implica un adecuado balance de los
componentes. Teniendo en cuenta
los requerimientos de cada microorganismo
en particular y de los fines
del investigador, se ha desarrollado
una gran variedad de medios de cultivo
con diferentes propsitos y usos.
El xito del diseo y la formulacin
de medios de cultivo para procesos
microbianos, est muy relacionado
con la aplicacin de conocimientos
bsicos acerca de los microorganismos
y sustratos.
Para el desarrollo de un medio
de cultivo es necesario seleccionar
adecuadamente los componentes a
usar. Esto incluye la seleccin del
tipo y la concentracin de los diferentes
nutrientes, como son: fuente
de carbono, energa, nitrgeno, fsforo,
factores de crecimiento, entre
otros, tambin de condiciones tales
como concentracin de oxgeno, temperatura
y pH (2).
No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los nutrientes que
pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes: a)
Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estn representados por las
fuentes de C, N, S, P, K y Mg; b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales
de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o
microgramos por litro; y c) Factores de crecimiento, que estn constituidos generalmente por
componentes orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni
metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin metablica
especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no saturados, etc..
La formulacin tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir debe establecer
las concentraciones de cada componente a ser utilizadas. Una primera aproximacin con respecto
a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la composicin de
biomasa del microorganismo a ser empleado. Una composicin elemental y tpica de la biomasa
es (en % de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrgeno, 7-12; Fsforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%.
Es decir, que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa
debemos proveer las distintas fuentes que aseguren como mnimo las cantidades de elementos
que deben ser suministrados.
Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimizacin de los medios de cultivo.
Entre ellas podemos mencionar las siguientes: 1) No existencia de informacin respecto a
coeficientes de rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo
determinado. 2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de
microelementos y factores de crecimiento. 3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos
en exceso respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestin, que
pueden causar inhibicin del crecimiento. 4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e
inhibidoras del crecimiento y formacin del producto. 5) Empleo de fuentes nutricionales no
convencionales. La metodologa ms elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales
se vara la concentracin del componente a ensayar mantenindose constante las
concentraciones de los dems ingredientes. Para organismos aerobios generalmente se utiliza
como sistema de cultivo erlen meyers agitados. En este caso, se analiza el efecto de la variable
escogida sobre la velocidad de crecimiento y la concentracin de biomasa obtenida.
MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCION
Las bacterias son organismos muy verstiles. Presentan un gran potencial en su capacidad de utilizar
disitntas fuentes de alimentos, desde sustancias inorgnicas hasta materias orgnicas sumamente
complejas. Muchas especies han aprendido a crecer en una amplia diversidad de nichos ecolgicos con
temperatura, acidez o tensiones de oxgeno extremas.
Es muy difcil estudiar microorganismos en forma individual; lo ms prctico es trabajar con
poblaciones de los mismos. Para lograr estas poblaciones es necesario disponer de un medio artificial que
brinde a los microorganismos todos los requerimientos nutricionales para desarrollarse. Este ambiente
artificial se denomina MEDIO DE CULTIVO.
* MEDIO DE CULTIVO es toda preparacin artificial, slida, semislida o lquida que suministra al
microorganismo cada una de las sustancias fundamentales, una fuente de energa y condiciones
ambientales adecuadas para la sntesis y mantenimiento de su protoplasma.
CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que se obtienen en los medios de cultivo.
Los cultivos pueden ser:
a) puros o axnicos, cuando la poblacin est constituida por una nica clase de
microorganismos.
b) mixtos, cuando la poblacin est constituida por ms de una clase de microorganismos.
En la actualidad, la mayora de los grmenes patgenos se pueden cultivar fuera de su hbitat natural.
Ciertos parsitos obligados como las Rickettsias, nunca han podido cultivarse en medios artificiales;
requieren clulas vivas, cultivos de tejidos o embriones de pollo.
Todos los organismos requieren una fuente de energa para obtener ATP y generar poder reductor (NADH,
NADPH) por alguno de los siguientes metabolismos:
Fotoautotrofos = fotolitotrofos
Fotoheterotrofos = fotoorganotrofos
Cuando se disea la frmula del medio de cultivo, es necesario conocer en qu categora est incluido el
microorganismo a cultivar para elegir acertadamente los componentes del medio: generalmente
compuestos inorgnicos para microorganismos fototrofos y quimiolitotrofos, y orgnicos para
quimioorganotrofos.
a) Macroelementos (g/l):
Fuente de carbono: puede ser CO2 compuestos carbonados orgnicos. Se utilizan en la
construccin de innumerables molculas necesarias para la clula. Los hidratos de carbono
se consideran fuente de carbono y energa por excelencia en los quimioorganotrofos. Los
ms comunes son:
- hexosas como glucosa, fructosa, galactosa;
- pentosas como arabinosa, xilosa, ramnosa;
- disacridos como lactosa, sacarosa, maltosa;
- trisacridos como rafinosa;
- polisacridos como almidn, glucgeno;
- alcoholes como glicerol, sorbitol, manitol; y
- glucsidos como salicina, y esculina.
