Sunteți pe pagina 1din 13

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian

Note de curs i tehnici de laborator

C A P. 6. T E H N I C I d e I N G I N E R I E G E N E T I C l a D R O J D I I

Drojdiile prezint numeroase avantaje care le recomand ca model experimental n ingineria


genetica i biotehnologie. n primul rnd, levurile prezint un timp scurt de multiplicare i apariie a
unei noi generaii, de aproximativ 2 ore, ceea ce permite obinerea a mii de colonii de drojdii , n numai
2 zile, prin cultivare pe plci Petri, pe un mediu relativ simplu. n al doilea rnd, genomul de S.
cerevisiae are dimensiuni relativ reduse (1,4 x 107 pb) fa de cel mamalian (3,5 x 109 pb), ceea ce
simplific analizele genetice i moleculare. n al treilea rnd, drojdiile reprezint un material optim
pentru analizele genetice deoarece pot fi meninute att n stadiu haploid ct i n stadiu diploid.
Astfel, mutaiile genetice recesive pot fi relativ uor obinute i exprimate n celulele haploide, iar
complementaia genetic poate fi realizat prin simpla mperechere a dou mutante haploide.
Ingineria genetic la drojdii, ca de altfel i la alte organisme, cuprinde 2 tehnologii: tehnologia
ADN recombinant - inginerie genetic molecular i fuziunea de protoplati inginerie genetic
celular.
Primele experimente de inginerie genetic molecular (transformare genetic) cu drojdii au
fost realizate de Hinnen i Beggs (1978) care au demonstrat posibilitatea clonrii i exprimrii genelor
heterologe n celula de Saccharomyces cerevisiae. Pn n prezent au fost construii numeroi vectori
att pentru tulpinile de drojdii de laborator, avnd o aplicabilitate mai mult teoretic, ct i pentru
tulpinile de drojdii industriale n scopul ameliorrii productivitii acestora.

Vectori, markeri genetici si procedee de transformare genetica


Vectorii utilizabili la drojdii pot fi clasificai n funcie de posibilitatea de clonare i / sau
exprimare a genelor heterologe n:
vectori de clonare care permit numai clonarea fragmentelor de ADN heterolog;
vectori de exprimare care permit exprimarea prin transcrierea ADN heterolog clonat
datorit prezenei unor promotori foarte puternici constitutivi, inductibli sau hibrizi;
vectori de secreie care permit secreia produilor genelor clonate datorit prezenei unor
peptide semnal, reprezentate, de regul, prin peptida semnal a precursorului factorilor de mperechere
a sau i cea a factorului killer.
Toate aceste tipuri de vectori prezint, n comun, ca baz de construcie, un fragment dintr-un
vector pentru celule bacteriene (pBR322, pUC118/119, pUC18/19, pBluescript SK/KS +/-). Acest
fragment asigur o origine de replicare pentru amplificarea vectorului n celula bacterian, o gen de
selecie a transformanilor n populaia bacterian (gena pentru rezisten la ampicilin este cel mai
des ntlnit) i, n unele cazuri, origini de replicare caracteristice fagilor filamentoi care permit
obinerea de ADN monocatenar i casete care fac posibil transcrierea in vitro a fragmentului clonat
(pentru vectori bazai pe fagimidul pBluescript SK/KS +/-).
Toi vectorii utilizabili n drojdii prezint i markerii genetici selectabili n celula de drojdie.
Acestea sunt gene ce codific enzime implicate n cile metabolice ale unor amionoacizi sau
nucleotide (Tab.1). Primul marker genetic de acest tip a fost gena LEU 2 care codific pentru -
izopropilmalat dehidrogenaza i care este capabil s complementeze mutaia leuB de la Escherichia
coli, mutaie care se exprim prin deficien n aceeai enzim a celulelor bacteriene.

Tab.1 Markeri selectabili utilizai pentru drojdii


Gena Enzima Selectia
HIS3 imidazol glicerofosfat dehidrogenaza histidina
LEU2 -izopropilmalat dehidrogenaza leucina
LYS2 -aminoadipat reductaza lizina
TRP1 N -5fosforibozil-antranilat izomeraza triptofan
URA3 Orotidin-5-fosfat decarboxilaza uracil

Principalele clase de vectori de clonare:


n funcie de stabilitate i modul de transmitere n descenden n celulele de levuri, se pot
defini dou clase majore de vectori de clonare (Fig.6. 1):
- vectori integrativi;
- vectori cu replicare autonom.

1
Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

LEU2

pBR322

ADN de drojdie

Vector integrativ (YIp)

LEU2 LEU2
LEU2
pBR322 pBR322 pBR322

CEN
Fragment
ARS din plasmida 2 m
ARS

ADN de drojdie ADN de drojdie


ADN de drojdie

Vector replicativ (YRp) Vector centromeric (YCp) Vector episomal (YEp)

Fig. 6. 1. Principalele clase de vectori de clonare pentru drojdii.


pBR322 - secven provenit din plasmidul pBR322; conine gene pentru rezisten la antibiotice (ampicilin
i/sau tetraciclin) i oriColE1 (pentru replicare autonom n celula bacterian);
LEU2 - gena pentru prototrofie la leucin; ADN drojdie - secven din genomul de drojdie;
ARS - secvena ARS cromosomal sau din plasmida 2 m (pentru replicare autonom n drojdii); CEN -
secven centromeric dintr-un cromosom de drojdie;
secven extins din plasmida 2 m care conine secvena ARS, REP1, REP2, REP3 (STB ) i, de cele mai
multe ori, FLP.

Vectori de clonare
A. Vectorii integrativi (YIp = Yeast Integrating plasmids) conin markeri selectabili pentru drojdii,
dar nu prezint secvene care s permit replicarea autonom a vectorilor n celula de drojdie.
Transformarea celulei de drojdie are loc n urma unui proces de integrare al plasmidei n genomul
drojdiei prin recombinare omoloag ntre o secven din cadrul plasmidei i regiunea corespunztoare
de la nivelul unuia dintre cromozomii drojdiei. Eficiena transformrii cu vectorii YIp este de numai 1
10 transformanig ADN.
n Fig. 6. 2 este reprezentat un vector din aceasta clas - YIp 5. Vectorul prezint:
- genele de rezisten la ampicilin i tetraciclin (ApR, TcR) care permit selecia transformanilor
(ampicilin rezisteni- tetraciclin sensibili);
- originea replicrii din plasmidul ColE1 (oriColE1) confer capacitate de replicare autonom n celula
bacterian;
- tulpinile de drojdie receptor sunt auxotrofe pentru uracil (ura3). Transformarea celulelor de drojdie
are loc prin integrarea vectorului la nivelul secvenei URA3 la locusul de omologie din cromosomul de
drojdie, celulele transformate revenind la starea de prototrofie pentru uracil.

