Autor(a):

Lic. Sandra Valds

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL QUMICA INDUSTRIAL

Ctedra de Qumica Orgnica y Bioqumica
2017

Contenidos Pgina

Normas de Trabajo en los Laboratorios 3

1
 Preparacin de medios de cultivo 7
Degradacin de colorantes con hongos ligninoliticos 12
Extractos vegetales y su potencial como controladores biolgicos 16
Fermentacin 23
Tincin diferencial de Gram 28
Elaboracin de un antibiograma 33
Extraccin de ADN animal y vegetal 40
Control biolgico 44
Uso de microorganismos a nivel industrial 47
Identificacin bioqumica de E.coli 54
Anlisis de aguas contaminadas 58
Actividad metablica 63
Manejo de la cabina de flujo laminar
67

Anexo 71

Bibliografa 72

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Se denomina bioseguridad, al conjunto de operaciones y medidas de autoproteccin que se

deben adoptar para evitar tomar contacto con materiales txicos y/o infecciosos que puedan
daar la integridad fsica.
Toda medida de autoproteccin debe constituir una conducta natural del personal de
laboratorio, ya que realizar tareas en el mismo implica exponerse a innumerables riesgos que
pueden ser prevenidos.
Existe una gran diversidad de elementos y equipos de autoproteccin, como pueden ser:
Guantes de ltex
Gavacha
Mascarillas

Tambin deben cumplirse pautas de seguridad, que, al igual que los elementos de
bioseguridad, sirven para el resguardo personal.
No se permitir el ingreso al laboratorio sin la gabacha debidamente cerrada.

2
 No se permitir fumar o comer dentro del laboratorio.
El cabello deber estar siempre recogido.
No utilizar telfonos celulares ni algn otro equipo electrnico dentro del laboratorio.
Si necesita ausentarse durante el laboratorio, debe solicitar permiso al profesor
encargado.
Se deber evitar el uso de sandalias como calzado dentro del laboratorio as como el uso
de anillos, pulseras y relojes que puedan interferir en el correcto manejo del material.
Se deber evitar la circulacin innecesaria por el laboratorio transportando sustancias
qumicas y/o biolgicas.
Durante la realizacin de los trabajos prcticos todos los elementos personales debern
ser retirados de las mesadas de trabajo
No se permitir el ingreso de alumnos sin previa autorizacin.

Se deben usar guantes al trabajar con sustancias txicas o patgenos.

Procure que el material que va a utilizar est limpio, seco y en buen estado para no
alterar el resultado del experimento. Al concluir la prctica, lave el material, acomdelo
en su lugar y limpie la mesa de trabajo
Al lavar la cristalera evite verter sustancias slidas, o lquidos viscosos al desage.

Si va a lavar las placas de Petri con medios de cultivo, que contengan organismos
patgenos, primero debe esterelizarlas en autoclave a 121 oC por 15 min. Una vez
concluido el proceso coloque los medios de cultivo en una bolsa antes de desecharlos
en la basura.

Revisar que los lquidos inflamables no se encuentran cerca, si va aprender el mechero.

Mantenga el mechero encendido solo el tiempo necesario.

Antes de comenzar a calentar sustancias colquese los lentes de seguridad.

Si necesita calentar sustancias debe tener extremo cuidado. Utilice el material de vidrio
refractario o de porcelana, pero primero debe colocar encima del mechero el trpode
con la tela de asbesto.

Cuando se est calentando un lquido en un tubo de ensayo, o bien se est llevando a

cabo una reaccin en l, primero debe calentar el tubo con un movimiento circular
suave y siempre mantenlo inclinado, pero NUNCA la boca del tubo debe dirigirse a su
cara o a la de tus compaeros de trabajo.

Cuando necesite transportar el microscopio ptico, tome el equipo sujetando con una
mano el brazo y con la otra base del mismo. NUNCA lo arrastre, pues esto provocar
que se des calibre.

3
 Al terminar la prctica, limpie el ocular y los objetivos con un trozo de papel de seda,
especialmente si utiliza aceite de inmersin. El aceite de inmersin solo se utiliza con
el objetivo de mayor aumento 100x.

Tan pronto como se termine un experimento, desmntense los aparatos y lmpiese el

equipo utilizado. Regrese todo equipo al lugar designado.

Emplee solo las sustancias indicadas en el experimento, asegurndote primero que

estn debidamente etiquetadas. NUNCA utilice sustancias que carezcan de nombre o
que no pueda identificar. Tampoco modifique las cantidades indicadas para dichas
sustancias.

No se lleve los frascos de reactivos a las mesas del laboratorio.

NUNCA regrese sustancia alguna no utilizada al frasco original. Si se toma demasiado,

djese el exceso para que sea utilizado por otros estudiantes, o bien trese en el lugar
apropiado.

NUNCA vierta agua en cido concentrado. Virtase siempre lentamente el cido en el

agua, mezclando con un agitador.

En caso de emergencia comunquesela inmediatamente al profesor, por muy ligera que

aparente ser.

Al terminar mantenga todo en orden y aseado.

INCENDIO O EXPLOSION

El fuego es una reaccin qumica, una oxidacin. Para que se produzca, resulta necesario el
ntimo contacto de tres componentes, lo que constituye el Tringulo del Fuego. Combustible -
Calor Comburente (Oxgeno). Si se eliminan cualquiera de estos componentes, ser
suficiente, para que el fuego no se inicie.

Tipos de Fuego
CLASE A - Slidos de Naturaleza orgnica
CLASE B - Combustibles lquidos
CLASE C - Las dos clases anteriores donde interviene la electricidad
CLASE D - Metales especiales

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TIPO DE EXTINTORES
TIPO A - Matafuegos de Agua
TIPO B - Matafuegos de Polvo Qumico Seco/ de Espuma
TIPO C - Matafuegos de Dixido de Carbono
TIPO D - Matafuegos Polvo Qumico Seco Presurizado
En caso de quemaduras en la piel, realizar una irrigacin de la zona
afectada con agua abundante por lo menos durante 15 minutos.
En caso de incendio en la mesa de trabajo o en el piso, para controlar el
fuego utilizar los extintores (espuma de dixido de carbono) que se encuentran
localizados en las paredes laterales del laboratorio. Si el fuego alcanza a alguna
otra persona, utilice, adems de los extintores, una manta. Si el fuego no puede
vencerse de inmediato, debe evacuar el laboratorio y avisar a los bomberos.

IMPORTANTE
LOS GUANTES DE LTEX NO RESISTEN EL CONTACTO CON LOS CIDOS Y LCALIS CONCENTRADOS.
INTOXICACIONES
Intoxicacin es el ingreso al cuerpo de toda sustancia que por sus caractersticas qumicas o
biolgicas puede comprometer seriamente la integridad del organismo o provocar la muerte
de la persona afectada; tambin se puede definir como el conjunto de manifestaciones
producidas por las reacciones nocivas de esta sustancia y capaces de exteriorizarse como
enfermedad.
Un frmaco o droga es una sustancia que puede modificar una o ms funciones del organismo
una vez introducido en l; un txico es toda aquella sustancia, incluidos los frmacos, que
pueden producir un dao en el organismo y un veneno es un txico muy potente, aunque se
utiliza como sinnimo de txico.

NUNCA PROVOCAR EL VMITO CUANDO EL TXICO SEA UN LCALIS, UN CIDO O DERIVADOS DEL PETRLEO.
CORTADURAS

Las cortaduras ms frecuentes se producen por la cristalera que se rompe. En caso de

sufrir algn corte, informe inmediatamente al profesor de laboratorio y, en la medida
de lo posible, cercirese de no dejar partculas de vidrio en la herida.

NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO

5
 Para cada experimento, la persona que realizar la prctica deber:

1. Estudiar el experimento antes de la fecha de realizacin.

2. Contestar el cuestionario que se incluye en cada prctica antes de la
realizacin de la misma.
3. Revisar la gaveta que se le signe, si no est completa, reportar el material
que falta al asistente o al profesor del laboratorio en los primeros diez
minutos.

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVOS:

1. Establecer los fundamentos tericos para la preparacin de medios de cultivo.

2. Preparar medios de cultivo y manejar adecuadamente la autoclave.

INTRODUCCIN:

Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para el

desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo
puede ser inoculado (es decir, se le aaden organismos) y a continuacin incubado en
condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. El crecimiento de los
microorganismos es el cultivo. Un cultivo axnico o puro contiene un nico tipo de
microorganismos.
Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante.
Los medios de cultivo contienen como mnimo: carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y
sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancias inductoras del crecimiento. Tambin se aaden colorantes que actan como

6
indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del
crecimiento de unas bacterias y no de otras.
El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriolgicos. Se
disuelve completamente a 100C y se solidifica al enfriarse a 40C.

De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

Lquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se
denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulacin.
Semislidos: Contienen 0.5% de agar en su formulacin. Se utilizan para
estudiar la movilidad de las bacterias (presencia o ausencia de flagelo).
Slidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulacin. Estos medios
inmovilizan a las clulas, permitindoles crecer y formar masas aisladas visibles
llamadas colonias. Las colonias permiten al microbilogo reconocer la pureza
del cultivo; las placas que contengan ms de un tipo de colonia no provienen de
un cultivo puro. Las placas de agar tambin se utilizan para la determinacin de
clulas viables (recuento en placas).

De acuerdo a su composicin, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

Definidos: es aqul medio de cultivo del cual se conoce su composicin exacta.
Son muy utilizados en estudios fisiolgicos. Los medios mnimos son medios
definidos que nicamente le proporcionan al microorganismo los nutrientes
necesarios para crecer, pero no para desarrollarse ptimamente.
Complejos: es aqul del cual no se conoce la composicin exacta del medio. A
menudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto de levaduras,
extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas pero de las cuales se
desconoce la composicin qumica exacta. Estos medios son muy utilizados para
cultivar bacterias desconocidas o bacterias de requerimientos nutricionales
muy complejos.

De acuerdo a su funcin, los medios de cultivo se clasifican como:

7
 Medios selectivos: Son aqullos que poseen uno o ms componentes aadidos,
los cuales inhibirn o prevendrn el crecimiento de ciertos tipos de especies de
bacterias y/o promovern el crecimiento de las especies deseadas. Uno puede
ajustar las condiciones fsicas de un medio de cultivo tales como el pH, la
temperatura, para hacerlo selectivo para los organismos de inters.
Medios diferenciales: Permiten al investigador distinguir entre diferentes tipos
de bacterias con base en alguna caracterstica observable en su patrn de
crecimiento en el medio, ya sea por produccin de algn pigmento o por
cambios de color en el medio debido a indicadores de pH, o por halos de
degradacin de algn componente en el medio de cultivo.
Medios de enriquecimiento: Contienen algn componente que permite el
crecimiento de cierto tipo especfico de bacteria, pero no contienen sustancias
inhibidoras.

