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ESCUELA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE


GROHOMANN

MONOGRAFIA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION
HPLC

DR. MIGUEL ANGEL LARREA CESPEDES

TACNA, 2016

1
INTRODUCCION

Los procedimientos cromatogrficos son procesos separativos basados en que


las sustancias a separar se reparten entre dos fases de forma multiplicativa, es
decir repetida. Una de las fases esa inmvil, o fija (= fase estacionaria) y la otra
fase se mueve (=fase mvil).

Durante la separacin, la fase mvil atraviesa la fase estacionaria. La fase


estacionaria es un slido (adsorbente, sorbente) o un lquido. La fase mvil es
un gas insoluble o un liquido inmiscible con la fase estacionaria y en una nueva
variante un gas supercrtico, es decir un fluido (la denominada SFC
Supercritical fluid Chromatography).

Cromatografa lquida de alta resolucin HPLC se ha convertido, sin lugar a


dudas, en la ms popular y verstil de las tcnicas analticas modernas en los
laboratorios de hoy. Los sistemas de HPLC se utilizan actualmente en una
amplia variedad de campos. Da a da aumentan los requerimientos de
confiabilidad de los datos analticos y de eficiencia en el flujo de trabajo del
laboratorio, para un desarrollo ms rpido de nuevas drogas, para mejorar la
seguridad de los alimentos, y para cumplir con estndares ms altos en
regulaciones ambientales.

La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o


grupos de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como
cuantitativamente

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CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTARESOLUCION HPLC

CARACTERISTICAS

La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en una columna


generalmente de vidrio, la cual est rellena con la fase fija. Luego de sembrar
la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la
columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en
las separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo
hasta el tamao de los micrones, lo cual gener la necesidad de utilizar altas
presiones para lograr que fluya la fase mvil.

De esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta


resolucin (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar
con las altas presiones requeridas.

La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o


grupos de sustancias en un tiempo corto (de minutos hasta 1 hora), tanto
cualitativa como cuantitativamente.

Permite separar sustancias o grupo de sustancias poco voltiles o


trmicamente inestables o que solo se transforman con dificultad en sus
derivados voltiles.

TIPOS DE HPLC

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que provoca la
separacin, la cromatografa lquida de alta resolucin puede ser:

1. Cromatografa de adsorcin.
La fase fija es un slido y se utiliza casi exclusivamente slice (slica) y en
mucha menor medida almina.

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2. Cromatografa de reparto.
En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos
unidos qumicamente a un soporte slido de slica. Se la subdivide en
cromatografa en fase normal y fase reversa.
En la cromatografa en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo
agua o trietilenglicol) y los compuestos menos polares eluyen primero.
En la cromatografa en fase reversa, el compuesto unido qumicamente es
un hidrocarburo aliftico y se emplean fases mviles polares. En este caso,
las sustancias ms polares eluyen primero.

3. Cromatografa inica.
Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio inico para
separar y determinar iones.

4. Cromatografa de exclusin por tamao.


La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que
contienen una red uniforme de poros y llevan a cabo un fraccionamiento
realcionado con el tamao molecular. Las molculas de tamao mayor son
excludas y eluyen primero, mientras que las ms pequeas que penetran
en los poros son retenidas ms tiempo.

VENTAJAS DE SU USO

Sensibilidad.
Rapidez de la tcnica.
Fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas.
Idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolabiles.
Gran aplicabilidad a sustancias que son de gran inters para la industria, la
ciencia y la sociedad en general.

EL METODO

Es un procedimiento que permite muy buenas separaciones dentro de un gran


nmero de sustancias en un corto tiempo ( orden de magnitud: de min. hasta 1
hora) mientras que la cromatografa gaseosa, solo permite separar sustancias

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que se volatilizan a temperaturas elevadas sin degradarse o de las cuales se
obtienen derivados voltiles reproducibles, la HPLC ofrece posibilidades de
separar sustancias o grupos de sustancias poco voltiles o trmicamente
inestables o que solo se transforman con dificultad en sus derivados voltiles.
Puesto que la fase mvil como indica el nombre HPLC ( se denomina tambin
cromatografa lquida de alta solucin) , un lquido, es condicin imprescindible
que la muestra sea soluble en un disolvente. Con excepcin de las redes de
alto peso molecular, esta condicin se cumple en todas las sustancias
orgnicas y las inorgnicas inicas.

