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INSTITUCIN PATROCINANTE:
UNIVERSIDAD DE CONCEPCIN (UDEC)
INSTITUCIONES ASOCIADAS:
CENTRO REGIONAL DE ESTUDIOS EN ALIMENTOS SALUDABLES (CREAS)
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS (INIA)
OCTUBRE 2013
INTEGRANTES
2
Tabla de contenido
I. FORMULACIN ........................................................................................................... 5
II. METODOLOGA.......................................................................................................... 7
1.1.- Ubicacin de las poblaciones y caracterizacin general de stas. Colecta de frutos (UDEC
y CREAS-INIA). ....................................................................................................................................................................... 7
1.2.- Propagacin vegetativa in vitro y en invernadero (UDEC). ................................................................ 7
1.2.1.- Cultivo in vitro de semillas de arrayn ................................................................................................. 10
1.2.2.- Propagacin in vitro de lleuque ............................................................................................................... 10
1.3.- Caracterizacin gentica de dos poblaciones de arrayn y peumo de la Regin del Biobo
(UDEC). .....................................................................................................................................................................................11
2.1.- Determinacin de parmetros agronmicos de madurez de los distintos estadios de
maduracin de los frutos (UDEC y CREAS-INIA) ...............................................................................................13
2.1.1.- Clasificacin de los estadios de maduracin de arrayn y peumo (CREAS-INIA).............. 13
2.1.2. Parmetros agronmicos de madurez evaluados en frutos de cada especie (UDEC y
CREAS-INIA). .................................................................................................................................................................... 13
2.2.- Determinacin de la tasa respiratoria y etileno (CREAS-INIA). ......................................................14
2.3.- Cuantificacin de polmeros de pared celular (UDEC). ........................................................................14
2.3.1.- Extraccin de residuos insolubles en alcohol. ..................................................................................... 14
2.3.2.- Cuantificacin de los componentes de la pared celular. ................................................................ 14
2.3.3.- Anlisis colorimtrico de las fracciones................................................................................................. 15
2.3.4.- Contenido de lignina. ...................................................................................................................................... 15
3.1.- Determinacin de la actividad antioxidante total en frutos en los tres estadios, hojas y
deshidratados (CREAS-INIA)........................................................................................................................................16
3.1.1.- Capacidad antioxidante expresada en equivalentes de Trolox (TEAC) .................................. 16
3.1.2.- Actividad antioxidante por el mtodo de DPPH................................................................................. 16
3.1.3.- Actividad antioxidante por el mtodo de FRAP ................................................................................. 16
3.1.4.- Anlisis estadstico........................................................................................................................................... 16
3.2.- Determinacin de compuestos bioactivos en frutos y hojas. ............................................................16
3.2.1.- Determinacin del contenido fenlico total......................................................................................... 17
3.2.2.- Determinacin de cido ascrbico (AA) en frutos ............................................................................ 17
3.2.3.- Determinacin de la actividad antimicrobiana en extractos de frutos y hojas de arrayn
................................................................................................................................................................................................. 17
3.2.4.- Determinacin de la bioactividad de extractos de arrayn y peumo ...................................... 18
3.2.5. Anlisis estadstico ............................................................................................................................................ 18
III. RESULTADOS .......................................................................................................... 20
1.1.- Ubicacin de las poblaciones y caracterizacin general de stas. Colecta de frutos. ...........20
1.1.1.- Caracterizacin general de las poblaciones. ....................................................................................... 22
1.1.2.- pocas de colecta de fruto para las especies ....................................................................................... 22
1.1.3.- Clasificacin de los estadios de maduracin de arrayan y peumo. ........................................... 23
1.2.- Propagacin vegetativa in vitro y en invernadero..................................................................................25
1.2.1.- Propagacin en invernadero. ..................................................................................................................... 25
1.2.2.- Respuestas a las condiciones de cultivo in vitro en peumo y arrayn. .................................... 25
1.2.3.- Cultivo in vitro de semillas de arrayn................................................................................................... 27
1.2.4.- Resultados del cultivo in vitro de lleuque. ........................................................................................... 28
1.2.5.- Propagacin in vitro de belloto del sur y naranjillo. ....................................................................... 29
1.3.- Caracterizacin gentica de dos poblaciones de arrayn y peumo de la Regin del Biobo.
......................................................................................................................................................................................................29
3
2.1.- Determinacin de parmetros agronmicos de madurez de los distintos estadios de
maduracin de los frutos. ...............................................................................................................................................33
2.1.1.- Dimetro, peso y pH. ....................................................................................................................................... 33
2.1.2.- Firmeza. ................................................................................................................................................................ 35
2.1.3.- Contenido de slidos solubles (CSS). ........................................................................................................ 35
2.1.4.- Cambios en la pigmentacin de los frutos. ........................................................................................... 38
2.2.- Determinacin de la tasa respiratoria...........................................................................................................39
2.3.- Cuantificacin de polmeros de pared celular...........................................................................................40
2.3.1.- Cuantificacin de pared celular como Residuos Insolubles en Alcohol (AIR). ..................... 40
2.3.2.- Fraccionamiento de la pared celular. ..................................................................................................... 42
2.3.3.- Cambios en el contenido de lignina. ........................................................................................................ 45
3.1.- Determinacin de la actividad antioxidante total determinada en frutos, expresada segn
mtodo TEAC DPPH y FRAP. .........................................................................................................................................47
3.1.1.- Anlisis de correlacin ................................................................................................................................... 47
3.2.- Determinacin de compuestos bioactivos en frutos y hojas. ............................................................48
3.2.1.- Determinacin de cido ascrbico (AA) en frutos ............................................................................ 48
3.2.2.- Determinacin de la actividad antimicrobiana ................................................................................. 48
3.2.3.- Ensayos funcionales en aorta de rata. .................................................................................................... 52
4.- Divulgar hacia la comunidad los resultados y conclusiones obtenidos (ver anexo Difusin
por detalles). .........................................................................................................................................................................54
IV. PRINCIPALES CONCLUSIONES.................................................................................. 56
1.- AREA GENTICA ...........................................................................................................................................................56
2.- AREA PROPAGACIN .................................................................................................................................................56
3.- AREA CARACTERIZACION DE FRUTOS Y POTENCIAL ALIMENTARIO ...........................................56
4.- AREA POTENCIAL SALUDABLE Y FARMACOLGICO ...............................................................................57
V. RECOMENDACIONES ............................................................................................... 58
VI. BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................ 59
4
I. FORMULACIN
Introduccin
Las especies seleccionadas para el estudio de sus frutos en el presente proyecto son
rboles nativos en los cuales la informacin referida a maduracin de stos es escasa, razn por la
cual este proyecto pretende entregar conocimientos slidos y bsicos referidos a este proceso
caracterizando cada especie de acuerdo a particularidades de la maduracin de cada fruto. El
primer grupo corresponde a especies en peligro de extincin o aquellas en las que los datos
colectados a la fecha son insuficientes y por ende los esfuerzos se centrarn principalmente en la
bsqueda de poblaciones: belloto del sur (Beilschmiedia berteroana); huillipatagua, naranjillo o
patagua (Citronella mucronata); y pitao (Pitavia punctata). El segundo grupo corresponde a
especies silviculturalmente mejor descritas, de uso en la medicina tradicional, pero de la cual se
tiene escaso conocimiento de los componentes bioactivos que poseen sus frutos: lleuque o uva de
la cordillera (Prumnopitys andina); peumo (Cryptocarya alba); y arrayn (Luma apiculata). Todas
estas especies poseen frutos del tipo berries o bayas, los cuales en otras especies, presentan
capacidades antioxidantes ms altas, en relacin a otras frutas y verduras. En general la mayora
de las especies nativas de Chile que han sido altamente estudiadas y con uso agroindustrial, como
lo son el boldo, la murta y el maqui, tienen una gran capacidad antioxidante, debido a su alto
contenido en molculas bioactivas como los polifenoles.