Fuente de nitrgeno: muchos organismos son autotrofos respecto de la fuente de nitrgeno
y pueden crecer utilizando molculas sencillas como NO3-, NH3 N2 . El nitrgeno es
metabolizado para proveer protenas, cidos nucleicos y polmeros de pared. Otros
microorganismos pueden incorporar nitrgeno en forma de aminocidos, bases pricas o
pirimdicas.
** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, el aporte de nitrgeno es realizado
por las peptonas, que son los productos de la hidrlisis cida o enzimtica de protenas de
origen animal o vegetal (carne, soja, casena, gelatina, harina de maz y girasol). Esos
productos de hidrlisis pueden tener longitud variable, desde aminocidos, hasta dipptidos,
tripptidos, polipptidos, albumosas, proteosas.
La hidrlisis cida puede ser realizada con HCl H2SO4 y presenta las siguientes desventajas:
- el triptofano se destruye
- se pierde el 10% de vitaminas presentes
- desaparecen casi completamente los polipptidos
Se prefiere la hidrlisis enzimtica que emplea diferentes proteasas actuando a pH
especficos, ej. papana a pH 6.5, tripsina a pH 8.5, pepsina a pH 2.
Las peptonas son fuente de nitrgeno y, en ausencia de hidratos de carbono en el medio
de cultivo complejo, cumplen la funcin de fuente de carbono y energa. Aportan vitaminas
del grupo B, trazas de metales y fosfatos que dan carcter buffer al medio.
Las peptonas de origen vegetal pueden aportar carbohidratos fermentables.
Fuente de fsforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o potasio que tambin confieren poder
buffer al medio de cultivo (pH cercano a 7). Si se agrega yema de huevo al medio de cultivo,
el aporte de P es realizado por los glicerofosfolpidos de la yema. El fsforo se incorpora a
cidos nucleicos, fosfolpidos, polmeros de membrana, ATP, y sustancias de reserva
(grnulos de volutina)
Fuente de azufre: se adiciona como SO4=, cisterna o metionina. En la clula se incorpora a
aminocidos y diferentes coenzimas.
Fuente de calcio, magnesio y potasio: potasio, calcio y magnesio se adicionan como sales
inorgnicas. Son cationes que estabilizan macromolculas aninicas. K+ acta como
coenzima y estabilizador de RNA. Mg2+ se integra a colorofila en organismos fotosintticos.
Ca2+ abunda en esporas como dipicolinato de calcio.
Fuente de sodio: sodio contribuira a equilibrar la presin osmtica del medio extracelular.
Es un catin requerido por bacterias haloflicas. Se suele suministrar como NaCl.
2. Factores de crecimiento
Son compuestos orgnicos especficos requeridos en muy bajas concentraciones que no
pueden ser sintetizados por la clula que los necesita. Por esta razn, deben ser agregados al
medio de cultivo. Ej.: principalmente vitaminas del grupo B, algunos aminocidos, purinas,
pirimidinas, cidos grasos. Hay ejemplos clsicos como los factores X y V (porfirinas) de la
sangre requeridos por la bacteria Haemophilus influenzae para crecer. El suero fetal bovino, que
aporta numerosos factores de crecimiento, es imprescindible para el cultivo de clulas animales.
Cmo surge la necesidad de un factor de crecimiento? La capacidad de sintetizar un compuesto
esencial est relacionada con una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas que se
completa satisfactoriamente. Cuando por alteraciones genticas, alguna enzima de la secuencia
no puede ser sintetizada, la serie de reacciones se bloquea en algn paso y no finaliza con xito.
El compuesto que por esta razn dej de sintetizarse, se convierte en un factor de crecimiento.
** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, los factores de crecimiento pueden ser
aportados por diversos extractos:
-Extracto de carne: su funcin es ser complemento vitamnico de las peptonas. Pero tambin
aporta sustancias nitrogenadas como: aminocidos, bases pricas y pirimdicas, cidos
orgnicos, creatina, xantina, hipoxantina, cido rico, urea, y sustancias no nitrogenadas como
glucgeno, fosfatos de hexosas, cido lctico, sales inorgnicas.
La calidad de este tipo de extracto vara con la carne empleada, el tiempo y la temperatura de
extraccin.
-Extracto de levadura: se obtiene por autolisis o plasmolisis de las clulas de levadura. Su funcin
es ser suplemento vitamnico de las peptonas, pero tambin aporta mezclas de aminocidos y
pptidos, y carbohidratos.
-Extracto de malta: es un interesante sustituto del extracto de levadura ya que posee adecuado
contenido de vitaminas, carbohidratos y aminocidos. Es el extracto soluble en agua de la malta
de cebada.
3. Agentes solidificantes
Su agregado al medio de cultivo es opcional.
El ms usado:
- el agar, es un polisacrido cido derivado de algas marinas, formado principalmente por
galactosa con un grupo sulfato cada 10 a 50 restos. Suele contener sustancias nutritivas en
pequeas concentraciones, y por esto no puede ser utilizado en medios de composicin qumica
estrictamente definida destinados a autotrofos. Se usa sin problemas en medios de cultivo
complejos para quimioorganotrofos.