La cromatografa de lquidos de alta eficacia (HPLC) utiliza una presin


elevada para forzar el paso del disolvente por una columna que contiene
partculas muy finas, consiguiendo las separaciones de gran resolucin. El
sistema HPLC que se muestra en la figura consta de un sistema de suministro
de disolvente, una vlvula de inyeccin de muestra, una columna de alta
presin, un detector y un ordenador para controlar el sistema y visualizar los
resultados. Actualmente muchos sistemas incluyen adems un horno para
controlar la temperatura de la columna.

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La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando
se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes
de diferentes botellas en una proporcin determinada y realice la mezcla en
una cmara de mezclado. Cuando durante toda la separacin se utiliza siempre
el mismo solvente, se denomina isocrtica, sin embargo es normal realizar un
gradiente de composicin del solvente a lo largo de la cromatografa para
mejorar la eficiencia y acortar la duracin del proceso. Estos gradientes de
solvente tambin son realizados en forma automtica por las bombas.
La bomba enva al solvente a travs de caos de dimetro pequeo,
generalmente de acero inoxidable, hacia la vlvula inyectora. Esta consiste en
una vlvula de seis vas que permite introducir en el flujo de solvente, la
muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Luego de que se
produzca la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan
por el detector. Este produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de
materia y esa seal es enviada al registrador que realiza un grfico de
intensidad en funcin del tiempo (cromatograma) del tipo:

Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un


componente de la muestra original. El integrador calcula adems el rea
correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia.
Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es posible recuperar los
productos que salen de l. De esta manera, dependiendo del tamao del loop
de inyeccin y de la columna, y del tipo de bomba, es posible realizar adems
de separaciones analticas, cromatografas preparativas.

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MATERIALES Y EQUIPOS BASICOS EN UN SISTEMA DE HPLC

Deposito para el eluyente.


Placa filtrante de metal (filtrar el eluyente).
Bomba de alta presin (indicador de flujo).
Vlvula de seguridad.
Manmetro y vaporizador de pulsacin.
Inyector ( sist. con bucle muestras 1 2000 ul, frecuente. De 20 ul).
Detector
Registrador/ Integrador
Micro jeringa.
Recipiente para recogida de disolvente.
Eventualmente: horno termostatizado para la columna.

COLUMNAS

La columna es un tubo recto calibrado la mayora de las columnas de HPLC


estn hechas de acero inoxidable (cromo nquel cromo molibdeno acero)
y menos frecuente de vidrio. Con fines analticos se utiliza por lo general
columnas con un dimetro interno de 2 5 mm. Si se trabaja micro partculas de
5, 7, o 10 10, 15, m de dimetro) la longitud de las columnas ser de 5, 10,
15, 255 cm. dependiendo del tipo de problema, la longitud ser distinta en
funcin del dimetro de las micro partculas.

Exige un flujo mvil de 0,5 a 2 ml/min. La fase estacionaria se mantiene entre


dos discos porosos situados entre sus extremidades cuyos volmenes muertos
deben ser lo ms pequeos posibles actualmente existen una gran gama de
columnas mas estrechas, estas columnas tiene la ventaja, aparte de un
consumo muy reducido del eluyente, ya que unas pocas gotas bastan para
eludir todos los compuestos, de producir una mejor resolucin debido a una
difusin menor, adems muestran una mayor sensibilidad y facilitan el
acoplamiento.

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TIPO DE COLUMNAS

Columnas analticas

La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tiene una longitud


entre 10 y 30 cm. Por lo comn, las columnas son rectas y se pueden alargar,
si es necesario, acoplando dos o ms columnas. En algunas ocasiones se
pueden encontrar columnas configuradas con forma helicoidal aunque el
resultado es una cierta perdida de eficacia. El dimetro interno de las columnas
es a menudo de 4 a 10 mm. y los tamaos de las partculas de los rellenos ms
comunes son 5 o 10 um. Tal vez la columna mas frecuentemente utilizada es la
de 25 cm. de longitud y 4.6 mm de dimetro interno, y rellena con partculas de
5 um. Este tipo de columnas tiene de 40.000 a 60.000 platos/metro.

Recientemente, se ha empezado a fabricar columnas de alta eficacia, ms


rpidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente
descritas. Estas columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1
y 4.6 mm y se rellenan con partculas de tamao de 3 o 5 um. A menudo su
longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen hasta 100000 platos/metro y
presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de disolvente. La
ultima propiedad es de considerable importancia, puestos que los disolventes
de alta pureza que se requieren en cromatografa de lquidos son muy caros.

