Coloracin de Ziehl Neelsen.

OBJETIVOS:

Realizar la tincin de Ziehl-Neelsen a partir de expectoraciones de los

propios alumnos.

Visualizar las tinciones de Ziehl-Neelsen positivas.

FUNDAMENTOS DE LA PRCTICA:
La tincin de Ziehl-Neelsen es una tcnica de tincin diferencial que se basa en

que las paredes celulares de ciertas bacterias contienen cidos grasos (cidos

mi clicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la

propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-acido,

despusde la tincin con colorantes bsicos.

Las mico bacterias absorben los colorantes solo muy lentamente debido a la

elevada proporcin de ceras y lpidos en la pared celular. Para acelerar la

absorcin del colorante fucsina y as la formacin del complejo micolatofusina

en la pared celular, se calintala solucin de fucsina fenicada aplicada sobre el

preparado normalmente hasta la formacin de vapores.

Una vez que las mico bacterias han absorbido el colorante, difcilmente lo

ceden a pesar del tratamiento con solucin decolorante alcohol-cido

clorhdrico.
Por esto se denominan bacilos alcohol acido resistente o BARR y aparecen en

el preparado microscpico teidas de rojo, mientras que todos los

microorganismos no resistentes a los cidos se tien de acuerdo con la contra

tincin.

Esta tincin tiene inters desde el punto de vista del diagnstico clnico puesto

que algunos microorganismos patgenos cido-alcohol resistentes, tales

como Mycobacterimum tuberculosis son patgenos muy importantes para los

humanos.

MICOBACTERIAS.

Las mico bacterias son bacilos aerobios no formadores de esporas, existen

ms de 50 especies de Mycobacterium, las cuales incluyen muchas que son
saprfitas. Entre las especies consideradas Patgenas Tenemos al
Tuberculosis cuyo nico reservorio es el humano, es el agente causal de la
tuberculosis pulmonar y diseminada.

Mycobacterium bovis tambin esta considerado dentro de este grupo,

origina una enfermedad similar a tuberculosis en humanos tales como:

El M. avium-intracellulare y las atpicas con frecuencia infectan a pacientes con

SIDA, son patgenos oportunistas en otras personas inmunodeficientes,
y en ocasiones producen enfermedad en pacientes con sistema inmunitario
normal.

Las micobacterias no constituyen el nico grupo que tienenpropiedades

alcohol-acido resistentes.

Las especies de Nocardia y Rhodococcus poseen una alcohol-

acido resistencia parcial as como Legionella micdadei ausante de neumona.
Los quistes de los gneros Cryptosporidium e Isospora tienen resistencia
definida a las tinciones con cido alcohol.

Transmisin

De los bacilos de la tuberculosis se produce casiexclusivamente por

medio de ncleos suspendidos en pequeas
gotas queson expulsadas con la expectoracin de las personas afectadas portu
berculosis pulmonar. Estas pequeas gotas pueden permanecerinfectantes en
el aire durante bastante tiempo y pueden ser inhaladas por
otras personas. La infeccin de los contactos es ms probable cuando
conviven o permanecen durante un tiempo prolongado cerca del enfermo que
est expectorando bacilos y en un ambiente poco ventilado. No todas las
personas infectadas enferman, slo una de cada diez
aproximadamente,que son las ms susceptibles.

Manifestarse

En cualquier rgano, porque M. tuberculosis se disemina por todo el

organismo; sin embargo, la enfermedad pulmonar es la ms frecuente (80-85%
de todos los casos diagnosticados) debido a que el bacilo necesita abundante
oxgeno para multiplicarse. En los pulmones de los enfermos se pueden formar
cavidades en las que se alojan grandes poblaciones de bacilos que
pueden ser detectados en muestras de esputos.

Los sntomas

Ms caractersticos de la tuberculosis pulmonar son la tos y la expectoracin

persistentes por ms de 2 semanas. A las personas con estos sntomas se Los
llama Sintomticos Respiratorios (SR). Otras manifestaciones pueden ser
prdida de peso, febrcula, sudores nocturnos, cansancio fsico y dolores de
trax.
El diagnstico

De certeza de tuberculosis puede hacerse en forma confiable en el laboratorio

demostrando la presencia de bacilos en una muestra de la lesin o el cultivo.

