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RESUMEN
La microencapsulacin por coacervacin consiste en el recubrimiento de micropartculas con una pelcula
polimrica, la cual es obtenida por la precipitacin del material polimrico disuelto en el medio dispersante.
El presente trabajo pretende estudiar la coacervacin con el copolmero del cido metacrlico Eudragit
S100 y su uso potencial para el desarrollo de microcpsulas de un baculovirus entomopatgeno del
gusano cogollero del maz, Spodoptera frugiperda. Se estudia la solubilidad del polmero en 16 solventes
orgnicos y la compatibilidad de stos con el principio activo (baculovirus). Teniendo en cuenta los
solventes compatibles se seleccionan parejas de solventes-no-solventes con las que se evalan cuatro
relaciones de volumen, tres concentraciones de polmero y cuatro velocidades de adicin de los no-
solventes. Se seleccionan las parejas: etanol-heptano, etanol-hexano, acetona-heptano y acetona-hexano,
como concentracin de polmero 0,50 % p/v y como relacin de volmenes 1:3, por presentarse la aparente
formacin de una fase de coacervado. El sistema consistente en acetona-hexano a una velocidad de 1,0
mL/min, es seleccionado como el ms promisorio por producir una separacin lenta del polmero y el
depsito uniforme de ste sobre el baln, comportamiento que podra permitir la microencapsulacin
del ncleo requerido.
Palabras clave: Eudragit S100, coacervacin, microencapsulacin, baculovirus, Spodoptera frugiperda
ABSTRACT
Microencapsulation by coacervation consists in the coating of microparticles by depositing a polymeric
film on them. This process is carried out by the precipitation of the polymer dissolved in the dispersing
medium. The present work pretends to study the coacervation of a methacrylic acid copolymer (Eudragit
S100) and their potential use in the development of microcapsules containing an entomopathogen
baculovirus of corn armyworm Spodoptera frugiperda. The polymer solubility in 16 solvents, as well
as the compatibility of them with the baculovirus is studied. By considering the compatible solvents,
several couples of SolventNon-Solvent are selected, with which four volume ratios, three polymer
concentrations, and four Non-Solvent addition velocities are evaluate. The couples Ethanol-Heptane,
Ethanol-Hexane, Acetone-Heptane, and Acetone-Hexane are chosen. The values 0.50 % w/v and 1:3 are
chosen as polymer concentration and volumes ratio respectively, because they show the apparent formation
of a coacervate phase. Finally, the system Acetone-Hexane with velocity 1.0 mL/min is chosen as the
most promissory because this system produces a slow polymer separation and therefore, the formation
of a uniform film inside the balloon. These behaviors could allow the nucleus microencapsulation.
Keywords: Eudragit S100, Coacervation, Microencapsulation, Baculovirus, Spodoptera frugiperda
de frmacos en el estmago, por ejemplo, en la El contenido de cada pozo se utiliz para evaluar
preparacin de micropartculas que permiten la la actividad viral mediante un bioensayo siguiendo
administracin oral de pptidos y protenas (5); la metodologa descrita por Tmez et al. (9). El trata-
stas, en particular, han generado un gran inters miento testigo positivo consisti en virus purificado
para el desarrollo de sistemas de administracin no expuesto a ningn solvente y se cont con un
oral de insulina (8). testigo absoluto en el que las larvas no recibieron
El presente trabajo pretendi determinar algunas ningn tratamiento.
condiciones tiles para el desarrollo de una tcnica El diseo experimental se hizo completamente
de microencapsulacin de un baculovirus entomo- al azar. Los resultados de mortalidad al da 7 fue-
patgeno del gusano cogollero del maz Spodoptera ron corregidos con respecto al testigo, utilizando
frugiperda, mediante la coacervacin con el copol- la frmula de Schneider-Orelli (10), sometidos a
mero del cido metacrlico Eudragit S100. un anlisis de varianza (ANAVA) y a una prueba
de comparacin de medias de Tukey con una
MATERIALES Y MTODOS confiabilidad del 95 % (11).