Medios enriquecidos: Se emplean para cultivar microorganismos que

requieren un gran nmero de factores de crecimiento. Generalmente contienen
extractos biolgicos poco usuales como sangre, suero en polvo, extracto de
cerebro de res, yema de huevo, etc.

MEDIO SELECTIVO Y HEMOLISIS EN AGAR SANGRE

DIFERENCIAL
Colonia Lactosa negativa

Colonia Lactosa positiva

HEMLISIS COMPLETA HEMLISIS PARCIAL

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MATERIALES Y REACTIVOS

- 2 mecheros
- 1 agitador
- 1 magneto
- 1 erlenmeyer de 500 mL
- 1 balanza
- 1 esptula
- 1 probeta de 250 mL
- 10 cajas de Petri estriles desechables
- Masking tape *
- Papel aluminio*
- Plumn indeleble*
- Reactivos para el medio de cultivo
- Autoclave

(Pedir el material marcado con * a los estudiantes)

PARTE EXPERIMENTAL

1. Realice los clculos pertinentes para preparar 250 mL de medio Agar nutritivo (AN).
(por equipo). Ponerlos en el matraz.

Componentes Por L
Peptona de caseina 10 g
NaCl 5g
Extracto de carne 3g
Agar 15 g

2. Con la probeta, medir 250 mL de agua destilada y aadirla al matraz con el polvo.
3. Poner el matraz sobre el agitador con un magneto para que la suspensin se mezcle
homogneamente.
4. Cuando la solucin est homognea, retirarla del agitador, sacar el magneto y tapar
con un pedazo de aluminio.
5. Proceder a preparar los otros medios de cultivo que la profesora indique.
6. La autoclave estar prendida previamente por la profesora. Con su ayuda, introduce
tu matraz en el interior de la autoclave. Cirrala siguiendo las indicaciones del
docente. Se esterilizan a 1 atm de sobrepresin durante 20 minutos .
7. Una vez que empiece a salir vapor, coloca la vlvula en la autoclave, para que la
presin comience a subir. Tiene que llegar hasta 15 lb/in 2. A partir de este momento,
debers tomar el tiempo de 20 minutos. Debers tener cuidado de que la presin de la
autoclave, nunca rebase los 20 lb/in2, ni est por debajo de los 15 lb/in2. Esto se puede
controlar conectando y desconectando la autoclave, segn te indique el docente.

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8. Transcurridos los 20 minutos, desconecta la autoclave. Comienza a abrir la vlvula
para liberar el vapor y que la presin comience a bajar. La autoclave puede abrirse
nicamente cuando el manmetro marque cero. Antes no ya que podra explotar!
9. La autoclave se abre desde atrs, procurando que nadie quede de frente hacia
donde se abre la tapa, ya que saldr mucho vapor caliente que causa quemaduras. Una
vez que se abri con cuidado, con ayuda del trapo, sacar el matraz.
10. Cuando an est caliente, se agita para hacer la disolucin de agar homognea y se
placas (a 45C) de Petri estriles, previamente esterelizadas. Las cajas no pueden ser
destapadas a menos que sea entre los mecheros o dentro de la campana de flujo
laminar. Las tapas no se tocan por dentro con los dedos, ni se sacan del rea de
esterilidad.
11. Cuando el medio solidifique, las placas petri se etiquetan con el tipo de medio,
equipo, grupo y fecha de elaboracin. Guardar en el refrigerador para utilizar la
siguiente prctica.
12. Vaciar el agua de la autoclave con cuidado de no quemarse.

RESULTADOS

1. Escriba los clculos que realiz para preparar el agar nutritivo y los otros medios
de cultivo.

CUESTIONARIO

1. Qu es el agar y de donde se obtiene?

2. Cules son los nutrientes que proporciona el agar a los microorganismos?
3. Qu importancia tienen los medios de cultivo?
4. Qu medios de cultivo son los ms empleados en el laboratorio?
5. Por qu el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de
bacterias?
6. Realice un diagrama de flujo del procedimiento a seguir en esta prctica.
7. Dibuje una autoclave, indicando como funciona.
8. Identifique las posibles fuentes de error

10
 DEGRADACIN DE COLORANTES CON HONGOS LIGNINOLTICOS
OBJETIVOS
- Determinar la capacidad bioremediadora de los hongos, modificando variables como
el pH y la adicin de manganeso.
- Remover los colorantes azul acido 113, azul disperso 3 y verde bsico 4 de aguas
contaminadas utilizando hongos.
-Realizar un grfico que permita visualizar la degradacin en el tiempo del colorante.
INTRODUCCION
Los efluentes industriales vertidos al medio ambiente provocan diferente impacto
sobre ste en funcin de su naturaleza. El color pocas veces considerado una forma de
contaminacin a pesar de los daos que provoca, puede estar asociado a la presencia
de compuestos txicos y grupos cromforos o polmeros.
Existe una gran cantidad de organismos (bacterias y hongos) degradadores de celulosa
y hemicelulosa, pero muy pocos con la capacidad de desdoblar la ligina; de hecho, los
nicos con la capacidad de hacerlo son un grupo de basidiomicetes poseedores de un
complejo enzimtico compuesto por enzimas oxidasas y peroxidasas, que al catalizar
las primeras reacciones pueden generar molculas ms pequeas que se incorporan a
los ciclos metablicos del organismo. Entre las peroxidadas, las ms importantes en la
mineralizacin de la lignina son la lignina peroxidasa (LiP), la manganeso peroxidasa

11
(MnP), y peroxidasa verstil (PV). MnP y PV tienen un grupo hemo como cofactor y
emplean H2O2 como primer aceptor de electrones, mientras que la LiP puede oxidar
directamente sustratos aromticos no fenlicos, como el alcohol veratrlico. La MnP
puede oxidar sustratos del tipo fenlico a travs de Mn2+ pero tambin puede hacerlo
con aqullos del tipo no fenlico a travs de los productos de peroxidacin de cidos
grasos insaturados, mientras que la PV comparte las propiedades catalticas con las
descritas anteriormente, pues puede oxidar el Mn2+ a Mn3+ (como lo hace la MnP) y
tambin oxida compuestos no fenlicos (como lo hace la LiP.
La lacasa es una oxidasa ampliamente distribuida entre los hongos de pudricin blanca
con cuatro tomos de cobre como cofactor y cuyo aceptor de electrones es el O2
dando agua como producto. La enzima oxidada ataca principalmente sustratos
fenlicos, pero en presencia de 1-hidroxibenzotriazol (1-HBT), 2,2-azinobis [cido 3-
etilbenzothiazoline- 6-sulfnico] (ABTS) o cido violrico [10,11] stos actan como
cooxidantes y capacitan a la enzima para atacar sustratos menos oxidables como los de
tipo no fenlico.
Los colorantes sintticos son ampliamente utilizados en muchas industrias (textil,
papel, cosmtica, farmacutica y alimentaria), por su fcil uso, bajo costo y alta
estabilidad, sin embargo, algunos estudios sugieren que estos colorantes pueden ser
txicos, carcingenos y generadores de reacciones alrgicas y asmticas en personas
susceptibles. Adicionalmente, estos colorantes no son removidos por los tratamientos
tradicionales de manejo de aguas residuales y por ello, en muchos pases se utilizan
microorganismos degradadores que separan los enlaces azo de su respectivo
azocolorante y produce la decoloracin de los productos.
Para este fn, los microorganismos generalmente emplean su sistema ligninoltico,
compuesto por enzimas oxidativas producidas en respuesta a la limitacin de
nutrientes, y con poca especificidad por el sustrato como la Ligninaperoxidasa (LiP), la
Manganesoperoxidasa (MnP) y la polifenoloxidasa o lacasa).
MATERIALES Y REACTIVOS
Cajas de petri, erlenmeyers de 125 ml, torundas de algodn, extracto de malta,
glucosa, ABTS, tween 80, Acido tanico, manganeso, cobre, azul de coomassie
(colorante).
PROCEDIMIENTO

PARTE A. Preparacin del pre inoculo

1. Colocar seis fragmentos (5 mm ) del hongo crecido en agar papa dextrosa en

erlenmeyers de 250 mL con 50 mL de medio de cultivo lquido, a 28 C y 150
rpm durante 4 das.
2. Del hongo que creci se tomaran 0.4 g en base hmeda y se agregaran a
erlenmeyers de 125 mL con 40 mL de agar malta, a 28 C, 125 rpm durante 7
das.

12
 3. Una vez ha esporulado el microorganismo en el medio de cultivo inicial (agar
malta), se cortan 4 o 5 pequeos fragmentos de agar (hongo incluido), se
transfieren al medio de expresin enzimtica y se somete a agitacin orbital
(aproximadamente 150 r.p.m.), en temperatura ambiente y por espacio de dos
a cuatro semanas aproximadamente.

PARTE B. Extractos enzimticos

1. El medio de cultivo se someter a agitacin por una hora, a 450 rpm. El fluido
extracelular se obtendr al exprimir con ayuda de un tamiz el sustrato, y
centrifugado a 6000 rpm durante 30 min, a temperatura ambiente.
2. Se tomarn muestras por triplicado al tiempo 0 y cada 12 h a partir de las 24 h
de cultivo hasta los tres das.
3. A estas muestras se les realizaran pruebas cualitativas (ensayo de placas) y
cuantitativas, como el contenido de glucosa, la produccin de biomasa, y la
actividad enzimtica de la lacasa (ug de medio solido) como lo describe
Bourbonnais et al, 1990.

PARTE C. Prueba cualitativa

Presencia de enzima lacasa en un medio con ABTS

1. Se aadir en una placa Petri, 15 mL de medio de agarosa estril (0.5%),

conteniendo 0.5 mM de ABTS por ml en buffer acetato de sodio (pH 4.5, 0.1 M).
2. El desarrollo de un color verde azuloso intenso, alrededor, ser considerado
como positivo para actividad lacasa. (Crdoba, 2009).

Parte D. Pruebas cuantitativas

Actividad de la enzima lacasa (UI)

1. Los extractos enzimticos de cada cultivo se obtendrn con buffer de acetato

0.05 M, pH 4.8, en una relacin 0.25 g de sustrato/mL de buffer. Se agitarn
vigorosamente y se centrifugan a 4000 rpm durante una hora.
2. El sobrenadante se filtrar sobre gasa y se centrifugar de nuevo a 4000 rpm
durante 30 min y se almacenar a 4C para una posterior medicin de su
actividad enzimtica.
3. La determinacin de la enzima lacasa se llevara a cabo por la oxidacin ABTS
[2,2- Azinobis( 3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] al catin ABTS+ .

