Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
determinacin de histamina en
productos pesqueros
Elisa Jimnez
www.azti.es 11/24/2014 1
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
INTRODUCCIN
Histamina
Amina bigena formada postmortem en msculo de peces
Crecimiento bacterias generadoras de histidina decarboxilasa
Principalmente en escombridos (atunes) (mayor contenido His)
Indicador nivel descomposicin
Elevado nivel: causa de reacciones txicas (cefalea, hipertensin,
nausea, )
Imagen: www.rcgroups.com
www.azti.es 11/24/2014 2
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
INTRODUCCIN
Histamina
Medicin: Cromatografa Lquida con detector de fluorescencia
(LCFLD), previa derivatizacin
Regulacin:
Reglamento (CE) n 2073/2005, de la Comisin de 15 de noviembre de 2005,
relativo a los criterios microbiolgicos aplicables a los productos alimenticios
Aptmeros
Oligonucletidos de pequeo tamao capaces de
unirse especficamente a la molcula de inters frente
a la cual han sido previamente seleccionados
(Ellington y Szostak, 1990)
ARN o ADN Imagen: www.amsbio.com
Mtodo seleccin
SELEX Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment
(Tuerk C y Gold L. 1990)
Ellington AD & Szostak JW (1990). In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346:818-822.
Tuerk C & Gold L (1990). Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249:505510.
www.azti.es 11/24/2014 4
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
OBJETIVOS
Objetivos
Desarrollar un sistema de deteccin rpido de histamina
www.azti.es 11/24/2014 5 5
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
DESARROLLO
Seleccin de aptmeros
Aplicacin de protocolo FluMagSELEX para la seleccin de
aptmeros ptimos (Stoltenburg, 2005)
Stoltenburg R.; et al. (2005), Flu-Mag-SELEX as an advantageous method for DNA aptamer selection. Anal. Bioanal. Chem., 383, 83
www.azti.es 11/24/2014 6
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
DESARROLLO
Protocolo de seleccin
Sucesivos ciclos: n=15
1. Enfrentamiento biblioteca de aptmeros-histamina
2. Lavado de aptmeros no unidos
3. Elucin de aptmeros afines
4. Amplificacin por PCR de aptmeros con mayor afinidad
5. Separacin PAGE desnaturalizante
Cebadores longitud desigual
Marcaje fluorescente
6. Vuelta al paso 1
7. Seleccin negativa
Esferas no tapizadas con histamina
Imagen: Stoltenburg R.; et al. (2005), Flu-Mag-SELEX as an advantageous
method for DNA aptamer selection. Anal. Bioanal. Chem., 383, 83
www.azti.es 11/24/2014 7
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
RESULTADOS
Identificacin de aptmeros
Clonacin de aptmeros
pMOS Blue Vector (Amersham)
www.azti.es 11/24/2014 8
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
RESULTADOS
Anlisis de afinidad
Test afinidad aptmero-histamina en sistema de fluorescencia
ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)
www.azti.es 11/24/2014 9
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
RESULTADOS
Optimizacin
Conjugacin Histamina+BSA (Bovine Serum Albumin)
Imagen Biacore X. www.biacore.com Imagen Estructura BSA. Autor: K.A.Majorek,P.J.Porebski,M.Chruszcz,S.C. Almo,W. Minor,
New York Structural Genomics Research Consortium (NYSGRC)
www.azti.es 11/24/2014 11
Nuevo mtodo rpido para la determinacin de histamina en productos pesqueros
ACTIVIDADES FUTURAS
Futuros pasos
Incorporacin de aptmeros a tiras de flujo laminar
Imagen: Liu J (2006). A Simple and Sensitive Dipstick Test in Serum Based on Lateral Flow Separation of Aptamer-Linked Nanostructures. Angew. Chem. Int. Ed. 45:7955-7959.
www.azti.es 11/24/2014 12
www.azti.es | www.alimentatec.com | www.itsasnet.com
T. +34 94 657 40 00
Txatxarramendi ugartea z/g Herrera Kaia, Portualdea z/g Astondo Bidea, Edificio 609
48395 Sukarrieta, Bizkaia 20110 Pasaia, Gipuzkoa Parque Tecnolgico de Bizkaia
48160 Derio, Bizkaia
13