Hiptesis
Frutos de especies nativas arbreas presentan una promisoria fuente de salud dado su
elevado valor saludable, por ello el desarrollo de estrategias de manejo sustentable de estas
especies con potencial en la industria agroalimentaria contribuir a incrementar las alternativas
alimenticias. De esta manera, mediante el anlisis y caracterizacin de los principales atributos de
la maduracin de frutos de especies nativas se entregar una clasificacin y visin del potencial
que tienen para el consumo humano directo y/o para su uso como fuente de metabolitos de inters.
Objetivo general
Objetivos especficos
1.- Determinar la distribucin de las especies arbreas en estudio y poca de colecta de sus frutos.
Colecta de frutos para caracterizacin y de material vegetal para preservacin y propagacin ex
situ de cada una de las especies.
2.- Caracterizar los frutos desde poblaciones seleccionadas en tres estadios (verde, a la cosecha y
postcosecha) en relacin a sus parmetros agronmicos de maduracin en dos temporadas.
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3.-Caracterizar componentes relacionados a propiedades saludables en frutos en tres estadios
(verde, a la cosecha y postcosecha) en dos temporadas.
6
II. METODOLOGA
Objetivo 1: Determinar la distribucin de las especies arbreas en estudio y poca de
colecta de sus frutos. Colecta de frutos para caracterizacin y de material vegetal para
preservacin y propagacin ex situ de cada una de las especies.
7
sulfato de estreptomicina (antibitico). Transcurrido este periodo y bajo cmara de flujo laminar, se
enjuag con agua destilada estril (ADE). Para la asepsia de los brotes de peumo y arrayn se
utiliz etanol al 70% (v/v) durante 30 s, seguido de 2 enjuagues con ADE. Luego se introdujeron en
-1
una solucin de cloro comercial (5 g L ingrediente activo) al 50% (v/v) en el caso de peumo, y
30% (v/v) para arrayn, ms 0,5 ml de Tween 20 durante 15 min, finalizando con 3 enjuagues
consecutivos con ADE.
Luego se cortaron segmentos binodales para su introduccin in vitro en medio MS 25%, sin
reguladores del crecimiento vegetal, debido a la alta oxidacin observada en los explantes en
-1
ensayos previos, para su establecimiento. ste fue suplementado con 20 g L de sacarosa como
-1
fuente de carbono. Se adicionaron 1,5 g L de polivinilpirridona (PVP) como antioxidante de los
-1 -1
tejidos; 1ml L de PPM como biocida. El pH se ajust a 5.8 para luego adicionar 7 g L agar-agar.
En esta etapa se contabiliz el nmero de explantes contaminados por bacterias, hongos, aquellos
que se oxidaron y los que pasaran a la etapa siguiente.
Para la fase de multiplicacin de microtallos se utiliz el medio WPM, suplementado con lo
descrito anteriormente para el medio MS, ms 0,01 mg L-1 de IBA y 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 mg L-1 de
-1
BAP, incluyendo un tratamiento control. Para arrayn se agreg adems 0,05; 0,5 y 1 mg L de
cido giberlico 3, incluyendo un tratamiento control. Los explantos se sembraron en recipientes de
vidrio conteniendo 20 mL de medio de cultivo, e incubados en cmara de crecimiento a 25 1C,
55% de humedad relativa, bajo fotoperiodo de 16 horas de luz fra y una intensidad lumnica de 40
-2 -1
mol m s . En esta etapa se contabiliz el nmero de nuevos brotes obtenidos al finalizar el
ensayo.
Se probaron variados protocolos de asepsias del material vegetal de las especies en
estudio, para visualizar su reaccin, para definir el mejor protocolo, se sometieron a diferentes
medios de cultivo y concentraciones hormonales. Todas las especies, luego de colectado el
material, se lavaron con jabn antibacterial con ayuda de un cepillo, bajo agua potable. Posterior a
-1
ello se mantuvieron 24 h en una solucin de los fungicidas captan-benomilo (2 g L de cada uno).
En vista de que la contaminacin bacteriana persista durante el cultivo in vitro, se agreg a la
-1
solucin 200 mg L de sulfato de estreptomicina. En la Tabla 1 se detallan las condiciones de
asepsias para peumo, arrayn, naranjillo y belloto del sur, a segmentos binodales, y para lleuque
segmentos con mltiples yemas y los medios de cultivo utilizados.
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Tabla 1. Condiciones de limpieza de tejidos para la generacin de un protocolo de asepsias del material
vegetal en todas las especies en estudios indicando los medios de cultivo utilizados y observaciones
obtenidas en el comportamiento del material vegetal introducido a condiciones de cultivo in vitro.
9
Los medios de cultivo utilizados fueron los siguientes:
-1 -1 -1 -1 -1
MSN: MS + 30 g L sacarosa + 1 g L PVP + 0,5 g L BAP + 0,05 g L AIB + 0,116 g L Vitrofural
-1
+ 6 g L agar; pH=5.8
-1 -1 -1 -1 -1
MSB: MS/2 + 30 g L sacarosa + 1 g L PVP + 2 g L BAP + 0,2 g L AIB + 7 g L agar; pH=5.8
MS2: MS + 30 g L-1 sacarosa + 1 g L-1 PVP + 2 g L-1 BAP + 0,5 g L-1 AIB + 0,116 g L-1 Vitrofural + 6
-1
g L agar; pH=5.8
MSN2: MS/2 + 20 g L-1 sacarosa + 1,5 g L-1 PVP + 0,5 g L-1 BAP + 0,05 g L-1 AIB + 1 ml L-1 PPM +
-1
7 g L agar; pH=5.8
-1 -1 -1 -1 -1
MSK: MS/2 + 20 g L sacarosa + 1,5 g L PVP + 0,5 g L KIN + 0,05 g L AIB + 1 ml L PPM + 7
-1
g L agar; pH=5.8
-1 -1 -1 -1 -1
WPM: WPM + 20 g L sacarosa + 1,5 g L PVP + 0,5 g L BAP + 0,05 g L AIB + 1 ml L PPM + 7
g L-1 agar; pH=5.8
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T0: 0 AIB + 0 BAP + 0 GA3
T1: 0,01 AIB + 0,1 BAP + 0 GA3
T2: 0,01 AIB + 0,1 BAP + 0,05 GA3
T3: 0,01 AIB + 0,1 BAP + 0,5 GA3
T4: 0,01 AIB + 0,1 BAP + 1 GA3
11
El descarte de combinaciones de partidores se efectu visualmente a partir de los geles de
agarosa, donde se obtuvo 6 combinaciones, las que fueron analizadas a travs de un secuenciador
de ADN capilar automtico ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Los datos
en bruto obtenidos en el secuenciador se visualizaron con el programa Genographer versin 2.1.4
para generar un perfil de AFLP representativo a travs de un gel virtual.
Para L. apiculata , a partir de un total de 25 combinaciones de partidores, se seleccionaron
15 (Tabla 3), para ser utilizados en anlisis posteriores.
Eco Mse
CC* CC
TC* GA
ACA* CCA
ACG* CCG
ACT* CAT
ACC* CTC
CCG* CTG
*Los partidores Eco+2 y Eco+3 bases selectivas fueron marcados con un fluorforo.
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Objetivo 2: Caracterizar los frutos desde poblaciones seleccionadas en tres estadios (verde,
a la cosecha y postcosecha) en relacin a sus parmetros agronmicos de maduracin en
dos temporadas
Para la caracterizacin agronmica y funcional se trabaj con las especies fuera de riesgo
y de amplia distribucin, arrayn y peumo. Las especies en estudio fueron clasificadas en funcin
de su estado de madurez y desarrollo; es as como para todas ellas se plantearon escalas basadas
en la evolucin del color y tamao de los frutos. Dicha clasificacin se aplic principalmente a estas
dos especies. En las restantes especies estudiadas se analizaron frutos en estado de plena
madurez, esto debido a la baja disponibilidad de material vegetal producto de la variacin
estacional. Las muestras analizadas en CREAS-INIA para peumo y arrayn se obtuvieron del
Parque Nacional Jardn Botnico (El Salto, El Olivar, Regin de Valparaso) y Antuco (Regin del
Bio-Bio), respectivamente.
