Universidad Politcnica de

GMEZ PALACIO

ANALISIS DE LEVADURA COMERCIAL Saccharomyces cervisiae PARA LA

REMEDIACIN DE SUELOS CONTAMINADOS POR HIDROCARBUROS

Presentado por:

Jorge Alejandro Escalera Villarreal

PROYECTO DE ESTANCIA

PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA LA ACREDITACIN DE LA

CARRERA DE:

Ingeniera en Biotecnologa

REALIZADO EN LA EMPRESA:

Universidad Politcnica de Gmez Palacio

ASESOR ACADMICO: M.C. Olivia Garca Galindo

ASESOR EXTERNO: M.C. Salvador Snchez Muoz
Gmez Palacio, Dgo. (Noviembre, 2016)
 INDICE

Contenido
CARTA DE
ACEPTACION..... 1

CAPITULO I. ANTECEDENTES ............................................................................ 2

A. Historia de la empresa ............................................................................ 2
i. Misin ...................................................................................................... 3
ii. Visin ....................................................................................................... 3
iii. Poltica de calidad................................................................................ 3
iv. Objetivos de calidad ............................................................................ 3
B. Planteamiento del problema................................................................... 4
C. Objetivo general del proyecto ................................................................ 4
D. Objetivos especficos ............................................................................. 4
E. Hiptesis ..................................................................................................... 5
F. Propuesta de solucin ............................................................................... 5
G. Justificacin ............................................................................................ 5
H. Alcances y limitaciones .......................................................................... 5
i. Alcances .................................................................................................. 5
ii. Limitaciones ............................................................................................ 5
I. Metodologa ................................................................................................ 5
CAPITULO II. FUNDAMENTOS ............................................................................. 7
1. Contaminacin por hidrocarburos en Mxico y en el mundo ................. 7
2. Mtodos de remediacin ........................................................................... 8
2.1. Mtodos fisicoqumicos ...................................................................... 9
2.2. Mtodos biolgicos ............................................................................. 9
2.2.1. Bacterias ......................................................................................... 10
2.2.2. Hongos ............................................................................................ 12
2.2.3. Levaduras ....................................................................................... 13
CAPITULO III: METODOLOGIA ........................................................................... 15
 3.1. Metodologa ........................................................................................... 15
3.1.1. Preparacin del medio slido para cultivar la levadura............... 15
3.1.2. Preparacin de medio lquido para hacer un preinculo. ............ 15
3.1.3. Diseo de reactor. .......................................................................... 16
3.1.4. Medicin de densidad ptica ......................................................... 16
3.1.5. Medicin de protenas extracelulares ........................................... 16
CAPITULO IV: RESULTADOS ............................................................................. 17
4.1. Densidad ptica .................................................................................... 18
4.2. Protenas extracelulares ....................................................................... 19
CONCLUSIONES ................................................................................................ 20
CARTA DE TERMINACION 21

Bibliografas. ........................................................................................................ 22
 AGRADECIMIENTOS

A mis padres Jorge Escalera Juregui y Silvia Alejandra Villarreal Santos, por
apoyarme incondicionalmente, por todo su amor, cario, cuidados y enseanzas,
por todo lo que me han dado y ms, estoy infinitamente agradecido con ustedes.

A mi hermana Silvia Alejandra Escalera Villarreal por formar parte de mi vida.

A mi novia Lorena Morales Morales que me ha apoyado y confa en m

incondicionalmente.

Al M.C. Salvador Snchez Muoz por haberme dado la oportunidad de trabajar en

su equipo.

A Mnica por haberme tenido paciencia y ayudarme con la elaboracin de este

proyecto.

A la M.C. Olivia Garca por su paciencia, asesoramiento y las tantas oportunidades

que me dio.
 Carretera El Vergel-La Torrea Km. 0 820, C.P. 35120 Localidad El Vergel, Gmez Palacio, Durango
Mxico, TELFONO: (871) 192-2700

Gmez Palacio, Dgo., a 20 de Septiembre de 2016.