Precolumnas

En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca


delante una pre columna que elimina no slo la materia en suspensin y los
contaminantes de los disolventes si no tambin componentes de la muestra
que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Adems en cromatografa
liquido-liquido, la precolumna sirve para saturar la fase mvil con la fase
estacionaria y as minimizar las perdidas de esta en la columna analtica. La
composicin del relleno de la precolumna debera ser semejante al de la
columna analtica; sin embargo, el tamao de partcula es por lo comn mayor
para minimizar la cada de presin. Cuando la precolumna se contamina se
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vaca y se rellena de nuevo o se reemplaza por otra nueva del mismo tipo. As,
la precolumna se sacrifica para proteger a la columna analtica, ms cara.

Columnas termostatizadas

En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y


las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si
se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado
centgrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayora de los
instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que
controlan la temperatura de la columna a las dcimas de grado, desde la
temperatura ambiente hasta 100 o 150 C. Para poder controlar con precisin,
las columnas tambin se pueden colocar en camisas con agua que provenga
de un bao de temperatura constante.

TIPOS DE RELLENO DE PARTICULAS

Se distinguen dos tipos de materiales:

Partculas enteramente porosas


Tiene forma irregular o esfrica y dimetros como mximo de 3, 5, o 10 um,
con un intervalo de criba ms estrecho
Partculas esfricas de superficie porosa
Las llamadas porous layer vedas (PLB) o partculas de capa fina con dimetros
de 30-60 um en las que un ncleo imposible de atravesar (por lo general de
vidrio), rodeado por una capa (1-3 um) activa, fina, porosa de silicagel, silicagel
modificado, poliamida, resina cambiadora de iones y similares. Las Plus suelen
utilizarse como material de relleno optimo para columnas previas.

EFICACIA DE LAS COLUMNAS

Efectos del tamao de partcula de relleno


Un examen del coeficiente de transferencia de masa de la fase mvil, revela
que Cm esta relacionada directamente con el cuadrado del dimetro d p de las
partculas que constituyen el relleno. Como consecuencia de ello, la eficacia de

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una columna de HPLC debera mejorar cuando disminuye el tamao de la
partcula.
En la figura es una demostracin experimental de este efecto, y en ella se
observa de una reduccin de tamao de partcula de 45 a 6 um origina una
disminucin de diez o mas veces de la altura del plato.
La eficacia de una columna empaquetada aumenta al disminuir el tamao de
las partculas de la fase estacionaria. El tamao tpico de las partculas en
HPLC es de 3-10 , m. La figura 25.2 ilustra el aumento de resolucin que se
consigue al disminuir el tamao de

Figura .2 Cromatogramas de una misma muestra obtenidos con una columna


empaquetada de partculas de scile,

10
Partcula al pasar de 10 a 5 , m. Se puede ver como se hacen mas estrechos
los picos, y como se resuelve un pico nuevo de los componentes que se eluyen
mas lentamente. La figura 25.2 muestra que al disminuir el tamao de las part-
culas se reduce la altura de plato, incluso a caudales altos. 1 En condiciones
ptimas (cerca del mnimo en la figura 25.3), el nmero de platos tericos de
una columna de longitud L (cm) es2

donde dp es el dimetro de las partculas en micrmetros. Una columna de 15


cm de longitud y partculas de 5 m de dimetro pueden tener 10 4 platos,
aproximadamente. Cuanto mas pequeas son las partculas, mayor es el
nmero de platos.

Una razn de por que las partculas pequeas originan mejor resolucin es que
permiten un flujo mas uniforme a travs de la columna, reduciendo as el
trmino de camino mltiple (A) de la ecuacin de van Deemter .

Otra razn es que el camino que debe recorrer el soluto en su difusin en la


fase mvil que hay entre las partculas es del orden del tamao de las part-
culas. Cuanto mas pequeas son las partculas, menor es la distancia en la que
debe difundirse el soluto en la fase mvil. Este efecto disminuye el trmino C
de la ecuacin de van Deemter, correspondiente al tiempo finito de difusin.

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La desventaja que tienen las partculas pequeas es la resistencia que ofrecen
al flujo del disolvente. La cromatografa analtica de alta eficacia precisa
presiones de ~ 7-40 MPa (70-400 atm) para alcanzar caudales de ~0,5-5
m1/min.

