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MONOGRAFIA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION
HPLC
TACNA, 2016
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INTRODUCCION
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CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTARESOLUCION HPLC
CARACTERISTICAS
TIPOS DE HPLC
Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que provoca la
separacin, la cromatografa lquida de alta resolucin puede ser:
1. Cromatografa de adsorcin.
La fase fija es un slido y se utiliza casi exclusivamente slice (slica) y en
mucha menor medida almina.
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2. Cromatografa de reparto.
En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos
unidos qumicamente a un soporte slido de slica. Se la subdivide en
cromatografa en fase normal y fase reversa.
En la cromatografa en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo
agua o trietilenglicol) y los compuestos menos polares eluyen primero.
En la cromatografa en fase reversa, el compuesto unido qumicamente es
un hidrocarburo aliftico y se emplean fases mviles polares. En este caso,
las sustancias ms polares eluyen primero.
3. Cromatografa inica.
Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio inico para
separar y determinar iones.
VENTAJAS DE SU USO
Sensibilidad.
Rapidez de la tcnica.
Fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas.
Idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolabiles.
Gran aplicabilidad a sustancias que son de gran inters para la industria, la
ciencia y la sociedad en general.
EL METODO
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que se volatilizan a temperaturas elevadas sin degradarse o de las cuales se
obtienen derivados voltiles reproducibles, la HPLC ofrece posibilidades de
separar sustancias o grupos de sustancias poco voltiles o trmicamente
inestables o que solo se transforman con dificultad en sus derivados voltiles.
Puesto que la fase mvil como indica el nombre HPLC ( se denomina tambin
cromatografa lquida de alta solucin) , un lquido, es condicin imprescindible
que la muestra sea soluble en un disolvente. Con excepcin de las redes de
alto peso molecular, esta condicin se cumple en todas las sustancias
orgnicas y las inorgnicas inicas.
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La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando
se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes
de diferentes botellas en una proporcin determinada y realice la mezcla en
una cmara de mezclado. Cuando durante toda la separacin se utiliza siempre
el mismo solvente, se denomina isocrtica, sin embargo es normal realizar un
gradiente de composicin del solvente a lo largo de la cromatografa para
mejorar la eficiencia y acortar la duracin del proceso. Estos gradientes de
solvente tambin son realizados en forma automtica por las bombas.
La bomba enva al solvente a travs de caos de dimetro pequeo,
generalmente de acero inoxidable, hacia la vlvula inyectora. Esta consiste en
una vlvula de seis vas que permite introducir en el flujo de solvente, la
muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Luego de que se
produzca la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan
por el detector. Este produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de
materia y esa seal es enviada al registrador que realiza un grfico de
intensidad en funcin del tiempo (cromatograma) del tipo:
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MATERIALES Y EQUIPOS BASICOS EN UN SISTEMA DE HPLC
COLUMNAS
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TIPO DE COLUMNAS
Columnas analticas
Precolumnas
Columnas termostatizadas
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una columna de HPLC debera mejorar cuando disminuye el tamao de la
partcula.
En la figura es una demostracin experimental de este efecto, y en ella se
observa de una reduccin de tamao de partcula de 45 a 6 um origina una
disminucin de diez o mas veces de la altura del plato.
La eficacia de una columna empaquetada aumenta al disminuir el tamao de
las partculas de la fase estacionaria. El tamao tpico de las partculas en
HPLC es de 3-10 , m. La figura 25.2 ilustra el aumento de resolucin que se
consigue al disminuir el tamao de
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Partcula al pasar de 10 a 5 , m. Se puede ver como se hacen mas estrechos
los picos, y como se resuelve un pico nuevo de los componentes que se eluyen
mas lentamente. La figura 25.2 muestra que al disminuir el tamao de las part-
culas se reduce la altura de plato, incluso a caudales altos. 1 En condiciones
ptimas (cerca del mnimo en la figura 25.3), el nmero de platos tericos de
una columna de longitud L (cm) es2
Una razn de por que las partculas pequeas originan mejor resolucin es que
permiten un flujo mas uniforme a travs de la columna, reduciendo as el
trmino de camino mltiple (A) de la ecuacin de van Deemter .
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La desventaja que tienen las partculas pequeas es la resistencia que ofrecen
al flujo del disolvente. La cromatografa analtica de alta eficacia precisa
presiones de ~ 7-40 MPa (70-400 atm) para alcanzar caudales de ~0,5-5
m1/min.