DR. JESS LUNA ANGUIANO

DIRECTOR DE PROGRAMA ACADMICO DE LA CARRERA DE
INGENIERO EN BIOTECNOLOGA
P r e s e n t e.-

Por medio de la presente, me permito informarle que el C. Jorge Alejandro

Escalera Villarreal, alumno con matrcula 15080576 de la carrera que tan
acertadamente Usted dirige, ha sido aceptado en este grupo para realizar su
Estancia, siendo asignado(a) al rea de anlisis microbiolgico, para que
desempee las funciones de analista del proyecto Analisis de levadura comercial
Saccharomyces cerevisiae para la remediacin de suelos contaminados por
hidrocarburos.
As mismo, hago constar que el periodo de realizacin de las 120 horas que
contempla la asignatura, estar comprendido a partir del 20 de Agosto de 2016 al
9 de Diciembre de 2016, con un horario establecido de 14:00 hrs. a 17:00 hrs. de
lunes a viernes.

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan,

quedando a sus rdenes para cualquier duda o aclaracin.

ATENTAMENTE

M.C. Salvador Snchez Muoz

Profesor asignatura Universidad Politcnica de Gmez Palacio
Grupo Bio-Act
8711831883/ bio-act1@hotmail.com

1
 CAPITULO I. ANTECEDENTES

A. Historia de la empresa
Los orgenes de la Universidad Politcnica de Gmez Palacio se inician en
el ao 2005, con la ceremonia de inicio de actividades y firma del decreto de
creacin que tuvo lugar en el saln dorado del hotel villa jardn el mircoles 03 de
agosto de 2005, a las 10:00 a.m. en donde, asistieron 300 personas integradas
por presidentes municipales de la regin lagunera, titulares de las cmaras y
organismos empresariales, empresarios, clubes de servicio, directivos de las
instituciones educativas de nivel medio superior y superior de la regin, mandos
medios de la subsecretara de educacin y estructura educativa de los distintos
niveles, as como los regidores, directores y jefes de departamento del R.
ayuntamiento de Gmez Palacio.

La coordinacin general del evento fue por parte: Ing. Hctor Arreola Soria,
secretario de educacin en el estado, la coordinacin regional estuvo a cargo de:
Lic. Octaviano Rendn Arce presidente municipal de Gmez Palacio C.P. Federico
de Jess Snchez Galindo subsecretario de educacin en la Regin Laguna.
A partir de que el gobernador C.P. Ismael Alfredo Hernndez Deras y dems
miembros del presdium firmaran el decreto de creacin, se comenz a fundar
paso a paso una institucin pblica, que formara parte de la identidad de nuestro
municipio de Gmez Palacio, Durango.
En subsecretaria de educacin pblica regin se comenz a reunir el equipo de
trabajo dirigidos desde el estado de Durango por el Ing. Gilberto Morilln, el enlace
acadmico el Ing. Rolando Cruz Garca. Posteriormente se uni al equipo la Lic.
Cecilia Anaid Hernndez Mata, asistente del enlace acadmico.

A partir de ah se convoca el 31 de Julio del 2005 a profesionales de la

docencia a participar en el proceso de ingreso de profesores mediante el concurso
por oposicin, para el ciclo escolar 2005 2006. Los interesados a participar en el

2
proceso de ingreso, hicieron llegar a las oficinas del CETIS No. 47, su
documentacin original y copia para su cotejo.

El 12 de Septiembre de 2005 la Universidad Politcnica de Gmez Palacio,

inicio sus clases con un total de 167 alumnos inscritos en las tres carreras, Ing. En
Tecnologas de la Informacin, Ingeniera en Tecnologa de Manufactura Industrial
e Ing. en Biotecnologa.

i. Misin
Impartir educacin superior de calidad mediante un modelo educativo basado
en competencias fortalecido a travs de procesos certificados y acreditados,
impulsando la formacin integral y visin emprendedora del ser humano que
contribuya en el desarrollo econmico, social y cultural de la regin y el pas
promoviendo la sustentabilidad de su entorno.

ii. Visin
Ser reconocidos nacional e internacionalmente como una universidad de
excelencia.

