PRCTICA N 12.

METABOLISMO MICROBIANO

INTRODUCCIN

Las clulas de los microorganismos, al igual que las de todos los seres vivos, por medio de su
metabolismo incorporan y transforman los diversos compuestos obtenidos del medio ambiente, en
compuestos requeridos para vivir, para su crecimiento y para su reproduccin. En estas
transformaciones participan diferentes enzimas que catalizan las reacciones de oxidacin,
reduccin, hidrlisis, transferencia de grupos, isomerizacin y sntesis, dando lugar a la degradacin
de los compuestos incorporados (catabolismo) y a la sntesis de nuevos compuestos (anabolismo).

Las exoenzimas son secretadas por la clula y actan fuera de ella sobre el sustrato, disminuyendo
el tamao de las molculas complejas en el medio ambiente, hasta lograr un tamao que pueda
difundir al interior de la clula, donde servirn de sustrato a las endoenzimas. Asimismo, cada grupo
de microorganismos muestra una capacidad enzimtica diferente para transformar los compuestos,
regida por su constitucin gentica y por factores ambientales. Pueden poseer una batera reducida
de enzimas actuando sobre pocos sustratos o pueden presentar una amplia variedad de sistemas
enzimticos (actuando sobre gran diversidad de sustratos

COMPETENCIAS

Desarrollar y aplicar tcnicas para observar la accin enzimtica bacteriana en diferentes

sustratos

Aplicar los estudios del metabolismo de los microorganismos para su identificacin y

diferenciacin de otras especies.

Realizar las pruebas bioqumicas para la identificacin lograr una correcta identificacin de
gnero y especie de cultivos puros.

MATERIALES:

Material Biolgico

CEPAS BACTERIANAS DE: - Pseudomonas aeruginosa

- Serratia Marcescens
- Escherichia coli
- Proteus mirabilis
- Citrobacter freundii
- Klebsiella pneumoniae
- Bacillus subtilis
- Staphylococcus aureus
- Staphylococcus epidermidis
- Salmonella entrica
- Shigella flexneri

Material de Laboratorio

Asas bacteriolgicas (anillo y en punta)

Mechero de alcohol o Bunsen
Placas de Petri
Incubadora a 37 C
Bao Mara.
 Medios de cultivos diferenciales

Medio O-F.
Medio TSI (triple sugar iron).
Medio SIM.
Medio MIO.
Medio Citrato de Simons.
Medio LIA (LisinaHierro)
Medio Manitol salado.
Medio Urea (agar y caldo)
Medio MR-VP
Medio Gelatina
Agar Almidn

Reactivos

Solucin de Lugol.
Solucin de KOH al 40%.
Rojo de Metilo
Solucin de Alfa Naftol
Reactivo de Kovacs

PROCEDIMIENTOS.

A. METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS

1. Fermentacin de carbohidratos (tres azcares)

Medio TSI: tres azcares (glucosa, sacarosa, lactosa)+Hierro / Indicador: Rojo de fenol.

Utilizado para evaluar la utilizacin de los carbohidratos como fuente de carbono por la va
fermentativa.

Con la aguja Bacteriolgica estril y frente a fuego de mechero, sembrar con la

tcnica de puntura en el fondo y estra en el plano inclinado del medio TSI cepas de
Pseudomonas aeurinosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri,
Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Citrobacter freundii.

Llevar a incubacin a 37C por 24 horas.

Observar e interpretar los resultados obtenidos.

Lectura
 Plano
N Fondo Centro Resultado CO2 H2S Interpretacin
inclinado
1 rojo rojo rojo K/K - - No fermentacin
Fermentacin de
2 amarillo rojo rojo K/A - -
glucosa
Fermentacin de
3 amarillo amarillo rojo R/A - - glucosa y sacarosa
Con produccin H2S
Fermentacin de
glucosa, sacarosa y
4 amarillo amarillo amarillo A/A + -
lactosa
Con produccin CO2
Fermentacin de
4A amarillo amarillo rojo K/A + - glucosa, sacarosa
Con produccin CO2
Fermentacin de
glucosa, sacarosa
5 amarillo amarillo amarillo K/K + +
Con produccin de
H2S y CO2

2. Fermentacin del Manitol

Medio Manitol salado: manitol + NaCl / Indicador: Rojo de fenol.