Compuesto Volumen

13
ABTS 1 mM 200 l
Buffer acetato de sodio 0.1M, pH 5 600 l
Extracto enzimtico 1200 l
Volumen total 2000 l

4. Con una micropipeta se tomarn 1500 L y se colocarn en una cubeta limpia.

Se medir la absorbancia por triplicado, en el espectrofotmetro a 420 nm en
un espectrofotmetro (Tinoco et al., 2001), realizando medidas al inicio de la
reaccin y tres minutos despus.
5. Si la absorbancia presenta un valor superior a 0.5 se debe tomar la muestra y
diluirla.
6. Se promediarn los valores de las tres mediciones de absorbancia obtenidas y
se multiplicarn por el factor de dilucin.
7. La actividad especfica se calcular a partir de las lecturas de DO 429 mediante
la siguiente ecuacin (Chaparro y Rosas, 2006):

AE = DO x fd x Vt t x x L x V enz

Donde:
AE: actividad enzimtica en unidades internacionales por L de disolucin de enzima
(UL-1 enz)
DO: Diferencia de densidad ptica
fd: Factor de conversin debido al coeficiente de extincin molecular
Vt: Volumen total de la disolucin (mL)
t: Tiempo de reaccin en el bao mara (min)
E: coeficiente de extincin molar ( 420 nm = 36 M-1, para ABTS)
L: longitud de celda (cm)
Venz: Volumen de la solucin de extracto crudo utilizado (mL)

Una unidad (U) de actividad de lacasas se define como la cantidad de enzima capaz de
oxidar 1 mol de ABTS, por minuto, minuto (U = mol / min), bajo las condiciones del
ensayo

En caso de no utilizar agua como blanco de calibracin, se debe preparar un poco ms

de este medio y esterilizarlo en pequeas alcuotas.

PARTE E. Concentracin de colorante residual

1. Colocar los micelios de los hongos en estudio en erlenmeyer de 250 mL que
contiene la solucin de colorante de: azul acido 113 (50 ppm), azul disperso 3
(50 ppm) y verde bsico 4 (50 ppm). Tapar cada Erlenmeyer.
2. Mantener en agitacin constante a 120 rpm, durante 7 das a 30 C.
3. A los 8 das tomar pequeas alcuotas del medio y medir la absorbancia a las
longitudes de onda de 565 nm y 640 nm, que faciliten la elaboracin de un

14
 grfico que evidencie el decoloramiento progresivo del color. Usar como blanco
de cada colorante agua destilada.
4. Repetir el paso 3 a los 15 das.
5. Confeccionar la curva correspondiente a cada colorante

CUESTIONARIO

1. Describa las caractersticas de la enzima lacasa.

2. Escriba la reaccin que ocurre con el sustrato.
3. Nombre tres organismos que degradan la lignina.
4. Seale la importancia de estos organismos.
5. Qu papel juegan los hongos en la biorremediacion?
6. Calcule la Actividad enzimtica.

EXTRACTOS VEGETALES Y SU POTENCIAL COMO CONTROLADORES

BIOLOGICOS

OBJETIVOS
- Realizar el anlisis qumico de los extractos de las plantas.
- Realizar la prueba de susceptibilidad de microorganismos, ante los extractos
vegetales.
- Determinar el efecto bactericida y fungicida de extractos acuosos y etanlicos,
de plantas colectadas en la regin del Valle Central, en ensayos in vitro

INTRODUCCION
En los ltimos aos con la finalidad de exterminar o contener plagas se han utilizado en
forma intensiva agroqumicos, los cuales si bien es cierto han disminuido la prdida de
cosechas por insectos tambin han daado el ambiente y la salud humana (Cobos-
Gasca et al. 2011).
Actualmente se han examinado otras alternativas para disminuir el uso de los
plaguicidas en la agricultura; nuevas investigaciones han demostrado que las plantas
producen una variedad amplia de compuestos con actividad insecticida (Scott et al.
2004, 2008, Vinayaka et al. 2009, Carmona, 2014). Esta actividad se debe
principalmente a la presencia de metabolitos secundarios que son sintetizados por las

15
plantas. Gracias a estas propiedades, muchas especies podran ser usadas como
agentes importantes en el control biolgico (Seplveda-Jimnez et al. 2003).
La bsqueda de metabolitos secundarios con actividad de inters insecticida,
bactericida, fungicida, genotxico y mutagnico en organismos nocivos (Pereira et al.
2008, 2009, Scott et al, 2004) resulta ser adecuada para sustituir el uso de plaguicidas
convencionales y dainos (Ramrez y Lacasaa 2001).
Metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios son los compuestos qumicos sintetizados por las plantas
que cumplen funciones no esenciales en ellas, de forma que su ausencia no es fatal
para la planta, ya que no intervienen en el metabolismo primario de las mismas. Los
metabolitos secundarios de las plantas intervienen en las interacciones ecolgicas
entre la planta y su ambiente, cumplen funciones de defensa, sirven para atraer a los
polinizadores, actan como agentes alelopticos. Adems su presencia en las plantas
les ha conferido a stas propiedades biolgicas contra diversos padecimientos lo ha
alentado el estudio de las plantas en la bsqueda de nuevas drogas, antibiticos,
insecticidas y herbicidas. Para Garca y Gutirrez, (2007) algunas malezas poseen una
serie de metabolitos secundarios tales como alcaloides, taninos, saponinas, glicsidos
cianognicos, compuestos fenlicos, entre otros.
Las saponinas actan en los sistemas cardiovasculares y nerviosos as como en el
sistema del digestivo. Las dosis grandes de los jugos de la legumbre que contienen
saponinas causan la digestin del estmago. Los glucsidos cianognicos imparten un
gusto amargo, reducen toxicidad del sabor agradable y de la causa. Dentro de las
sustancias que son consideradas como antinutrientes se encuentran metabolitos
secundarios como los fitatos, taninos, leucinas, glicsidos cianognicos, alcaloides,
saponinas, estos tres ltimos siendo el objetivo de identificacin en las plantas
recolectadas. Los glicsidos cianognicos al hidrolizarse, los ciangenos producen HCN
(un potente veneno), glucosa y otros productos, en funcin del tipo de ciangeno. Los
cianidos exhiben marcada afinidad hacia enzimas crticas, como el citocromo oxidasa,
inhibiendo la respiracin celular, lo que produce convulsiones y la muerte. La
utilizacin de estos ingredientes en la alimentacin animal es posible mediante
tratamientos trmicos suaves debido a que son muy lbiles ante el calor (DMello,
1995) En los alcaloides, a los herbvoros, les resultan desagradables por su sabor
amargo. Los efectos metablicos del alcaloide son primariamente la inhibicin
neuronal, produciendo agudos signos de toxicidad como convulsiones y parlisis
respiratoria. Se supone que el gusto desagradable es mediado parcialmente a travs de
efectos neurolgicos (Cheeke y Kelly 1989). Las saponinas se diferencian de acuerdo a
la naturaleza del residuo aglicona (sapogenina), en saponinas conteniendo aglicona
esteriodal y saponinas conteniendo aglicona triterpnica. Estas ltimas son las que se
encuentran mayormente en las plantas. Se reporta que afectan el comportamiento y
metabolismo del animal a travs de: hemolisis de eritrocitos, reduccin de colesterol
sanguneo y heptico, depresin de la tasa de crecimiento, inhibicin de la actividad
del msculo liso, inhibicin enzimtica y reduccin en la absorcin de nutrientes
(Cheeke 1971).

16
En estudios realizados se demostr que el extracto acuoso de Urtica dioica, posee
actividad antioxidante. Las dosis de 50, 100 and 250 g mostraron 39, 66 and 98% de
inhibicin sobre la peroxidacin de la emulsin de cido linoleico, mientras que con
una dosis de 60 g/ml de -tocopherol, se obtuvo solamente, un 30% de inhibicin.
Adems, los compuestos fenlicos totales en el extracto fueron determinados como
pyrocatechol equivalente, el cual mostro actividad antimicrobiana contra nueve
microorganismos, y actividad antiulcerosa contra ulcero gnesis inducida por etanol,
as como tambin, efecto analgsico (Glin et al, 2004).
MATERIALES Y REACTIVOS
Cajas de petri, erlenmeyers de 125 ml, torundas de algodn, agar PDA, agar Mueller
Hinton, Filtro wathman No.1, discos de papel de filtro.
HCL, H2SO4, glucosa, etanol, NaOH, diclorometano, sulfato, amoniaco.

METODOLOGIA
PARTE A. Recoleccin de Material Biolgico.

1. Recolectar muestras de hojas y tallos de plantas procedentes del Valle Central.

2. Envolver las plantas en papel peridico y llevarlas al laboratorio.
3. Pesar aproximadamente 500 g de hojas y tallo, de la planta y secar a 60 C en
una estufa.
4. Moler las plantas hasta obtener un polvo fino.

PARTE B. Reconocimiento de metabolitos secundarios.

1. Reconocimiento de alcaloides
Los alcaloides son bases nitrogenadas, las cuales pueden convertirse en sus
respectivas sales mediante la adicin de un cido diluido y formar precipitados al
reaccionar con los reactivos especficos para alcaloides. En esta prctica utilizaremos
los reactivos de: Mayer y Dragendorff.
Obtencin del extracto: tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco
macerar en un mortero y adicionar un volumen suficiente de cido clorhdrico al 5%,
calentar al bao mara durante 10 minutos, enfriar y filtrar.
Prueba cualitativa: colocar en dos tubos de ensayo aproximadamente 0.5 ml del
filtrado cido y agregar a uno de los tubos 2 gotas del reactivo de Dragendorf y al otro
tubo 2 gotas del reactivo de Mayer. Si se observa turbidez o precipitado en ambos
tubos se considera como prueba presuntiva de la presencia de alcaloides.

17
2. Reconocimiento de esteroides y/o triterpenoides
Obtencin del extracto: en un beaker limpio y seco, tomar una pequea cantidad de
material vegetal seco y molido, adicionar diclorometano en cantidad suficiente hasta
que cubra la muestra (realice esta prueba bajo campana extractora de gases) agitar con
varilla de vidrio para realizar una mejor extraccin, posteriormente filtrar sobre sulfato
de sodio anhidro.
Prueba cualitativa (Ensayo de Lieberman Burchard): en un tubo de ensayo limpio y
seco tomar 1 ml del filtrado orgnico y agregar por la pared del tubo 1 ml de anhdrido
actico y con precaucin 1-2 gotas de cido sulfrico concentrado. La aparicin de
coloraciones: verdes, azules, rojas o violeta es prueba positiva para esteroides y/o
triterpenoides en la muestra.
3. Reconocimiento de saponinas
Obtencin del extracto: tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco y
macerar en un mortero, adicionar suficiente cantidad de agua que cubra la muestra,
filtrar a travs de gasa.
Prueba cualitativa: pasar 4 ml del filtrado a un tubo de ensayo y agitar vigorosamente
durante un minuto, si se forma abundante espuma que permanece estable durante 5
minutos es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra.
4. Reconocimiento de compuestos fenlicos y taninos
Obtencin del extracto: tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco,
macerar en un mortero hidratando la muestra para facilitar el rompimiento de los
tejidos, pasar la muestra completamente macerada a un beaker y adicionar cantidad
suficiente de agua para cubrir la muestra, calentar en bao mara de 10 minutos y
filtrar en caliente.
Prueba cualitativa: tomar 1 ml del filtrado en un tubo de ensayo y adicionar 2 gotas de
solucin de tricloruro frrico (FeCl3 al 1%). La aparicin de un color verde, azul o negro
es prueba positiva para compuestos fenlicos.
En un segundo tubo de ensayo tomar 1 ml del filtrado y agregar unas gotas de la
solucin de gelatina-sal, si se presenta turbidez o formacin de precipitado es prueba
presuntiva de la presencia de taninos en la muestra.
5. Reconocimiento de flavonoides, leucoantocianidinas y cardiotnicos
Obtencin del extracto: macerar en un mortero aproximadamente 10 g del material
vegetal finamente picado, adicionar suficiente cantidad de etanol, calentar al bao
mara durante 5 minutos, enfriar y filtrar.
Prueba cualitativa para flavonoides (Ensayo de Shinoda): tomar un 1 ml del filtrado
etanlico en un tubo de ensayo, agregar varias limaduras de magnesio y por la pared
del tubo dejar caer lentamente HCl concentrado (37%). La aparicin de colores:

18
naranja, rojo, violeta rosado, indican es prueba presuntiva de la presencia de
flavonoides en el material vegetal.
Prueba cualitativa para leucoantocianidinas: tomar 2 ml del filtrado en un tubo de
ensayo y adicionar 1 ml de cido clorhdrico concentrado (37%). Calentar en bao
mara durante 15 minutos. La aparicin de coloraciones rojas es prueba presuntiva de
la presencia de leucoantocianidinas en la muestra.
Prueba para la deteccin de cardiotnicos y lactonas , insaturadas: adicionar 1 ml
de filtrado en un tubo de ensayo y agregar 0.5 ml de reactivo de Kedde (mezclar 1 ml
de solucin A con 1 ml de solucin B para preparar este reactivo antes de usarlo). La
aparicin de coloraciones violetas o prpuras es prueba presuntiva de la existencia de
cardiotnicos en la muestra.
6. Reconocimiento de quinonas
Obtencin del extracto: pesar 0,5 g de material vegetal en polvo en un beaker de 100
ml, adicionar 20 ml de etanol al 95% y calentar en bao mara durante 5 minutos hasta
ebullicin, filtrar en caliente,
Hidrlisis: tomar 5 ml del filtrado y adicionar 3 ml de H2SO4 al 10%, calentar en bao
mara durante 15 minutos hasta ebullicin, enfriar la muestra.
Extraccin con tolueno: adicionar 5 ml de tolueno al extracto previamente hidrolizado,
agitar suavemente sin emulsionar, utilizando la cabina de extraccin.
Prueba cualitativa: tomar 2 ml de la fase orgnica en un segundo tubo de ensayo,
adicionar 1 ml de la solucin previamente preparada de hidrxido de sodio al 5% en
amonaco al 2%. La aparicin de un color rojo cereza en la capa acuosa indica presencia
de quinonas en la muestra.
7. Reconocimiento de antocianinas
Obtencin del extracto: en un erlenmeyer colocar 10 g de muestra fresca finamente
desmenuzada, aadir 200 ml de agua, calentar a ebullicin durante 5 minutos y filtrar.
Prueba cualitativa: adicionar 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo y aadir 1 ml de
NaOH diluido. Observar la coloracin formada.
En otro tubo de ensayo adicionar 2 ml del filtrado y aadir 6 gotas de algn cido
mineral diluido (HCl H2SO4 al 10%). Observar la coloracin formada.
Las antocianinas se reconocen por producir diferentes colores es a diferentes pH.
8. Reconocimiento de cumarinas
En un tubo de ensayo grande adicionar 1 g de material vegetal fresco y macerado y
agregar cantidad suficiente de etanol hasta cubrir la muestra. Con un trozo de papel
filtro blanco cubrir la boca del tubo de ensayo y sujetarlo con pinzas o una banda
elstica. Agregarle unas gotas de NaOH diluido en el papel filtro y calentar hasta
ebullicin durante 5 minutos, posteriormente enfriar y retirar el papel filtro. Observar

19
bajo luz ultravioleta a 365 nm la aparicin de una coloracin fluorescente que puede
ser: verde, amarilla o roja.
PARTE C. Preparacin del extracto alcohlico.
1. Colocar 10 g del polvo de la planta, en un erlenmeyer y agregar etanol al 96 %, hasta
llegar a un volumen de 20 mL (concentracin de 500 mg/ml).
2. Dejar reposar por tres das hasta que se evapore el solvente.
3. Se obtuvo un extracto concentrado, a partir del cual a partir del cual se prepararan
tres dosis (1, 0.5 y 0.1) que sern derivadas de una solucin madre al 10 % (1 ml del
extracto concentrado en 9 mL de agua).
4. Filtrar con filtro Whatman N 1.
5. El material obtenido se recoge en botellas de vidrio de color mbar y se almacena
refrigerado a 4C.

PARTE D. Preparacin del extracto acuoso.

1. Preparar extractos acuosos al 25 %, 50 y 100 % agregando 12.5, 25 y 50 g de polvo
de la planta en 50 mL de agua, respectivamente.
2. Dejar 24 horas en reposo, para la mejor extraccin de los compuestos
hidrosolubles.
3. Filtrar con filtro Whatman N 1 y guardar en un frasco limpio.
4. El material obtenido se recoge en botellas de vidrio de color mbar y se almacena
refrigerado a 4C.

PARTE E. Preparacin de los Discos de Sensibilidad.

1. Colocar los discos y esterelizarlos en autoclave a 121C por 15 minutos, para
luego ser secados en horno a 60C por una hora.
2. Los discos se colocan en placas petri estriles, donde sern impregnados con
10l del extracto etanlico yo acuoso. Se realizaran 3 rplicas por ensayo.
3. Dejar secar por espacio de 15 minutos.

PARTE F. Prueba de Susceptibilidad Bacteriana.

1. Preparar placas petri conteniendo agar Mueller Hinton a las cuales se les
efectu un control de esterilizacin a 37C por 24 horas.
2. Sembrar en las placas los cultivos de los microorganismos en estudio dejndolas
secar por unos minutos.
3. Colocar los discos impregnados con el extracto etanlico a las diferentes
concentraciones junto con un disco control.

20
 4. Colocar los discos impregnados con el extracto acuoso a las diferentes
concentraciones.
5. Incubar a 37 C por 24 horas los cultivos bacterianos, y por 7 das los de hongos.
6. Tras este perodo se recogen las placas y sin abrir, se observa el crecimiento de
los microorganismos. Medir el halo de inhibicin.

1 1. Extracto etanlico al 1 %;
2.Extracto etanlico al 0.5 %;
6 2 3.Extracto etanlicol 0.1 %;
7 4. Extracto acuoso al 25 %
5. Extracto acuoso al 50 %
6. Extracto acuoso al 100 %
3
5 7. Control
4

Figura 1. Colocacin de los discos con extractos etanlicos y acuosos de las plantas.

CUESTIONARIO
1. Qu son los metabolitos secundarios?
2. Qu importancia tienen los metabolitos secundarios para las plantas?
3. Qu importancia tienen para nuestra vida?
4. Qu son las malezas? Qu importancia juegan?
5. Nombre cuatro posibles errores que pueden afectar los resultados de la
prctica.
6. Nombre los metabolitos secundarios que se evaluaran en la prctica
7. Seale dos funciones de cada uno de ellos.

21
 FERMENTACION
OBJETIVOS
1. Reconocer la importancia de la fermentacin para los seres vivos.
2. Reconocer la importancia industrial de la fermentacin.
3. Aprender a elaborar de forma sencilla yogurt.
4. Determinar la actividad catalasa de las bacterias del yogurt

INTRODUCCIN
La fermentacin se define como el proceso por el cual una sustancia orgnica sufre
reducciones u oxidaciones que producen energa y acumulacin de productos. En
dicho proceso, el microorganismo produce un metabolito o biomasa, en ausencia o
presencia de oxgeno.
En la naturaleza la fermentacin tiene lugar cuando las condiciones ambientales
permitan la interaccin del microorganismo y la sustancia orgnica susceptible.
El proceso de fermentacin se puede clasificar de acuerdo a:
Tipo de producto final (cido actico, cido lctico etanol, butanol y enzimas)
Presencia o ausencia de oxgeno

22
 Producto: clulas microbianas (biomasa)
En el caso particular de la fermentacin anaerbica se realiza en ausencia de oxigeno y
se refiere por lo general a la degradacin de los carbohidratos, aunque otras sustancias
aparte de los carbohidratos pueden fermentar. La fermentacin tiene como principal
funcin la produccin de energa utilizable para la clula, debido a que los
carbohidratos almacenan gran cantidad de energa.
El yogur es un producto lcteo obtenido mediante la fermentacin bacteriana de la leche. Si
bien se puede emplear cualquier tipo de leche, la produccin actual usa predominantemente
leche de vaca. La fermentacin de la lactosa (el azcar de la leche) en cido lctico es lo que da
al yogur su textura y sabor tan distintivo. A menudo se le aade fruta, vainilla, chocolate y otros
saborizantes, pero tambin puede elaborarse sin aadidos. Las bacterias lcticas que se deben
utilizar segn el Cdigo Alimentario Argentino son: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y
Streptococcus salivarius subsp. termophilus
En el siguiente experimento se realizar la produccin de cido lctico por
Lactobacillus helveticus. Este microorganismo es un bacilo gram positivo, que se
presenta aislado en racimo y forma cido lctico como producto de la fermentacin
de la lactosa.
La protena predominante en la leche es la casena, pero cuando L. helveticus crece en
la leche no se disuelve, sino, que precipita producto de la acidificacin y disminucin
de pH. Esta precipitacin de las protenas debido a que se vuelven insolubles , es lo
que se conoce como cuajo o leche agra y permite detectar la fermentacin con
una prueba visual, por su olor caracterstico y con un indicador de pH.

ACTIVIDAD CATALASA

Se trata de un ensayo muy simple que intenta determinar si la bacteria

problema tiene capacidad para degradar el perxido de hidrgeno, uno de los
agentes oxidantes producidos como consecuencia de determinadas reacciones
metablicas oxidativas propias del metabolismo aerobio. La enzima encargada de
degradar este producto es denominada catalasa y aparece en casi todos los
microorganismos aerobios obligados o facultativos. Existen sin embargo organismos
anaerobios o microaerfilos que carecen de dicha actividad, constituyendo esta
prueba un importante elemento taxonmico.

El ensayo es muy sencillo, pues basta con aadir una gota de agua oxigenada
sobre una colonia del cultivo y observar si de sta se empiezan a desprender
burbujas de oxgeno como consecuencia de la actividad enzimtica de la catalasa:

23
 2H2O2 ==========> 2H2O + O2

Prueba de la catalasa

+ -

REACTIVOS Y EQUIPOS

2L de leche descremada estril *

100 g de leche en polvo *
100 g de azcar*
Marcador permanente *
2 yogurt de 200 mL del sabor que prefiera*
Rojo fenol
Bao mara
Erlenmeyers estriles
Agua oxigenada
Material que debe aportar cada grupo de trabajo en el laboratorio.