iii. Poltica de calidad

En la Universidad Politcnica de Gmez Palacio se imparte educacin superior
utilizando mtodos centrados en el aprendizaje que permitan la formacin integral
de profesionistas, basndonos en un sistema de gestin de calidad con el
compromiso de mejorarlo continuamente.

iv. Objetivos de calidad

Incrementar la eficiencia terminal.
Incrementar el ndice de satisfaccin del sector productivo respecto a los
alumnos en estada.
Incrementar el ndice de retencin por cuatrimestre.
Incrementar el nmero de docentes capacitados en EBC

3
 B. Planteamiento del problema
La creciente contaminacin accidental o provocada de suelos por hidrocarburos
derivados del petrleo estn aumentando la demanda en la descontaminacin de
suelos y ha conducido a la posibilidad del uso de microorganismos como
bacterias, hongos (mohos) y levaduras capaces de degradar los compuestos
orgnicos de los hidrocarburos para la recuperacin de las reas afectadas por
medio de procesos biolgicos como la biorremediacin.
Entre las ms severas contaminaciones se destacan las que se producen a
causa de la extraccin y el manejo del petrleo en nuestro pas. En el suelo los
hidrocarburos impiden el intercambio de gases con la atmosfera dando paso a una
serie de procesos fsico-qumicos como evaporacin y penetracin, que
dependiendo del tipo de hidrocarburo y sus propiedades fsicas y qumicas, as
como de las caractersticas del suelo y de la cantidad derramada de hidrocarburo,
pueden ser ms o menos lentos, ocasionando mayor toxicidad, adems de una
alta o extrema salinidad, dificultando su tratamiento.

C. Objetivo general del proyecto

Estudiar la capacidad de la levadura Saccharomyces cerevisiae para degradar
hidrocarburos presentes en combustibles fsiles.

D. Objetivos especficos
- Obtener la levadura comercial a sembrar
- Obtener el sustrato (diesel)
- Preparar el hidrocarburo a una concentracin de 5%
- Preparar tres medios de cultivo YPDE y Bushnell Hass (medio mnimo de sales)
para cada sustrato y para cada uno de las diluciones correspondientes
- Inocular la muestra de levadura en cada medio
- Observar el desarrollo de la levadura en los distintos medios.

4
 E. Hiptesis
La levadura oxida y degrada los compuestos orgnicos de los sustratos
empleados.
F. Propuesta de solucin
El uso de microorganismos para una remediacin de suelos contaminados por
hidrocarburos que sea ms amigable para el medio ambiente.
G. Justificacin
Como respuesta a la creciente contaminacin tanto de suelo y agua, generada
por derrames accidentales y provocados de hidrocarburos del petrleo, se han
implementado diversos sistemas biolgicos encaminados a la limpieza y
recuperacin de las reas impactadas por estos contaminantes orgnicos.

H. Alcances y limitaciones
i. Alcances
Estudiar las levaduras que sean capaces de degradar los hidrocarburos
satisfactoriamente.

ii. Limitaciones
Las limitaciones del proyecto son la disponibilidad y cantidad de sustratos y de
reactivos para la preparacin de los medios nutritivos.

I. Metodologa
El proyecto se llev a cabo en los laboratorios de Biotecnologa de la
Universidad Politcnica de Gmez Palacio. Se utilizaron diversos sustratos de
hidrocarburo necesarios para llevar a cabo el experimento (gasolina verde,
gasolina roja y diesel), realizamos una serie de diluciones para tener diferentes
concentraciones del sustrato y as poder observar la respuesta de la levadura en
las distintas concentraciones de cada tipo de gasolina, una vez realizadas las
diluciones procedimos a pesar los reactivos necesarios para preparar los medios y
ya pesados los reactivos proseguimos con la preparacin de los medios agitando

5
constantemente el matraz para poder disolver completamente los reactivos y
homogenizar la mezcla por completo, una vez listos los medios, los tapamos con
un tapn de gasa y aluminio y metemos a esterilizar en la autoclave, una vez
terminado el proceso de esterilizacin, agregamos las diluciones de cada
hidrocarburo a los medios (tres cajas por dilucin) y dejamos solidificar