Comportamiento del Eudragit S100 frente
Materiales a diferentes solventes orgnicos
En esta investigacin se utilizaron Eudragit Se pesaron 0,050 g de polmero y se adiciona-
S100 de Rhm GmbH; dimetilsulfxido R.A., ron en tres tubos de ensayo con 6,0 mL de cada
butanol R.A. y tolueno R.A. (Sigma); etanol R.A., uno de los 16 solventes. Los tubos de ensayo tapa-
heptano R.A., etilenglicol R.A. (Merck); acetona rosca con los diferentes tratamientos se taparon y
R.A., xileno R.A., n-hexano R.A., cloruro de me- se ubicaron en una gradilla sumergida en un
tileno R.A. y alcohol i-amlico R.A. (J.T. Baker); bao termostatado Linderberg/blue SWB1122A
metanol R.A. (Mallinckrodt); cloroformo R.A. (22,0 1,0 C). Pasados 10 minutos los tubos
(Chemicol); benceno R.A. (RPE); n-propanol R.A. se agitaron mediante inversiones manuales y se
(Fisher); dietilter R.A. (Proanalysis). observ el comportamiento de la dispersin, ade-
ms se ley la absorbancia de cada muestra en un
Determinacin de la compatibilidad del espectrofotmetro Milton Roy Spectronic 601, a
virus con solventes orgnicos una longitud de onda de 650 nm (12). Los solventes
Con miras a seleccionar solventes orgnicos que que slo produjeron el hinchamiento del polmero
no afectaran la actividad del virus y que pudieran fueron clasificados como no-solventes. As mis-
ser utilizados en el proceso de microencapsulacin, mo, se consideraron no-solventes, aquellos con
se realiz un estudio de compatibilidad. Para tal fin, los que se obtuvo una absorbancia superior a 0,010,
muestras de 0,010 g del virus purificado liofilizado as como todos aquellos con los que se obtuvo una
fueron dispensadas en 16 tubos Eppendorf de 500 L. absorbancia inferior a 0,010, pero en los cuales se
En cada tubo se adicionaron 20 L de cada solvente observaron slidos en suspensin.
y se agitaron mediante inversin manual durante 30
Determinacin de la concentracin del pol-
minutos a una temperatura de a 20,0 1,0 C. Pos-
mero y de la relacin solventeno-solvente
teriormente, los tubos fueron centrifugados en una
microcentrfuga Eppendorf Centrfuga 5415 a 14000 Se evaluaron las diferentes parejas de solven-
rpm durante 30 minutos. El sobrenadante se elimin te-no-solvente determinadas previamente utili-
y el sedimento correspondiente a las partculas virales zando diferentes concentraciones del polmero y
fue lavado dos veces con 500 L de agua destilada relaciones de solventes (13). Las concentraciones
estril. El sedimento fue resuspendido en 50 L de de polmero evaluadas fueron 0,25, 0,50 y 0,75
agua y a partir de dicha suspensin viral se prepar %, combinadas con las relaciones de solvente-
una suspensin ajustada a una concentracin de no-solvente: 1:1, 1:2, 1:3 y 1:4 respectivamente,
1 x 1010 cuerpos de inclusin por mL. Se colocaron 10 obtenindose as un total de 12 tratamientos para
L de cada suspensin viral en uno de los pozos de cada pareja de solventes.
una microplaca de 96 pozos de fondo plano, adicio- La dispersin del polmero en el solvente
nando a cada pozo 10 L de una solucin de sacarosa correspondiente a cada tratamiento se adicion
al 4,0 % y colorante azul de alimentos al 1,0 %. en un baln de fondo redondo con un agitador
126 VITAE
torn totalmente transparente (absorbancia < 0,01), por lo que se consider que el polmero fue soluble
en dichos solventes (Tabla 1).
Tabla 1. Valores de absorbancia del Eudragit S100 en diferentes disolventes orgnicos
Solvente Id. Rplica 1 Rplica 2 Rplica 3 Promedio Desv. Est.