ApR
ApR
TcR
TcR

YIp
YIp 55
5.5
5.5kb
kb

oriColE1
oriColE1

URA3
URA3

Fig. 6. 2. Vectorul integrativ YIp 5

2
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

B. Vectorii cu replicare autonom:


- replicativi (YRp = Yeast Replicating plasmids)
- centromerici (YCp = Yeast Centromeric plasmids)
- episomali (YEp = Yeast Episomal plasmids)
- lineari (YLp = Yeast Linear plasmids)
conin markeri selectabili n celula de drojdie i, spre deosebire de vectorii integrativi, pe lng
secvenele care
le permit replicarea autonom n celula bacterian mai prezint i secvene ce confer capacitatea de
replicare autonom n celula de drojdie de unde i denumirea de vectori navet sau shuttle.
Vectorii replicativi (YRp) prezeni n numar de 1 10 copii/celul, conin secvena ARS
(autonomously replicating sequence) de la nivelul plasmidei 2 m sau dintr-un cromosom de drojdie,
se replic autonom fa de ADN-ul cromosomial al drojdiilor, numai o dat pe parcursul unui ciclu
celular. Acest tip de vectori prezint un grad destul de mare de instabilitate mitotica i meiotica astfel
nct vor fi prezeni n numai aproximativ 5% - 10% dintre descendeni dup circa 10 generaii.
Eficiena transformrii cu vectori YRp este de 103 104 transformani/g ADN.
Vectorii centromerici (YCp) prezeni n 1 2 copii/celul, au fost obinui din plasmidele YRp prin
ncorporarea unei secvene centromerice CEN dintr-un cromozom de drojdie (de exemplu: CEN IV)
pentru a mri stabilitatea mitotica i meiotica a acestora. Ca urmare, rata de pierdere a plasmidelor
este de numai 1% / generaie.
Fig. 6. 3 reprezint schema general de construcie a unui vector centromeric din seria pRS
413 - 414 - 415 - 416. Vectorul este constituit dintr-o regiune care provine din fagimidul pBluescript SK
+/- i o regiune originar din drojdii.
I - din fagimidul pBluescript SK +/- se pstreaz:
- oriColE1 - permite replicarea autonom n celula bacterian (n lipsa unui fag helper pentru
f1), permind meninerea vectorului n forma ADN CCC;
- gena ApR - confer rezisten la ampicilin celulelor bacteriene purttoare a vectorului;
- ori f1 - originea replicrii fagului filamentos f1; prin co-infecia celulei bacteriene gazd cu un
virus helper pentru f1 se declaneaz replicarea ADN de la ori f1 cu obinerea ADN monocatenar sens
sau antisens n funcie de orientarea ori f1 (+ sau -);
- lac Z - gena care codific pentru captul amino-terminal al galactozidazei; aceast regiune
permite, prin complementaie intraalelic, selecia histochimic a vectorilor recombinani (purttori de
ADN exogen la nivelul MCS). Prezena unui promotor inductibil upstream de gena lac Z permite
obinerea de proteine de fuziune;
II - din drojdii:
- gena URA3 ( HIS3/ LEU2/ TRP1) confer prototrofie celulelor de drojdie transformante;
- caseta ARS/CEN - permite replicarea autonom i asigur stabilitatea mitotic a vectorilor
n descenden.

ori f1 (-)

ori f1 (+)
lac Z T3
Kpn I
ApR BssHII

MCS
Sac I
BssHII T7

URA3

oriColE1
ARS CEN

Fig. 6. 3. Schema general de construcie a vectorilor centromerici


din seria pRS 413 - 414 - 415 - 416

3
Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

O variant a vectorilor centromerici o reprezint vectorii de tip YAC (Yeast Artificial


Chromosomes) care conin n plus secvene telomerice de drojdie. Acestea le pemite YAC-urilor s se
replice asemenea cromosomilor lineari. Dei YAC-urile nu sunt folosite n acelai tip de experimente
de clonare ca celelalte categorii de vectori pentru drojdii, capacitatea lor de a clona secvene de ADN
de pn la 400 kpb le-a adus o larg utilizare n studiile ce vizeaz caracterizarea genomului
eucariotelor superioare.
Vectorii episomali (YEp) prezeni n 20 50 copii/celul, conin o regiune mai extins din
plasmida 2 m reprezentat de secvena ARS i situsurile REP1, REP2 i STB (REP3) ceea ce le
confer capacitate de replicare autonom i stabilitate n descenden, astfel nct dup 10 generaii
acetia sunt prezeni nc n 60 95 % dintre descendeni. Cea mai mare parte a vectorilor YEp mai
prezint i secvena FLP din plasmda 2 m, secven care face posibil recombinarea ntre
plasmidele purttoare, rezultnd o mare varietate de multimeri plasmidiali recombinani. Frecvena de
4 5
transformare cu vectori YEp este mare, atingnd 10 10 transformani / g ADN.
Unul dintre vectorii episomali cu mare utilizare n ameliorarea diferitelor tulpini de drojdii, n
special tulpini de laborator, este YEp 24 (Fig. 6. 4). Vectorul prezint:
- o regiune bacterian provenit de la vectorul pBR322, reprezentat de genele pentru rezisten la
ampicilin (ApR) i tetraciclin (TcR) i originea replicrii oriColE1;
- o regiune de la drojdii reprezentat de un fragment extins din plasmida 2 m i gena URA3 ceea ce
permite, pe de o parte, replicarea autonom a vectorului n celula de drojdie i, pe de alt parte,
selecia transformanilor prin cultivarea produilor transformrii pe mediu minimal. Dat fiind auxotrofia
pentru uracil (ura3) a celulelor de drojdie receptor, pe mediul minimal vor crete numai celulele
transformate care au primit vectorul n urma procesului de transformare.

fragment din
ApR
plasmida 2m

ori ColE1

YEp 24
7.7 kb

URA 3

TcR
Fig. 6. 4. Vectorul episomal YEp 24

Vectorii lineari (YLp) sunt prezeni ntr-o singur copie / celul i prezint la capete secvene
repetitive bogate n guanin de tipul 5(dG1-3dT)3, asemntoare secvenelor telomerice de la drojdii
sau ciliate. Aceti vectori sunt de aproximativ 100 ori mai puin stabili dect cromosomii obinuii, dup
10 generaii fiind prezeni n numai 20 40% dintre descendeni.
Civa dintre cei mai utilizai vectori de la drojdii sunt cuprini n Tab. 2.