PARTE EXPERIMENTAL
A. AISLAMIENTO DE BACTERIAS LCTICAS

Materiales: Cada pareja se encargar de traer un yogur natural como fuente de

lactobacilos. Para el aislamiento, emplearemos el medio MRS (Man, Rogosa y
Sharpe). Se trata de de un medio natural muy rico que contiene polisorbato,
acetato, magnesio y manganeso que actan como factores de crecimiento para
muchos lactobacilos. El crecimiento se efectuar en medios microaerfilos

24
 empleando jarras para el cultivo de organismos anaerbicos y un sistema comercial
para la eliminacin del oxgeno.

Procedimiento:

1) Tomar 50 ml del suero de yogur con una pipeta estril (puntas amarillas) y
diluirlos en 1 ml de solucin salina. Hacer una o varias diluciones 1/10 en solucin
salina segn indique el profesor, y extender 50 ml de la ms diluda sobre una placa
de agar MRS (que no est muy seca). Incubar boca abajo en condiciones de
microaerofilia durante 48 horas a 37 C.

2) Observar si las colonias crecidas sobre la placa son homogneas y calcular su

nmero aproximado. Utilizar varias colonias para inocular con el asa de siembra un
tubo conteniendo 5 ml de leche estril. Mantener el segundo tubo sin inocular.
Incubar ambos tubos a 37C hasta el da siguiente.

3) Observar el grado de gelificacin del tubo inoculado y compararlo con el no

inoculado. Abrir el tubo y proceder como en el paso 1 para obtener una suspensin
del contenido del yogur. Hacer un frotis y una tincin simple para observar los
organismos que han crecido.

B. PREPARACIN DE YOGUR

1. Tome una pequea muestra de yogur comercial y realize un extendido para

coloracin de Gram.
2. Tome 100 mL de leche fluida y calientela a 80C durante 10 minutos. No la deje
hervir. Este proceso se denomina tyndalizacin.
3. Enfre la leche a 37C.
4. Agregue 4 g de leche en polvo.
5. Agregue 6 g de azcar y 10 g de yogur.
6. Incube a 44C durante 3-4 horas.
7. Trascurrido este tiempo evaluar la formacin o no del cuajo en la leche.
8. Agregar unas gotas en el control de rojo fenol o acido clorhdrico y observe los
resultados
9. Utilizar el producto de la fermentacin para la prctica de tincin de gran.

C. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD CATALASA

1. Tomar con un palillo una colonia de bacterias y depositarla en un portaobjetos.
2. Agregar a cada colonia una gota de agua oxigenada.
3. Observe si aparecen burbujas de oxgeno como consecuencia de la actividad de
la catalasa

D. DETERMINACION DE ACIDEZ

25
 1. Tome 10 mL de leche, agregue 2-3 gotas de fenolftalena y titule con NaOH 0,1 N
hasta observar una coloracin rosada plida que se mantenga ms de 30 segundos.
2. Tome 10 mL de leche + 0.4 g de leche en polvo y proceda de igual forma.
3. Tome 10 mL de yogur comercial y proceda de igual forma.

4. Una vez que se puso a incubar la leche, se deben tomar 10 mL de muestra cada 30
minutos y proceder de igual forma.

Clculo:
(V x N)NaOH = mEq cido lctico
PEq cido lctico = 90.08
1 Dornic = 0.01 % p/v cido lctico
Nota: expresar los valores de acidez en Dornic.

RESULTADOS

1. Complete la siguiente tabla:

Temperatura de Leche fluida Leche Yogur
Incubacin fluida+polvo

4C

28C

37C

44C

2. Presentan los dos erlenmeyers la misma apariencia en cuanto a formacin

del cuajo?
3. Que deducciones puede hacer en cuanto a la presencia de leche agria del
microorganismo utilizado?
4. Clasifique la bacteria como catalasa positiva o negativa

26
CUESTIONARIO

1. Describa las caractersticas de la fermentacin

2. Cual es el producto de la fermentacin?
3. Qu importancia industrial tienen las fermentaciones?
4. Que provoca el cambio fsico en la protena de la leche?
5. Explique la interpretacin en la prueba del indicador de pH.
6. Qu indica la actividad catalasa?

TINCION DIFERENCIAL DE GRAM

OBJETIVOS
1. Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la
tincin de Gram.
2. Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterizacin e identificacin
de las bacterias. Hans Christian Gram (1853-1938)

INTRODUCCION
La tincin diferencial requiere ms de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre
varios tipos de clulas bacterianas. Una tincin diferencial tpicamente consiste de tres pasos
principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teir a todas las clulas en la
tincin; enseguida un paso de decoloracin, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos
de clulas y finalmente un colorante de contraste, el cual tie las clulas recin decoloradas
pero no tiene efecto sobre las clulas que an retienen el colorante primario.

27
La tincin propuesta por el mdico dans Christian Gram en 1884, es una de las tinciones
diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de
24 horas en Gram positivas y Gram negativas. La reaccin de la tincin de Gram se basa en la
cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias. Las
bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen
molculas de cido teicoico. El cido teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado
en este proceso de tincin. Un complejo de las molculas cristal violeta-yodo-cido teicoico es
muy difcil de remover. Como la pared celular de las clulas Gram positivas retiene estos
compuestos, es ms difcil decolorar una clula Gram positiva que una Gram negativa.
Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la clula Gram negativa, pero no de la
Gram positiva. Esta mezcla de alcohol tambin disuelve mucho de la capa exterior de
lipopolosacrido de la pared celular de la pared Gram negativa, lo cual acelera la remocin del
colorante primario cristal violeta de estas clulas.

Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de
la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas
permanecen azules.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo
tiene poca afinidad con las clulas.

2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas
grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del
tiempo para obtener resultados satisfactorios.

3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal

violeta - yodo.

El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos

organismos son ms grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir,
unas veces grampositivos y otras gramnegativos.

Fijar por calor Violeta de genciana

Lugol Lavar con H2O
2
1

28
Safranina Lavar con H2O
1
 Lavar con H2O Decolorante

MATERIALES Y REACTIVOS

- Pipeta - Alcohol al 95%

-gradilla - Cultivos bacterianos: A, B y C
- Mechero Bunsen. -Frasco lavador con agua
- Cerillos encendedor -Soporte de tinciones
- Lpiz graso -goteros
- Papel absorbente -Agua destilada
- Portaobjetos y cubreobjetos -Balanza de precisin (para la preparacin de
-Asa bacteriolgica los colorantes)
- Hisopos
- Microscopio
- Aceite de inmersin
- Cristal violeta
- Lugol
- Safranina

PARTE EXPERIMENTAL
1. Marcar un portaobjetos con el nombre del microorganismo a observar. Cada equipo deber
hacer tres preparaciones
2. Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar, segn las indicaciones del docente.

a. Micrococcus urea: Dejar un poco de orina en un tubo de ensayo hasta que fermente: lo
indica su marcado olor a amonaco. Con una pipeta tomar un par de gotas del sedimento del
lquido. Depositar una gota en el centro de un vidrio portaobjetos, haciendo una extensin. Es
una bacteria Gram positiva.

b. Lactobacillus helveticus: Se hace una extensin de una gota de yogur desnatado, siguiendo
la tcnica general. Es Gram positiva.

c. Escherichia coli: Se toma una pequea porcin de muestra con la aguja enmangada, se
disuelve en el portaobjetos, con un par de gotas de agua destilada y se extiende la disolucin
por la parte de central de la lmina. Es Gram negativa

3. A la llama del mechero de alcohol desecar la extensin realizada. El paso del portaobjetos
por la llama debe de ser rpido, por lo general basta con hacerlo tres o cuatro veces. La
temperatura del porta debe ser la que soporte el dorso de nuestra mano sin quemarnos.
4. El vidrio portaobjetos se coloca sobre el soporte de tincin, montado sobre la cubeta.

29
5. Cubrir la extensin con cristal violeta y dejar actuar durante un minuto.
6. Una vez transcurrido el tiempo, lavar con agua corriente la preparacin sobre el recipiente
de plstico para tinciones, cuidando que no se arrastre la preparacin y sacudir para eliminar el
exceso de agua.
7. Cubrir la extensin con 1 o 2 gotas de solucin de lugol y dejar actuar por un minuto. De esta
forma se refuerza la interaccin entre el colorante y la pared celular.
8. Transcurrido el tiempo, lavar con agua corriente.
9. Decoloracin: Con cuidado, aadir gota a gota el alcohol al 95 96%, aproximadamente 10
segundos hasta observar el alcohol transparente.
10. Aadir inmediatamente agua para evitar el arrastre completo de todo el colorante. En esta
fase se produce la decoloracin diferencial de las Gram negativas.
11. Puesto el vidrio portaobjetos sobre el soporte de tinciones, se agregan unas gotas de
safranina (1 2 gotas), de 30 seg a un minuto. El exceso de safranina puede marcar poca
diferencia de contraste con la coloracin de violeta cristal.
12. Lavar con el frasco lavador.
13. Secar la preparacin al aire.
14. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin y observar al microscopio con
objetivo de inmersin. Llevar la preparacin sobre la platina del microscopio. Bajar con cuidado
el objetivo de inmersin (100x) hasta que ste tome contacto con la gota de aceite de
inmersin. Enfocar lentamente hasta conseguir la visin clara. En esta fase las Gram negativas
adquirirn color rojo o rosado de la safranina mientras que las Gram positivas continuarn con
el color azul o morado propio del primer colorante

Acetobacter aceti y Bacterium coli: Gram negativas

Micrococcus urea: Gram positivas

30
 Streptococcus lacti, Lactobacillus bulgaricus: Gram positivas

RESULTADOS
1. Dibuja tus observaciones

Gnero o especie:
Aumento:
Morfologa:
Gram:

Gnero o especie:
Aumento:
Morfologa:
Gram:

Gnero o especie:
Aumento:
Morfologa:
Gram:

2. Si observ alguna diferencia en cuanto a morfologa o reaccin a la tincin de Gram,

trate de buscar alguna explicacin.

CUESTIONARIO
1. Cul es el fundamento de la Tincin Diferencial de Gram?

31
2. Cul es la funcin que desempea el Lugol en esta coloracin?
3. Busque en la literatura, a los microorganismos que vas a observar en la prctica y
compara tus resultados con lo reportado.
4. Investigue qu tipo de variables pueden ocasionar que se obtengan resultados no
deseables cuando se realiza una tincin de Gram (por ejemplo que una bacteria Gram negativa
se colore de morado).
5. Haga un diagrama de flujo sobre el proceso de la tincin de Gram, indicando la funcin de
cada sustancia empleada.
6. Dibuje las paredes celulares de una bacteria Gram positiva y una Gram negativa sealando
las principales estructuras en ellas.