Cloroformo 1 0,613 0,622 0,599 0,611 0,011
Tolueno 2 0,008 0,009 0,006 0,008 0,001
Benceno 3 0,009 0,005 0,006 0,007 0,002
Heptano 4 0,294 0,288 0,29 0,291 0,003
n-Hexano 5 0,129 0,136 0,148 0,138 0,009
Butanol 6 0,531 0,503 0,542 0,525 0,020
Etilenglicol 7 0,079 0,088 0,093 0,087 0,007
ter dietlico 8 0,344 0,367 0,357 0,356 0,011
Alcohol isoamlico 9 0,420 0,467 0,423 0,437 0,026
Cloruro de metileno 10 0,091 0,096 0,071 0,086 0,013
Xileno 11 0,004 0,002 0,002 0,003 0,001
Metanol 12 0,002 0,000 0,002 0,001 0,001
Etanol 13 0,006 0,002 0,003 0,004 0,002
Acetona 14 0,000 0,000 0,001 0,000 0,000
Dimetilsulfxido 15 0,006 0,003 0,006 0,005 0,001
Propanol 16 0,032 0,042 0,039 0,038 0,005
La disolucin de un polmero es un proceso lento 0,010. Sin embargo, sobre las paredes de los tubos se
que puede tener lugar si las fuerzas intermoleculares observ una capa de partculas slidas transparentes,
polmero-polmero son superadas por las fuerzas de correspondientes al polmero con cierto grado de
interaccin polmerosolvente (19). Se considera que hinchamiento y no se produjo lechada, lo que indica
la disolucion de un polmero puede llevarse a cabo que dichos solventes iniciaron la solvatacin, pero
por dos mecanismos, dependiendo de factores como posiblemente requieren ms tiempo para disolver
el peso molecular del mismo, el solvente empleado y al Eudragit S100 y, por lo tanto, para alcanzar el
la temperatura, entre otros (20). El comportamiento equilibrio; por esta razn, stos ltimos se podran
observado con los solventes etanol, metanol, n-pro- considerar como solventes pobres. El compor-
panol, acetona y dimetilsulfxido podra deberse a un tamiento observado con estos solventes se puede
mecanismo de disolucin denominado de rajado atribuir a un segundo mecanismo de disolucin, en
o agrietado (cracking mechanism, en ingls), en el cual el solvente posiblemente tiene que difundir
el cual no se produce el hinchamiento del polmero. dentro del polmero, produciendo el hinchamiento
ste se agrieta rpidamente cuando las partculas del mismo en la interfase, lo que se detect como una
entran en contacto con solventes molecularmente pe- capa con aspecto de gel, mecanismo que se desarrolla
queos y muy buenos solventes para el polmero. Su principalmente con solventes pobres (20). Con el
alta velocidad de difusin y poder de hinchamiento transcurso del tiempo, posiblemente una cantidad
causan un rpido aumento en la presin interna del mayor de solvente podra haber penetrado en el
polmero, de manera que ste se fractura antes de que polmero aumentando la fase de hinchamiento hasta
la matriz pueda relajarse mediante el hinchamiento alcanzar la completa disolucin, pero este efecto no
gradual (21). Dicho agrietamiento y rompimiento fue detectado ya que la evaluacin cualitativa y la
catico de las partculas podra estar relacionado con medida de la absorbancia se realizaron nicamente
el cambio en el color del sistema antes de alcanzarse a los 10 minutos despus de montado el sistema.
el equilibrio o completa disolucin. Estas diferencias en los mecanismos de diso-
Con benceno, tolueno y xileno, las partculas de lucin de los polmeros estn relacionadas con el
polmero desaparecieron al entrar en contacto con tamao de las molculas de solvente, como lo sugi-
los solventes y la absorbancia obtenida fue menor a rieron Papanau et al (22), quienes encontraron que
128 VITAE
la velocidad de disolucin de un polmero del cido categoras para los posibles cambios en el sistema,
metacrlico, disminuy a medida que aument algunos de los cuales presentaron respuestas com-
el tamao molecular del solvente, posiblemente binadas: [SC] -Sin cambio: el sistema se mantuvo
porque a mayor tamao se tiene una menor veloci- homogneo y traslcido, sin cambio de color ni
dad de difusin del solvente dentro del polmero. aparicin de slidos; [L] -Lechoso: el sistema se
Con los solventes restantes (heptano, butanol, torn blanco lechoso y no se observan slidos en
cloroformo, ter dietlico, alcohol i-amlico cloruro suspensin; [P] -Precipitado: aparicin de polmero
de metileno y hexano) el polmero se sediment en el precipitado, que se ubic en una zona especfica
fondo del tubo en forma de partculas redispersables formando agregados, masas o hebras blancas de
mediante agitacin pero sin presentar disolucin y tamao variable, y finalmente, [D] -Depsito: el
se obtuvieron absorbancias de 0,290; 0,520; 0,610; polmero se deposit sobre las paredes del baln
0,350; 0,430; 0,090 y 0,140 respectivamente (Tabla formando una pelcula viscosa y traslcida.