Tab. 2. Vectori utilizai la drojdii


Dimensiune Originea replicrii Originea replicrii Fenotip selectabil Fenotip selectabil
Plasmida
[kpb] n E. coli n drojdii n E. coli n drojdii
r r
YIp 5 5.541 oriColE1 - Ap , Tc URA
r r
YRp 7 5.816 oriColE1 ARS1 Ap , Tc TRP
r r
YRp 17 7.002 oriColE1 ARS1 Ap , Tc URA, TRP
r r
YEp 13 10.7 oriColE1 2 m Ap , Tc LEU
r r
YEp 24 7.769 oriColE1 2 m Ap , Tc URA
r
YCp 19 10.1 oriColE1 ARS1 Ap URA, TRP
r r
YCp 50 7.95 oriColE1 ARS1 Ap , Tc URA
YLp 21 55 - ARS1 - TRP, HIS
r r
pYAC 3 11.4 oriColE1 ARS1 Ap , Tc TRP, URA, HIS
2 m 6.318 - 2 m - -

4
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

Vectori de exprimare
Vectorii de exprimare permit transcrierea unui segment de ADN heterolog sub controlul unui
promotor aparinnd unei gene structurale. ntreaga regiune este alcatuit din:
secvenele reglatoare i un promotor puternic (fr codonul AUG de iniiere al traducerii);
situs pentru 1 - mai multe endonucleaze de restricie;
secvena terminator al transcrierii.
ADN heterolog poate fi clonat prin inserie n situsul pentru endonucleazele de restricie, fiind
astfel ncadrat ntre secvenele eseniale (promotor i terminator) ale unui proces de transcriere; n
urma procesului de transformare a unor celule de drojdie receptor cu vector recombinat, pot fi uor
obinute proteine heterologe.
Vectorii de exprimare sunt clasificai n funcie de tipul de promotor utilizat n:
1. vectori de exprimare cu promotori constitutivi;
2. vectori de exprimare cu promotori inductibili;
3. vectori de exprimare cu promotori hibrizi constitutivi/inductibili.

1. Un exemplu de promotor constitutiv utilizat n obinerea de vectori de exprimare la drojdii este cel al
genei pentru gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaz, enzim implicat n calea metabolic a glucozei
(Fig. 6. 5). Bitter i colab. (1984) au inserat acest promotor ntr-un vector de tip YEp i l-au utilizat
pentru clonarea i exprimarea genei pentru 1-antitripsin, protein heterolog reprezentnd, n final,
pn la 5% din totalul proteinelor celulare. Gena a fost inserat la nivelul unui situs multiplu de clonare
restictat cu endonucleaza de restricie BamHI. Ca secven semnal pentru terminarea transcrierii i
pentru poliadenilare a fost folosit segmentul de la captul 3' al genei pentru fosfoglicerat kinaz (Fig.
6. 6).

G lu c o z a

G lu c o z o 6 - fo s fa t

F ru c to z o 6 - fo s fa t

F ru c to z o 1 ,6 - b ifo s fa t

D ih id r o x ia c e to n a G lic e ra ld e h id 3 - fo s fa t
g lic e ra ld e h id 3 - fo s fa t d e h id ro g e n a z a

P ir u v a t

A c e ta ld e h id a

a lc o o ld e h id ro g e n a z a

E ta n o l

Fig. 6. 5. Clea metabolizrii fermentative a glucozei pn la etanol n celula de drojdie

2. Exprimarea genelor clonate n vectorii de drojdii ce prezint inserai promotori inductibili este
dependent de concentraia n mediul de cretere a drojdiilor a factorului inductibil, reprezentat, spre
exemplu, de ionii de cupru sau de metanol.
Utiliznd regiunea promotoare 5' a genei CUP1, gena codificatoare a metalotioneinei din
drojdii, a crei activititate este indus de prezena n mediu a ionilor de cupru, s-a reuit clonarea i
exprimarea genei pentru antigenul de suprafa a virusului hepatitei B. Celulele de drojdii transformate
cu plasmide purttoare a acestei gene produc cantiti mari de protein viral ce poate reprezenta
aproximativ 1-2% din totalul proteinelor celulare. Creterea drojdiilor transformate n fermentatoare
mari a facut posibil obinerea a 50 - 100 mg protein viral / litru de cultur. Proteina recombinant
obinut are un grad nalt de omologie cu cea natural, avnd proprieti similare cu cea izolat de la
pacieni infectai i este utilizat n prezent la vaccinarea contra hepatitei B.

5
Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

Un alt promotor inductibil utilizat intens este cel pentru gena codificatoare a alcool (metanol)
oxidazei, enzim implicat n prima treapt de degradare a metanolului n peroxizomii drojdiilor
metilotrofe. Promotorul genei pentru alcool oxidaz este inhibat de prezena n mediul de cultur a
glucozei i etanolului, este derepresat de glicerol i indus de metanol. Prezena promotorului respectiv
permite obinerea unor cantiti mari de protein heterolog (pn la 35% din totalul proteinelor
celulare) de mare puritate.

PGPD
gena pentru
1 - antitripsina

ApR
capat 3' PGK

LEU 2

ori ColE1
fragment
din plasmida 2 m
(include ARS)

Fig. 6. 6. Vector de exprimare cu promotor constitutiv pentru exprimarea


genei care codific 1-antitripsina
(ApR - gena pentru rezisten la ampicilin; oriColE1 - originea replicarii din ColE1;
LEU2 - gena pentru b-izopropilmalat dehidrogenaz - confer prototrofie la Leu celulelor de drojdie
transformante; fragment din plasmida 2 m care conine i secvena ARS pentru replicare autonom n celule
de drojdie; PGPD -promotorul genei pentru gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaz; gena pentru a 1-antitripsin
(gena de interes) integrat la situsul de restricie pentru BamHI; captul 3' al genei pentru fosfoglicerat kinaz -
pentru terminarea transcrierii genei de interes)