Para la caracterizacin agronmica y funcional los frutos de arrayn fueron cosechadas a
partir de una poblacin ubicada en Antuco, Regin del Biobo, Chile (3722'35.01"S,
7129'21.20"W, 850 msnm). Se clasificaron en cuatro estadios segn el color y el tamao: La1,
baya verde, pequea y delgada; La2, baya verde con tonos prpura; La3, baya prpura
redondeada; La4, redondeado negro (Figs. 2 y 3). Los anlisis de calidad fueron realizados luego
de la cosecha y para los analticos la fruta se congel en nitrgeno lquido y se almacen a -80 C
hasta su uso.
Las muestras de peumo fueron colectadas en Jardn Botnico de Via del Mar
(330218.58 S; 712948.04 W; 77 msnm), sector El Salto-El Olivar, Regin de Valparaso. Los
frutos de peumo se clasificaron en tres estadios de desarrollo (verde, semi-maduro y maduro), de
este modo, los tres estadios se diferenciaron segn el color y el tamao en las categoras
siguientes: Ca1, rosado claro y pequeo; Ca2, rosado claro mediano; Ca3, rosado grande y ms
oscuro (Fig. 2). Los anlisis de calidad fueron realizados luego de la cosecha y para los analticos
la fruta se congel en nitrgeno lquido y se almacen a -80 C hasta su uso.
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al., 2009). El CSS fue determinad a 20C utilizando un refractmetro manual (Atago Co. Japan) con
compensacin de temperatura y se expres como g/g de peso fresco (PF). La acidez (pH) y la AT
del jugo se determin por titulacin de una alcuota de 5 mL de jugo del fruto con NaOH 20 mM
determinando el punto de equilibrio y se expres como mEq del respectivo cido/g PF (Valdenegro
et al., 2012).
14
los lavados se reuni y se design como la fraccin soluble CDTA (CSF). El sedimento CDTA
insoluble se extrajo nuevamente con 15 mL de Na2CO3 50 mM que contuvo NaBH4 20 mM,
durante 1 h a 4C, con agitacin constante. El homo genizado se centrifug y filtr, lavando
nuevamente dos veces con 15 mL de solucin de Na2CO3. Esta fraccin se design como la
fraccin soluble en Na2CO3 (NSF). El sedimento restante se extrajo con 15 mL de KOH 4 M que
incorporaba NaBH4 1 mM, durante 1 h a 4C, con agit acin. La mezcla se centrifug y filtr una
vez ms, y el sedimento se lav dos veces con 15 ml de KOH, designando la fraccin soluble en
KOH como KSF. Tres extracciones independientes se realizaron a partir de cada repeticin,
obtenindose tres fracciones pcticas y una hemicelulsica. Luego, se midi la concentracin de
pectinas (como cidos urnicos) y azcares neutros en las fracciones de pared mediante test
colorimtrico.
Determinacin de cidos urnicos (AU): las concentraciones de cido urnico de todas las
fracciones pcticas se estimaron por el mtodo de m -hidroxifenil usando cido galacturnico (AG)
como estndar (Blumenkrantz y Asboe-Hansen, 1973). De cada fraccin pctica se extrajo un
volumen de 210 L la cual se hidroliz con 1250 L de una solucin consistente en Na2B4O7
0,0125 M en H2SO4 concentrado, la cual se incub 1 min en mezcla agua-hielo, para luego mezclar
por vrtex. La solucin se incub 10 min en agua hirviendo, y despus en bao agua-hielo.
Posteriormente, se agreg 20 L de 3-PhPOH 0,15% (p/v) en NaOH 0,5% (p/v), homogeneizando
en vrtex, y se determin la absorbancia de la mezcla a 520 nm en espectrofotmetro. Se realiz
una curva de calibracin utilizando una dilucin seriada a partir de AG 0,33 mM en cido
actico/acetato de sodio 50 mM, pH 5.5. Los contenidos de AG se expresaron en mg en base a
100 mg de AIR y a 100 mg de fruto fresco (Blumenkrantz y Asboe-Hansen, 1973; Yemm y Willis,
1954).
Determinacin de azcares neutros (AN): la concentracin de azcares neutros (AN) de
todas las fracciones de pared celular se estim por el mtodo de antrona usando glucosa como
estndar (D Amour et al., 1993). De cada fraccin se extrajo un volumen de 200 L la cual se
hidroliz con 2 mL de una solucin consistente en antrona (Sigma, USA) 0,05% (p/v) en H2SO4
(66% v/v), la cual se mezcl con vrtex. La solucin se incub 20 min en agua hirviendo y despus
1 min en bao agua-hielo. Luego, se dej por 15 min en oscuridad. Se determin la absorbancia de
la mezcla a 620 nm en espectrofotmetro. Se realiz una curva de calibracin utilizando una
dilucin seriada a partir de 0,16 mg/ml de glucosa 0,04% (p/v) en agua destilada. Los contenidos
de AG se expresaron en mg en base a 100 mg de AIR y a 100 mg de fruto fresco. El contenido de
AN de las fracciones pcticas fue calculado en base a la sustraccin del valor equivalente en
glucosa correspondiente al contenido de AG que presente cada fraccin.
Los resultados se calcularon utilizando una curva estndar de cido galacturnico (UA) o
de glucosa (AN). Las mediciones se realizaron por triplicado, y los resultados se expresaron como
microgramos de cido galacturnico/miligramo de AIR.
15
Objetivo 3: Caracterizar componentes relacionados a propiedades saludables en frutos
en tres estadios (verde, a la cosecha y postcosecha) en dos temporadas
16
3.2.1.- Determinacin del contenido fenlico total
El contenido total de fenoles se determin utilizando el mtodo colorimtrico de Folin-
Ciocalteu midiendo la absorbancia a 760 nm propuesto por Singleton y Rossi (1965) y Galati et al.
(2003) en un espectrofotmetro UV/Vis (Perkin Elmer, Lambda 25, Beaconsfield, Bucks, UK). La
cuantificacin se realiz mediante una curva estndar de cido glico. El contenido total de
compuestos fenlicos se expres en miligramos de equivalentes de cido glico por cada 100 g de
peso hmedo (GA mg/100 g FW).
3.2.3.2.- Cultivos bacterianos. Se emplearon para el estudio dos cepas de Escherichia coli (E. coli
O157;H7, E. coli no toxignica), tres de Salmonella (S. enteritidis, S. typhimurium, S. newport), dos
de Listeria (L. monocytogenes, L. innocua) y tres de Staphylococcus aureus (S. aureus 25923, S.
aureus ST182-2001, S. aureus 433000 MRSA). Todas las bacterias fueron adquiridas del Instituto
de Salud Pblica (ISP, Chile).
3.2.3.3.- Preparacin de extractos de estudio. Hojas y frutos limpios fueron secados en horno a
una temperatura de 70C por 48 h. Las muestras secas fueron desmenuzadas a mano y
pulverizadas utilizando un procesador de alimentos. Diez gramos de las muestras pulverizadas
fueron mezcladas con 150 mL de metanol y sometidas a extraccin por 24 h a temperatura
ambiente. Despus de la extraccin cada muestra fue filtrada y rotaevaporada a 40C hasta
obtener un extracto libre de solvente. Los extractos fueron luego reconstituidos con metanol hasta
alcanzar una concentracin stock de 500 mg/mL. Los extractos reconstituidos fueron esterilizados
mediante filtracin y empleados para los anlisis posteriores.