1), que indican que el polmero no fue soluble en Independientemente del solvente evaluado, de la
estos compuestos. concentracin de polmero o de la relacin de sol-
Con base en los resultados, y teniendo en cuen- ventes, no se observ ningn cambio en la aparien-
ta que para la induccin de la coacervacin por el cia del sistema cuando el no-solvente adicionado fue
mtodo de adicin de un no-solvente se requiere el cloruro de metileno (Tabla 2). La no induccin
que la pareja de solventes sean totalmente miscibles de la separacin del polmero por la adicin de este
entre s, se seleccionaron como parejas solven- solvente podra sugerir que la acetona, el metanol y
teno-solvente: etanol-heptano, etanol-hexano, el etanol son tan buenos solventes para el Eudragit
etanol-butanol, etanol-cloruro de metileno, ace- S100 que requeriran una mayor adicin de cloruro
tona-heptano, acetona-hexano, acetona-butanol, de metileno para que el polmero se desolvate. Lo
acetona-cloruro de metileno, metanol-butanol y anterior tambin sugiere que el polmero podra
metanol-cloruro de metileno. presentar una mejor solubilidad en este solvente, la
cual posiblemente no se evidenci en el ensayo de
Determinacin de la concentracin del pol- solubilidad en solventes orgnicos realizado en el
mero y de la relacin solventeno-solvente presente trabajo, debido al corto tiempo de evalua-
Con el propsito de seleccionar un sistema que cin, o porque la solubilidad del polmero en este
permitiera la formacin de una fase de coacervado solvente es inferior a las concentraciones aparentes
con potencial para el recubrimiento de las partculas evaluadas en dicho ensayo. Tambin se ha demos-
virales, se evalu cualitativamente el comporta- trado que la adicin de una cantidad de no-solvente
miento de la solucin polimrica variando las pa- a un buen solvente, da como resultado un aumento
rejas solventeno-solvente, la relacin de volumen significativo de la solubilidad de algunos polmeros
entre los solventes, y el porcentaje de polmero. y, por lo tanto, no conduce a su precipitacin, debido
Considerando que el resultado obtenido es de a un efecto de plastificacin, como lo reportaron
carcter cualitativo, se definieron las siguientes Cooper et al (23) para el polimetil-metacrilato.
Tabla 2. Comportamiento del polmero utilizando diferentes parejas solventeno-solvente y relaciones de
volumen entre estos. [SC] Sin cambio, [L] Lechoso, [P] Precipitado, [D] Depsito.
Polmero 0,25 % Polmero 0,50 % Polmero 0,75 %
Solvente No-solvente
1:1 1:2 1:3 1:4 1:1 1:2 1:3 1:4 1:1 1:2 1:3 1:4
Butanol SC SC SC SC SC SC SC D SC SC SC D
Metanol
Cloruro de Metileno SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
Butanol SC SC SC SC SC SC SC D SC SC SC D
Hexano L L L L L L L, D L, D L L L, P P
Etanol
Heptano L L L L L L L, P P L P P P
Cloruro de Metileno SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
Butanol SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
Hexano L L L L L L L, D L, D L L D D
Acetona
Heptano L L L L L L L, D L, D L L L D
Cloruro de Metileno SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
DETERMINACIN DE LAS CONDICIONES DE MICROENCAPSULACIN DE UN BACULOVIRUS ENTOMOPATGENO ... 129
El butanol slo produjo, como respuesta, la Este mismo comportamiento se present con
formacin de una capa translcida y pegajosa en el la pareja de solventes etanol-heptano cuando la
fondo del baln, cuando se alcanz la relacin de concentracin de polmero fue 0,50 % y la rela-
solventes 1:4 con los solventes metanol y etanol, sin cin de solventes 1:3, y cuando la concentracin
observarse previamente un cambio en la coloracin de polmero fue 0,75 % para las relaciones de
del medio. solventes 1:2, 1:3 y 1:4.