3. n unele cazuri proteinele heterologe obinute pot fi toxice pentru celula de drojdie determinnd rate
sczute de cretere. n scopul ameliorrii procesului de obinere a compuilor respectivi s-au construit
o serie de vectori care conin promotori hibrizi constituvi / inductibili a cror funcionare nu este
simultan.
Astfel, interferonul este toxic pentru celula de drojdie. Cu toate acestea a fost posibil
clonarea genei pentru interferon n drojdii i exprimarea ei cu ajutorul unor vectori ce prezentau un
promotor hibrid format din secvena 5' a promotorului genei pentru gliceraldehid-3-fosfat
dehidrogenaz n care a fost inclus secvena activatoare tip enhancer (UAS - upstream regulating
sequence) a genei GAL 10 ce codifica pentru galactoepimeraz (UASG) (Fig.6. 7). Funcionarea
UASG este indus de prezena n mediul de cultur a galactozei (nivelul de exprimare a genei crete
de aproximativ 1000 ori) i este inhibat de prezena glucozei, nivelul de exprimare a genei GAL 10
fiind de 1000 - 2000 ori mai mic n aceste condiii. Celulele de drojdie sunt crescute iniial pe mediu cu
glucoz ceea ce asigur obinerea unei densiti celulare mari, nivelul de exprimare a genei pentru
interferon fiind foarte sczut la fel ca i eventualul efect toxic al interferonului. n etapa urmtoare
celulele sunt trecute pe mediu cu galactoz ca surs unic de carbon, rezultatul fiind activarea UASG
i transcrierea genei pentru interferon , ajungndu-se, n final, la circa 2g interferon / litru de cultur.
Un exemplu asemntor l reprezint cel al clonrii i exprimrii genei pentru factorul de
cretere epidermal necesar pentru regenerarea esuturilor. n acest caz, secvena activatoare UASG a
fost nlocuit cu promotorul genei ADR2, gena structural a alcooldehidrogenazei citoplasmatice ADH
II. Promotorul genei ADR2 este inactivat de concentraiile mari de glucoz din mediul de cultur i
este indus de scderea concentraiei acesteia. Dup creterea celulelor de drojdie pe mediu bogat n
glucoz i atingerea densitii celulare optime, odat cu consumarea glucozei din mediu, are loc
activarea promotorului ADR2 sub influena cruia are loc exprimarea genei pentru factorul de cretere
epidermal. Produsul obinut prezint o structur identic cu cea a hormonului izolat din celulele
umane.

6
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

UASG
PGPD
gena pentru
interferon

ApR
capat 3' PGK

LEU 2

ori ColE1

fragment
din plasmida 2 m

(include ARS)

Fig. 6. 7. Vector de exprimare cu promotor hibrid inductibil/constitutiv


pentru exprimarea genei pentru interferon g
(are aceeai structur ca vectorul de exprimare cu promotor constitutiv, dar, n plus,
prezint secvena UASG - secven tip enhancer a genei GAL 10 pentru
galactoepimeraz)

Vectori de secreie
Drojdiile pot fi manipulate genetic pentru producerea de proteine care sunt secretate n mediu
utiliznd vectori de secreie. Polipeptidele secretate de celulele eucariote sunt sintetizate sub forma
unui precursor cu un capt amino-terminal extins, precursor care sufer mai multe modificri ce includ
procese de clivare proteolitic, formarea unor puni disulfurice i, eventual, O- sau N-glicozilri, n final
rezultnd forma matur a proteinei.
La drojdii s-au folosit diverse secvene semnal pentru direcionarea secreiei n mediu a
proteinelor heterologe. Dintre acestea amintim secvena semnal a factorului killer, cea a genei pentru
proteaz alcalin extracelular (XPR2) n cazul drojdiilor capabile s degradeze n-alcanii, i secvena
semnal (pre-prosegmentul precursorului) a factorului de mperechere. Aceasta din urm este
reprezentat de regiunea amino-terminal de 85 de aminoacizi a produsului genei MFa1 i se termin
cu un situs dibazic Lys-Arg recunoscut de endoproteaza numit kexin care cliveaz la acest nivel
produsul primar de traducere n cursul procesrii spre forma matur.
Proteinele heterologe secretate de celulele de drojdie manipulate genetic sunt proteine de
fuziune care ncep cu pre-prosecvena MF1 i continu cu proteina propriu-zis. n cele mai multe
cazuri polipeptida ce urmeaz a fi secretat flancheaz situsul dibazic de clivare, astfel nct n urma
aciunii kexinei se elibereaz proteina de interes.

I. Experiment de construire a vectorilor shuttle la Saccharomyces cerevisiae.


Experimentul const n construirea unui vector de clonare replicativ din seria pRS, denumit
pBY, pornind de la vectorii YEp 24 i pBluescript SK +/-.
Principalele etape ale acestui experiment sunt : (1) izolarea ADN plasmidial reprezentat de vectorii
parentali; (2) restricia vectorilor cu endonucleaze de restricie (Hind III) i tratamentul cu fosfataz
alcalin (pentru a evita recircularizarea vectorilor parentali); (3) ligarea fragmentelor de restricie cu
obinerea vectorului pBY ; (4) transformarea celulelor de drojdie cu vectorul pBY.
I.1. Izolarea ADN plasmidial reprezentat de vectorii parentali.
ADN plasmidial de YEp24 i pBluescript SK +/- se izoleaz din tulpina bacterian Escherichia
coli K-12 DH5, conform protocolului de lucru prezentat n Cap. 2. 3. (metoda lizei alcaline). Se
verific electroforetic i spectrofotometric puritatea i integritatea ADN izolat i se calculeaz
concentraia ADN exprimndu-se n g ADN/l.
I.2. Digestia vectorilor cu Hind III si tratamentul cu fosfataz alcalin
n desfurarea protocolului de lucru se va ine cont de indicaiile din Cap. 3. 2, cu
urmtoarele observaii: se realizeaz 4 amestecuri de restricie, notate A, B, C i D; pentru digestia
ADN plasmidial de YEp24 se realizeaz dou variante de lucru - cu i fr fosfataz alcalin - pentru
observarea aciunii fosfatazei alcaline; ca marker de migrare se folosete ADN de fag restrictat cu
HindIII (rezult 8 fragmente de restricie).

7
Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

ori f1 ori f1

ApR lacZ' ApR


lacZ'
pBluescriptSK+
2,96 kbp.
PCS
p lacZ'
ori f1
lacZ'
ori Col EI ApR
ori Col EI
Hind III
digestion ligation ARS2m
pBY
HindIII 6293 bp

ori
ApR ARS2m ARS2m

p lacZ' URA3

ori YEp24 HindIII


7,769 kbp

URA3
URA3
HindIII
TcR

Fig. 6. 8. Structura noului vector pBY


(secvena ARS pentru replicare autonom n celula de drojdie ; URA3 permite selecia celulelor de drojdie
transformate ; ori- ColE1 pentru replicare n celula bacterian ; ori f1 permite replicarea dup modelul fagilor
filamentoi; ApR marker pentru selecia n celula bacterian; LacZ selecia transformanilor prin complementaie
inter-alelic; situs MCS incluznd situsul de restricie BamH I pentru inserarea ADN heterolog).