ELABORACIN DE UN ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS

1. Determinar la sensibilidad a diversos antibiticos de un determinado

microorganismo
2. Comprender el concepto de antibitico y su especificidad de accin sobre
determinadas bacterias.
3. Conocer el concepto de cepa sensible y resistente.
4. Entender el concepto de halo de inhibicin.
5. Ser consciente de la importancia de la higiene y el cuidado en la manipulacin de
materiales biolgicos.
6. Comprender la importancia de la eliminacin de los residuos orgnicos
7. Conocer el instrumental de laboratorio necesario en microbiologa y los
procedimientos para su utilizacin

INTRODUCCION

32
El escocs Alexander Fleming descubri la penicilina, un antibitico que revolucion la
medicina moderna, de un modo bastante accidental. Hasta Fleming el nico
tratamiento posible contra las infecciones bacterianas era la quimioterapia, usando
sustancias sintetizadas en el laboratorio que, si bien solucionaban parcialmente ciertos
efectos de la enfermedad, generaban efectos secundarios importantes. Gracias a la
penicilina, en el siglo XX, algunas enfermedades hasta entonces consideradas
incurables empiezan a tener solucin.
En 1921, Fleming haba observado la accin bactericida de una sustancia presente en
las secreciones nasales, llamada lisozima.
En 1928, cuando estudiaba el virus de la gripe encontr que en la placa en la que
estaba cultivando unas bacterias haba crecido moho y que alrededor de este se haba
formado un rea libre de estafilococos. Esta capa contena alguna sustancia que inhiba
el crecimiento de la bacteria. A este principio activo lo llamo Penicilina, ya que proceda
del hongo Penicillium notatum. Sin embargo, problemas tcnicos no le permitieron
purificar ni producir la penicilina por lo que no lleg a usarla clnicamente.

En 1938, los britnicos Ernst Boris Chain y Howard Walter Florey iniciaron una
investigacin detallada y sistemtica de este antibitico y lograron, en 1940, tras su
traslado a EEUU, la fabricacin industrial y el empleo mdico de la penicilina, lo que
supuso la salvacin de incontables vidas durante la Segunda Guerra Mundial. En 1945
los tres investigadores fueron galardonados con el Premio Nobel de Fisiologa y
Medicina.
El primer antibitico aislado fue la actinomicetina (Gratia & Dath, 1924). Los primeros
antibiticos usados en clnica fueron la gramicidina y la tirotricina (Ren Dubos, 1939)
Mediante un antibiograma podemos establecer qu tratamiento ser el ms adecuado
para el paciente afectado por una infeccin por la bacteria que estemos estudiando.
Alrededor de cada disco de antibitico, las bacterias sensibles a ese antibitico no
habrn podido reproducirse y, por lo tanto, no forman colonias, dejando un hueco
alrededor del disco, es lo que se cono ce como halo de inhibicin.

33
 No basta con ver si las bacterias han crecido o no alrededor del antibitico para saber
si son o no sensibles. Hay que saber cunto no han crecido. Solo si el halo de
inhibicin es suficientemente grande, usando el antibitico a la concentracin
teraputica la que el antibitico puede alcanzar en el lugar de la infeccin sin que se
produzcan efectos txicos o secundarios- se dice que la bacteria es sensible al
antibitico. Por eso se mide el efecto y se consultan las tablas.

Antibitico Abreviatura Dosis (g/ disco) Efecto Inhibidor

CloranfenicolC 30 Sntesis de protenas

Cefalotina CR 30 Sntesis de peptidoglicano
Tetraciclina TE 30 S. de protenas
A. Nalidxico NA 30 Replicacin
Eritromicina E 15 S. de protenas
Estreptomicina S 10 S. de protenas
Trimetoprim TMP 5 Sntesis A. flico

HALOS DE INHIBICION ESTANDARES (segn N. C. C. L. S.)

REVISION ENERO 2004 ,M100-S14 VOL.24 N 1

AGENTE ANTIMICROBIANO SIGLA POTENCIA RESISTENCIA SUSCEPTIBLE

AMIKACINA AK 30 mcg 14 mm 17 mm
AMPICILINA A 10 mcg 13 mm (28)*(18)H(16)E(23)Sb 17 mm (29)*(22)H(17)E(24)Sb
AMPICILINA-SULBACTAM SAM 10/10 mcg 11 mm (19)H 15 mm (20)H
AMOXICILINA AX 25 mcg 11 mm 14 mm
AMOX- AC.CLAVULANICO AMC 20/10 mcg 13 mm (19)* (19)H 18 mm (20)*(20) H
ACIDO NALIDIXICO W 30 mcg 13 mm 19 mm
ACIDO OXOLINICO O 2 mcg 10 mm 11 mm
ACIDO PIPEMIDICO PI 20 mcg 13 mm 19 mm
AZITROMICINA AZT 15 mcg 13 mm (11)H 18 mm (12)H
AZTREONAM AZ 30 mcg 15 mm (25)H 22 mm (26)H
CEFADROXILO (1) CPH 30 mcg 14 mm 18 mm

34
CEFALEXINA (1) CN 30 mcg 14 mm 18 mm
CEFALOTINA (1) CF 30 mcg 14 mm 18 mm
CEFAZOLINA (1) CEZ 30 mcg 14 mm 18 mm
CEFAMANDOL (2) CMA 30 mcg 14 mm 18 mm
CEFEPIME (4) CPM 30 mcg 14 mm (30)N(25)H(23)Sb(21)Sv 18 mm (31)N(26)H(24)Sb(24)Sv
CEFIXIMA (3) CFM 5 mcg 15 mm (20)H(30)N 19 mm (21)H(31)N
CEFOPERAZONA (3) CFP 75 mcg 15 mm 21 mm
CEFOTAXIMA (3) CTX 30 mcg 14 mm (25)H(30)N(23)Sb(25)Sv 23 mm (26)H(31)N(24)Sb(28)Sv
CEFOXITINA (2) CXA 30 mcg 14 mm (23)N 18 mm (28)N
CEFPROZIL CPR 30mcg 14mm 18mm
CEFRADINA (1) CD 30 mcg 14 mm 18 mm
CEFTAZIDIMA (3) CAZ 30 mcg 14 mm (25)H(30)N(17)B 18 mm (26)H(31)N(21)B
CEFTRIAXONA (3) CTR 30 mcg 13 mm (25)H(24)Sv(23)Sb(34)N 21 mm (26)H(27)Sv(24)Sb(35)N
CEFUROXIMA i v (2) CXM 30 mcg 14 mm (16)H(25)N 18 mm (20)H(31)N
CIPROFLOXACINO CIP 5 mcg 15 mm (20)H(27)N 21 mm (21)H(41)N
CLARITROMICINA CLR 15 mcg 13 mm (10)H(16)$(16)S 18 mm (13)H(21)$(21)
CLINDAMICINA D 2 mcg 14 mm (15)S(15)$ 21 mm (19)S(19)$
CLORANFENICOL C 30 mcg 12 mm (17)S(25)H(20)$ 18 mm (21)S(29)H(21)$
CLOXACILINA CX 1 mcg 10 mm 13 mm
COLISTIN CL 10 mcg 8 mm 11 mm
DICLOXACILINA DX 1mcg 10 mm 13mm
DOXICICLINA DXS 30mcg 12 mm 16 mm
ENOXACINO E 10 mcg 14 mm (31)N 18 mm (36)N
ERITROMICINA EM 15 mcg 13 mm (15)S(15)$ 23 mm (21)S(21)$
ESTREPTOMICINA S 10 mcg 11 mm 15 mm
FOSFOMICINA FO 200 mcg 12 mm 16 mm
FLEROXACINO FLX 5 mcg 15 mm (18)H(28)N 19 mm (19)H(35)N
FURAZOLIDONA FZ 100 mcg 14 mm 17 mm
GENTAMICINA GE 10 mcg 12 mm 15 mm
KANAMICINA K 30 mcg 13 mm 18mm
LEVOFLOXACINO LVX 5 mcg 13 mm (16)H 17 mm
LINCOMICINA L 2 mcg 16 mm 21 mm
LINEZOLID LZD 30 mcg 20 mm 21 mm (23)E
MEROPENEM MRP 10 mcg 13 mm (19)H(15)B 16 mm(20)H(20)B
MOXIFLOXACINO MXF 5 mcg 15 mm (17)H(14)$ 19mm (18)HS$
NEOMICINA N 30 mcg 12 mm 17 mm
NITROFURANTOINA NIT 300 mcg 14 mm 17 mm
NORFLOXACINO NOR 10 mcg 12 mm 17 mm
OFLOXACINO FLX 5 mcg 12 mm(24)N 16 mm(31)N
OXACILINA OX 1 mcg 19 mm$ (10)*(17)** 20 mm$(13)*(18)**
PENICILINA P 10 UOF 19 mm (28)*(26)N (14)E(23)Sb 20 mm $(29)*(47)N(15)E(24)Sb

35
PIPERACILINA PE 100 mcg 17 mm 21 mm (18)P
PIPERAC/TAZOBACTAM TZ 100/10 MCG 17 mm 21 mm (18)P(18)*
RIFAMPICINA R 5 mcg 16 mm 20 mm(19)$
ROXITROMICINA RXT 15 mcg 13 mm 23 mm
SULFATRIMETOPRIM SX 25 mcg 10 mm (15)$ 16 mm (19)$
SULFONAMIDA SF 250 mcg 12 mm 17 mm
SULPERAZONA SFP 30/75 mcg 15 mm 21 mm
TEICOPLANINA TEI 30 mcg <10 mm >14 mm

TETRACICLINA T 30 mcg 14 mm (18)S(18)$(30)N(25)H 19 mm (23)S(23)$(38)N(29)H

TOBRAMICINA TB 10 mcg 12 mm 15 mm
TRIMETOPRIM TMP 5 mcg 10 mm 16 mm
VANCOMICINA VA 30 mcg 16 mm(14)*(14)E(14)S 17 mm$(15)*(15)S

* Staphylococcus spp. ** Staphy.coagulasa-negativo E Enterococcus spp. H Haemophilus spp.

S Streptococcus spp.
N N.Gonorrhoeae
Notas:Para Burkholderia cepacia
slo se informa CAZ Y MRP. Para
Stenotrophomonas maltophilia
slo se informa LVX y SX.
Cloramfenicol no se informa en
cepas del tracto urinarioNotas :
Kleibsiella spp. y E. coli que
producen beta-lactamasa de
expectro expandido (BLEE),
Puede ser clinicamente R a
Penicilina, Cefalosporinas o
Aztreonam a pesar de ser S in
vitro.
P Ps. aeruginosa
$ Streptococcus
pneumoniae
Sv Strept.viridans Sb Strept. Beta Hemoliticus
B B. Cepacia
En Salmolella spp y Shigella spp.
las Cefalosporinas de primera
y segunda generacin pueden
ser activa in vitro no son
efectivas clnicamente, por lo
que no deben informarse como S.
En cepas de LCR debe
informarse CTX y CTR
CFM no es aplicable a
Morgarella spp.
CPR no es aplicable a Providencia
spp. por dar S falsa.