Ensanchamiento de banda extracolumna en cromatografa de lquidos

En cromatografa de lquidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda


significativo fuera del relleno de la columna propiamente dicho. El as llamado
ensanchamiento de banda extra columna tiene lugar como se transporta el
soluto a traves de tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyeccin,
en los detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes del
sistema. El ensanchamiento proviene de las diferencias en la velocidad de flujo
de las capas de lquido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro.
Como consecuencia, la parte central de una banda de soluto se mueve con
ms rapidez que la perfireria. En la cromatografa de gases la difusin
compensa la dispersin extra columna. Sin embargo la difusin compensa la
dispersin extra columna. Sin embargo, la difusin en los lquidos es
significativamente menor y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de
banda se hace evidente.

Se ha demostrado que la contribucin a la altura total del plato de los efectos


extra columna viene dada por

Hex = r2 = velocidad de flujo en cm2/s


r = radio del tubo cm.
24DM Dm = coeficiente de difusin soluto en
fase mvil cm2/s

Efecto del tamao de muestra en la eficacia de la columna

El efecto de la cantidad de muestra (ug de muestra/ g de relleno) sobre la


eficacia en diversos tipos de cromatografa de lquidos, se puede decir que el
mejor comportamiento de los rellenos de fase unida qumicamente es en la
fase inversa comparados con otros rellenos.

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COLUMNAS

BOMBAS PARA ELUYENTES

Todos los equipos HPLC incluyen al menos una bomba para forzar el paso de
la fase mvil a travs de la columna cuyo relleno, muy compacto es
responsable de la sobre presin muy importante a travs del inyector esta
presin puede alcanzar los 20. 000 kPa ( 200 bares) segn el caudal de la
fase mvil , su viscosidad y el tamao de la partcula de la fase mvil.

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La presencia de gases ambientales (N2 O2 y CO2), disueltos en la fase mvil
en cantidades apreciables, puede perturbar las separaciones ya que se
modifica la compresibilidad de los eluyentes y pueden formarse eventualmente
burbujas. Adems el oxgeno acorta la vida til de las columnas e interfiere en
caso de deteccin electroqumica o UV. Por lo tanto es preferible desgasificar
los disolvente , bien por ultrasonido o burbujeando helio, o bies por difusin
hacindolos pasar por un tubo largo y de pequeo dimetro de un material
polimrico permeable al gas.

MODO DE SEPARACIN E INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA

En HPLC existen dos modos posibles de separacin:

1. Elucin Isocrtica.

En este tipo de elucin la composicin de la fase mvil permanece


constante, es decir, la fuerza de elucin es la misma a lo largo de todo el
proceso cromatogrfico. Solo se necesita una bomba en el aparato de
HPLC.

2. Elucin en gradiente

La composicin de la fase mvil, es decir la composicin durante eo


proceso cromatogrfico, se modifica. Esta modificacin puede ser lineal, no
lineal o en etapas. Para programar los cambios de gradientes de la fase
mvil se necesitan los denominados sistemas de gradientes (mezclas de
gradientes de alta y baja presin con ayuda de una bomba adicional por
cada componente a eludir o por medio del sistema de cmaras o vlvulas
de mezclas)

Elucin isocratica y gradiente

La elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla


de disolventes fija). Si un disolvente no permite una elucin suficientemente
rpida de todos los componentes, se puede usar una elucin gradiente. En

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este caso, se van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al
disolvente A, produciendo as un gradiente contino.

Tabla 25.1 Serie eluotropica y longitudes de onda de corte en el ultravioleta de los


disolventes, en cromatografa de adsorcin sobre silice

Fuerza eluyente Corte en el ultravioleta


Disolvente
(nm)
Pentano 0,00 190
Hexano 0,01 195
Heptano 0,01 200
Triclorotrifluoroetano 0,02 231
Tolueno 0,22 284
Cloroformo 0,26 245
Diclorometano 0,3 233
Eter dietlico 0,43 215
Acetato de etilo 0,48 256
Eter metil t-butilico 0,48 210
Dioxano 0,51 215
Acetonitrilo 0,52 190
Acetona 0,53 330
Tetrahidrofurano 0,53 212
2-Propanol 0,60 205
Metanol 0,70 205

El corte en el ultravioleta del agua es 190 nm.

