Informe de laboratorio: desnaturalizacin de protenas de la clara de huevo

mediante diversos agentes capaces de inducir alteraciones en su conformacin

nativa y reconocimiento de aminocidos con pruebas de identificacin comunes.

Mnica Antolnez, 1
Facultad de ciencias naturales e ingeniera, programa de ingeniera qumica, universidad de Bogot Jorge Tadeo
Lozano, Bogot D.C.
monicaf.antolinezp@utadeo.edu.co,

Objetivo: identificar los diversos factores que afectan la estructura y estabilidad de las protenas
y reconocer las pruebas ms comunes en el reconocimiento de aminocidos.

importance of the spatial distribution in its

Resumen
Los aminocidos son las unidades
estructurales de las protenas, el estudio de la
estructura tridimensional de estas, permite
comprender la importancia de la distribucin
espacial en sus diversas funciones.
Para la desnaturalizacin de protenas (clara
de huevo), se aplican factores como el calor,
PH extremos, precipitacin por sales,
solventes orgnico y metales pesados. El
reconocimiento de aminocidos se realiz
con las reacciones de acetato de plomo
alcalino, xantoproteica, Hopkins Cole, Biuret
y ninhidrina. Con cada una de estas pruebas
es evidente el desdoblamiento de las
protenas, la perdida de solubilidad, la
precipitacin y coagulacin debido al
rompimiento de las fuerzas que estabilizan la
estructura tridimensional o nativa de la
protena y conllevan a la prdida de su
funcin. De igual manera en las reacciones
de reconocimiento de aminocidos se
presentan diferentes coloraciones, las cuales
dependen de la
estructura y conformacin de la cadena
lateral de los diferentes aminocidos y
pptidos.
Abstract
Amino acids are the building blocks of
proteins, the study of the three-dimensional
structure of these, can understand the
various functions.
For denaturation of proteins (egg white),
factors such as heat, pH extremes,
precipitation are applied salts, organic
solvents and heavy metals. Recognition of
amino acids was performed with ethyl
reactions alkaline xantoproteica lead,
Hopkins Cole, biuret and ninhydrin. With
each of these tests clearly the splitting of
proteins, loss of solubility, precipitation and
coagulation due to the breaking of the forces
that stabilize the three-dimensional or native
protein structure and lead to the loss of its
function. Similarly in the amino acid
recognition reactions occur different colors,
which depend on the structure and
conformation of the side chain of different
amino acids and peptides.
Palabras claves: protena, aminocido,
pptido, desnaturalizacin, reaccin.
Introduccin
Las protenas son las macromolculas ms
verstiles de los seres vivos y desempean
funciones cruciales en los procesos
biolgicos. Funcionan como catalizadores,
transportan y almacenan otras molculas
como el oxgeno, proporcionan apoyo
mecnico y proteccin inmunolgica,
generan movimiento, trasmiten impulsos
nerviosos, y controlan el crecimiento y la
diferenciacin.

Las protenas son polmeros lineales
construidos a partir de cadenas de
monmeros llamados aminocidos, y
contienen ciertos grupos funcionales tales
como alcoholes, tioles, tioeteres, acidos
carboxlicos, carboxiamidas, y grupos
bsicos. La mayora de estos grupos son
qumicamente activos, siendo los
responsables de las funciones de la protena.
Estas macromolculas pueden interaccionar
entre s para formar asociaciones complejas.
distribucin espacial en las diversas
funciones de las protenas como son la
funcin cataltica, estructural, recepcin y
trasmisin de seales. Cada protena tiene
una estructura tridimensional caracterstica
indispensable para realizar su funcin. Esta
estructura es mantenida por interacciones
dbiles formndose la estructura secundaria,
terciaria y cuaternaria.