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COLUMNAS
Todos los equipos HPLC incluyen al menos una bomba para forzar el paso de
la fase mvil a travs de la columna cuyo relleno, muy compacto es
responsable de la sobre presin muy importante a travs del inyector esta
presin puede alcanzar los 20. 000 kPa ( 200 bares) segn el caudal de la
fase mvil , su viscosidad y el tamao de la partcula de la fase mvil.
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La presencia de gases ambientales (N2 O2 y CO2), disueltos en la fase mvil
en cantidades apreciables, puede perturbar las separaciones ya que se
modifica la compresibilidad de los eluyentes y pueden formarse eventualmente
burbujas. Adems el oxgeno acorta la vida til de las columnas e interfiere en
caso de deteccin electroqumica o UV. Por lo tanto es preferible desgasificar
los disolvente , bien por ultrasonido o burbujeando helio, o bies por difusin
hacindolos pasar por un tubo largo y de pequeo dimetro de un material
polimrico permeable al gas.
1. Elucin Isocrtica.
2. Elucin en gradiente
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este caso, se van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al
disolvente A, produciendo as un gradiente contino.
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La figura 25.10 muestra el efecto de aumentar la fuerza eluyente en la elucin
isocrtica de ocho componentes en una columna de fase inversa. En una
separacin con fase inversa, la fuerza eluyente disminuye a medida que el
disolvente se hace mas polar. El primer cromatograma (superior izquierda) se
obtuvo con disolvente que tena un 90% de acetonitrilo y un 10% de tampn
acuoso. El acetonitrilo tiene una gran fuerza eluyente, y eluye todos los
compuestos rpidamente. De hecho, slo se observan cuatro picos, porque los
restantes estn solapados. Es habitual llamar disolvente A al componente
acuoso, y disolvente B al orgnico. El primer cromatograma se obtuvo con un
90% de B. Cuando se redujo la fuerza eluyente utilizando un disolvente con
80% de B, se consigue una separacin algo mejor, observndose cinco picos.
Con un 60% de B, se empiezan a ver seis picos. Con un 40% de B, se ven
claramente ocho picos, pero los picos 2 y 3 no estn completamente resueltos.
Con un 30% de B, todos los picos quedan bien resueltos, pero la separacin
deja que desear porque tarda demasiado. Ajustando a 35% el contenido de B
(el grafico de abajo), se separan todos los picos en poco mas de 2 horas (que
todava es demasiado tiempo para muchos fines).
A partir de los datos obtenidos con las eluciones isocrticas en la figura 25.10,
se eligi el gradiente que se representa en la figura 25.11, con el que se
consigui resolver todos los picos en 38 min. Primero, se trabaj con un 30%
de B (B = acetonitrilo) durante 8 minutos, para separar los componentes 1, 2 y
3. A continuacin se fue aumentando de forma continua la fuerza eluyente
durante 5 minutos hasta alcanzar un 45% de B, y se mantuvo durante 15
minutos, para eluir los picos 4 y 5. Finalmente, se modific el disol vente hasta
alcanzar un 80% de B en 2 minutos, mantenindose esa composicin para eluir
los ltimos picos.
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SELECCIN DEL MODO DE SEPARACIN
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con la polaridad del disolvente, con el mas polar en la base. La fuerza eluyente
del diclorometano (0,30) es mas parecida a la del CHCl 3 (0,26) que a la de los
alcoholes, acetonitrilo o acetato de etilo ( 0,48) Por consiguiente, la figura
25.12 sugiere que debemos probar una cromatografa de adsorcin sobre
slice. El camino que se debera seguir se ha destacado en color.
Si los solutos se disuelven solo en los disolventes no polares o dbilmente
polares, el rbol de decisin sugiere que probemos la cromatografa de fase
inversa. La eleccin puede ser de fase enlazada con grupos octadecilo (C 18),
octilo, butilo, etilo, metilo, fenilo y ciano.
Si los pesos moleculares de los solutos son > 2000, son solubles en
disolventes orgnicos y su dimetro molecular es > 30 nm, la figura 25.12 nos
indica que se intente la cromatografa de exclusin molecular. Las fases
estacionarias en este tipo de separaciones se describen en el captulo
siguiente. Si el peso molecular de los solutos es < 2000 y son solubles en
agua, pero no son inicos, y tienen dimetros < 30 nm, el rbol de decisin nos
dice usar cromatografa de fase inversa, o cromatografa de interaccin
hidrfoba.