17
3.2.3.5.- Determinacin de la concentracin mnima de inhibicin (CMI). Aquellos extractos
que mostraron actividad microbiana fueron empleados para determinar la concentracin mnima de
inhibicin siguiendo la metodologa descrita por Hsu et al. (2010). En breve, los extractos fueron
diluidos hasta alcanzar rangos de dilucin 150 a 300 mg/mL. Discos impregnados con estas
concentraciones fueron depositados en tubos eppendorf con 500 L de Caldo Muller Hinton, a los
que se aadi 5 L de cultivo bacteriano (8 log UFC/mL). Los tubos fueron incubados a 37C por
18 h y observados para determinar turbidez. Luego se aadieron 0,2 mg/mL de p-
iodonitrotetrazolium. Los cultivos fueron incubados por otros 30 min y se reexaminaron: aquellos
cultivos de color rosa/violeta fueron tomados como cultivos con crecimiento microbiano, mientras
que los incoloros como cultivos inhibidos. La concentracin ms baja que permiti la inhibicin
microbiana se tom como concentracin mnima inhibitoria (CMI).
3.2.4.1.- Preparacin de los anillos de aorta torcica de rata y de grabacin. Para los ensayos
de vasoproteccin se utilizaron tres extractos: (1) hoja de peumo (Peumo-H), (2) hoja de arrayn
(Arrayan-H) y (3) fruto de arrayn (Arrayan-F). Estas muestras son las mismas que se sometieron a
anlisis de compuestos con capacidad antioxidante que se detallan en el punto 3.1. Para cada
extracto se evalu su capacidad para proteger la relajacin dependiente de endotelio, de anillos de
aorta de rata pre-incubados con alta glucosa (HG, D-glucosa 25 mM).
3.2.4.2.- Preparacin de los anillos de aorta. Las ratas fueron sacrificadas por decapitacin y la
aorta torcica se retir cuidadosamente para ser instalada en una cmara de tejido, tal como se ha
descrito previamente (Vinet et al., 1991). La aorta fue disectada y los anillos se suspendieron entre
dos ganchos de acero inoxidable, y se colocaron al interior de cmaras de rganos de 30 mL que
contenan los tampones y atmosfera adecuada.
3.2.4.3. Ensayos del efecto protector de los extractos. Se determin la tensin isomtrica. El
primer anillo se incub en KHB (Control), el segundo se incub en KHB con alta glucosa (HG; D-
Glucosa 25 mM) y el tercer anillo se incub en tampn KHB con HG ms el extracto (0,1; 1; 10
mg/ml)). Todos los anillos se incubaron durante 3 h. Despus de este perodo, los anillos fueron
contrados con fenilefrina (0,1 M) y una vez que se consigui una contraccin estable, se
realizaron las curvas de concentracin-respuesta mediante adicin acumulativa de ACh. La
relajacin mxima (Emax) y concentracin que produce la mitad del efecto mximo (CE50),
expresada como pD2 (-log CE50), se determinaron mediante un ajuste no lineal para una
sigmoidea mediante la aplicacin GrapPad Prims versin 6. La relajacin desde el nivel base del
vaso pre-contrado hasta la lnea base, se consider como un 100% de relajacin.
18
9.0, Cary, NC, USA) y la prueba de Duncan para la diferencia de medias (P 0,05).
Para los ensayos en aorta de rata, el anlisis estadstico se realiz mediante el software
GraphPad Prism versin 6 (GraphPad Prism, Inc, USA). Se utiliz un anlisis unidireccional de la
varianza (ANOVA) con la prueba de Newman-Keuls para comparacin mltiple o una prueba t
segn fuera ms apropiado. Todos los datos se expresan como el promedio E.S. Las diferencias
se consideraron estadsticamente significativas con un P < 0,05.
19
III. RESULTADOS
Objetivo 1: Determinar la distribucin de las especies arbreas en estudio y poca de
colecta de sus frutos. Colecta de frutos para caracterizacin y de material vegetal para
preservacin y propagacin ex situ de cada una de las especies.
20
Figura 1. Distribucin de las especies prospectadas en el Proyecto 064/2011, ubicadas en la Regin del Biobo y
Araucana, utilizadas para la mayor parte de los anlisis (principalmente los realizados en la UDEC).
21
1.1.1.- Caracterizacin general de las poblaciones.
En la Tabla 4 se muestra una caracterizacin general de cada localidad en donde se
encontraban las especies, y desde donde se obtuvieron muestras para los diferentes anlisis y
propagacin.
Tabla 4. Caracterizacin general de las poblaciones colectadas en la VIII y IX regin, para las diferentes
especies objetivo, segn localidad.
LOCALIDAD
R. N. Nongun, San Fabian de Alico Angol Bulnes
Parque Pedro del
Rio Zaartu
Especies Arrayn, peumo, Arrayn, peumo, lleuque Lleuque Belloto del sur
naranjillo, pitao
Amenazas Extraccin ocasional Cambio uso del suelo Cambio uso del Cambio uso del
de madera y follaje plantacin forestal, suelo por suelo siembre
crianza de animales y plantacin de especies
creacin de centrales de forestal agrcolas y
paso frutcolas
Proteccin Si No No No
SNASPE
Regeneracin Si Si Si Si
N/A=No Aplica
Dado el poco conocimiento de la especies objetivos, las pocas de colecta fueron definidas
segn lo descrito por Hechenleitner et al. 2005.
22
En la Tabla 5 se pueden apreciar las diferentes pocas de colecta de frutos determinadas
en el presente proyecto:
Estadio
Especie Verde Transicin Maduro
Arrayn Febrero Marzo-Abril Mayo-Julio
Lleuque Diciembre-Enero Febrero Marzo
Peumo Febrero Marzo- Abril Mayo-Julio
Belloto del Sur Febrero NA Marzo
Pitao Febrero NA Marzo-abril
Naranjillo Enero NA Febrero-Marzo
NA= No Aplica
23
Figura 2. Clasificacin de frutos de arrayn y peumo de acuerdo a el estado de maduracin. Frutos de
arrayn: La1, fruto verde alargado; La2, fruto verde purpura; La3, fruto redondo purpura; La4, fruto maduro
fruto negro redondo. Frutos de peumo: Ca1, verde; Ca2, semi-maduro; Ca3, maduro.
Figura 3. Detalle de los estadios de maduracin clasificados en arrayn. (A) La1 fruto verde alargado; (B) La2
fruto verde purpura; (C) La3 fruto redondo purpura; (D) La4 fruto maduro fruto negro redondo.
24
1.2.- Propagacin vegetativa in vitro y en invernadero.
Lleuque
15%
% saludable
24% % necrotico
47%
% clorosis
% patogenos
25%
%muerte
Figura 4. Estado fitosanitario de belloto del sur, naranjillo y lleuque en plntulas llevadas a vivero.
25
80%
72.8%
70.0%
70%
60%
50%
40%
30%
19.6%
20% 17.0%
Peumo Arrayn
Figura 5. Porcentaje de contaminacin de acuerdo a los agentes contaminantes durante la fase de
establecimiento del cultivo in vitro de peumo y arrayn. B: contaminacin por bacterias; H: contaminacin por
hongos; O:oxidacin de los explantes; E: explantes que pasan a la etapa siguiente.
A B C
26
A B B
Figura 7. Segmentos nodales y desarrollo de yemas axilares en arrayn cultivados en medio WPM
-1 -1 -1
suplementado con 0,01 mg L de IBA, 0,1 mg L BAP y 1 mg L de cido giberlico. A) expresin de yemas
axilares; B) desarrollo de microtallo con callo basal; C) multiplicacin de brotes.
A B
D
C
Figura 8. Cultivo de semillas en condiciones aspticas in vitro. A) retiro cubierta seminal; B) larva al interior de
la semilla, responsable de daos en ella; C) microplntula en medio de establecimiento; D) plntulas aptas
para etapa de multiplicacin; E) arrayanes en medios de multiplicacin.
27
La germinacin de la semilla bajo condiciones de cultivo in vitro se produjo a los 7 das de cultivo
(Fig. 8C), desarrollndose microplantas a los 30 das de cultivo, perodo donde se comenz la fase de
multiplicacin y proliferacin del material para la produccin de microtallos aptos para su enraizamiento
(Fig.7E).