FUENTES: L. R. Snyder en High- Performance Liquid Chromatography (C. Horvth,


ed.), Vol. 3 (New York: Academic Press, 1983); Burdick & Jackson Solvent Guide, 3a
ed. (Muskegon, MI: Burdick & Jackson Laboratories, 1990.)

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La figura 25.10 muestra el efecto de aumentar la fuerza eluyente en la elucin
isocrtica de ocho componentes en una columna de fase inversa. En una
separacin con fase inversa, la fuerza eluyente disminuye a medida que el
disolvente se hace mas polar. El primer cromatograma (superior izquierda) se
obtuvo con disolvente que tena un 90% de acetonitrilo y un 10% de tampn
acuoso. El acetonitrilo tiene una gran fuerza eluyente, y eluye todos los
compuestos rpidamente. De hecho, slo se observan cuatro picos, porque los
restantes estn solapados. Es habitual llamar disolvente A al componente
acuoso, y disolvente B al orgnico. El primer cromatograma se obtuvo con un
90% de B. Cuando se redujo la fuerza eluyente utilizando un disolvente con
80% de B, se consigue una separacin algo mejor, observndose cinco picos.
Con un 60% de B, se empiezan a ver seis picos. Con un 40% de B, se ven
claramente ocho picos, pero los picos 2 y 3 no estn completamente resueltos.
Con un 30% de B, todos los picos quedan bien resueltos, pero la separacin
deja que desear porque tarda demasiado. Ajustando a 35% el contenido de B
(el grafico de abajo), se separan todos los picos en poco mas de 2 horas (que
todava es demasiado tiempo para muchos fines).

A partir de los datos obtenidos con las eluciones isocrticas en la figura 25.10,
se eligi el gradiente que se representa en la figura 25.11, con el que se
consigui resolver todos los picos en 38 min. Primero, se trabaj con un 30%
de B (B = acetonitrilo) durante 8 minutos, para separar los componentes 1, 2 y
3. A continuacin se fue aumentando de forma continua la fuerza eluyente
durante 5 minutos hasta alcanzar un 45% de B, y se mantuvo durante 15
minutos, para eluir los picos 4 y 5. Finalmente, se modific el disol vente hasta
alcanzar un 80% de B en 2 minutos, mantenindose esa composicin para eluir
los ltimos picos.

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SELECCIN DEL MODO DE SEPARACIN

Existen varios modos de separar los componentes de una mezcla dada. La


figura 25.12 es un rbol de decisin para elegir el punto de partida. Si el peso
molecular del analito es menor que 2 000, usar la parte superior de la figura; si
el peso molecular es mayor que 2 000, usar la parte inferior. Supongamos que
tenemos una mezcla de molculas pequeas (peso molecular <2 000), solubles
en diclorometano. La tabla 25.1 es, prcticamente, una ordenacin de acuerdo

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con la polaridad del disolvente, con el mas polar en la base. La fuerza eluyente
del diclorometano (0,30) es mas parecida a la del CHCl 3 (0,26) que a la de los
alcoholes, acetonitrilo o acetato de etilo ( 0,48) Por consiguiente, la figura
25.12 sugiere que debemos probar una cromatografa de adsorcin sobre
slice. El camino que se debera seguir se ha destacado en color.
Si los solutos se disuelven solo en los disolventes no polares o dbilmente
polares, el rbol de decisin sugiere que probemos la cromatografa de fase
inversa. La eleccin puede ser de fase enlazada con grupos octadecilo (C 18),
octilo, butilo, etilo, metilo, fenilo y ciano.
Si los pesos moleculares de los solutos son > 2000, son solubles en
disolventes orgnicos y su dimetro molecular es > 30 nm, la figura 25.12 nos
indica que se intente la cromatografa de exclusin molecular. Las fases
estacionarias en este tipo de separaciones se describen en el captulo
siguiente. Si el peso molecular de los solutos es < 2000 y son solubles en
agua, pero no son inicos, y tienen dimetros < 30 nm, el rbol de decisin nos
dice usar cromatografa de fase inversa, o cromatografa de interaccin
hidrfoba.