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En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Tcnicas del Laborarlo
Moderno ms importantes como herramienta analtica para separar y detectar
compuestos qumicos. Como en todas las tcnicas analticas, los pequeos
problemas a la larga pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y
durabilidad del sistema. Aun con la evolucin de los cromatgrafos lquidos en
la era de la computadora, hay aun problemas que sta no puede resolver.
Hasta los Solventes para HPLC, todos filtrados cuidadosamente en la fbrica,
pueden acumular partculas en suspensin que pueden ser perjudicial a los
componentes del sistema HPLC. Estas partculas en suspensin pueden venir
de varias fuentes, incluso de la exposicin al polvo en el aire durante el
trasegado de solvente en el depsito para solvente, la exposicin a particulares
del aire durante el almacenamiento del solvente en el depsito del solvente, la
degradacin lenta del recipiente solvente, o de condensacin y polimerizacin
del solvente. Las partculas pueden ocasionar costosos daos a la bomba
HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de
HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y
recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.
En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone
el interior del solvente a la atmsfera y empieza a acumular gases disueltos
que se encuentran en la atmsfera. El trasegado del solvente en el depsito
solvente y su almacenamiento en estos depsitos ms este fenmeno. El
Oxgeno Disuelto que constituye el 21% de la atmsfera puede producir mayor
interferencia en los detectores de fluorescencia y electroqumicos. El Nitrgeno
Disuelto es el otro componente de la atmsfera que puede producir burbujas en
la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos
falsos y desviaciones de la lnea base. El Dixido de Carbono disuelto algunas
veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente.
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Mtodos de Desgasificacin de Solventes en HPLC
Existen cuatro (4) mtodos comunes usados para desgasificar solventes en
HPLC previos a su uso:
Sonificacin
Burbujear Helio
Desgasificacin Electrnica en la Lnea del Flujo
Desgasificacin al Vaco en Lnea
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DETECCIN
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Segn el sistema ptico
o Detectores Electroqumicos. Pueden ser clasificados en tres tipos:
Detector Amperomtrico
Detector Conductimtrico
Detector Potenciomtrico
Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroqumicos
para asegurarse anlisis reproducicbles:
Chequear que esten conectados adecuadamente a
tierra la bomba, el detector y registrador (integrador.
Usar bombas reciprocantes de doble piston
Mantener en todo momento el flujo de la fase mvil
en el detector.
Operar con el voltaje adecuado
Monitorear la altura de los picos para observar
cambios en la efiencia que nos indique la necesidad de reacondicionar
los electrodos.
Tener electrodos de referencias extras en solucin
3M de NaOH y reemplazar el electrodo de referencia en la celda 1 2
veces a la semana.
Desconectar el detector electroqumico cuando este
llimpiando las columnas.
Utilizar agua, buffers y solventes orgnicos de alta
pureza.
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TIPOS DE CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN
o Cromatografa de Particin.
o Cromatografa de Adsorcin
o Cromatografa Inica
o Cromatografa de Exclusin
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Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus
posibles causas posibles, y cmo solucionarlos.
o Presin Alta
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o
Guarda Columna por partculas.
Solucin: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente,
teniendo la columna desconectada del detector. Si sto no funciona
reemplace el fritado a la entrada de la columna. Si la presin sigue alta
reemplaze la columna.
Solucin a largo plazo: Asegrese que todas las fases
mviles se filtren propiamente antes que entren a la bomba de HPLC.
Tambin filtre todas las muestras antes de inyectarlas.
o Prdida de la Resolucin
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC del
Guarda Columna por partculas.
Solucin: vea la seccin de Presin Alta
Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se
introduzcan las fases mviles en el sistema de HPLC.
o Picos Hendidos
Posible causa : Obstruccin de la Columna de HPLC o del
Guarda Columna por partculas.
Solucin: Marcha atrs columna roja con presin baja est
al lado de abre. Si es necesario reemplaze el fritado de la entrada o la
columna.
Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se
introduzcan las fases mviles en el sistema de HPLC.
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o El Sistema de Gradiente. La suavidad y reproducibilidad de la mezcla
o Que tipo de servicio ofrecen puede ofrece la casa vendedora
o Suministro de software y compatibilidades
o Cunto se puede pagar!
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
o http://www.restek.cominfo sixport.asp
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