Amestecurile de restricie se realizeaz n tuburi Eppendorf sterile:

Componenta reaciei A B C D
Ap distilat steril 26 l 26 l 23 l 23 l
Tampon pentru Hind III 4 l 4 l 4 l 4 l
[10 X]
ADN plasmidial YEp24 6 l 6 l - -
[1,5 g ADN/l]
ADN plasmidial pBluescript SK+/- - - 10 l -
[2 g ADN/l]
ADN fag (dilutie 1:5) - - - 10 l
Hind III [10U/l] 2 l 2 l 3 l 3 l
Fosfataz alcalin [1U/l] 2 l - - -
Volum total: 40 l 40 l 40 l 40 l

Componentele reaciilor de restricie vor fi adugate exact n ordinea menionat,


schimbndu-se vrful pipetei la fiecare tub i component al reaciilor. Enzimele utilizate vor fi
meninute pe ghea.
Dup realizarea amestecurilor, probele se incubeaz pe baie de ap, la 37oC, timp de 2,5 ore.
La terminarea timpului de digestie se realizeaz precipitarea fragmentelor de restricie. Pentru
fiecare prob se va face urmtorul amestec de reacie: tot volumul probei (40 l) + 1/5 volume soluie
EDTA 0,25M + 1/2 volume soluie acetat de amoniu 5M + 3 volume etanol 100% rece (-20oC). Probele
se incubeaz 15 minute la -20oC. Se centrifugheaz 15 minute la 14000 rpm (4oC). Sedimentul se
spal de 2 ori cu etanol 70% i se centrifugheaz 15 minute la 14000 rpm. ADN rezultat se reia n 25
l soluie TE.
Pentru verificarea eficienei reaciei de restricie probele vor fi supuse n continuare unei
electroforeze n gel de agaroz n sistem submers (Cap. 2. 2). Pentru electroforez se folosesc
tampon TBE 0,5X i agaroz 1% (preparat n TBE 0,5X), iar ca marker de migrare 1 l amestec
albastru de bromfenol - sucroz. Schema de ncarcare a gelului de electroforez este : cte 5 l din

8
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

probele de ADN restrictat, cte 5 l din probe reprezentate de ADN plasmidial de YEp24 i pBluescript
SK +/- nedigerat (folosite ca markeri pentru reaciile de restricie), 5 l ADN plasmidial E. coli V517
scala de plasmide. Restul de 20 l din probele de digestie vor fi folosii n etapa urmtoare ligarea
fragmentelor i obinerea noului vector pBY. Probele se las la migrat la un voltaj de 2.5 3 V/cm.

Fig. 6. 9. Gelul de verificare a reaciei de restricie a ADN plasmidial


de YEp24 i pBluescript SK +/-
(godeurile : 1 ADN / Hind III; 2-3 - ADN plasmidial YEp24/ Hind III; 4 ADN
plasmidial YEp24/Hind III i tratament cu fosfataz alcalin; 5 ADN plasmidial
YEp24; 6 ADN plasmidial pBluescript SK+/ Hind III; 7 ADN plasmidial
pBluescript; 8 ADN plasmidial E. coli V517)

I.3. Ligarea moleculelor de ADN restrictate


Moleculele de ADN restrictate sunt supuse reaciei de ligare conform schemei din tabelul
urmtor. n timpul pregtirii reaciei, tuburile cu probe i enzimele sunt meninute pe ghea. Ca i n
cazul reaciei de restricie, componentele sunt adugate n ordinea menionat.
Probele sunt incubate la 14oC, peste noapte.

Componenta reaciei L1 L2 L3 L4
ap distilat steril 3 l 11 l 2 l 2 l
tampon de ligare (10X) 2.5 l 2.5 l 1 l 1 l
Reacia A 10 l - - -
(YEp24/Hind III + AP)
Reacia B - 5 l - 5 l
(YEp24/Hind III)
Reacia C 5 l 2 l 5 l -
(pBlue/Hind III)
ATP (10 mM) 2.5 l 2.5 l 1 l 1 l
ADN ligaz de fag T4 2 l 2 l 1 l 1 l
(diluie 1 :2 n tamponul de ligare)
Volum total 25 l 25 l 10 l 10 l

Verificarea eficienei reaciilor de ligare i identificarea fraciei reprezentate de vectorul nou


obinut pBY, se realizeaz prin electroforez n gel de agaroz n sistem submers, folosind tampon de
electroforez TBE 1X, agaroz 0.8% (preparat n TBE 1X), 3 l ADN din fiecare prob, 1 l marker
de migrare (albastru de bromfenol-sucroz).

Fig. 6. 10. Gelul de verificare a reaciei de ligare a fragmentelor de


restricie obinute pentru YEp24 i pBluescript SK +/-
(godeurile : 1 ADN / EcoR I, Hind III ; 2 YEp24/Hind III; 3 pBluescript
SK +/-; 4 ligare L2; 5 ligare YEp24/Hind III (digestie parial) + pBluescript
SK +/- / Hind III; 6 ligare L1; 7 autoligare ADN plasmidial YEp24/Hind III i
tratament cu fosfataz alcalin ; 8 - autoligare L3; 9 - autoligare L4; 10
ADN plasmidial pBluescript SK +/-; 11 ADN plasmidial YEp24)

II. Transformarea genetic cu vectori shuttle


Transformarea genetic reprezint principalul procedeu de introducere n vitro de material
genetic exogen n celule pro- sau eucariote. Acest proces permite realizarea unor studii fundamentale
privind structura i funcionarea genelor pro- i eucariote, cartarea i screening-ul genelor i a unor
studii aplicative privind ameliorare genetica a diferitelor categorii de organisme.

9
Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

La Saccharomyces cerevisiae, exist mai multe modaliti de realizare a transferului de


material genetic, cu eficiene diferite, dintre care menionm :
- transformarea chimic;
- transformarea celulelor intacte cu vectori plasmidiali, prin electroporare.

A. Transformarea chimica n prezena LiCl


Mecanismul care st la baza acestei metode este, n principal, formarea de pori la nivelul
peretelui celular al celulelor de drojdie sub aciunea ionilor de Li (Li+) i, probabil, eliberarea unor
receptori membranari pentru ADN exogen. Ceilali reactivi utilizai au rolul de a facilita ptrunderea
ADN transformant n celula de drojdie: ADN carrier (ADN din sperm de hering preparat n soluie
stoc 10 mg/ml n TELI) mrete eficiena transformrii avnd un rol cu prepoderen cantitativ; PEG
are rolul de a concentra ADN transformant i ADN carrier la suprafaa celulelor de drojdie.
Aceast metod asigur o frecven de transformare mai mare dect n cazul transformarii
prin fuziune de protoplati i, spre deosebire de electrotransformare, nu necesit aparatur special.