6
 CAPITULO II. FUNDAMENTOS

1. Contaminacin por hidrocarburos en Mxico y en el mundo

La contaminacin del suelo y agua ha venido en aumento como resultado de la
explotacin, refinacin, distribucin y almacenamiento del petrleo y sus
derivados. El volumen de derrames accidentales de petrleo y de sus derivados
fue calculado en 1,5 millones de toneladas por ao, daando suelos, agua y a la
atmsfera (SEMARNAT, 2004).

Uno de los grandes problemas que enfrentan las actividades de una de las
empresas ms conocidas a nivel mundial, petrleos Mexicanos (PEMEX) es la
generacin de residuos peligrosos los cuales representan el 22% de las
emisiones y descargas totales de esta industria, as como los derrames
accidentales o provocados en el agua, suelos y aire (PEMEX, 2000).

Los suelos contaminados por derrames de hidrocarburos son uno de los

problemas ambientales de mayor preocupacin en Mxico y en el mundo, ya que
los accidentes debidos al mal estado de las instalaciones o a tomas clandestinas,
han afectado grandes extensiones de suelo, principalmente de uso agrcola.

En Mxico, la industria del petrleo ha tenido un fuerte impacto negativo en

materia ambiental. Debido a la amplia variedad de productos derivados del
petrleo. El problema de los suelos contaminados con hidrocarburos radica en que
hasta hace pocos aos no exista conciencia del grado de dificultad y el costo que
representa la remediacin de los suelos y cuerpos de agua contaminados para la
sociedad, por lo que resulta ms costoso remediar que prevenir (Saval, 1995).

Actualmente una gran cantidad de sitios contaminados con diferentes tipos de

compuestos, tanto orgnicos como inorgnicos, debido principalmente a las
actividades de la industria minera y petroqumica, adems de la disposicin

7
clandestina y derrames de residuos peligrosos. Como una consecuencia de la
extraccin, conduccin, almacenamiento de petrleo crudo y sus derivados, la
contaminacin del suelo ha sido inevitable, por lo que ha tenido impactos
negativos en los ecosistemas de Veracruz y Tabasco. La contaminacin del suelo
por hidrocarburos del petrleo en el estado de Tabasco (Mxico) ha llegado a
abarcar 0.07% del rea total de este estado (5). El 7 de enero de 2012, la
organizacin Greenpeace realiz un recorrido en la zona conocida como El
Polvorn, en Veracruz, para realizar un reconocimiento de los severos impactos al
medio ambiente ocasionados por el derrame de crudo, ocasionado por un derrame
registrado el 31 de diciembre de 2011 causado por una toma clandestina en el
oleoducto Nuevo Tepeaca-Poza Rica.

Entre las afectaciones observadas fueron los daos a la flora y fauna del lugar,
el agua del Ro Coatzacoalcos, pelicanos y peces, adems de la contaminacin
visible como manchas de petrleo crudo en la playa Villa Allende, en la
desembocadura del ro en el Golfo de Mxico.

Los resultados del muestreo realizado, as como las condiciones observadas en

la zona, son evidencia del incumplimiento y violacin de la normatividad aplicable,
sobre pasaban los lmites establecidos, y cuando esto sucede existe el riesgo de
causar daos a la salud humana ya que entre sus componentes registran altas
concentraciones de sustancias consideradas como peligrosas (Greenpeace,
2012).

Antes de considerar el uso de una tecnologa de remediacin para un sitio en

particular, es indispensable contar con informacin del sitio y llevar a cabo su
caracterizacin, as como la del contaminante a tratar. Posteriormente, la
tecnologa puede elegirse con base en sus costos y a la disponibilidad de
materiales y equipo para realizar el tratamiento.

2. Mtodos de remediacin

8
El trmino tecnologa de tratamiento implica cualquier operacin que altera la
composicin de una sustancia peligrosa o contaminante a travs de reacciones
qumicas, fsicas o biolgicas, de manera que se vea reducida su toxicidad y
volumen del contaminante (EPA, 2001).