Los aminocidos son los constituyentes de las

protenas, un -aminocido consiste en un
grupo de carbono unido a un grupo amino,
un cido carboxlico y una cadena lateral
caracterstica. Solo los L-aminocidos son
Figura 1. Estructura de las protenas
constituyentes de protenas y habitualmente
se encuentran 20 tipos de cadenas laterales
Segn el nivel de organizacin se suelen
que varan en tamao, forma, carga,
considerar como globulares y fibrosas. Las
capacidad de formar puentes de hidrogeno,
primeras se caracterizan por su forma
carcter hidrofbico y reactividad qumica.
esfrica, su solubilidad en medios acuosos y
(Berg, Tymoczo & stryer 2009, pg 25-27).
presentar diferentes estructuras secundarias
en una misma molcula. Las protenas
Los aminocidos son un grupo heterogneo
fibrosas presentan una nica estructura
de molculas que poseen unas caractersticas
secundaria que disponen en forma de largas
estructurales y funcionales comunes. Estos se
hebras y son insolubles en agua. (Feduchi,
unen mediante enlaces covalentes y
Blasco, Romero & Yaez 2011, pg 78-85)
formando largas cadenas de pptidos y
polmeros. La disposicin lineal concreta de
los aminocidos de una protena constituye su
secuencia primaria, y esta determina la
estructura tridimensional.

Esto hace que los grupos amino y carboxilo

de todos los aminocidos estn unidos por
enlaces peptdicos, por esto la naturaleza
qumica de la cadena lateral es la que va a
condicionar su solubilidad en agua, su Figura 2. Protenas globulares y fibrosas
reactividad y el tipo de interacciones que se (Berg, Tymoczo & stryer 2009, pg 46).
pueden establecer.
Como la estructura tridimensional se
El estudio detallado de la estructura mantiene mediante interacciones dbiles, si
tridimensional de las protenas permite se alteran las condiciones que mantienen
comprender la importancia de esta
estas fuerzas de atraccin se produce la
desnaturalizacin de la protena.
La desnaturalizacin de una protena implica
la alteracin de su estructura tridimensional,
la protena nativa pierde su actividad
biolgica o funcin. En algunos casos el
proceso de desnaturalizacin es reversible.
La desnaturalizacin de protenas ocurre por
su exposicin a diversos factores como la
agitacin, la temperatura, la luz ultravioleta,
la adicin de sustancia s acidas o bsicas,
disolventes orgnicos, sales, metales pesados
y reactivos con grupos tiol, estos agentes
alteran las fuerzas de dispersin, los puentes
de hidrogeno y los enlaces inicos. (Acua,
2008, pg. 315)
Figura 3. Desnaturalizacin de las protenas.
El albumen es una solucin acuosa de
numerosas protenas globulares y una
protena fibrosa, la ovomucina, que le
confiere la textura gelificada.
Figura 4. Estructura primaria de la albumina.
(Pertierra, pg 166).
La ovoalbmina es la protena ms abundante
del albumen, es una fosfoglicoproteina cuyo
nmero de moles de fosfato ligados a los
residuos de serina varia de 2 a 0; la
ovoalbmina A1 representa cerca del 80% de
la ovoalbmina total. La molecula contine
3,5% de glcidos bajo forma de una unidad
glucdica de masa molar 1,570,
comprendiendo 5 residuos de D-mannosa y 3
residuos de D-glucosamina. La molecula
encierra cuatro grupos SH y dos uniones
disulfuro (aumenta durante el
almacenamiento), formndose una S-
ovalbmina mas termoestable que l protena
original. La desnaturalizacin trmica de la
ovalbmina ocurre a 72-84C. Esta es muy
sensible a la desnaturalizacin superficial.
Figura 5. Estructura tridimensional de la
ovoalbmina.
Tomado de: http://www.ciencia-
explicada.com/2010/11/por-que-la-clara-de-huevo-
se-vuelve.html
La conalbmina es una glicoprotena que
contiene 0,9% de D-mannosa y 1,7% de D-
glucosamina y est formada de dos
subunidades. Esta protena es muy sensible a
la desnaturalizacin trmica y menos sensible
a la desnaturalizacin superficial que la
ovoalbmina. Particularmente compleja
cationes metlicos y trivalentes tales como
2+ , 2+ , 3+ , 3+ . A un PH prximo a
6 una molcula de conalbmina, puede fijar
dos iones metlicos; segn la naturaleza del
catin fijado, los complejos pueden resultar
coloreados (rojos con 3+ y amarillos con
2+ . Los complejos metlicos de
conalbmina son ms estables que la protena
natural.
 Tabla 1. Concentracin de aminoacidos en la
El ovomucoide es una glicoprotena que albumina.
contiene 0,5- 4% de D-galactosa, 7-8% de D-
mannosa, 10 al 18% de D-glucosamina y 0,03
a 2,2% de cido saliclico. Las unidades
glucdicas estn ligadas a la molcula
proteica a nivel de residuos de asparragina.
La molecula est constituida de tres
subunidades, las zonas estructurales en -
hlice representan 22% de las cadenas
polipeptdicas; la protena es muy resistente Tomado de: http://alimentos.org.es/aminoacidos-
al calor salvo en medio alcalino. Posee una clara-huevo.
actividad antitrpsica.
Metodologa
La lisozima contiene 129 residuos de
1. Desnaturalizacin trmica
aminocidos, el PH isoelctrico de esta
molecula es muy elevado (cerca de 10). Esta
protena posse una actividad enzimtica -
glucosaminidasica, se trata de un
mucopptido N-acetilmuramoilhidrolasa. La
lisozima puede separarse de la clara por una
precipitacin en cloruro de sodio (5%) a PH
isoelctrico.

