O abordare a unui design experimental pentru optimizarea metodei spectrofotometrice

pentru estimarea coninutului de trihidrat de cefixima folosind c reactiv pentru

derivare ninhidrina, n formulri farmaceutice sau n bloc

Cuvinte cheie Abstract

Trihidrat de cefixim; Scopul acestei lucrri este utilizarea designului experimental pentru
Ninhidrin; evaluarea i optimizarea variabilelor experimentale pentru dezvoltarea unei
Design experimental; metode spectrofotometrice pentru a determina coninutul de trihidrat de
Full-factorial; cefixima utiliznd ninhidrina ca agent de derivare. Metoda se bazeaz pe
Design Box-Behnken; reacia dintre gruparea amino- a trihidratului de cefixime i ninhidrina n
mediu basic pentru a form un derivate galben (max = 436 nm). Un design
factorial complet pe dou nivele a fost utilizat pentru a vizualiza efectul
concentraiei de ninhidrina (X 1), volumul de ninhidrina utilizat (X2),
temperatura de nclzire (X3) i timpul de nclzire (X4), asupra formrii
complexului format ntre trihidratul de cefixima i ninhidrina Y (absorbanta).
Analizele de clasificare unidirecionale ANOVA i Pareto au artat faptul c
concentraia ninidrinei (x1) volumul acesteia (x2) i temperature de nclzire
(x3) sunt factori statistici importani (P<0.05) care afecteaz formarea
complexuilui cefixima-ninhidrina, y(absobanta). Un design experimental de tip
Box-Behnken cu metodologie de rspuns de suprafa a fost utilizer pentru a
evalua efectele principale de interacie i ptratice a acestor trei factori asupa
rspunsului selectat. Cu ajutorul graficului de rspuns de suprafaa i de
contur valorile optime ale factorilor selectai au fost determinate i utilizate
pentru experimmentele urmtoare. Aceste valori au fost: concentraia
ninhidrieni (x1) egal cu 0.2% mas/volum, volumul acestea (x2) egal 1ml,
respective temperature de nclzire (x3) 80 de grade Celsius. Metod propus
a fost validate n conformitate cu ICH Q2 (R1) ghidul de validare al metodelor.
Rezulatele acestui studio au artat n mod clar un concept de desin
experimental poate fi aplicat n mod eficient pentru optimizarea unei metode
spectofotometrice pentru estimarea coninutului de trihidrat de cefixima n
formulrile farmaceutice i n bloc cu cel mai mic numr de experimente
realizate posibil.
Introducere
Trihidratul de cefixim (CEF) este un antibiotic oral, cefalosporinic, din treia generatie,
utilizat n tratamentul gonoreei, amigdalitei i faringitei. Din punct de vedere chimic CEF este
acidul (6R.7R)-7-{[2-(2-amino-1.3-tiazol-4-il)-2-carboximetoxiimino)acetil]amino}-3-etenil-
8-oxo-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxilic (figura 1).

Figura 1 - structura CEF

Proiectrile de tip dublu full-factorial i factorial fracionar i designul de tip Placket-