Para la etapa de multiplicacin, utilizando medio de cultivo WPM, el tratamiento que present una
mayor produccin de microtallos por explante cultivado fue T2 (0,1 IBA + 1 BAP + 1 GA4+7), con un promedio
de 3,5 microtallos por explante (Fig. 9).
5
4
3 T0
2 T1
1 T2
0
Total
Figura 9. Nmero de microtallos obtenidos en los diferentes tratamientos ensayados.
T0: 0,1 IBA + 1 BAP + 0 GA4+7; T1: 0,1 IBA + 1 BAP + 0,5 GA4+7; T2: 0,1 IBA + 1 BAP
+ 1 GA4+7.
A B
Figura 10. Aspecto de los segmentos nodales de lleuque despus de 35 das de cultivo. A) oxidacin de las
yemas; B) elongacin de yemas.
28
A
B C
Figura 11. Respuesta de segmentos nodales de lleuque cultivados en medio WPM en diferentes tratamientos
-1 -
hormonales. A) ausencia de hormona; B) T1 (0,01 mgL AIB + 0,1 BAP mgL 1 + 0 GA3); C) T2 (0,01 AIB + 0,1
BAP + 0,05 GA3).
Los tratamientos T3 (0,01 AIB + 0,1 BAP + 0,5 GA3) y T4 (0,01 AIB + 0,1 BAP + 1 GA3),
presentaron el 100% de contaminacin fngica y bacteriana, por lo que no pudieron ser evaluados.
Figura 12. Integridad de ADN de C. alba mediante electroforesis en gel de agarosa 1% p/v. : Marcador de
peso molecular (20 ng/L). S1 a S10 y N1 a N10 corresponden al ADN de 10 individuos, de la poblacin de
San Fabin de Alico y Reserva Nacional Nongun, respectivamente.
29
El ADN genmico de obtenido a partir de brotes de hojas de L. apiculala result ptimo, en
cuanto a calidad y concentracin, para ser utilizado en anlisis de AFLP. La integridad del ADN de
las dos poblaciones, fue visualizada por electroforesis en gel de agarosa, donde se observ una
banda ntegra, sin presencia de contaminacin ni degradacin de ADN (Fig. 13).
Figura 13. Integridad de ADN representativo para L. apiculata mediante electroforesis en gel de agarosa 1%,
10 min a 75 V. : marcador de peso (20 ng/ul). 1 a 10 corresponde a DNA genmico de 10 individuos de la
poblacin de Reserva Nongun (aproximadamente 100 pb). Se utiliz un control positivo de ARN.
30
Figura 14. Patrn de bandeo representativo gel virtual C. alba. Para cada combinacin de partidores, los
primeros cuatro carriles corresponden a la poblacin Reserva Nacional Nongun y los siguientes cuatro a la
poblacin San Fabin de Alico.
31
Figura 15. Patrn de bandeo representativo gel virtual. L. apiculata (carril 1-48). Los primeros 24 carriles
corresponden a la poblacin Reserva Nacional Nongun y los siguientes 24 a la poblacin San Fabin de
Alico.
32
Objetivo 2: Caracterizar los frutos desde poblaciones seleccionadas en tres estadios (verde,
a la cosecha y postcosecha) en relacin a sus parmetros agronmicos de maduracin en
dos temporadas
A continuacin en la Tabla 6, se muestran los resultados obtenidos para todos los frutos en
estudio de la Regin del Biobo, respecto a su dimetro, peso y pH, segn localidad y estadio de
maduracin. La mayora de las especies muestran un aumento en el peso fresco. Arrayn present
un importante cambio en el dimetro y en el peso. Peumo tiene importantes bajas en el pH a
medida que madura en ambas localidades. El pH de lleuque es comparativamente ms bajo que
todas las especies. Este fruto presenta un importante crecimiento entre los estadios V y T en
ambas localidades. Pitao, belloto y naranjillo presentan pH de valores similares. Los frutos de
mayor peso son los de belloto.
33
Tabla 6. Valores de pH, dimetro (mm) y peso (g) durante la maduracin en frutos de arrayn, peumo, lleuque,
pitao, belloto del sur y naranjillo colectados en diversas localidades de la VIII y IX Regin. Letras diferentes, para
cada parmetro evaluado, indican diferencias significativas entre estadios en cada especie y localidad (P 0,05).
34
2.1.2.- Firmeza.
A continuacin se expone la evolucin de la firmeza y el color en frutos de peumo y arrayn
analizados en CREAS-INIA (Fig. 16).
Figura 16. Evolucin de la firmeza y color de peumo y arrayan durante la maduracin de sus frutos. Firmeza
(N) en frutos de arrayan y peumo en funcin del estadio de maduracin.
En ambas especies, la firmeza del fruto se redujo significativamente a travs del proceso
de maduracin. Peumo mostr una alta firmeza en el estado maduro (P<0.05). El color del fruto
durante el periodo de maduracin, en arrayan cambi de verde a negro, mientras que en peumo
desde verde a rosado oscuro (Fig. 16).
35
Figura 17. Evolucin de CSS (Brix) en L. apiculata, C. alba y P. andina en diferentes localidades de la
Regin del Biobo (C=costa; SF=San Fabin). El CSS se midi en Brix en funcin del estado de maduracin
de cada especie. Letras diferentes indican diferencias significativas entre estadios en cada localidad (P<0.05).
36
Figura 18. Evolucin de CSS (Brix) durante la maduracin de frutos de naranjillo, pitao y belloto del sur.
Letras diferentes indican diferencias significativas entre estadios (P<0.05).
37
2.1.4.- Cambios en la pigmentacin de los frutos.
Se detectaron cambios importantes en los principales parmetros del color entre los
estadios de maduracin de los frutos de las especies estudiadas (Tabla 7). En el caso del lleuque
de Angol las diferencias entre los estadios T y M no son tan notorias al comparar todos parmetros.
Tabla 7. Cambios en los diferentes parmetros del color durante la maduracin en frutos de arrayn, peumo,
lleuque, belloto, naranjillo y pitao. Colectados en la VIII y IX Regin.
38
2.2.- Determinacin de la tasa respiratoria.
A continuacin se expone la evolucin de la tasa respiratoria en ambas especies en las
que fue posible la determinacin: peumo y arrayan (Fig. 19). En relacin a las restantes especies,
dado su no disponibilidad no fue posible hacer la evaluacin.
Figura 19. Tasa respiratoria de frutos de arrayan en funcin del estado de madurez. Los datos corresponden
a las medias ES. Se consideraron 3 repeticiones de 50 frutos de cada estado, para cada especie.
39
2.3.- Cuantificacin de polmeros de pared celular.
Figura 20. Evolucin de la concentracin de residuos solubles en alcohol (mg de AIR por peso fresco de fruto)
a travs de la maduracin de frutos de belloto del sur, pitao y naranjillo. Las letras indican diferencias
significativas entre estadios en cada especie (P<0.05).
40
En el caso de lleuque y arrayn se produjo una disminucin en el contenido de pared
celular entre los estadios de T y M en la localidad de San Fabin, mientras que para Angol y
Concepcin esta disminucin se produjo entre los estadios verde y transicin, respectivamente
(Fig. 21). Para el caso de peumo, no hubo variaciones en el contenido de pared celular a travs de
la maduracin y entre localidades.
Figura 21 Evolucin de la concentracin de residuos solubles en alcohol (mg de AIR por peso fresco de fruto)
a travs de la maduracin de frutos de lleuque, arrayan y peumo en dos localidades. Localidades: SF=San
Fabian; C=Concepcin (RN Nonguen); A= Angol. Las letras indican diferencias significativas entre estadios de
cada localidad (P<0.05).
41
2.3.2.- Fraccionamiento de la pared celular.