Utilizado para evaluar la utilizacin de diferentes fuentes de carbono por la va fermentativa

como el manitol, teniendo como barrera de selectividad las concentraciones elevadas de
sal.

Con el asa de kolle estril y frente a fuego de mechero, sembrar con la tcnica
agotamiento y estra en medio Manitol salado cepas de Staphylococcus aureus y
Staphylococcus epidermidis.

Llevar a incubacin a 37C por 24 horas.

Observar e interpretar los resultados obtenidos.

Lectura Sin inocular

NEGATVO POSITIVO
3. Prueba del Citrato de sodio.

Medio Citrato de Simmons: Citrato de sodio /Indicador: Azul de bromotimol.

En esta prueba se evala la capacidad metablica de las bacterias para utilizar el Citrato de
sodio como fuente de carbono.

Con la aguja Bacteriolgica estril y frente a fuego de mechero, sembrar por tcnica
de estra en el plano inclinado del medio Citrato de Simons cepas de Pseudomonas
aeurinosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus
mirabilis, Serratia marcescens, Citrobacter freundii.

Llevar a incubacin a 37C por 24 horas.

Observar e interpretar los resultados obtenidos.

Lectura

NEGATIVO POSITIVO

4. Prueba del Rojo de Metilo

Medio MR-VP: Glucosa /Indicador: -----

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la

glucosa con gran produccin de cido.

Con la aguja Bacteriolgica estril y frente a fuego de mechero, sembrar por tcnica
de siembra en medio lquido en el caldo MR-VP, cepas de Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Citrobacter freundii.

Llevar a incubacin a 37C por 24 horas.

Despus de la incubacin, agregar 5 gotas de reactivo de Rojo de metilo,

homogenizar y dejar en reposo unos minutos.

Observar e interpretar los resultados obtenidos.

 Lectura

POSITIVO NEGATIVO

5. Prueba del Voges-Proskauer

Medio MR-VP: Glucosa /Indicador: -----

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la

glucosa con produccin de cido por la va cido mixta o con produccin de un producto
final neutro (acetona) por la va butanodilica.

Con la aguja Bacteriolgica estril y frente a fuego de mechero, sembrar por tcnica
de siembra en medio lquido en el caldo MR-VP, cepas de Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Citrobacter freundii.

Llevar a incubacin a 37C por 24 horas.

Despus de la incubacin, agregar 4 gotas de solucin de KOH al 40%, homogenizar

y dejar en reposo por 20 minutos a T de 37C.

Agregar posteriormente 5 gotas de solucin de Alfa naftol, homogenizar y dejar en

reposo por 10 minutos.

Observar e interpretar los resultados obtenidos.

Lectura

POSITIVO NEGATIVO
6. Prueba de la Hidrlisis del Almidn

Medio Agar Almidn: Base Agar nutritivo + Almidn soluble 0.4%

Utilizado para evaluar la capacidad metablica de las bacterias de hidrolizar el almidn por
la accin de exoenzimas (amilasas), y degradarla a maltosa (disacrido de dos glucosas) y
glucosa. Estos azcares son transportados al citoplasma de la clula y usados como fuente
de carbono y fuente de energa.

Con el asa de kolle o aguja bacteriolgica estril y frente a fuego de mechero,

sembrar por picadura y de forma concntrica en agar almidn cepas de Bacillus
subtilis en cada uno de los cuadrantes de la placa.

Llevar a incubacin a 37C por 24 horas.

Despus de la incubacin, agregar gotas de lugol a la placa de agar almidn en el

que se evidencie desarrollo de colonias.

Mover suavemente hasta lograr que el lugol se extiendo por toda la placa.

Observar e interpretar los resultados obtenidos.

Lectura

La aparicin de color azul revela la presencia de almidn.