MATERIALES Y REACTIVOS

- Jeringa con suero fisiolgico estril (solucin de NaCl al 0,9%)

- Placa problema (cultivada en agar)
- Discos de diferentes tipos de antibiticos
- Tubos de ensayo
- Placa agar
- Regla milimetrada *
- Rotulador de vidrio*
- Cinta adhesiva*
- Pinzas finas
- Guantes*
- Torunda estril

36
- Tablas para determinacin de resistencias

Lo traen los estudiantes

PARTE EXPERIMENTAL

A. SIEMBRA EN CESPED DEL MICROORGANISMO PROBLEMA

1. Tome con una jeringa una pequea cantidad de suero fisiolgico estril (2-5 ml) y
virtalo en un tubo de ensayo.
2. A partir de la placa problema, que contiene colonias del microorganismo cuya
sensibilidad a los antibiticos queremos determinar, tome una muestra SUPERFICIAL
de UNA SOLA COLONIA con un asa de siembra.
3 Introduzca el asa de siembra con la muestra en el tubo, y agite el asa para realizar
una suspensin de las bacterias en el suero fisiolgico. Al acabar ponga el asa en el
mechero hasta que este al rojo vivo.
4 Introduzca una torunda estril en el tubo y se psela muy suavemente por la
superficie de una placa agar nueva. En esta ocasin se realizara una siembra en
csped, es decir, por toda la superficie de la placa, para conseguir que crezcn bacterias
de modo masivo (no interesa aislar bacterias). Es importante que la siembra sea
SUPERFICIAL, sin profundizar en el medio de cultivo.
5 Se tapa la placa y se rotula indicando en el nombre, grupo y fecha y marcando con
una A la tapa (antibiograma)

B. COLOCACIN DE LOS DISCOS DE ANTIBIOTICOS

1. Tome con las pinzas NUNCA CON LAS MANOS- un disco de cada uno de los
antibiticos que se facilitan (cada disco es un papel de filtro que contiene una
suspensin de uno o varios antibiticos a la concentracin teraputica).
2. Deposite el disco suavemente sobre la placa, sin tocar con la superficie con las
pinzas. Es muy importante que el disco contacte con el medio de cultivo en un nico
sitio.

3. Realice la misma operacin con los otros antibiticos, colocando los nuevos discos
separados de los anteriores, formando un hexgono, como se muestra en la figura.

37
 C. INCUBACIN Y OBSERVACION

1. Lleve las placas a incubar a 37C (temperatura corporal), durante 24 horas.

2. Tras este perodo se recogen las placas y SIN ABRIR se observa el crecimiento
bacteriano.
Figura 3
D. MEDICIN DEL HALO DE INHIBICION

1. Por la parte trasera de la placa incubada se medir el dimetro de los halos de

inhibicin, que se han formado alrededor de los discos de antibitico, a los que la
bacteria problema es sensible.
2. Anote los datos en la representacin de la tabla, indicando con un nmero del 1 al 6,
el antibitico colocado en el disco y dibuje la presencia o ausencia de halos y su
tamao en mm.

Tabla 1. Medicin de halos de inhibicin.

Disco Antibitico Tamao del halo de Sensible(S) Resistente(R)

inhibicin mm
1
2
3
4
5
6

Con ayuda de las tablas que se te proporcionan determina si la bacteria es sensible (S)
o resistente (R) a cada antibitico y antalo en la tabla, en las columnas
correspondientes.

RESULTADOS
1. Completa la tabla con los resultados obtenidos

Disco Antibitico Tamao del halo de Sensible(S) Resistente(R)

inhibicin mm
1
2
3
4
5
6

38
CUESTIONARIO
1. Los antibiticos son sustancias de origen natural, producidas por bacterias y hongos, que
impiden el crecimiento o la reproduccin bacteriana. Es til emplear antibiticos contra la
gripe? Por qu?
2. Qu es y qu indica la presencia de un halo de inhibicin?
3. En nuestro intestino grueso existen bacterias: es lo que se conoce como flora intestinal. Por
qu son beneficiosas estas bacterias para nuestro organismo?
4. Qu ocurrira si empleramos un antibitico de amplio espectro es decir, que acta contra
un conjunto muy variado de bacterias- teniendo en cuenta lo contestado en la pregunta
anterior?
5. Uno de los problemas sanitarios ms graves en la actualidad es la aparicin de cepas
bacterianas resistentes a los antibiticos existentes. Se ha culpado de esto a la gran capacidad
de mutacin de las bacterias y a la costumbre de no terminar los tratamientos con antibiticos
(5 das, generalmente) y suspenderlos cuando se nota cierta mejora. Podras explicar por qu
esta conducta puede provocar la aparicin de resistencias?

EXTRACCION DE ADN A PARTIR DE CULTIVOS BACTERIANOS

OBJETIVOS

1. Caracterizar la molcula de ADN desde el punto de vista qumico

2. Realizar una extraccin sencilla de ADN de clulas bacterianas.
3. Adquirir experiencia en un mtodo de extraccin de ADN.

INTRODUCCION

39
Los cidos nuclicos son molculas complejas que producen las clulas vivas y los virus.
Reciben este nombre porque fueron aisladas por primera vez del ncleo de clulas
vivas. Sin embargo, ciertos cidos nuclicos no se encuentran en el ncleo, sino en el
citoplasma celular. Tiene al menos dos funciones transmitir la s caractersticas
hereditarias de una generacin a la otra y dirigir la sntesis de protenas especficas. El
modo en que realizan estas funciones es el objetivo de algunas de las ms
prometedoras e intensas investigaciones actuales. Los cidos nuclicos son las
sustancias fundamentales de los seres vivos y se cree que aparecieron hace unos 3.000
millones de aos, cuando surgieron en la Tierra las formas de vida ms elementales.
Las dos clases de cidos nuclicos son el cido desoxirribonucleico (ADN) y el cido
ribonucleico (ARN). Tanto la molcula de ADN como la de ARN tienen una estructura de
forma helicoidal.
El ADN (acido desoxirribonucleico) es el material de todos los seres vivos, que por su
estructura proporciona las bases qumicas para expresar informacin gentica en las
clulas, as como para transmitirlas a las generaciones futuras.
La molcula de ADN tiene la estructura de una escalera formada por azcares, fosfatos
y cuatro bases nitrogenadas llamadas adenina (A), guanina (G), citocina (C) y timina (T).
El cdigo gentico queda determinado por el orden de estas bases, y cada gen tiene
una secuencia nica de pares de bases. Los cientficos utilizan estas secuencias para
localizar la posicin de los genes en los cromosomas y elaborar el mapa del genoma
humano.

Los nucletidos de cada una de las dos cadenas que forman el ADN establecen una
asociacin especfica con los correspondientes nucletido de la otra cadena. Debido a
la afinidad qumica entre las bases, los nucletidos que contienen adenina se acoplan
siempre con los que contienen timina, y los que contienen citocina con los que
contiene guanina. Las bases nitrogenadas complementarias se unen entre si por
enlaces qumicos dbiles llamados enlaces de hidrgeno.
Cuando se produce las desnaturalizacin del ADN, se rompen los puentes de hidrgeno
de la estructura dplex, sta se desenrolla y las cadenas se separan. Lo anterior, tiene
su importancia para los proceso de amplificacin de ADN, tecnologa de ADN
recombinante y estudios de gentica.

40
La extraccin de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad posible
del ADN de alto peso molecular, libre de protenas, carbohidratos y otros inhibidores
de enzimas.
Diferentes mtodos de extraccin han sido descritos para el aislamiento de cidos
nucleicos. En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la
extraccin, es necesario degradarla empleando mtodos fsicos o qumicos. Los
mtodos fsicos son los ms empleados, especialmente la congelacin y la maceracin.
Para bacterias y clulas desprovistas de pared, se emplean soluciones ricas en
detergentes o enzimas, para destruir las membranas celulares.
Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y soluciones
de alta (o baja) fuerza inica para permitir que el ADN se libere en el buffer.
La inhibicin de nucleasas es un factor critico, esta se alcanza empleando buffer1 con
pHs poco ptimos para accin de estas enzimas y adicionando agentes quelantes de
iones como el EDTA (Ethylen diamin tetre acetato).
Posteriormente se utilizan sustancias que desnaturalicen y separen las protenas del
ADN como fenol y cloroformo. Finalmente el ADN es precipitado con alcohol y
centrifugacin. El ADN libre de protenas y otros compuestos celulares se disuelve en
un buffer2.
Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacridos, para separarlos
de los cidos nucleicos se puede emplear mayor cantidad de buffer extraccin o
sustancias como CTAB ( cetil trimethyammonium) que colabora en la precipitacin del
ADN.
El pH durante el proceso de extraccin debe ser ptimo, que evite la accin de enzimas
degradativas del cido nucleico. La mayora de los procedimientos de extraccin de
ADN emplean soluciones taponadas con pH 7.0-9.0.
Para cuantificacin del ADN se hace uso de la espectrofotometra (absorbancia a una
longitud de onda de 260nm), o la observacin directa con fluorescencia despus de
teir el gel de extraccin con bromuro de etidio (mtodo de saram wrap, mtodo del
plato de agarosa, mtodo del minigel) o por fluorometria.
Por lo anterior, la lisis alcalina en la mayora de los casos, es un mtodo suficiente
para preparar el ADN (de tejido foliar) para el proceso de amplificacin. Cuando las

41
 hojas presentan altos contenidos de polisacridos y no se remueven por completo se
puede inhibir la reaccin de amplificacin del producto.

MATERIALES Y REACTIVOS

- Mortero con pistilo

- Gradilla
- Tubos de ensayo
- Pipetas de 1 mL
- Micropipetas de 5, 10, 1000 uL
- Alcohol al 70%
- Isopropanol
- Solucin de lisis nuclear
- Solucin RNAsa
- Solucin de precipitacin de protenas
- Solucin de rehidratacin de ADN
- Tubos de centrfuga
- Centrfuga
- Bao Mara
- Vortex
- Cmara de refrigeracin

PARTE EXPERIMENTAL

1. Agregar 1 mL de cultivo en eppendorf de 1.5 mL.

2. Centrifugar a 13000-16 000 x gravedad (g), por 2 min. Descartar el sobrenadante.
3. Agregar 600 uL de Solucin de lisis nuclear. Suavemente re suspender clulas con
micropipeta.
4. Incubar a 80 c por 5 min para lisar clulas, luego enfriar a temperatura ambiente.
5. Agregar 3 ul de la solucin RNAsa. Invertir el tubo 2-5 veces para mezclar.
6. Incubar a 37 C por 15-60 min. Enfriara temperatura ambiente.
7. Agregar 200 uL de Solucin de precipitacin de protenas. Mezclar por 20 seg en el
vortex.
8. Incubar en hielo por 5 min.
9. Centrifugar a 13000-16 000 xg por 3 min.
10. Transferir el sobrenadante a un tubo de 15 mL con 600 uL de isopropanol a
temperatura ambiente.
11. Mezclar suavemente por inversin hasta que hebras de ADN formen una masa visible.
12. Centrifugar a 13000-16 000 xg por 2 min.
13. Cuidadosamente vaciar el sobrenadante sobre una toalla de papel. Agregar 600 uL de
etanol 70 % a temperatura ambiente. Invertir gentilmente el tubo varias veces para
lavar el precipitado de ADN.
14. Centrifugar a 13000-16 000 xg por 2 min. Cuidadosamente aspirar el etanol con
micropipeta.
15. Vaciar tubo sobre una toalla de papel, secar el precipitado con el tubo abierto por 10-
15 min.