2.3.2.1.- Cuantificacin de la fraccin soluble en agua (WSF):
-1
Figura 22. Evolucin de la concentracin de cidos urnicos (AU, como ug mg AIR) en la fraccin WSF en
diferentes localidades y estadios de lleuque y arrayn (V, T y M). Las letras indican diferencias significativas
entre estadios de cada localidad (P < 0.05). Localidades: Angol, San Fabin y Concepcin (RN Nongun).
42
2.3.2.2.- Cuantificacin de la fraccin soluble en CDTA (CSF):
-1
Figura 23. Evolucin de la concentracin de cidos urnicos (AU, como ug mg AIR) en la fraccin CSF en
diferentes localidades y estadios de lleuque y arrayn (V, T y M). Las letras indican diferencias significativas
entre estadios de cada localidad (P < 0.05). Localidades: Angol, San Fabin y Concepcin (RN Nongun).
43
2.3.2.3.- Cuantificacin de la fraccin soluble en Na2CO3 (NSF):
La NSF de lleuque y arrayn disminuye a entre los estadios T y M en San Fabin para
ambas especies y en Concepcin slo para arrayn (Fig. 24). Los frutos de lleuque provenientes
de Angol no experimentan una disminucin en la concentracin de NSF.
-1
Figura 24. Evolucin de la concentracin de cidos urnicos (AU, como ug mg AIR) en la fraccin NSF en
diferentes localidades y estadios de lleuque y arrayn (V, T y M). Las letras indican diferencias significativas
entre estadios de cada localidad (P < 0.05). Localidades: Angol, San Fabin y Concepcin (RN Nongun).
44
2.3.3.- Cambios en el contenido de lignina.
En el caso del belloto del sur, se observ un aumento significativo en la concentracin de
lignina durante el proceso de maduracin (Fig. 25). En el caso de pitao y naranjillo se observ una
disminucin significativa en la concentracin de lignina durante el proceso de maduracin (Figs. 26
y 27, respectivamente).
Figura 25. La concentracin de lignina en Belloto del sur (ug/gPF) fue cuantificada en funcin del estado de
maduracin de la especie. Letras diferentes indican diferencias significativas entre estadios de la localidad
(P<0.05).
Figura 26. La concentracin de lignina en pitao (ug/gPF) fue cuantificada en funcin del estado de
maduracin de la especie. Letras diferentes indican diferencias significativas entre estadios de la localidad
(P<0.05).
Figura 27. La concentracin de lignina en naranjillo (ug/gPF) fue cuantificada en funcin del estado de
maduracin de la especie. Letras diferentes indican diferencias significativas entre estadios de la localidad
(P<0.05).
45
En el caso de lleuque, arrayn y peumo se observ una disminucin significativa en la concentracin
de lignina durante el proceso de maduracin (Fig. 28).
Figura 28. Evolucin de la concentracin de lignina (ug/gPF) en lleuque, arrayn y peumo a travs de la
maduracin en diferentes localidades (A=Angol; C=Concepcin (RN Nongun); SF=San Fabin). Letras
diferentes indican diferencias significativas entre estadios de la localidad (P<0.05).
46
Objetivo 3: Caracterizar componentes relacionados a propiedades saludables en frutos en
tres estadios (verde, a la cosecha y postcosecha) en dos temporadas
Tabla 8. Contenido de polifenoles totales (TPC) y actividad antioxidante por tcnicas analticas de FRAP,
TEAC y DPPH en frutos de arrayn y peumo, colectados en Antuco, VIII Regin y Parque Jardn Botnico, V
Regin, respectivamente. Letras iguales, para cada parmetro evaluado no difieren significativamente entre s
(p 0,05).
ARRAYN
47
de los polifenoles totales respecto a la capacidad antioxidante fue del 90 %, indicando que si bien
los polifenoles aportan a esta capacidad antioxidante habran otras molculas que pueden aportar
a esta capacidad (Fig. 29).
Figura 29. Anlisis de correlacin. (A) Correlacin entre el contenido de polifenoles totales y croma; (B)
correlacin entre en contenido de polifenoles totales y la capacidad antioxidante determinada por TEAC.
48
Tabla 9. Contenido de humedad, actividad y rendimiento de extraccin de muestras frescas de las especies
en estudio
Parmetro Hojas Frutos
Arrayn Lleuque Peumo Arrayn Lleuque Peumo
Humedad (%) 82.0 0.9 76.9 4.1 72.9 4.2 84.5 0.1 84.1 2.1 73.9 0.2
Actividad de 0.84 0.01 0.72 0.01 0.67 0.01 0.85 0.01 0.83 0.01 0.7 0.01
agua, aw
Rendimiento de 5.18 0.1 5.34 0.1 5.90 0.1 30.8 0.1 28.9 0.1 28.1 0.1
extraccin (%)
Los valores representan la media desviacin estndar de tres replicas y dos ensayos independientes.
Los extractos de frutos presentaron una amplia capacidad antimicrobiana, mientras que
nicamente los extractos de hojas de arrayn y peumo mostraron actividad antimicrobiana mnima
contra dos cepas de S. aureus (Tabla 10). En general los extractos de fruto de arrayn mostraron
actividad antimicrobiana superiores y significativamente mayores que los extractos de fruto de
peumo y lleuque. Esto puede estar relacionada con el alto contenido fenlico y la capacidad
antioxidante de estos frutos. De particular inters es la capacidad que tienen estos extractos de
inhibir el crecimiento de S. aureus, incluyendo una cepa resistente a los antibiticos (Tabla 10).
49
Tabla 10. Actividad antimicrobiana de extractos de plantas nativas (arrayn, peumo, lleuque) contra bacterias patognicas mediante el mtodo de difusin de disco.
S. aureus 25923 ND ND ND 12.3 0.11c,c 9.33 0.31b,d 7.83 1.18e,e ND 19.5 0.58c,b 21.0 4.83a
S. aureus MRSA 8.00 8.00 0.10a,d ND 14.7 0.12a,a 8.32 0.35c,c 8.67 0.47a,c ND 10.2 0.96e,b 11.2 2.06e,b
a,d
0.10
S. aureus ST-2011 8.00 7.5 0.10a,e ND 15.0 0.11a,b 12.7 0.19a,c 8.50 0.24a,d ND 32.2 2.63a 14.0 0.82C,b
a,e
0.10
E. coli O157:H7 ND ND ND 12.0 0.10c,c 8.21 0.19c.d ND ND 19.5 1.73c,a 14.7 0.96c,b
E. coli (non- ND ND ND 10.3 0.10d,c 7.85 0.21c,d ND ND 16.5 0.58d,a 12.7 0.96d,b
toxigenic)
S. enteritidis ND ND ND 14.3 0.12a,c 8.00 0.11c,d 7.00 1.41d,d ND 20.7 0.96b,a 18.0 1.83b,b
S. newport ND ND ND 14.0 0.11a,b 8.00 0.10c,c 8.33 1.89b,c ND 20.7 0.50b,a 13.5 1.29c,b
L. monocytogenes ND ND 6.00 0.00a,d 13.3 0.09b,b ND 8.17 0.24b,c ND 19.7 0.50c,a 13.5 1.29c,b
L. innocua ND ND 6.00 0.00a,c 13.0 0.11b,b ND 7.83 0.24c ND 20.2 0.50b,a 13.5 0.58c,b
50
Las infecciones causadas por bacterias de la familia Staphylococcus generalmente estn
relacionadas con infecciones de piel, por lo que la capacidad de los extractos de arrayn abre una
potencial aplicacin de stos para uso tpico. Ms cuando la concentracin mnima de inhibicin
de estos microorganismos se encuentra en el orden de menor a 500 g/mL (Tabla 11). De inters
sera evaluar posteriormente la capacidad de los extractos contra levaduras, que son clnicamente
conocidas por causar enfermedades drmicas. El control de bacterias de las familias de
Salmonella, Escherichia y Listeria abre la posibilidad de emplear extractos de fruto de arrayn en
pelculas biocomestibles por ejemplo. De esta manera sera posible proteger alimentos frescos y
procesados contra actividades de deterioro (capacidad antioxidante de los extractos) e inhibir el
crecimiento de microorganismos patognicos y deteriorantes. Se estima que es necesario
profundizar la investigacin en este mbito, ampliando el nmero de ensayos para evaluar esta
aplicacin en funcin del microorganismo objetivo a controlar y su potencial uso mediante la
inclusin en diversas matrices tanto alimenticias como farmacolgicas.