2.1. Mtodos fisicoqumicos

Este tipo de tratamientos utiliza las propiedades fsicas y/o qumicas de los
contaminantes del medio contaminado para destruir, separar o reducir la
contaminacin. Estos mtodos pueden realizarse en periodos cortos a
comparacin de los biolgicos pero los residuos generados por estas tcnicas
deben de tratarse o disponerse lo que significa un aumento gradual en los costos
de tratamiento.

2.2. Mtodos biolgicos

Como respuesta a la creciente contaminacin de suelos y agua, generada por

derrames accidentales de hidrocarburos derivados del petrleo, se ha acudido a la
utilizacin de sistemas biolgicos que contribuyan a la oxidacin, degradacin,
transformacin y completa mineralizacin de estos contaminantes.

Estos sistemas de descontaminacin se basan en la digestin de las sustancias

orgnicas que componen los hidrocarburos por medio de microorganismos,
compuestos de los cuales, estos obtienen la fuente de carbono necesaria para el
crecimiento adecuado de las clulas y la energa necesaria para llevar acabo sus
funciones metablicas. Estos microorganismos son capaces de utilizar como
sustrato un hidrocarburo y oxidar los componentes orgnicos y por ende,
degradarlos, a este proceso se le conoce como biorremediacin.

9
 Las medidas de biorremediacin consisten principalmente en el uso de los
microorganismos (bacterias, hongos, levaduras) existentes para degradar o
descomponer sustancias de carcter peligroso en sustancias de carcter menos
peligroso para el medio ambiente y la salud humana y animal. Los mtodos
descontaminacin por medio de agentes biolgicos dependen de la capacidad de
los microorganismos para degradar los contaminantes orgnicos y transformarlos
a productos inocuos como dixido de carbono (CO2), agua (H2O) y biomasa. (Van
Deuren et al, 1997)

El uso de procedimientos biolgicos para limpiar y remediar suelos

contaminados ha recibido especial atencin, por ser de bajo costo, rentable y
ambientalmente amigable, comparado con los procesos fsicos y qumicos. Pero el
uso de estos procedimientos biolgicos puede llevar mucho tiempo para llevar a
cabo una completa restauracin, limpieza y recuperacin de las reas afectadas,
ya que depende de muchos otros factores como la cantidad de contaminante y de
las condiciones ambientales que favorezcan la actividad de los microorganismos
que se utilicen en el proceso.

2.2.1. Bacterias

Las bacterias son seres vivos y estn compuestas al igual que las clulas
eucariotas por protenas, polisacridos, lpidos, cidos nucleicos, entre otros.
Estas molculas a su vez forman parte de estructuras celulares ms complejas,
como por ejemplo la pared celular y la membrana citoplasmtica. Una
caracterstica de los seres vivos es la capacidad para sintetizar sus propios
constituyentes a partir de nutrientes que toman del medio externo.

El trmino metabolismo se refiere al conjunto de reacciones qumicas que tiene

lugar en la clula, y tiene tres funciones especficas:

10
 - Obtener energa qumica del entorno, almacenarla, para utilizar luego en
diferentes funciones celulares.

- Convertir los nutrientes exgenos en unidades precursoras de los

componentes macromoleculares de la clula bacteriana.

- Formar y degradar molculas necesarias para funciones celulares especficas,

como por ejemplo, movilidad y captacin de nutrientes.

(M.T. Madigan, J.M. Martinko y J. Parker., 2003).

El metabolismo tiene lugar a travs de secuencias de reacciones catalizadas

enzimticamente, y se divide en anabolismo y catabolismo. El proceso por el cual
la clula bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como
anabolismo, y como resulta en la produccin de nuevo material celular, tambin se
denomina biosntesis. Y al proceso por el cual la clula degrada u oxida los
componentes se le conoce como catabolismo. (T. Audesirk y G.Audesirk, 2008).