LA MUESTRA.

La muestra ms examinada es el esputo debido a que, como se ha dicho, la

tuberculosis pulmonar es la ms frecuente. Sin embargo, dado que la
enfermedad puede manifestarse en cualquier rgano, con menor frecuencia
puede requerirse la investigacin de muestras muy variadas: orina, lquido
cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido asctico, sangre, pus de
cavidadesabiertas, biopsias. Estas muestras de lesiones Extra pulmonares

Deben procesarse tambin por cultivo

EL ESPUTO.

El envase.

Debe tener las siguientes caractersticas:

Boca ancha: De no menos de 50 mm de dimetro

Capacidad entre 30 y 50 ml: para facilitar que el paciente pueda Depositar la

expectoracin con facilidad dentro, sin ensuciar sus Manos o las paredes del
frasco y para que en el laboratorio se pueda Seleccionar y tomar la partcula
ms adecuada, con comodidad, para Realizar el extendido.

Cierre hermtico: con tapa a rosca, para evitar derrames durante El

transporte y la produccin de aerosoles cuando se abre en el laboratorio.
Material plstico transparente resistente a roturas, para poder Observar la
calidad de la muestra cuando la entrega,
evitarRoturas y derrames de material infeccioso y para que pueda ser
desechado.

Obtencin espontnea del esputo.

Para la recoleccin de las muestras:

Elegir un lugar bien ventilado y que ofrezca privacidad. Puede ser una
habitacin bien ventilada y con acceso de luz natural (sol) o algn lugar
abierto no concurrido.2
Entregar el envase de recoleccin ya rotulado con su nombre o nmero
de identificacin y el servicio que solicita. Estos datos deben ser escritos
en la pared del frasco y no en la tapa para evitar errores, con rtulos que
no se despeguen o con lpiz indeleble.
 Obtener una buena muestra de esputo instruyendo al paciente con
lenguaje simple y comprensible para que:
Inspire profundamente llenando sus pulmones de aire tanto como sea
posible.
Retenga el aire un momento (10 a 15 segundos)- expulse luego la
expectoracin con un esfuerzo de tos, tratando de arrastrar las
secreciones del pulmn
Recoja el esputo producido dentro del envase tratando de que entre en
su totalidad, sin manchar sus manos o las paredes externas del frasco-
repita esta operacin otras dos veces colocando todas las secreciones
en el mismo frasco-
Limpie el exterior del envase con un pauelo de papel y se lave las
manos con agua y jabn.

PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION ZIEHL- NEELSEN.

El calentamiento del portaobjetos permite mayor penetrancia de lacarbolf
uscina en la pared celular. Los cidos miclicos y las ceras
formancomplejos con el colorante bsico, que luego no se eliminan con

La decoloracin con cidos dbiles.

MATERIALES:

Portaobjeto
Mechero
Asa de siembra
Pipetas
Pinzas de madera
Microscopio ptico
Equipo de tincin (barras paralelas)
 REACTIVOS:

Fucsina fenicada bsica

Alcohol acido 3,0 %
Azul de metileno
Microorganismos uno BAAR y uno no BAAR
Aceite de inmersin

PROCEDIMIENTO: (ver anexo 1)

Se fija los portaobjetos al calor con la muestra.

.Se cubre el frotis con el reactivo de colorante de carbolfuscina y
se calienta con suavidad hasta la aparicin de vapores durante 1
minuto

Se deja actuar el colorante sobre el portaobjetos durante 4-

5minutos,sin calentar.4.Se lavan los frotis con agua destilada y se
los inclina para eliminar el exceso de agua.

Se decoloran con cido alcohol al 3,0 % durante 2 minutos. Se

lavarlos frotis con agua destilada y se los inclina para escurrir el
resto
deagua.6.Se cubren los frotis con reactivo de azul de metileno dur
ante 1minuto.7.Se lavan con agua destilada y se dejan secar al
aire.
Se examinan con aceite de inmersin en bsqueda de BAAR.

RESULTADOS:
Positiva rojos BAAR

Negativo azul no BAAR

Un hallazgo positivo significa presencia de bacilos alcohol acidoresistent

es y un hallazgo negativo significa ausencia de bacilos alcoholacido
resistentes