Protocol de lucru
Tulpina receptor folosit este S.cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2)
Vector shuttle utilizat pentru transformare: YEp24
Se realizeaz o cultur de S. cerevisiae Ts5 n YPG lichid i se incubeaz 18 ore la 28oC. 1,5
ml cultur se centrifugheaz 5 minute la 6500 rpm. Supernatantul se arunc, iar sedimentul celular se
resuspend n 1 ml soluie TELI , pH 8.0 i se incubeaz 30 minute la 30oC. Din suspensia format se
repartizeaz cte 200 l n 5 tuburi Eppendorf (de 1,5 ml). n fiecare dintre cele 5 tuburi se adaug
cte 20 l ADN carrier. n 4 dintre tuburi se adaug i cte 40 l extract vector (tubul nr.5 va fi notat ca
Martor). Se incubeaz 30 min la 30oC. Dup agitare la vortex, n fiecare dintre cele 5 tuburi se adaug
cte 200 l soluie TELI-PEG. Se incubeaz 20 minute la 30oC, apoi 10 minute la 42oC.
Din fiecare tub se nsmneaz pe cte 2 placi Petri (100 l/plac) cu mediu YNB-leu-
glucoza i se incubeaz 48 ore la 28oC.

Medii i soluii
Mediu YPG
Mediu YNB-leu-glucoza : yeast nitrogen base 0.67 % ; sulfat amoniu 0.5 % ; glucoza 2.0 % ;
agar 2.0 % ; leucin 3 mg/l
soluie TELI - pH 8.0 : Tris 10 mM; EDTA 1 mM ; LiCl 50 mM
soluie TELI-PEG : 25 ml soluie TELI + 40 % polietilenglicol 6000

B. Transformarea electric - electrotransformarea


Electrotransformarea presupune expunerea celulelor, tratate sau nu nainte cu un agent
labilizator al peretelui celular, n prezena ADN-ului exogen, la pulsuri de cmp electric cu o anumit
amplitudine i durat. Aceste pulsuri determin dezorganizarea reversibil a membranei plasmatice,
ceea ce conduce la o cretere a permeabilitii acesteia, inclusiv pentru macromolecule de tipul ADN.
Mecanismul molecular al penetrrii particulelor exogene prin membrana celular nu este elucidat.
Condiiile optime de electropulsare (intensitatea cmpului electric, durata pulsului, compoziia mediului
de suspensie, cantitatea de ADN plasmidial, numrul de celule, etc) sunt determinate prin ncercari
pentru fiecare experiment n parte.
n multe experimente de electrotransformare parametrii cei mai importani par a fi intensitatea
i durata pulsului electric aplicat deoarece acesta produce o dezorganizare temporar a membranei
celulare. De asemenea, celulele supuse electrotransformarii trebuie s se gseasc n faz
logaritmic de cretere, iar tamponul utilizat este glicerolul n soluie apoas, deoarece literatura de
specialitate menioneaz faptul ca glicerolul i sucroza sunt cei mai eficieni stabilizatori osmotici. Un
alt parametru important n electrotransformare este densitatea suspensiei celulare i concentraia
ADN exogen. n literatur se menioneaz c numrul de transformani crete linear cu creterea
numrului de celule pn la o anumit valoare, dup care apar erori datorit heterogenitii cmpului
electric aplicat. Saturaia n ADN plasmidial corespunde unui raport ntre numrul moleculelor de ADN
exogen i numrul de celule de aproximativ 100:1. La concentraii mai mari de ADN plasmidial
frecvena transformrii scade. O posibil interpretare a acestor rezultate ar fi aceea conform creia
doar o subpopulaie de celule de drojdie este competent pentru transformare. n experimentele
noastre am utilizat o cantitate de cca 200 ng ADN plasmidial la 1.5 ml suspensie (ce conine cca 5.1 x
8
10 celule / ml).

Protocol de lucru
Tulpina receptor utilizat este Saccharomyces cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2).
ADN transformant este reprezentat de ADN vector YEp24

10
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

1,5 ml cultur de S. cerevisiae Ts5 n mediu YPG, n faz logaritmica de cretere (18 ore) se
centrifugheaz 6 minute la 6000 rpm. Sedimentul se resuspend n 1,5 ml soluie glicerol 20%, se
citete la spectrofotometru absorbana la = 650 nm i se calculeaz densitatea celular. Se
determin concentraia ADN de YEp 24 prin citirea A260.
Pentru electroporare se realizeaz 10 probe folosind camere de electroporare de 2 mm3,
fiecare prob fiind format din : 200 l suspensie celular i 20 l ADN transformant. Se realizeaz i
un Martor care are aceeai compoziie ca probele dar nu este supus curentului electric. Cele 10 probe
sunt suspuse electrotransformrii la diverse intensiti ale cmpului electric (kV/cm): 0.250; 0.500;
0.750; 0.870; 1.000; 1.125; 1.250; 1.375; 1.500; 1.625. Pentru toate probele curentul electric este
reprezentat de pulsuri bipolare de cte 10 sec, cu pauze de cte 10 sec, durata total a trenului
fiind de 22 msec. Dup electroporare, din fiecare cuv se iau 100l i se aduc 1000 l cu YPG, se
incubeaz 2 ore la 30oC. Se realizeaz diluii zecimale n funcie de densitatea celular a suspensiei
citit iniial i din ultimele 2 diluii se nsamneaz 0.1 ml pe plci cu YNB suplimentat cu leucin .
Dup incubarea plcilor 72 ore la 30oC, se numr coloniile de electrotransformani i se
calculeaz frecvenele i eficienele de transfomare pentru cele 10 probe. Ca martor sunt nsmnate
celulele ce nu au fost supuse electroporrii, pe mediu complet (YPG). Eficiena transformrii este
estimat prin raporarea numrului de celule transformate la numrul de celule martor.