El carbono es la principal fuente de sustrato de la clula. Las bacterias se

pueden dividir de acuerdo a la forma en la que el organismo obtiene o utiliza el
carbono para la construccin de la biomasa:

- Auttrofos: Crecen a partir de sustancias inorgnicas sencillas. Obtienen el

carbono del dixido de carbono (CO2).

- Hetertrofos: Su fuente de carbono es orgnica. El carbono se obtiene de

compuestos orgnicos.

- Quimitrofos: La energa se obtiene de compuestos qumicos externos.

Qumiolitrtofos: Obtienen energa de oxidacin de compuestos

inorgnicos. (SH2 SO, NH3, NO2 - , Fe, etc.).
Quimioorgantrofos: Obtienen energa de oxidacin de compuestos
orgnicos. (Hidratos de carbono, hidrocarburos, lpidos, protenas,
alcoholes).

11
- Fottrofos: La energa se obtiene de la luz.

Fotolitoauttrofos: Obtienen energa de la luz y el carbono de la fijacin

del dixido de carbono
Fotoorgantrofos: Obtienen energa de la luz y el carbono

(Smith, C.A., y Wood, E.J., 1998).

2.2.2. Hongos

Los hongos constituyen uno de los mayores grupos de seres vivos. Se han
descrito unas 80000 especies pero se estima que el nmero real debe
aproximarse al milln y medio de especies. Que presenta una amplia distribucin
en la naturaleza, contribuyendo a la descomposicin de la materia orgnica.
Existen dos grandes grupos de hongos:

- Levaduriformes

- Filamentosos o mohos.

Los hongos son eucariotas, es decir, poseen ncleo, mitocondrias, sistemas de

endomembranas y otros rasgos tpicos de las clulas eucariotas. Carecen de
plastidos por lo que no pueden realizar fotosntesis, son hetertrofos, su pared
celular contiene quitina (un polisacrido nitrogenado) y almacenan glucgeno en
sus clulas como compuesto de reserva.

El tamao de los hongos vara considerablemente. Algunos son unicelulares

(levaduras) la mayora tienen cuerpos vegetativos compuestos por filamentos
microscpicos ramificados llamados hifas. Las hifas son tubos largos y finos, por lo
que tienen una gran superficie externa. Esto constituye una gran ventaja para los
hongos, ya que obtienen su alimento absorbiendo materia orgnica desde el
exterior a travs de las paredes celulares. El conjunto de hifas recibe el nombre de

12
micelio. En una colonia de un hongo filamentoso se produce una diferenciacin en
las funciones del micelio, de tal forma que el micelio vegetativo penetra en el
sustrato para obtener los nutrientes, mientras que el micelio areo se proyecta
hacia el exterior de la colonia y produce las estructuras reproductoras.

Los hongos son hetertrofos, obtienen los nutrientes del medio ambiente, a
partir de materia ya elaborada por otros organismos. Los hongos segregan
enzimas al medio para romper las grandes molculas orgnicas para hacerlas
ms pequeas. El hongo absorbe a travs de las paredes y membranas de las
hifas las molculas pequeas resultantes de la digestin externa y una vez dentro,
utiliza estos compuestos para su metabolismo. (Graham, L., Graham, J.M. &.
Wilcox, L.W. 2006)

2.2.3. Levaduras

Levadura es un nombre genrico que agrupa a una variedad de hongos. Los

hongos son organismos eucariotas tpicos y poseen un ncleo que contiene varios
cromosomas (diecisis en Saccharomyces cerevisiae), las levaduras son
organismos unicelulares. Las levaduras constituyen el grupo de microorganismos
ms ntimamente asociado al progreso y bienestar de la humanidad. Algunas
especies de levaduras del gnero Saccharomyces son capaces de llevar a cabo el
proceso de fermentacin, propiedad que se ha explotado desde hace muchos
aos en la produccin de pan y de bebidas alcohlicas. Dentro del
gnero Saccharomyces, la especie cerevisiae constituye la levadura y el
microorganismo eucariote ms estudiado.

Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxgeno para vivir y es

anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las
bacterias entricas, o como Saccharomyces cerevisiae. En general, cuando un

13
microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla
un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que
requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo
fermentativo.