La ovomucina es una glicoprotena

constituida de dos subunidades, de contenido 2. Desnaturalizacin por PH extremo
en glcidos cerca al 30%, con 6-23% de
hexosas, 6-16% de hexosaminas y 1-14% de
cido slico. Su estructura es alargada y
fibrosa, y es la responsable de la viscosidad
de la capa espesa gelificada del albumen. Es
insoluble en agua y soluble en soluciones
salinas a PH >= 7. Es termorresistente pero
sensible a la desnaturalizacin superficial.
Forma con la lisozima un complejo insoluble 3. Precipitacin por sales
en agua.

Las ovoglobulinas G2 y G3 poseen un poder

espumante elevado.
La avidina est compuesta de tres
constituyentes (A, B, C) siendo capaz de
formar un complejo con la biotina.
El ovoinhibidor es una protena que inhibe la
actividad de la tripsina y de la quimotrpsina.
La flavoprotena puede fijar la riboflavina. 4. Desnaturalizacin por presencia de
(Cheftel 1989, pg 167-177). solventes orgnicos
 8. Reaccin de Hopkins Cole

5. Desnaturalizacin por metales

pesados

9. Reconocimiento de protenas con el

reactivo de Biuret

6. Reaccin con acetato de plomo

alcalino
10. Reaccion con nidria

7. Reaccin xantoproteica
Tablas de datos y resultados 4. desnaturalizacin por presencia de solventes
orgnicos
1. desnaturalizacin trmica
muestra reactivo observaciones
muestra temperatura observaciones clara de huevo se form un anillo
de color blanco

Se someti a se form una Resultado:

clara de etanol positivo para
una precipitacin
huevo desnaturalizacin
temperatura formacin de
por presencia de
aproximada al coloide
solventes
punto de
orgnicos.
ebullicin del Resultado:
agua en positivo para
Bogot. desnaturalizacin
5. desnaturalizacin por metales pesados
trmica.
muestra reactivo observaciones

clara de huevo se form una

precipitacin de
2. desnaturalizacin por pH extremo un color azul-
verdoso
muestra pH observaciones sulfato de
cobre Resultado:
positivo para
clara de desnaturalizacin
huevo se form una por metales
precipitacin pesados.
pH en su
Resultado:
punto
positivo para
isoelctrico.
desnaturalizacin 6. reaccin de acetato de plomo alcalino
por pH extremo.
temperatur observacione
muestra reactivos
a s
Se someti se form una
a una coloracin
clara de 1. hidrxid
temperatur gris-oscura
huevo o de
a
3. precipitacin por sales sodio
aproximada Resultado:
NaOH
al punto de positivo para
muestra reactivo observaciones 2. acetato
ebullicin reaccin de
de plomo
del agua en acetato de
alcalino
clara de huevo Bogot. plomo
se form una alcalino.
precipitacin
sulfato de
Resultado:
amonio
positivo para
7. Reaccin Xantoproteica
desnaturalizacin
por sales.
 muestra reactivos observaciones Clara de Huevo La serina
Clara de huevo obtuvo un color
-Se form una violeta
coloracin
naranja. Resultado:
Ninhidrina
-cido Positivo para la
Ntrico -Formacin de prueba de
complejo. Ninhidrina en
-NaOH al aminocidos
40% Resultado: libres de serina.
Positivo para La prolina
reaccin obtuvo un color
xantoproteica. amarillo