Respecto a las parejas etanol-heptano, etanol- Se seleccionaron las parejas solventeno-sol-
hexano, acetona-heptano y acetona-hexano se vente: etanol-heptano, etanol-hexano, acetona-
encontr que antes de alcanzarse la relacin de heptano y acetona-hexano, como concentracin
solventeno-solvente 1:1, los sistemas presenta- de polmero 0,50 % y como relacin de volmenes
ron un cambio en su coloracin, observndose 1:3, por presentarse con estos tratamientos la
stos totalmente homogneos y de color blanco aparente formacin de una fase rica en polmero
lechoso, lo que indic el inicio de la desolvatacin (que se distingui por el color blanco), sin pro-
del Eudragit S100 . ducirse precipitacin, como se observ con el
Con la pareja etanol-hexano se observ la polmero al 0,75 % o con la relacin de solventes
formacin de agregados (precipitado) cuando 1:4 (Figura 2). Con estos tratamientos se procedi
el polmero se utiliz a la mayor concentracin a evaluar diferentes velocidades de adicin del
(0,75 %) y se alcanz la relacin de solventes 1:4. no-solvente.
Determinacin de la velocidad de adicin del rpida, producindose una precipitacin que dio
no-solvente origen a la formacin de agregados densos de un
Para todos los tratamientos evaluados, a me- tamao cercano a 3 mm.
dida que la velocidad de adicin del no-solvente Cuando se utiliz la menor velocidad (1,0 mL/min)
aument, la separacin del polmero fue ms el sistema inicialmente se torn lechoso para todos
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los tratamientos, lo que indica la formacin de una polmero, los cuales se precipitaron al fondo del
fase rica en polmero, que se mantuvo en equilibrio baln y aumentaron a medida que se sigui adi-
hasta llegar a una relacin solventeno-solvente cionando el no-solvente, hasta alcanzar la relacin
1:2, momento en el que se observ para el sistema 1:3 (Tabla 3).
etanol-heptano, la aparicin de hilos delgados de
Tabla 3. Respuesta observada al evaluar diferentes velocidades de adicin del no-solvente. [SC] Sin cambio, [L]
Lechoso, [P] Precipitado, [D] Depsito.
3 L L L, D
n-Hexano
5 L L, P P
8 L P P
Etanol
1 L P P
3 L L L, P
Heptano
5 L P P
8 L P P
1 L L L, D
3 L L L, D
n-Hexano
5 L L L, D
8 L P P
Acetona
1 L L L, D
3 L L L, D
Heptano
5 L L L, D
8 L P P
En el caso de los tratamientos con acetona, los eficiente, que permita disponer del virus (principio
sistemas se mantuvieron lechosos sin observarse activo) requerido para el desarrollo de los ensayos
precipitacin hasta alcanzar la relacin de vol- de microencapsulacin con Eudragit S100, utili-
menes 1:3. Sin embargo, al desechar el contenido zando los diferentes parmetros determinados en
del baln para los dos no-solventes evaluados se este estudio.
observ que una cierta proporcin del polmero
se deposit sobre la superficie del baln formando CONCLUSIONES
una fina pelcula translcida. A partir de estos re-
sultados se seleccion el sistema acetona-hexano El presente trabajo permiti establecer algunas
con la velocidad 1,0 mL/min como el ms adecua- condiciones con potencial para desarrollar un
do, por producir una separacin lenta del polmero sistema de microencapsulacin de un nucleopo-
y, adems, el depsito uniforme de ste sobre el liedrovirus de S. frugiperda con el polmero pH
baln, sin inducir la precipitacin del mismo en dependiente Eudragit S100 mediante el mtodo
forma de agregados. de coacervacin. El sistema seleccionado fue el
Paralelamente al presente trabajo, en el La- siguiente: concentracin de polmero 0,50 %, la
boratorio de Control Biolgico del Centro de pareja de solventes acetona-hexano, la relacin de
Biotecnologa y Bioindustrias de CORPOICA se solventeno-solvente 1:3 y la velocidad de adicin
est desarrollando un sistema de produccin viral 1,0 mL/min.
DETERMINACIN DE LAS CONDICIONES DE MICROENCAPSULACIN DE UN BACULOVIRUS ENTOMOPATGENO ... 131