Se agrega al 1.5-2% en medios de consistencia slida normal, al 0.2-0.3% en medios semislidos
o blandos, al 5% en medios de consistencia muy firme para detener el crecimiento de grmenes
muy mviles, y al 0% cuando se preparan medios lquidos (caldos).
Sus caractersticas:
- Funde a 80-100C y permanece lquido hasta 50-55C.
- A 45-55C se pueden agregar suspensiones de clulas sin afectar la viabilidad (supervivencia)
de las mismas.
- Permanece slido a 37C, temperatura de incubacin de la mayora de las bacterias patgenas
del hombre.
- No es txico para las bacterias, ni es degradado por stas.
- Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias (poblaciones de microorganismos
derivadas de una nica clula), lo que resulta imposible en medios lquidos!
- Es transparente, lo que facilita la visualizacin de las colonias.
- Al solidificar, forma una trama suficientemente abierta para permitir la difusin de los nutrientes
del medio de cultivo en todas direcciones, y suficientemente cerrada segn la concentracin
empleada- para impedir la movilidad de los microorganismos.
Otros solidificantes:
- Agarosa: es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa intensamente para fines especficos
en Inmunologa y Biologa Molecular.
- Silicagel: es silicato diluido en HCl. Se emplea en medios de cultivo para autotrofos, cuando debe
excluirse materia orgnica del medio de cultivo.
- Gelatina: es una protena obtenida por hidrlisis del colgeno. Fue el primer solidificante usado
en Microbiologa, pero es degradado por la mayora de las bacterias (lo comen, por lo que el
medio inicialmente slido termina convertido en medio lquido) y la temperatura de incubacin
no puede ser mayor a 22C (es el punto de fusin) con lo que cultivos slidos a temperaturas
ms altas resultan inviables.
- Albmina de huevo, suero: a 80C estas protenas coagulan y solidifican el medio de cultivo.
4. Agua
El agua representa una altsima proporcin (80-90%) del peso total de una clula y es
fundamental para la realizacin de todos los procesos metablicos, funciones enzimticas,
solvatacin de materiales orgnicos e inorgnicos, donacin de electrones para organismos
fotosintticos. Los medios de cultivo se preparan en el laboratorio con agua destilada lo que
estandariza su composicin y asegura la ausencia de iones como Ca2+ y Mg2+ que pueden
precipitar con fosfatos o generar reacciones indeseables.
An cuando las condiciones qumicas del medio de cultivo estn cubiertas, el crecimiento y desarrollo
de los microorganismos no tendr lugar si se desconocen las siguientes condiciones fsicas:
-humedad: todas bacterias necesitan un ambiente mucho ms hmedo para su desarrollo que los hongos.
En condiciones ambientales adversas, algunas especies producen estructuras de resistencia a la
desecacin llamadas esporas que permanecen viables durante tiempo prolongado hasta que el ambiente
sea propicio para la germinacin. Producen esporas los gneros Clostridium (ej. C. tetani,, C. botulinum),
Bacillus (ej. B. cereus, B. subtilis ), Sporosarcina, entre otros.
- luz: es importante para los microorganismos fotosintticos.
-pH: la mayora de las bacterias crece en medio neutro o ligeramente alcalino (7 7.6). Excepciones son
los lactobacilos (pH 5, acidfilos), Vibrio cholerae (pH 8.6,). Los hongos crecen a pH menor que 7.
b) Por su origen (esto depende de que la frmula se pueda describir qumicamente con precisin)
-Medios de transporte: se usan cuando se transcurre cierto tiempo entre la toma de una muestra y
su procesamiento. Incluye compuestos que aseguran la supervivencia de las clulas hasta que sean
sembradas en un medio de cultivo adecuado.
IMPORTANTE: un gran nmero de medios de cultivo tienen funciones mixtas. Ej.: puede ser enriquecido
porque lleva sangre y selectivo porque incluye algn antibitico. Puede ser selectivo porque incluye
inhibidores y diferencial porque pone en evidencia propiedades metablicas.
EJERCICIOS DE APLICACIN
c) Medio BW3
K2 HPO4 ... 0.25 g c.1. Mencione fuente de carbono y fuente de nitrgeno
CO2 burbujeo constante c.2 Cul sera la fuente de energa?
MgSO4 ... 0.0375 g c.3. Por su consistencia y su origen, cmo clasificara este
medio?
Na2MoO4... 2.5 x 10-3 g c.4. Para qu clase de grmenes segn fuente de C y de
energa-
NaVO3 .. 1.24 x 10-4 g sera adecuado?
KNO3 . 1 g
Agua destilada 1000 ml
d) Cul de los siguientes componentes agregara a un medio de cultivo comn para convertirlo en un medio
enriquecido?
- agua destilada -penicilina -suero fetal bovino -colorantes
- sangre de oveja -leche -extracto proteico de cianobacterias
-sales biliares -antispticos -yema de huevo -agar