Burman au fost utilizare pentru a vizualiza factorii importani care influeneaz rezultatele
msurtorilor sau calitatea produsului. Un design factorial complet pe dou nivele este
constituit din dou nivele ale fiecrui factor experimental i are o matrice de design
experimental realizat pe baza combinrii tuturor factorilor. Poate oferi direcia pentru
urmtoarele experimente [3].
Metodologia suprafeei de rspuns (RSM) este o tehnic statistic utilizat pentru
dezvoltarea i optimizarea proceselor complexe [4-6]. RSM este utilizat dup vizualizarea
preliminar a factorilor experimentali care afecteaz n mod signifiant rspunsul folosind
designul factorial. Tehnic care cteva avantaje fa de metod optimizrii convenionale n
care o singur variabila este utilizat pe experiment (OVAT). RSM ofer o cantitate mare de
informaii i este o abordare relativ ieftin datorit numrului mic de experimente realizate
pentru monitorizarea interaciunii dintre variabilele independente i rspuns. n optimizarea
convenional, numrul mare de experimente necesare realizate n cercetare, duce la un timp
i la cheltuieli mai mari odat cu numrul ridicat de utilizri ale reactivilor i materialelor
necesare experimentelor [7].
Multe tipuri de proiectri de suprafa de rspuns sunt utilizare pentru optimizare,
precum compozitul central, Doehlert i Box-Behnken. Desingul de tip Box-Bhnken este
utilizat preferenial fa de compozitul central sau metod Doehlert, deoarece sunt necesare
mai puine experimente i este ciclic. Un design este ciclic doar atunci cnd experimentele
sunt aproximativ situate pe o (hiper)sfer. Prin selectarea unui numr adecvat de puncte
centrale, este posibil modificarea preciziei rspunsului unui design intuitiv s fie similar pe
ntregul domeniu. Un astfel de design este presupus s aib o precizie uniform.
Designul de tip Box-Behnken este avantajos deoarece nu conine niciun punct la
extremitile regiunii cubice creat prin combinaiile factoriale pe dou nivele [4.5.8].
Designul de tip Box-Behnken a fost selectat pentru utilizarea n cadrul acestei cercetri i
folosit pentru optimizarea, validarea i analizarea coninutului de cefixima prin metod
spectrofotometrica deoarece acest design ofer trei nivele pentru fiecare factor i necesit
mai puine este n acest caz n comparaie cu metod compozitului central sau metod
Doehlert.
Numeroase studii au fost realizate pe CEF. Farmacopeea Indian [2], farmacopeea
Britanic [9], farmacopeea Statelor Unite [10], farmacopeea European [11] au descris o
form de cromatografie de lichide pentru estimarea coninutului de CEF, n form de tip
bloc i n formulrile de tip tablet sau suspensie oral.
Utilizarea spectrofotometriei [12-18], spectrofluorimetriei [17], cromatrografie de
lichide de performan nalt (HPLC) [12,19] i voltametriei [20] pentru analiz coninutului
de CEF n formulrile cu un singur component au fost raportate n literatur.
Estimarea coninutului de CEF n formulrile de tip multicomponent prin
spectofotometrie [21-23], HPLC [24-27] i cromatografie n strat subire de nalt
performan [HPTLC], [28,29] a fost descris n literatur.
Metoda spectofotometrica n vizibil [12] se bazeaz pe reacia de culoare oxidativ
dintre CEF i hidroclorura de 3-metil-2-benzotiazolinonhidrazona n prezena clorurii ferice.
n cadrul altui experiment [16], a fost dezvoltat un produs stabil cu o concentraie
dependena, de culoare roie, dup reacia CEF cu nitrit de sodiu n mediu acid.
O metod spectrofotometrica bazat pe oxidarea acid CEF cu ceriu la temperaturi
de nclzire ridicate a fost studiat n cadrul unor altor experimente [17 i 18] i a descris o
metod spectofotometrica n care cefalosporinele sunt convertite n acid hidroxamic care
formeaz un complex colorat cu fierul (III). O metod spectrofotometrica simpl i precis
bazat pe derivatizarea CEF cu 1,2-naftochinon-4-sulfonat de sodiu a fost dezvoltat n
cadrul unui alt experiment [30]. O metod spectrofotometrica precis i eco-friendly pentru
estimarea coninutului de CEF utiliznd ninhidrina a fost dezvoltat n anul 2012 [31].
Metoda experimental convenional a fost utilizat pentru a optimiza variabilele de
reacie n metodele spectofotometrice menionate mai sus. Metod variabilei unice este
ineficiena i poate da rezultate greite [7], aadar trebuie evitat. Este nevoie de o metod
sistematic i statistic pentru a optimiza variabilele de reacie pentru a obine rezultate
signifiante i precise.
Scopul acestei lucrri este s foloseasc designul experimental pentru sortarea i
optimizarea variabilelor experimentale pentru dezvoltarea unei metode spectofotometrice
care s duc la determinarea coninutului de CEF, n bloc sau formulri farmaceutice,
folosind nihidrina c agent de derivare.

2. Mod de lucru
2.1 Instrumente
Spectofotometru Shimadzu UV-VIS cu cuve de cuar cu latur de 1 cm pentru
msurarea absorbantei.
2.2 Materiale
CEF a fost donat de ctre Centurion Laboratories din Vadodara (Gujarat).
HIFEN DT 100 tablete (100mg) i ZIFI DT 50 tablete (50 mg). Acestea au fost cumprate
de la o farmacie local.
Substane chimice de calitate analitic ninhidrina, acid boric, clorura de potasiu,
hidroxid de sodiu, fosfat diacid de potasiu.
Metanol i apa distilat (de calitate HPLC) au fost folosite n experiment.
C faz staionara pentru HPLC, a fost folosit o coloan de tip Qualisil BDS C8 (250 x 4.6
mm).

2.3 Reactivi i soluii standard

Soluiile de ninhidrina (0.1% w/v, 0.2% w/v i 0.3% w/v) au fost preparate n
metanol.
Soluie tampon bazica (ph 10) a fost preparat n concordan cu procedura descris n
farmacopeea Indian.

2.4 Soluia standard pentru medota spectofotometrica.

O soluie standard CEF (1000 ug/ml) a fost preparat prin dizolvarea a 10mg de
CEF n 10mL de metanol:amestec (3:2, v/v)

2.5 Soluia de pentru spectofotometrica

Douzeci de tablete din fiecare au fost cntrite transformate . O cantitate de cu
10 mg de CEF fost transferat ntr-un recipient de 10mL. Apoi, 0.5 ml de
metaanol:amestec de (3:2, v/v) fost pentru dizlova pulberea. Amestecul fost lsat ntr-o
de ultrasunete timp de 10 minute, , la punctul maxim cu acelai solvent. Soluia fost cu un
filtru de hrtie.