La levadura Saccharomyces cerevisiae desarrolla ambos tipos de metabolismo;

pero slo produce etanol en condiciones de crecimiento anaerobio (fermentativo).
Al igual que todos los microorganismos necesitan de una fuente de carbono que
les provea energa.

Durante la fase vegetativa, la levadura se divide por gemacin. La clula hija

inicia su crecimiento formando una yema en la clula madre, posteriormente
ocurre la divisin nuclear, la sntesis de la pared y finalmente la separacin de las
dos clulas.

El fundamento bioqumico de la biorremediacin se basa en que en la cadena

respiratoria, o transportadora de electrones de las clulas, se van a producir una
serie de reacciones de xido-reduccin cuyo fin es la obtencin de energa. La
cadena la inicia un sustrato orgnico (compuestos hidrocarburados) que es
externo a la clula y que acta como dador de electrones, de modo que la
actividad metablica de la clula acaba degradando y consumiendo dicha
sustancia. Si utiliza los sulfatos o el dixido de carbono se produce en condiciones
reductoras o anaerobias, y los procesos de biodegradacin sern de tipo
anaerobio. (Levin, L.; Gealt M. 1997)

14
 CAPITULO III: METODOLOGIA

3.1. Metodologa
3.1.1. Preparacin del medio slido para cultivar la levadura

El proyecto se realiz en los laboratorios de gentica, biotecnologa y de

bioprocesos de la Universidad Politcnica de Gmez Palacio.

Se consigui la muestra de la levadura a sembrar y se prepar medio YEPD

slido para un volumen de 80ml con 0.8gr de extracto de levadura, 1.6gr de
dextrosa, 1.6gr de peptona y 1.2gr de agar bacteriolgico con una concentracin
de sustrato del 5% (4ml) para aislar la levadura en el medio. Dejamos incubar a
28 C durante 48 horas (FGRS, 2010).

Observar la degradacin del hidrocarburo y el desarrollo de la levadura

estresada a una concentracin de hidrocarburo del 5%.

3.1.2. Preparacin de medio lquido para hacer un

preinculo

Se prepar un medio YEPD lquido para un volumen de 300ml con 3gr de

extracto de levadura, 6gr de dextrosa y 6gr de peptona con una concentracin de
sustrato de 5% (15ml) para inocular la levadura previamente aislada, con un palillo
de dientes esterilizado se toma una muestra de la levadura y se deposita el palillo
en el medio lquido. Dejamos incubar a 28 C de 12 a 16 horas (CSH
PROTOCOLS, 2010).

3.1.3. Preparacin de medio mnimo de sales

15
 Se necesitaran 4.5gr de (NH4)2SO4, 1.8gr de MgSO4 *7H2O, 1.8gr de K2HPO4 y
0.09gr de FeSO4 *7H2O para un volumen de 900mL. Disolver cuidadosamente los
ingredientes en el orden indicado (Ma. De los Angeles, et. al, 2004).

3.1.4. Diseo de reactor

Se esterilizar el reactor de volumen de 1L junto con el medio mnimo de sales

(900ml) a una temperatura de 121 C durante 15 minutos. Despus de esterilizar
se agreg 5% (50ml) del hidrocarburo y luego se inoculo con la muestra del
preinculo (50ml), todo esto en condiciones de esterilidad. Posteriormente se
configuro el reactor con una agitacin de 70rpm y se dej el tratamiento por 7 das
para observar la degradacin del hidrocarburo y presenciar el aumento de
biomasa (Ali Ashgar N, et. al, 2015).

3.1.5. Medicin de densidad ptica

Se toma una muestra del reactor de 1ml y la depositamos en un tubo

eppendorf, se toma 1ml del blanco y se deposita en otro tubo eppendorf.

Para medir la densidad configuramos el espectrofotmetro a 600nm y vertimos

el contenido de los tubos eppendorf en dos celdillas diferentes, medimos primero
el blanco y despus introducimos la muestra. Registramos los datos arrojados
(Fquim, UNAM).