Tabla 11. Mnima concentracin inhibitoria (CMI) de extractos metanlicos de plantas nativas (arrayn,
peumo, lleuque) contra microorganismos patognicos.
CMI (g/mL)
Cepas
bacterianas Extracto de hojas Extracto de frutos
Arrayn Peumo Lleuque Arrayn Peumo Lleuque
S. aureus
25428 NE NE NE 424 0.06d,c 611 1.14b,b 1000 0.35a,a
S. aureus
MRSA 454 1.00a 1039 0.75a NE 474 1.11d,c 965 1.12a,b 1031 1.01a,a
S. aureus ST-
2011 440 0.99a 1050 1.12a NE 435 0.98d,b 454 0.98a,b 1039 1.14a,a
b,a a,b
E. coli O157:H7 NE NE NE 611 1.12 450 1.12 NE
E. coli (non-
toxigenic) NE NE NE 531 1.12c,b 890 1.14a,a NE
a,a
S. typhimurium NE NE NE 890 0.38 615 1.14a,b 857 1.05b,a
d,c a,b a,a
S. enteritidis NE NE NE 454 1.35 965 1.12 1019 1.13
a,a b,c b,b
S. newport NE NE NE 965 1.14 675 0.87 860 1.17
L.
monocytogenes NE NE NE 450 1.14d,c 965 1.12a,a 798 1.69c,b
L. innocua NE NE NE 531 0.78c,b NE 724 1.17c,a
Los valores representan el promedio desviacin estndar de seis rplicas y dos ensayos independientes.
Valores seguidos por una letra mayscula diferente entre columnas son significativamente diferentes (p < 0.05).
Valores seguidos por una letra minscula diferente entre filas son significativamente diferentes (p < 0.05).
NE: No evaluado. Solo extractos que mostraron actividad antimicrobiana mediante el mtodo de difusin de discos
fueron evaluados para CMI.
51
3.2.3.- Ensayos funcionales en aorta de rata.
Para ello, se utilizaron tres extractos: (1) hoja de Peumo (Peumo-H), (2) hoja de Arrayn
(Arrayan-H) y (3) fruto de Arrayn (Arrayan-F). Para cada extracto se evala su capacidad para
proteger la relajacin dependiente de endotelio, de anillos de aorta de rata pre-incubados con alta
glucosa (HG, D-glucosa 25 mM)
Como lo muestran en las Figura 30, cuando los anillos articos fueron pre-incubados por 3
h con HG, el efecto vasodilatador mximo (Emax) tpico de ACh se redujo drsticamente desde
87,69 2,59% (N = 6) a 40,54 1,78% (N = 6).
Figura 30. Relajacin inducida por ACh en anillos de aorta de rata pre-contrados con fenilefrina (PE, 10-7 M)
y pre-incubados con HG y extractos. Curva concentracin-respuesta acumulativa de ACh (10-10 - 10-5 M) en
anillos de aorta de pre-incubados durante 3 h en presencia de D-glucosa 5 mM (control), D-glucosa 25 mM
(HG), y HG ms cada extracto a tres concentraciones (0.1, 1 y 10 mg/ml). Los resultados (promedio + SEM)
se expresan como porcentaje de inhibicin (% Relajacin) de la contraccin inducida por PE (10-7 M). Los
valores de Emax (%) y pD2 se muestran en la Tabla 1 del Informe Anexo (ver anexo).
52
El efecto negativo de HG sobre la relajacin dependiente de endotelio en aorta, se revirti
parcialmente en los vasos co-incubados con los extractos, siendo significativo en las
concentraciones de 1 y 10 mg/ml en hoja de peumo, concentracin de 10 mg/ml en hoja de
Arrayan y en todas las concentraciones para frutos de arrayan. A partir de lo anterior se observa un
efecto protector de los extractos, dependiente de su concentracin. Por su parte, la proteccin
otorgada por fruto de arrayan fue casi 100 veces mayor en trminos de eficacia, respecto de las
hojas. Se concluye que todos los extractos muestra un efecto protector, dependiente de
concentracin, respecto de la relajacin dependiente de endotelio, inducida por ACh en anillos de
aorta de rata pre-tratados con altos niveles de glucosa. Estos resultados sugieren que estos
extractos pueden tener un importante uso en la prevencin de daos vasculares producidos por
enfermedades como la diabetes o hipertensin arterial.
53
4.- Divulgar hacia la comunidad los resultados y conclusiones obtenidos (ver
anexo Difusin por detalles).
-Asistencia a congresos cientficos: durante los dos aos de proyecto se presentaron trabajos tanto
en reuniones cientficas nacionales como internacionales. Se presentaron 9 trabajos a congresos
nacionales (destacable presencia en el Tercer Congreso Nacional de Flora Nativa) y 2 a
internacionales (ver anexo).
-Publicaciones de divulgacin: se realiz dos publicaciones de divulgacin del tema general del
proyecto. Una en la revista del INIA Tierra Adentro (Frutos Nativos: Fuente de Ingredientes
Bioactivos para la Creacin de los Nuevos Alimentos Saludables) y otra en la revista agroindustrial
Indualimentos (Potencial Agroalimentario de Especies Nativas Un Camino hacia el Manejo
Sustentable de nuestra Flora Nativa?)
-Realizacin de Seminarios: Cabe destacar la realizacin de dos actividades de difusin del tema
del proyecto a la comunidad general. El 2 de agosto de 2013 se realiz el seminario Valorizacin
de rboles frutales nativos con potencial productivo en la Regin del Biobo, realizado en la
comuna de San Fabin de Alico, VIII Regin, con presencia de estudiantes secundarios,
agricultores, y autoridades locales de la comuna. Por otra parte, el 29 de agosto de 2013 se
organiz el Seminario Flora chilena como fuente de antioxidantes: una alternativa para reforzar la
agroindustria nacional realizado en INIA, La Cruz, V Regin.
-Charlas a la comunidad estudiantil: realizacin de dos charlas a liceos de la comuna de Lota, VIII
Regin, en relacin a la importancia de la biodiversidad de nuestro pas y el valor de los frutos
nativos. Adems, se ha contemplado, realizar dos charlas el 7 de octubre de 2013 a travs del
programa Explora de Conicyt titulada: Bosque nativo, una fuente de beneficios para la salud.
-Divulgacin del marco general del proyecto y algunos resultados a travs de portales
institucionales y otros de Internet: es importante sealar que se cre la pgina web Frutos Nativos
(www.frutosnativos.udec.cl) para divulgar a la comunidad en general sobre el tema del proyecto.
-Entrevista en TVU al Investigador responsable del proyecto: en entrevista canal regional TVU (11
de mayo de 2013), sobre lnea de investigacin en frutos nativos, se incluy el tema del proyecto
CONAF 064/2011. Ver entrevista en: https://www.youtube.com/watch?v=52JXpw67AlE
54
-Adems, el proyecto en general, los resultados y la importancia de la flora nativa fue difundida a
travs de distintos medios de comunicacin impresos y portales. En la siguiente tabla se muestra la
lista de portales donde se difundi el proyecto:
55
IV. PRINCIPALES CONCLUSIONES
- Belloto del sur y naranjillo, sus yemas vegetativas no lograron reaccionar para su establecimiento
en el cultivo in vitro, bajo las condiciones ensayadas.
-De acuerdo a los resultados obtenidos a la fecha, el establecimiento del cultivo in vitro de material
adulto de las especies en estudios depende del estado de desarrollo ontognico (grado de
lignificacin de los tejidos caulinares) y poca del ao.
-Es necesario suplementar los medios de cultivo con dosis bajas de giberelinas para lograr
elongacin de yemas vegetativas en lleuque.