III. Fuziunea de protoplati


Protoplatii reprezint sisteme experimentale importante, cu implicaii n elucidarea unor
probleme majore ale biologieie moleculare i celulare, biochimiei i geneticii. nlturarea peretelui
celular a creat posibilitatea studierii directe a proprietilor fizice, i fiziologice ale plasmalei, ct i a
altor citomembrane. Protoplatii permit, de asemenea, descifrarea mecanismelor care intervin n
fuziunile membranare, precum i nelegerea proceselor de biosintez a componentelor peretelui
celular. Tehnologia protoplatilor a facilitat i separarea, n condiii optime, a diferitelor componente
celulare (mitocondrii, nuclei, peroxizomi), permind cunoaterea interrelaiilor morfo-funcionale de la
nivelul diferitelor compartimente celulare. Importana protoplatiilor deriv i din perspectivele oferite
pentru experimentele de inginerie genetica celular i molecular.
Dup ce Eddy i Williamson (1957) au pus la punct o tehnic eficient de preparare a
protoplatilor la drojdii, folosind enzime litice din sucul digestiv de Helix pomatia, cercetrile privind
izolarea i utilizarea protoplatilor de drojdii n experimentele genetice au luat o mare amploare.
Aceste sisteme celulare au fost utilizate cu succes n hibridarea somatic prin fuziune de
protoplati. Astfel, tehnica fuziunii de protoplati a prezentat i prezint, nca, o importan deosebit
n realizarea hibrizilor intra-, interspecifici i intergenerici, pornind de la tulpini de laborator cu markeri
de auxotrofie sau tulpini industriale cu markeri mitocondriali.
Protoplatii sunt sisteme celulare fragile, astfel nct pentru meninerea viabilitii, integritii i
metabolismului lor normal, trebuiesc realizate condiii speciale de izolare, manipulare i cultur. Astfel,
masa de protoplati este influenat de vrsta i starea fiziologic a culturii. Celulele tinere de S.
cerevisiae, aflate n faz exponenial de cretere, sunt imediat convertite n protoplati, pe cnd cele
n faz staionar sunt rezistente la liz. n timpul tranziiei de la faza exponenial la faza staionar,
se constat o cretere rapid a rezistenei la protoplastizare, datorit diferenelor structurale ale
peretelui celular.
Procedeele de preparare a protoplatilor de drojdii pot fi clasificate n :
1. procedee de inhibare specific a sintezei peretelui celular ;
2. procedee de digestie enzimatic a peretelui celular cu enzime din sucul digestiv de Helix
pomatia (un complex de peste 35 de enzime, dintre care amintim : endo (1,3) i endo (1,3)
glucanaz, manaz, chitinaz, celulaz, lipaz, poligalacturonaz), sau cu enzime microbiene de tipul
zymolyaz de Arthrobacter luteus, lyticaz sau novozym 234 (Fig.6.11 - a,b).
Deoarece protoplatii sunt sensibili la variaiile presiunii osmotice, este necesar asigurarea
unei osmolariti echilibrate a mediului cu stabilizatori osmotici de tipul zaharurilor nemetabolizabile i
a srurilor anorganice (manitol, sorbitol, clorur de poatsiu, sulfat de magneziu, sulfat de amoniu).
S-a constatat ca unii aminoacizi cu sulf, cum ar fi cisteina, accelereaz procesul de izolare a
protoplatilor de drojdii prin tratamentul enzimatic cu suc digestiv de Helix pomatia. Ulterior, o serie de
cercettori au realizat sensibilizarea celulelor de drojdie la tratamentul enzimatic cu compui mercapto
- : 2 - mercaptoetanolamin, 2 mercaptoetanol, tioglicolat i ditiotreitol. S-a presupus c aceti
compui acioneaz asupra proteinelor din structura peretelui celular prin desfacerea legturilor
disulfurice, facilitnd aciunea litic a enzimei.
Primele cercetri referitoare la fuziunea controlat a protoplatilor la drojdii au fost iniiate de
Ferenczy (1974) i au fost impulsionate n urma descoperirii i folosirii ca agent de fuziune a
polietilenglicolului (PEG). Ulterior, s-a demonstrat ca fuziunea chimic cu PEG este mediat de ionii
2+ 2+
de calciu (Ca ). Rolul PEG i Ca n procesul de fuziune a fost ns ndelung controversat. Astfel,

11
Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

Lucy (1984) a presupus ca evenimentul central n procesul de fuziune membranar este interaciunea
i fuziunea bistraturilor lipidice ale celor dou membrane, proces n care proteinele nu intervin. PEG i
Ca2+ determin deshidratarea membranelor i schimbarea permeabilitii datorit dezorganizarii locale
a bistraturilor lipidice. Prin reducerea repulsiei electrostatice i a forelor de hidratare a lipidelor apare
un contact strns ntre bistraturile lipidice. Lipidele celor dou bistraturi se unesc, fapt ce implic
pierderea temporar a configuraiei bistratificate n punctul de fuziune. n final, cele dou bistraturi
fuzioneaz i se produce restabilirea structurii normale a plasmalemei. Conform altor cercetatori, ionii
Ca2+ intervin n fuziune prin creterea intracelular a concentraiei Ca2+ i activarea unor enzime ce
determin dezorganizarea lipidelor. Astfel, s-a presupus c n cazul fuziunii mioblastelor, spre
exemplu, ionii Ca2+ activeaz fosfodiesteraza ce determin ruperea bistraturilor lipidice (Fig. 6.11
c,d).
Electrofuziunea reprezint o alt tehnic de fuziune a protoplatilor. n esen, metoda const
n expunerea protoplatilor unui cmp electric pulsatoriu de intensitate nalt i de scurt durat. n
aceste condiii, se realizeaz o rupere local a membranelor care devin astfel permeabile. Procesul
este reversibil. n timpul fuziunii se formeaz ntre membranele celor dou celule puni lipidice, astfel
nct cele dou membrane se refac mpreun n zona de contact. Punile formate determin apariia
unor pori cu diametrul foarte mic, fapt care are ca rezultat apariia unei tensiuni de suprafa foarte
nalt. Etapa urmtoare const n fuziunea celulelor ntr-o sfer.
n realizarea fuziunii, se pornete, de regul, de la tulpini de laborator ce prezint markeri
biochimici de auxotrofie, fapt ce uureaz izolarea ulterioar a produilor de fuziune. Prin fuziunea de
protoplati sunt depite barierele sexuale ce mpiedic realizarea ncrucirilor ntre tulpinile de
drojdii ce aparin aceluiai tip de mperechere ( x , a x a). Fenomenul de reversie a protoplatilor de
drojdii presupune parcurgerea a dou etape: (1) formarea unui nou perete celular i (2) realizarea
mitozei i citochinezei i repetarea ciclului celular. S-a pus problema dac peretele celular este
sintetizat de novo sau este necesar existena unui model supramolecular (resturi ale peretelui celular
iniial), primer pentru sinteza noului perete. Cercetrile de microscopie electronic utiliznd tehnici de
fluorescen i criodecapaj, au adus dovezi n sprijinul ipotezei privind sintetizarea de novo a peretelui
celular. Reversia la starea celulei iniiale este un proces gradat, determinat genetic, ce presupune
existena ctorva generaii de revertani. Iniierea reversiei este marcat de desfurarea primei
citochineze care se realizeaz imediat ce peretele celular a fost complet regenerat. Regenerarea
protoplatilor la drojdiile din genul Saccharomyces se realizeaz pe medii solide cu gelatin, agar sau
polietilenglicol (Fig. 6.11 - d).
n ceea ce privete produii de fuziune, descendena hibrizilor selecionai pentru
complementaia markerilor de auxotrofie sau pentru markeri de rezisten, poate fi caracterizat
pentru confirmarea originii hibride prin: (1) sporulare i segregare meiotic sau segregare mitotic, (2)
stabilirea fuziunii nucleare - formarea de heterocarioni sau homocarioni, (3) stabilirea gradului de
ploidie.
1. Segregarea meiotic i mitotic. La tulpinile de drojdii ce prezint sporulare i meioz (S.
cerevisiae MAT a/) se poate realiza analiza tetradic i, implicit, stabilirea constituiei genetice a
descendenei produilor de fuziune. n experimentele de fuziune de protoplati s-au utilizat ns, i
tulpini de laborator de S. cerevisiae heterotalice de acelai tip de mperechere (fuziuni de tipul a x a,
sau x ), sau tulpini industriale ce nu prezint sporulare i meioz. Urmrind capacitatea de
sporulare i mperechere a produilor de fuziune / sau a/a, s-a constatat c acetia sunt deficitari n
sporulare, dar prezint capacitate normal de mperechere (a/a x /), iar descendenii, dup
sporulare, pot fi analizai genetic. n absena capacitii de sporulare se poate iniia pierderea
cromozomilor n mitoz (haploidizare) cu acriflavin, radiaii ultraviolete, nitrosoguanidin, etc. Prin
aceast metod a fost indus seregarea parentalilor i a recombinanilor la Saccharomyces
cerevisiae, Candida tropicalis i Hansenula polymorpha, fapt ce a permis analiza ulterioar a
descendenilor i, implicit, caracterizarea produilor de fuziune.
2. Formarea heterocarionilor i a homocarionilor. n urma fuziunii de protoplati se pot obine
heterocarioni, heteroplasmoni sau hibrizi. Prima etap ce urmeaz fuziunii protoplatilor aparinnd la
dou tulpini diferite de drojdii este formarea heterocarionilor multinucleai. S-a stabilit ca la S.
cerevisiae, n urma fuziunii de protoplati apar cu o frecven mare celule poliploide. De asemenea,
este posibil s se obin produi de fuziune pornind de la trei parentali haploizi diferii. Aceste rezultate
demonstreaz c produsul de fuziune conine 2 sau mai multi nuclei. n aceast faz se realizeaz
ns, intermixarea citoplasmatic i, probabil, fuziunea unora dintre nuclei. Numrul de nuclei per
produs de fuziune poate fi determinat prin colorare cu acridin orange, DAPI sau Giemsa.
3. Gradul de ploidie al produilor de fuziune poate fi determinat prin metode diferite. La
drojdiile ce sporuleaz, de tipul S. cerevisiae a/, se poate aplica analiza tetradic. O alt metod
const n stabilirea gradului de ploidie prin msurarea cantitii de ADN din celul. La unele drojdii,