Resultado:
Ninhidrina Positivo para la
8. Reaccin Hopkins Cole prueba de
Ninhidrina en
muestra reactivos observaciones aminocidos
Clara de Formacin de un libres de
huevo anillo precipitado prolina
-cido
color violeta-azul
Sulfrico

-Reactivo de
Resultado: Anlisis de resultados
Positivo para
Hopkins Cole
reaccin de Protenas de la clara de huevo:
Hopkins Cole Ovoalbmina, Ovomucina, Conalbmina,
lisozima, Ovoglobulinas y Ovomucoides.
9. Reconocimiento de protenas con el reactivo de
Biuret
1. Desnaturalizacin trmica

muestra reactivo observaciones Cuando la muestra de clara de huevo se

Clara de someti a una temperatura aproximada al
Huevo Se form una punto de ebullicin del agua (90 C 100
coloracin violeta
C), las protenas presentes se
Resultado: desestabilizaron por el efecto del calor sobre
Reactivo de
Positivo para los enlaces de la estructura terciaria (en gran
Biuret
reconocimiento
parte enlaces de hidrogeno), causando as un
de protenas con
reactivo de desdoblamiento de la protena y una
Biuret. disminucin progresiva de su solubilidad. El
calentamiento de una solucin proteica causa
10. Reconocimiento de protenas con la reaccin de
Ninhidrina
un incremento en la energa de vibracin y
rotacin que pueden rebasar el equilibrio de
muestra reactivo observaciones las interacciones dbiles que estabilizan la
conformacin plegada y funcional.
(Virginia Melo, Oscar Cuamatzi, 2007, p.98).
 al ser una sal neutraliz las interacciones
(puentes de hidrogeno) de la estructura
terciaria de la protena, causando as un
desdoblamiento de la misma, la cual se
precipit a consecuencia.
Esquema de la reaccin:

2. Desnaturalizacin por pH extremo

La muestra de clara de huevo se precipit al
momento de adicionar cido clorhdrico. A
partir de esto, por el carcter acido del
reactivo se present un cambio abrupto en las
cargas formales de los grupos esenciales de
las protenas presentes, esto afect las
interacciones de la estructura terciaria,
produciendo la desactivacin y posterior
degradacin de las protenas.
Esto se puede explicar de otra forma: Las
protenas en un pH Isoelctrico se precipitan,
debido a que en este punto la carga neta es
cero y se eliminan las interacciones
electrostticas, lo que permiten la separacin 4. Desnaturalizacin por presencia de
selectiva de estas. solventes orgnicos
La muestra se precipit en presencia de
etanol, debido a que el reactivo es un solvente
orgnico polar produce agregados de
molculas proteicas que causan la
desestabilizacin de los enlaces de hidrogeno
presentes en la estructura de las protenas de
la clara.
La adicin de un solvente orgnico como el
etanol produce agregados de molculas
proteicas que tienden a precipitar, esto se
debe a que el solvente presenta una constante
dielctrica menor que la del agua, lo cual
Desnaturalizacin acido base produce un incremento en las fuerzas de
3. Precipitacin por sales atraccin entre cargas opuestas y una
disminucin en el grado de ionizacin de los
Al mezclar la muestra de clara de huevo con radicales de las protenas, y en consecuencia
Sulfato de Amonio ((4 )2 4), este ltimo
una disminucin en la solubilidad de sta.
(Calvo, 2004)
Ecuacin de la reaccin:
Desnaturalizacin por alcohol
5. Desnaturalizacin por metales pesados
Cuando se adicion Sulfato de cobre en la
muestra de clara de huevo se form una
precipitacin de coloracin azul, esto a causa
de la presencia de Cobre (metal pesado) en el
reactivo, por tanto al haber presencia de iones
metlicos se neutralizaron las cargas
anicnicas de los grupos esenciales de la
protena causando una precipitacin debido a
la desestabilizacin de esta.
Ecuacin de la reaccin:
6. Reaccin de acetato de plomo alcalino
La reaccin de acetato de plomo alcalino con
la clara de huevo se torn de un color oscuro
a causa de la reaccin entre los aminocidos
azufrados (principalmente Cisteina y
Metionina) de las protenas (en especial
Ovoalbumina) presentes en la clara de huevo
y el acetato de plomo, debido a que estos se
presentara una separacin mediante un
lcali, del azufre de los aminocidos, el cual
al reaccionar con una solucin de acetato de
plomo, forma el sulfuro de plomo y
cualitativamente un olor caracterstico fuerte
y un precipitado negro, que permite su
reconocimiento en el laboratorio (Aguirre &
Edwin).
Ecuacin de la reaccin:
7. Reaccin Xantoproteica
La interaccin entre cido ntrico y la clara de
huevo produjo una solucin con coloracin
naranja, esto producto de la reaccin del
cido ntrico con los aminocidos aromticos
de las protenas de la clara, los cuales
formaron posteriormente nitroderivados de
anillos aromticos. Lo aminocidos
aromticos que se reconocieron y dieron
positivo durante la prueba son la Tirosina,
Fenilalanina y Triptfano los cuales estn
considerablemente presentes en protenas de
la clara como la Ovoalbmina.
Ecuacin de la reaccin:
Reaccin con Aminocidos aromticos
Ejemplo: Tirosina:
8. Reaccin de Hopkins Cole
La reaccin de Hopkins Cole con la muestra
de clara de huevo dio como producto una
muestra con color violeta, esta caracterstica
se form debido a la reaccin del derivado del
indol presente en el triptfano de las
protenas de la clara con el cido glioxlico,
en presencia de cido sulfrico concentrado.
En gran medida el anlisis cualitativo dio
positivo en la prueba por la riqueza de
aminocidos de triptfano en las protenas de
la muestra trabajada.
Ecuacin de la reaccin:
9. Reconocimiento de protenas con el
reactivo de Biuret
Se form una coloracin violeta al reaccionar
la muestra de clara de huevo con el reactivo
de Biuret, debido a la formacin de un
complejo de coordinacin entre los cationes
cpricos (2+ ) en medio alcalino con las
uniones peptdicas (los pares de electrones no
compartidos del nitrgeno).
Ecuacin de la reaccin:
10. Reconocimiento de protenas con el
reactivo de Ninhidrina
Al momento de reaccionar la muestra de
Serina y de Prolina se formaron complejos
coloreados de violeta y amarillo
respectivamente. La causa principal de este
comportamiento en la prueba se debe a que
durante la reaccin se consumen dos
equivalentes de Ninhidrina por cada
aminocido.
En el primer paso de la reaccin el
aminocido se oxida, descarboxilandose y
liberando amoniaco, mientras que uno de los
equivalentes de Ninhidrina se reduce a
Hindrindantina.
En el segundo paso la Hindrindantina
formada y otro equivalente de Ninidrina
reaccionan con el amoniaco formando un
complejo de color purpura (Purpura
Ruhemann). La Prolina produce un complejo
color amarillo. (Maria de la Luz Velasquez
Monroy, 2013)
Ecuacin de la reaccin:
Primer paso:
Segundo paso:

En el caso de la prolina se producir un
complejo de color amarillo
Conclusiones
La desnaturalizacin de protenas se
da por cambios bruscos del medio
donde esta se encuentra. Los factores
tales como temperatura, pH, sales,
cidos minerales fuertes y metales
pesados afectan las interacciones de
la estructura terciaria de la protena de
manera reversible o irreversible
disminuyendo as la solubilidad de la
misma.
El desdoblamiento de la protena no
solo desnaturaliza su estructura, sino
que inactiva considerablemente la
funcin biolgica que tiene la misma,
por ejemplo, el impacto de las
temperaturas altas que estn por
encima de los 40C o los 50C hacen
que la protena sometida se vuelva
instable e inactiva.
La ovoalbmina presente en la clara
de huevo es una protena con diverso
contenido de aminocidos, por lo
tanto en todas las reacciones de
reconocimiento realizadas los
resultados fueron positivos.
Bibliografa
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Maria de la Luz Velasquez Monroy, M. A.
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http://es.slideshare.net/OswaldoAnge
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