- Arrayn y peumo presentan un aumento progresivo en el peso conforme avanza la madurez del
fruto. En cuanto a las dimensiones, peumo es un fruto que principalmente crece en longitud,
mientras arrayn crece en dimetro, hacindose ms redondo en la madurez. El fruto de arrayn
es un fruto ms bien neutro de baja acidez.
- Los frutos de naranjillo y peumo, mostraron sus mayores diferencias en relacin al color durante
la maduracin, pasando de un color verde en su estado inmaduro a un color negro y rojo en su
estado final de maduracin, respectivamente. Por otra parte, arrayn y lleuque presentaron la
mayor cantidad de diferencias organolpticas durante la maduracin, en especial la concentracin
de slidos solubles (CSS) aumenta notoriamente hacia la maduracin, teniendo ambas especies
valores relativamente altos, indicando que sus frutos al estado de madurez presentan altos
56
contenidos de azcar.
-Los resultados de concentracin de AIR informan que, al igual que en lignina, existe una
disminucin en el contenido de pared celular a medida que transcurre la maduracin. Dichas
respuestas pueden estar asociadas a la despolimerizacin y solubilizacin de los componentes de
la pared celular. En el caso de arrayn y lleuque se observ cambios drsticos en el contenido de
AIR de las localidades prospectadas. El arrayn muestra disminuciones de un 50% entre el estadio
verde y maduro, mientras que el lleuque slo disminuye un 25% entre estadios, indicando que este
fruto no sufre tantos cambios en la estructura de su pared a medida que madura.
-El anlisis de las fracciones pcticas (CSF y NSF) indica que el lleuque y arrayn presentan una
mayor concentracin de pectinas a medida que maduran. Esta acumulacin de pectinas durante la
maduracin puede estar dada por sntesis de componentes pcticos de la pared celular
(probablemente de interaccin covalente) lo que podra potenciar a estas especies en la
produccin de agentes gelificantes y/o espesantes.
- El contenido de lignina de los frutos mostr una tendencia decreciente durante el transcurso de la
maduracin. Esta baja en la concentracin de lignina puede estar asociada al proceso de
ablandamiento que ocurre durante la maduracin del fruto. Durante la investigacin fue posible
establecer diferencias comparativas entre los diferentes estadios de cada especie. En el caso de
peumo, arrayan y lleuque se logr determinar que existen diferencias entre las distintas
localidades muestreadas. Estos cambios pueden tener una explicacin dadas las condiciones
climticas propias de cada sector, y los efectos de estas en la maduracin.
-Los extractos metanlicos de frutos son significativamente ms eficientes que los extractos de
hojas en la inhibicin de microorganismos patognicos. Dentro de estos, los extractos de fruto de
arrayn demostraron capacidades muy interesantes contra microorganismos conocidos por iniciar
enfermedades cutneas (S. aureus). Ms an, la concentracin mnima de inhibicin de estas
bacterias, se encuentra dentro las ms bajas en el estudio. Estos resultados abren posibilidades de
uso de los extractos en formulaciones de uso tpico.
-Respecto a los anlisis funcionales de relajacin de aorta de rata. Los extractos de hoja y frutos
de peumo y frutos de arrayn mostraron ser capaces de relajar los anillos de aorta. Las muestras
de frutos de arrayan y las muestras de hojas de peumo mostraron una actividad a concentraciones
bajas de extracto 0,1 mg/ml y 1 mg/ml respectivamente. Estos resultados indican que los extractos
de ambas especies pueden tener un uso en la prevencin de hipertensin.
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V. RECOMENDACIONES
Las especies arrayn, lleuque y peumo son las especies ms promisorias de acuerdo a los
resultados obtenidos en este proyecto. Por ejemplo, es posible recomendar tanto a lleuque como
arrayn para el desarrollo de la industria agroalimentaria debido a que presentan caractersticas
interesantes (principalmente color atractivo, dulzor, contenido de pectinas). Adems, arrayn posee
una propiedades antioxidantes notables, un potencial antimicrobiano para la industria de proteccin
drmica y para inocuidad alimentaria. Por otra parte, tanto arrayn como peumo podran tener un
uso en la prevencin de hipertensin como indican los resultados de bioactividad en aorta de rata.
A todo esto se suma que para estas tres especies se gener un protocolo de asepsia,
establecimiento y multiplicacin in vitro, lo que ayudara a propagar material vegetal y proveer del
material gentico necesario para un futuro programa de mejoramiento de estas especies.
Estos recursos fitogenticos nativos pueden ser la base de innovacin en la industria de los
frutos saludables y bioactivos de Chile con impacto en la industria alimentaria y farmacolgica. En
relacin a las otras especies, aun no es posible descartar su potencial, pues todava falta
profundizar en la investigacin de sus propiedades y potenciales beneficios. Se recomienda a la
Coorporacin Nacional Forestal implementar una lnea de investigacin permanente en el Fondo
de Investigacin del Bosque Nativo que apoye el financiamiento de proyectos destinados a la
investigacin y desarrollo en base a productos forestales no madereros, en especial frutos.
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VI. BIBLIOGRAFIA
AOAC. 2011. International guidelines for laboratories performing microbiological and chemical
analyses of food and pharmaceuticals : an aid to interpretation of ISO/IEC 17025:2005. AOAC
International. Gaithersburg, MD, USA.
Benzie IFF, Strain JJ. 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of
antioxidant power: the FRAP assay. Anal. Biochem. 239, 70-76.
Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C. 1995. Use of free radical method to evaluate antioxidant
activity. Lebensm.-Qwiss.u-Technol. 28, 25-30.
Clinical Laboratory Standards. 2011. Performance Standards for antimicrobial disk susceptibility
test. Approved standard, M2-A6, NCCLS. Document M100-S9. 10th Informational Supply. 18 (1).
DAmour J, Gosselin C, Arul J, Castaigne F, Willemot C. 1993. Gamma-radiation affects cell wall
composition of strawberries. J. Food Sci. 58, 182-185.
Galati EM, Mondello MR, Giuffrida D, Dugo G, Miceli N, Pergolizzi S, Taviano MF. 2003. Chemical
characterization and biological effects of Sicilian Opuntia ficus indica (L.) Mill. Fruit juice: antioxidant
and antiulcerogenic activity. J. Agric. Food Chem. 51, 4903-4908.
Hsu W-Y, Simonne A, Weissman A, Kim J-M. 2010. Antimicrobial activity of greater Galangal
[Alpina galanga (Linn.) Swartz.] flowers. Food Sci. Biotechnol. 19, 873-880.
Murcia MA, Egea I, Romojaro F, Parras P, Jimnez AM, Martnez-Tom M. 2004. Antioxidant
evaluation in dessert spices compared with common food additives. Influence of irradiation
procedure. J. Agric. Food Chem. 52, 1872-81.
Singleton VL, Rossi JA. 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-
Phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic. 16, 144-158.
Valdenegro M, Fuentes L, Herrera R, Moya-Leon MA. 2012. Changes in antioxidant capacity during
development and ripening of goldenberry (Physalis peruviana L.) fruit and in response to 1-
methylcyclopropene treatment. Postharvest Biol. Technol. 67, 110117.
Van den Berg R, Haenen GRMM, Van den Berg H, Bast A. 1999. Applicability of an improved
Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay for evaluation of antioxidant capacity
measurements of mixtures. Food Chem. 66, 511517.
59
Vicente AR, Ortugno C, Powell ALT, Greve LC, Labavitch JM. 2007. Temporal sequence of cell wall
disassembly events in developing fruits. 1. Analysis of raspberry (Rubus ideaus). J. Agric. Food
Chem. 55, 4119-4124.
Wimalasiri P, Wills RBH. 1983. Simultaneous analysis of ascorbic and dehydroascorbic acid in fruit
and vegetables by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. 256, 368-371.
Yemm EW, Willis AJ. 1954. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone.
Biochem. J. 57, 508-514.
60