3.1.6. Medicin de protenas extracelulares

Las muestras previamente tomadas se meten a centrifugar durante 10:00 min a

una velocidad de 10000rpm, a 4 C (Marca: HERMLE LaborTechnik, Modelo: Z326
K). Una vez terminado el proceso de centrifugado se sacan las muestras con

16
cuidado de no homogenizar el pellet con el sobrenadante. Se vaca el
sobrenadante en otro tubo eppendorf.

Preparamos las muestras para medirlas en el espectrofotmetro, en una celdilla

aadimos 800L de agua destilada y 200L de reactivo Bradford para el blanco,
en una segunda celdilla aadimos 700L de agua destilada, 200L de reactivo
Bradford y 100L de la muestra del sobrenadante del blanco de la muestra, en una
tercera celdilla se aaden igualmente 700L de agua destilada, 200L de reactivo
Bradford y 100L del sobrenadante de la muestra D5%.

Configuramos el espectrofotmetro a 595nm, medimos blanco, una vez medido,

introducimos nuestra primer celdilla del blanco de la muestra y registramos el
resultado, luego se introduce la siguiente celdilla de la muestra D5% y registramos
el resultado.

17
 CAPITULO IV: RESULTADOS

4.1. Densidad ptica

Das O.D. (600nm)

1 0.069

2 0.091

3 0.114

4 0.128

5 0.294

0.35
O.D.

0.3

0.25
O.D. 600nm

0.2

0.15 O.D.

0.1

0.05

0
0 1 2 3 4 5 6
t (Das)

18
4.2. Protenas extracelulares

Das Protenas extracelulares (595nm)

1 0.030

2 0.031

3 0.060

4 0.049

5 0.025

0.07 Protenas extracelulares

Protenas extracelulares (595nm)

0.06

0.05

0.04

Protenas
0.03
extracelulares

0.02

0.01

0
0 1 2 3 4 5 6
t (Das)

19
 CONCLUSIONES

La levadura comercial Saccharomyces cervisiae M44 fue capaz de degradar

satisfactoriamente los compuestos orgnicos del hidrocarburo utilizado,
confirmado por el aumento de densidad en el medio que tiene como nica fuente
de carbono al diesel. Con esto se puede decir que los mtodos biolgicos siguen
siendo una arma efectiva contra la contaminacin de suelos y mantos por el
impacto antropognico.

20
 Carretera El Vergel-La Torrea Km. 0 820, C.P. 35120 Localidad El Vergel, Gmez Palacio, Durango
Mxico, TELFONO: (871) 192-2700

Gmez Palacio, Dgo., a 25 de Noviembre de 2016.

DR. JESS LUNA ANGUIANO

DIRECTOR DE PROGRAMA ACADMICO DE LA CARRERA DE
INGENIERO EN BIOTECNOLOGA
P r e s e n t e.-

Por medio de la presente, me permito informarle que el C. Jorge Alejandro

Escalera Villarreal, alumno con matrcula 15080576 de la carrera que tan
acertadamente Usted dirige, ha concluido satisfactoriamente las actividades
encomendadas en su periodo de Estancia, en donde ha realizado un total de 120
horas en trabajos inherentes al desarrollo del proyecto Analisis de levadura
comercial Saccharomyces cerevisiae para la remediacin de suelos contaminados
por hidrocarburos. El periodo de realizacin contempla la asignatura, estuvo
comprendido a partir del 20 de Agosto de 2016 al 9 de Diciembre de 2016.

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan,

quedando a sus rdenes para cualquier duda o aclaracin.

ATENTAMENTE

M.C. Salvador Snchez Muoz

Profesor asignatura Universidad Politcnica de Gmez Palacio
Grupo Bio-Act
8711831883/ bio-act1@hotmail.com

21
Bibliografas.
1. Ronald Ferrera-Cerrato, Norma G. Rojas-Avelizapa, Hctor M. Poggi-
Varaldo, Alejandro Alarcn, Rosa Olivia Caizares-Villanueva; Vol. 48,
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