ELECCCIN DEL SOLVENTE


Caractersticas:
o Disponible comercialmente
o Precio
o Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad
de pureza cromatogrfica. Bajo contenido de impurezas.
o Disolver la muestra
o Misible con otros solventes para formar mezclas tiles
o No degradar o disolver la fase estacionaria
o Tener baja viscosidad para reducir las cadas de presin
o Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia ptica (cuando se
usan detectores UV)

Filtracin y Desgasificacin de solventes

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En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Tcnicas del Laborarlo
Moderno ms importantes como herramienta analtica para separar y detectar
compuestos qumicos. Como en todas las tcnicas analticas, los pequeos
problemas a la larga pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y
durabilidad del sistema. Aun con la evolucin de los cromatgrafos lquidos en
la era de la computadora, hay aun problemas que sta no puede resolver.
Hasta los Solventes para HPLC, todos filtrados cuidadosamente en la fbrica,
pueden acumular partculas en suspensin que pueden ser perjudicial a los
componentes del sistema HPLC. Estas partculas en suspensin pueden venir
de varias fuentes, incluso de la exposicin al polvo en el aire durante el
trasegado de solvente en el depsito para solvente, la exposicin a particulares
del aire durante el almacenamiento del solvente en el depsito del solvente, la
degradacin lenta del recipiente solvente, o de condensacin y polimerizacin
del solvente. Las partculas pueden ocasionar costosos daos a la bomba
HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de
HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y
recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.
En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone
el interior del solvente a la atmsfera y empieza a acumular gases disueltos
que se encuentran en la atmsfera. El trasegado del solvente en el depsito
solvente y su almacenamiento en estos depsitos ms este fenmeno. El
Oxgeno Disuelto que constituye el 21% de la atmsfera puede producir mayor
interferencia en los detectores de fluorescencia y electroqumicos. El Nitrgeno
Disuelto es el otro componente de la atmsfera que puede producir burbujas en
la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos
falsos y desviaciones de la lnea base. El Dixido de Carbono disuelto algunas
veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente.

Mtodos de Filtracin de Solventes en HPLC


Hay tres(3) mtodos comunes que se utilizan hoy para la filtracin previa de los
Solventes en HPLC :
Filtro a la Entrada del Solvente
Filtracin al Vaco
Filtracin en Lnea

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Mtodos de Desgasificacin de Solventes en HPLC
Existen cuatro (4) mtodos comunes usados para desgasificar solventes en
HPLC previos a su uso:
Sonificacin
Burbujear Helio
Desgasificacin Electrnica en la Lnea del Flujo
Desgasificacin al Vaco en Lnea

SISTEMAS DE INYECCIN DE MUESTRA


Estos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un
principio de utilizaba la inyeccin de la muestra con jeringas de alta presin
cuales ya estn de desuso. Hoy se utiliza el sistema de Vlvulas inyectoras.

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DETECCIN

La eficiencia de un detector cromatogrfico depende de la relacin entre la


cantidad fsica medida y la composicin del efluente, as como tambin de las
caractersticas de las seal de transferida.
Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:
o Detectores basados en una propiedad de la fase mvil . Ejemplo:
Detector de Indice de Refraccin
o Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar.
Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta
Los detectores ms utillizados en HPLC son:
o Detector UV. Hay bsicamente tres tipos:
Detector de Longitud de Onda Fija
Detector de Longitud de Onda Variable
Detector de Arreglo de Diodos
o Detector de Indice de Refraccin. Existen muchos diseos de estos
detectores, pero solamente existen ahora dos tipos:
Tipo Deflexin
Tipo Fresnel
o Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar
compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacin.
o Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
Segn la Fuente de Excitancin

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Segn el sistema ptico
o Detectores Electroqumicos. Pueden ser clasificados en tres tipos:
Detector Amperomtrico
Detector Conductimtrico
Detector Potenciomtrico
Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroqumicos
para asegurarse anlisis reproducicbles:
Chequear que esten conectados adecuadamente a
tierra la bomba, el detector y registrador (integrador.
Usar bombas reciprocantes de doble piston
Mantener en todo momento el flujo de la fase mvil
en el detector.
Operar con el voltaje adecuado
Monitorear la altura de los picos para observar
cambios en la efiencia que nos indique la necesidad de reacondicionar
los electrodos.
Tener electrodos de referencias extras en solucin
3M de NaOH y reemplazar el electrodo de referencia en la celda 1 2
veces a la semana.
Desconectar el detector electroqumico cuando este
llimpiando las columnas.
Utilizar agua, buffers y solventes orgnicos de alta
pureza.