La aparicin de halos claros alrededor de las colonias indica la hidrlisis del polisacrido.
B. METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS

1. Utilizacin del Triptofano y produccin de INDOL:

Medio SIM (Sulfuro de hidrgeno, Indol, Motilidad): Triptofano / Semislido

Este medio permite evaluar 3 pruebas: Motilidad de la bacteria, la cual se evidencia por el
desplazamiento del crecimiento alrededor de la lnea de inoculacin, realizada en
profundidad y en el centro del agar; Produccin de Indol, producto de la accin de la enzima
Triptofanasa sobre el triptfano del medio y la produccin del Sulfuro de hidrgeno.

Con la aguja Bacteriolgica estril y frente a fuego de mechero, sembrar con la

tcnica de puntura en el medio SIM cepas de Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Citrobacter
freundii.

Llevar a incubacin a 37C por 24 horas.

Despus de la incubacin, agregar 5 gotas de reactivo de Kovacs y mover

suavemente.

Observar e interpretar los resultados obtenidos.

Lectura

Positivo: Formacin de un anillo rosado o rojo

Negativo: No formacin de anillo.

2. Descarboxilacin / desaminacin de la ORNITINA:

Medio MIO (Motilidad, Indol, Ornitina): Ornitina / Indicador: Purpura de Bromocresol

Este medio permite evaluar 3 pruebas: Motilidad, Indol y descarboxilacin o desaminacin

de la Ornitina.

Debido a la fermentacin de la glucosa se produce una condicin cida y originando que el

indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga
condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual
decarboxila la ornitina presente. Por descarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el
consecuente viraje del indicador hacia el color prpura.

Con la aguja Bacteriolgica estril y frente a fuego de mechero, sembrar con la

tcnica de puntura en el medio MIO cepas de Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Citrobacter
freundii.
 Llevar a incubacin a 37C por 24 horas.

Observar e interpretar los resultados obtenidos.

Lectura
POSITIVO NEGATIVO

3. Descarboxilacin / desaminacin de la LISINA:

Medio LIA: Lisina / Indicador: Purpura de Bromocresol

Este medio permite evaluar la capacidad metablica de la bacteria de utilizar la Lisina como
fuente de Nitrgeno.

Debido a la fermentacin de la glucosa se produce una condicin cida y originando que el

indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga
condiciones ptimas para la actividad de la enzima Lisina decarboxilasa, la cual decarboxila
la Lisina presente. Producto de la descarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el
consecuente viraje del indicador hacia el color prpura.

Con la aguja Bacteriolgica estril y frente a fuego de mechero, sembrar con la

tcnica de puntura y estra en el medio LIA cepas de Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Citrobacter
freundii.

Llevar a incubacin a 37C por 24 horas.

Observar e interpretar los resultados obtenidos.

Lectura:
4. Hidrlisis de la REA:

Agar rea: rea / Indicador: Rojo de fenol.

Este medio permite evaluar la capacidad metablica de la bacteria de utilizar la rea como
fuente de Nitrgeno, siempre que la especie bacteriana produzca la enzima ureasa.

Con la aguja Bacteriolgica estril y frente a fuego de mechero, sembrar con la

tcnica de estra en plano inclinado del medio agar Urea, cepas de Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Serratia marcescens,
Citrobacter freundii.

Llevar a incubacin a 37C por 24 horas.

Observar e interpretar los resultados obtenidos.

Lectura:
NEGATIVO POSITIVO POSITIVO

5. Hidrlisis de la GELATINA:

Medio Frazier (Agar Gelatina): Gelatina / Indicador: ---------

Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo para producir

enzimas proteolticas que lican la gelatina (gelatinasas).

Con la aguja Bacteriolgica estril y frente a fuego de mechero, sembrar con la

tcnica de Puntura en el medio Frazier (agar Gelatina), cepas de Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Serratia marcescens,
Citrobacter freundii.

Llevar a incubacin a 37C por 24 horas.

Despus de la incubacin llevar a refrigeracin por 30 min.

Observar e interpretar los resultados obtenidos.

CUESTIONARIO

1. Esquematice lo realizado en prctica.

2. Reporte los resultados obtenidos con la especie bacteriana que trabaj.
3. Explique el fundamento de cada una de las pruebas realizadas.