2.6 Soluia standard pentru metoda HPLC

O soluie standard de CEF (1000ug/ml) a fost preparat prin dizolvarea a 10mg de
CEF n 10mL de methanol. Aproximativ 0.1mL de soluie standard (1000ug/ml) a fost
transferat ntr-un vas volumetric 10mL i a fost folosit un diluant pentru soluia final
pentru a obine o soluie CEF de 10 ug/ml.
2.7 Soluie de test pentru metod HPLC
Douzeci de tablete din fiecare marc au fost cantarie i transformate n pudr. O
cantitate echivalent cu 10mg de CEF a fost dizolvat n methanol ntr-un recipient
volumetric de 10mL. Amestecul a fost tratat cu ltrasunete timp de 20 de miunute. Soluia a
fost filtrate folosind o membran de hrtie de 0.45um. Aproximativ 0.1 ml a fost transferat
ntr-un flacon volumetric. Diluia final a fost procesat cu un diluent obinnd astfel 10
ug/ml de soluie CEF.
Tabelul 1 Factorii experimentali si variabila de raspuns pentru un design full factorial pe doua nivele

Factori experimentali Cod Nivel

Low High
Concentratia ninhidrinei (% w/v) X1 0.1 0.3
Volumul ninhidrinei (mL) X2 0.5 1.5
Temperatura de incalzire (C) X3 70 90
Timpul de incalzire (min) X4 20 30
Raspuns Y Goal
Formarea complexului ninhidrina-CEF (absorbanta) Maximum

2.8 Faza mobil

Faza mobile folosit pentru analiz HPLC a fost preparat amestecnd metanol i
0.025 M fosfat diacid de potasiu n raport 70:30, v/v. Faza mobil a fost folosit ca solvent
pentru analiz HPLC.
3. Metode
3.1 Designul full-factorial pe dou nivele
Un design de tip full-factorial pe dou nivele a fost utiliat pentru a evalua efectele a
patru factori independeni: concentraia reactantului de ninhidrina (X1), volumul de reactant
ninhidrina (X2), temperatura de nclzire (X3) i timpul de nclzire (X4) raportat la
absorban Y. La baza experimentelor preliminare gama de valori folosite n design este
urmtoarea: concentraia reactantului ninhidrina (X1): 0.1 0.3 % w/v; volumul
reactantului ninhidrina (X2): 0.5 1.5 ml; temperatura de nclzire (X3): 70-90oC i timpul
de nclzire (X4): 20 -30 min. Nivelele diferite ale factorilor selectai sunt prezentate n
Tabelul 1 i matricea designului de tip full-factorial pe dou niveluri se afl n Tabelul 2.
Toate experimentele au fost realizate de trei ori, iar rezultatele sunt prezentate n Tabelul 2.
Tabel 2 Experiment 24 si valoarea de raspuns
Standard Order Run Order X1 X2 X3 X4 Y
12 1 0.3 0.5 90 30 0.181
15 2 0.3 1.5 90 20 0.194
14 3 0.3 1.5 70 30 0.179
3 4 0.1 0.5 90 20 0.178
4 5 0.1 0.5 90 30 0.178
5 6 0.1 1.5 70 20 0.177
16 7 0.3 1.5 90 30 0.195
11 8 0.3 0.5 90 20 0.194
1 9 0.1 0.5 70 20 0.163
10 10 0.3 0.5 70 30 0.176
9 11 0.3 0.5 70 20 0.167
6 12 0.1 1.5 70 30 0.176
7 13 0.1 1.5 90 20 0.191
8 14 0.1 1.5 90 30 0.191
13 15 0.3 1.5 70 20 0.180
2 16 0.1 0.5 70 30 0.163
3.2 Optimizarea prin reactive/rspuns a metdei de suprafaa.
Un design Box-Behnken pe trei nivele cu trei puncte cheie (Tabelul 3) a fost folosit
pentru evaluarea principalei interaciuni i efectelor ecuaiilor de gradul 2 a concentraiei
reactantului ninhidrina (X1), volumul reactantului de ninhydrin (X2) i temperaturii de
reactive (X3) fa de absorban Y. Condiiile experimentale care au fost constant pe
parcursul tuturor reaciilor au fost soluia tampon de ph BBS (ph 10, 1 ml), timpul de
nclzire (X4) (25 min) i solventul de diluare (ap). Toate experimentele au fost efectuate
de trei ori i rezultatele se afl n Tabelul 3.
3.3 Studiu de liniaritate
O prob alicot de soluie standard (0.05 0.3 ml) a fost transferat ntr-un vas de
10 ml. Volumul total din fiecare vas a fost adus la 1 ml cu methanol: amestec de ap (3:2
v/v). 1 ml de soutie de ninhidrins i 1 ml de soluie tampon de ph BBS (ph 10) au fost
adugate n fiecare vas. Amestecul de reacie a fost nclzit la 80oC timp de 25 de minute.
Apoi amestecul de reacie a fost rcit la temperature camerei. Volumul final a fost crescut la
10 ml (completat cu ap). Substan galben obinut a fost analizat la nivelul de 400 800
nm pentru a descoperi goluri n reactant. Lungimea de und, 436 nm, a fost selectat ca (
max) pentru analiz soluiei.

Figura 2 - Spectrul UV - VIS pentru complexul ninhidrina - CEF