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TIPOS DE CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN
o Cromatografa de Particin.
o Cromatografa de Adsorcin
o Cromatografa Inica
o Cromatografa de Exclusin

PROBLEMAS MS COMUNES ENCONTRADOS EN HPLC

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Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus
posibles causas posibles, y cmo solucionarlos.
o Presin Alta
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o
Guarda Columna por partculas.
Solucin: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente,
teniendo la columna desconectada del detector. Si sto no funciona
reemplace el fritado a la entrada de la columna. Si la presin sigue alta
reemplaze la columna.
Solucin a largo plazo: Asegrese que todas las fases
mviles se filtren propiamente antes que entren a la bomba de HPLC.
Tambin filtre todas las muestras antes de inyectarlas.
o Prdida de la Resolucin
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC del
Guarda Columna por partculas.
Solucin: vea la seccin de Presin Alta
Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se
introduzcan las fases mviles en el sistema de HPLC.
o Picos Hendidos
Posible causa : Obstruccin de la Columna de HPLC o del
Guarda Columna por partculas.
Solucin: Marcha atrs columna roja con presin baja est
al lado de abre. Si es necesario reemplaze el fritado de la entrada o la
columna.
Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se
introduzcan las fases mviles en el sistema de HPLC.

o Variacin en los Tiempos de Retencin


Posible causa : Aire atrapado en la bomba debido a gases
disueltos en fase mvil.
Solucin: Bomba primera y est fases seguras tan mviles
es propiamente [degassed]
Solucin a larga plazo: Asegurese fase tan mvil est
propiamente y adecuadamente desgasificada. Si usa desgasificacin
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electrnica en lnea asegura esa cadencia del flujo no es demasiado alto
para evita [degassing] completo.
o Variaciones de la Lnea Base
Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del
detector debido a una mala desgasificacin de los solventes de la fase
mvil.
Solucin: Asegurese que todas las fases mviles estn
debidamente desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la
presin a toma de corriente del detector.
o Lnea Base con mucho Ruido
Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la
bomba.
Solucin: Enjuage el sistema y purge la bomba de HPLC .
Use Solventes desgasificados adecuadamente para mantener constante
la velocidad de flujo de la fase movil del sistema.
o Picos Falsos (Detectores Electroqumicos y de Fluorescencia)
Posible causa: Oxgeno Disuelto
Solucin: Desgasificar adecuadamente las fases mviles
para reducir la concentracin de oxgeno disuelto.
Solucin a largo plazo: Agregar un sistema de filtracin al
vaco en lnea. Peridicamente chequear el nivel de oxgeno disuelto.
o Baja Ninguna Presin
Posible causa: Trabajar con bombas, sellos pistones
expuestos por mucho tiempo a partculas en suspencin en la fase
mvil.
Solucin: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.

RECOMENDACIONES PARA ADQUIRIR UN SISTEMA DE HPLC


Estos son algunos consejos para adquirir un sistema de HPLC ajustado a sus
necesidades:
o Cuntas muestras y tipos de ensayos
o La facilidad para reemplazar los sellos de las bombas (mantenimiento)
o La exactitudad y presicin del sistema de bombas

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o El Sistema de Gradiente. La suavidad y reproducibilidad de la mezcla
o Que tipo de servicio ofrecen puede ofrece la casa vendedora
o Suministro de software y compatibilidades
o Cunto se puede pagar!

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

AHUJA, Satinder. Selectivy and Detectability Optimizations in HPLC. Vol.


104 in Chemical Analysis Series. Wiley Interscience. U.S.A. 1989.

EWING, Galen. Instrumental Methods of Chemical Analysis. 3rd Edition.


Mc Graw-Hill. USA. 1969

o McNAIR, Harold y ESQUIVEL, Benjamin. Cromatografa Lquida de Alta


Presin. N 10. Serie Qumica. Organizacin de los Estados Americanos.
Washington. 1973.

o PICKERING,W.F. Qumica Analtica Moderna. Editorial Revert. Espaa.


1976

o Rouessac F, Rouessac A,. 2003. Mtodos y tcnicas instrumentales


modernas. Edit. Mc Graw-Hill.Espaa

o SKOOG, Douglas y LEARY, James. Anlisis Instrumental. 5 Edicin.


McGraw-Hill. Espaa.1994.

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Cromatografa lquida de alta presin. H. M. McNair y B. Esquivel.


Monografa cientfica de la OEA.

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