12
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

ploidia poate fi estimat i prin msurarea dimensiunii celulei. Se poate aprecia gradul de ploidie i pe
baza viabilitii sporului, innd cont de faptul ca triploizii produc spori cu o viabilitate scazut.
Prin combinarea acestor metode de analiz s-a demonstrat ca produii de fuziune de la S.
cerevisiae, provenii de la dou sau mai multe tulpini haploide sunt predominant diploizi, dar pot s
apar cu frecven mare i triploizi sau tetraploizi. De asemenea, au fost identificai i produi
aneuploizi. Apariia acestora demonstreaz faptul c, ntre nucleii heterocarionului se poate realiza
transferul unor cromosomi individuali, ntr-o manier similar cu cele observate n producerea de
citoductani (Fig.6.11).
Parte experimental
Pentru fuziunea de protoplati se folosesc urmtoarele perechi de tulpini de drojdii :
A B
S.cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2) x S.cerevisiae D-585-11c (a lys)
S.cerevisiae 17/17 ( his) x S.cerevisiae 9744 ( leu2)
R
S.ellipsoideus Ni (Ni 7mM) x S.cerevisiae SMR4 CdR (Cd 0.8 mM)
R
H.polymorpha Ni (Ni 7mM) x H.anomala CdR (Cd 0.8mM)

Experimentul necesit parcurgerea mai multor etape:


A. Izolarea de protoplati
n aceast etap se urmrete izolarea de protoplati pentru fiecare dintre tulpinile de drojdii
menionate mai sus. Tulpinile se cultiv n mediu YPG, 16 ore la 30oC, cu agitare. 1.5 ml cultur se
centrifugheaz 5 minute la 6000 rpm. Sedimentul celular se resuspend n 500 l Tris-HCl 0.05 M (pH
7.5). Se adaug: 500 l soluie (KCl 1.2M + MgSO4 0.02M) i 10 l -mercaptoetanol
(mercaptoetanolul poreaz peretele celular al drojdiilor, iar soluia de KCl + MgSO4 este stabilizator
osmotic). Tuburile se agit timp de 15 min.

a b c

d
e
Fig. 6.11. Aspectul celulelor de drojdie n timpul protoplastizrii, fuziunii si reversiei protoplatilor
a. ultrastructura celulei de S. cerevisiae (25000 x); b. ultrastructura protoplatilor de S. cerevisiae (24600 x) ; c. aglutinri ale
2+
protoplatilor de S. cerevisiae induse de PEG n prezena Ca (20500 x) ; d. diferenierea unor puni citoplasmatice ntre
protoplati adiaceni la S. cerevisiae (31500 x) ; e. aspectul celulelor de S. cerevisiae dup reversia protoplatilor (17600 x).

Se centrifugheaz 5 minute la 6000 rpm, iar sedimentul celular se resuspend n 750 l


soluie KCl 1.2M + MgSO4 0.02M. Se adaug 500 l soluie zymolyaz (soluie stoc 2mg/ml) pentru
distrugerea peretelui celular. Se incubeaz 1 or la 37oC cu agitare. La sfritul acestei etape se obin
protoplati de drojdii. Se centrifugheaz probele 5 minute la 6000 rpm, iar sedimentul celular se
resuspend n 1 ml soluie KCl 1.2 M + MgSO40.02M.
B. Fuziunea protoplatilor i regenerarea produilor de fuziune:
1 ml suspensie protoplati A (obinui n etapa anterioar) se amestec cu 1 ml suspensie
protoplati B. Amestecul se centrifugheaz 5 minute la 5000 rpm. Sedimentul se resuspend n 1.5 ml
soluie ce conine 1.34 ml PEG 6000 concentraie 40% i 0.16 ml soluie CaCl2 0.1M. Probele se in 10
minute la 20oC, iar 100 l suspensie se nsamneaz pe plci Petri cu mediu de regenerare (YPG +
KCl 0.6 M, topit i rcit la 44oC).

13