42
16. Agregar 100 uL de solucin de rehidratacin de ADN e incubar por 24 h a 4 C.
17. Almacenar a 2-8 C.

.
RESULTADOS

1. Podramos asegurar que la estructura precipitada es ADN puro?

2. Qu otros compuestos podrn encontrarse junto al ADN?
2. Qu funcin cumplen las soluciones de precipitacin de protenas y de
rehidratacin del ADN?
4. Seale tres cuidados que debe tener al realizar la prctica para extraer el ADN.

CUESTIONARIO

1. Complete la tabla con las caractersticas de las sustancias

SUSTANCIA USADA ESTRUCTURA QUIMICA FUNCION EN EL PROCESO

1. ISOPROPANOL

2. SOLUCION DE
LISIS NUCLEAR
3. SOLUCION
RNAsa
4. ALCOHOL 70 %

2. Seale las propiedades qumicas de los cidos nuclicos: ADN y ARN

CONTROL BIOLOGICO
OBJETIVOS

1. Reconocer la importancia del control biolgico.

2. Demostrar como algunos microorganismos pueden inhibir el crecimiento de
organismos patgenos.
3. Reconocer otros tipos de biocontroladores

INTRODUCCION

43
El rpido desarrollo de resistencia a agroqumicos por parte de microorganismos,
unidos a la preocupacin del hombre por el ambiente han generado la necesidad
de nuevos mecanismos de controles sustentables y seguros, resaltando
especficamente en esta lucha el control biolgico. El control biolgico involucra
todas aquellas prcticas tendientes a disminuir la incidencia de enfermedades
excluyendo el control qumico. En un sentido ms restringido, sera el uso de
microorganismos antagonistas que interfieren en la supervivencia de patgenos o
en el desarrollo de actividades determinantes de enfermedad.
En la naturaleza existe una interaccin continua entre los potenciales patgenos y
sus antagonistas de forma tal que estos ltimos contribuyen a que no haya
enfermedad en la mayora de los casos; es decir el control biolgico funciona
naturalmente. En condiciones naturales, los microorganismos estn en un
equilibrio dinmico en la superficie de las plantas. La disminucin de la flora de
competencia por prcticas agrcolas como lavado de frutos, aplicacin de
fungicidas, y desinfeccin de suelos, favorecen el desarrollo de patgenos.
No es fcil determinar los mecanismos que intervienen en las interacciones entre
los antagonistas y los patgenos sobre la planta o en las heridas. En general los
antagonistas no tienen un nico modo de accin y esta cualidad es una
caracterstica a tomar en cuenta al seleccionar un antagonista. El riesgo de
resistencia se puede reducir mediante el uso de combinaciones de antagonistas de
diferente modo de accin. En la literatura se han descrito varios mecanismos de
accin de los antagonistas para controlar el desarrollo de patgenos sobre fruta.
Por ejemplo: antibiosis, competencia por espacio o por nutrientes, interacciones
directas con el patgeno (lisis enzimtica), e induccin de resistencia.
Las enfermedades causadas por hongos fitopatgenos, producen en sus
hospederos una amplia variedad de tipos diferentes de sntomas. Entre otros, los
hongos fitopatgenos pueden producir manchas clorticas y necrticas,
podredumbres hmedas o secas, agallas, abolladuras, costras, ahogamientos,
marchitamientos y pstulas.
Entre algunos de estos hongos fitopatgenos encontramos: Fusarium oxysporum, el
cual coloniza los conductos xilemticos de la planta, bloqueando y tapando los
vasos, lo que determina la aparicin de sntomas de marchitamiento de la hoja,

44
 color amarillento, y eventualmente necrosis y muerte total de la planta. Adems
Rhizoctonia solani, es un patgeno de plantas que posee un gran rango de
huspedes y posee una distribucin mundial. Es una de las causas de podredumbre
damping off, que mata a las plntulas en horticultura.
Para seleccionar potenciales bioantagonistas como controladores biolgicos, es
necesario realizar algunos ensayos in vitro que orientan respecto a su capacidad
antagnica para posteriormente ser formulados y utilizados en pruebas de campo.
Entre las pruebas realizadas se encuentran: Antagonismo directo, metabolitos
voltiles y metabolitos difusibles.

MATERIALES Y REACTIVOS

- Pipetas pasteur
- Asas bacteriolgicas
- Pinzas
- Placas petri
- Agar PDA
- Bodoques de papel de filtro estriles
- Micropipetas
- Alcohol al 95%.
- Incubadora
- Cepas de hongos: Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Azospirillum sp
- Cepa bacteriana: Pseudomonas sp
- Regla milimetrada *

*Lo traen los estudiantes

PARTE EXPERIMENTAL
1. Prepare y esterilice previamente las placas de agar PDA.
2. Coloque un bodoque de hongo fitopatgeno en el centro de la placa de agar.
3. Con pinzas previamente flameadas, coloque 4 bodoques de papel filtro
estriles, distribuidos en la periferia de la placa.
4. Inocule 30 uL del biocontrolador bacteriano, sobre los papeles de filtro.
5. Repita el procedimiento con otro biocontrol (No. 2)
6. Inocule una placa control de cada hongo fitopatgeno.
7. Incube a 37 0C, durante 7 das.
8. Mida el dimetro de inhibicin del hongo con regla milimetrada.

bodoque de hongo

45
RESULTADOS
1. Complete la tabla con los resultados obtenidos

Cepa de hongo Dimetro de Inhibicin Dimetro de Inhibicin

Biocontrol 1 Biocontrol 2

2. Cul de los biocontroles ejerci una inhibicin mayor?

CUESTIONARIO
1. Qu es el control biolgico?
2. Qu importancia tiene el control biolgico?
3. Qu es un hongo fitopatgeno?
4. Describa las caractersticas de las cepas de hongos mencionadas.
5. Porque se emple agar PDA?
6. Qu es una antagonista?

USO DE MICROORGANISMOS A NIVEL INDUSTRIAL

OBJETIVOS

1. Reconocer la importancia de los procesos aerbicos y anaerbicos, para los seres

vivos.
2. Demostrar la formacin de cido pirvico durante la fermentacin de glucosa por
parte de una levadura.
3. Demostrar la formacin de cido ctrico empleando Aspergillus niger.
4. Reconocer la importancia industrial de los procesos fermentativos.

46
INTRODUCCION

Tradicionalmente el uso de microorganismos en procesos industriales se relaciona con

cultivos masivos para obtener productos metablicos. Inicialmente el proceso ms
utilizado fue la fermentacin alcohlica. A mediados del siglo pasado hubo una
revolucin importante en el uso industrial de microorganismos: primero en la industria
qumica para orientar los procesos microbianos a la obtencin de alcoholes y acetona;
luego el descubrimiento de los antibiticos llev al desarrollo de la industria
farmacutica; posteriormente, el empleo de aditivos en los alimentos, como los
prebiticos y los probiticos han impulsado el desarrollo de la microbiologa industrial
en alimentos.
El trmino fermentador engloba a todos aquellos recipientes en los cuales se desarrolla
un proceso de fermentacin con microorganismos. En los sistemas cerrados los
microorganismos crecen en un medio que no se renueva, por ello, los microorganismos
presentan las cuatro fases de a curva de crecimiento: adaptacin, crecimiento,
estacionaria y muerte.
Los cultivos crecen hasta terminar los nutrientes, por tanto duran poco tiempo. En los
sistemas abiertos los microorganismos crecen en un medio que se renueva. En los
semiabiertos se renueva cada cierto intervalo de tiempo y en los abiertos se renueva
constantemente. Por ello, los microorganismos crecen exponencialmente durante
mucho ms tiempo. Dependiendo del medio los microorganismos crecern con una
tasa de crecimiento, que podemos controlar dentro de unos mrgenes.

47
La respiracin celular permite a los organismos producir energa, en forma de ATP en
presencia de oxgeno. En condiciones anaerbicas, luego de la gluclisis se lleva a cabo
la fermentacin, donde se obtiene productos como el etanol, cido lctico, cido
actico entre otros, dependiendo del organismo que la efecte. Estas rutas de
fermentacin son similares hasta la produccin de piruvato o cido pirvico.
El piruvato es ampliamente utilizado en la industria farmacutica, qumica, cosmtica y
en la sntesis de aminocidos. Diferentes microorganismos pueden producirlo
mediante el uso de materias primas baratas, bajo condiciones de operacin
determinadas, con un alto grado de pureza y altos rendimientos. Entre estos
microorganismos encontramos levaduras como Yarrowia lipolytica y Saccharomyces
cereviciae.
Para conseguir la acumulacin de cido pirvico y poderlo detectar, la fermentacin
deber ser llevada acabo en condiciones ligeramente alcalinas, para inactivar la enzima
piruvato descarboxilasa, la cual convierte el piruvato a acetaldehdo.
Por otro lado, los hongos filamentosos son un grupo de inters industrial en la
produccin de enzimas. Muchos de estos hongos estn adaptados a crecer sobre
superficies, y requieren un contacto cercano con el sustrato debido a su nutricin
hetertrofa, secrecin de enzimas extracelulares, absorcin de nutrientes a travs de l
pared celular y el crecimiento apical de sus hifas. Algunos procesos utilizan los hongos
inmovilizados en distintos soportes sintticos.

48
Aspergillus sp. Es un organismo ampliamente utilizado en la produccin de variedad de
glucanasa, y se ha probado la inmovilizacin para la produccin de cidos orgnicos a
partir de un aminocido especfico. Se ha visto que Aspergillus niger, es capaz de crecer

y producir cido ctrico (C6H8O7) a partir de distintos aminocidos.

La manera en que el hongo puede utilizar los aminocidos es por la caracterstica
anaplertica del ciclo de Krebs. Por ejemplo, el Aspartato puede entrar directamente al
ciclo por medio de su transformacin a oxalacetato, y de ah sigue el curso del ciclo.
Gracias a esta caracterstica, este hongo puede utilizar casi cualquier aminocido con el
que se alimente, siguiendo rutas distintas, de forma general tanto para producir
energa y para biosntesis, dentro del cual est la produccin de cidos orgnicos como
el cido ctrico.

Tabla 1. Comparacin entre aminocidos vrs peso de hongo y produccin de cido

Aminocido Peso del hongo mg cido/50 mL
Lisina 1.99 245.06
Leucina 2.12 40.454
Glicina 0.18 230.32
Arginina 0.83 230.32
Acido glutmico 5.545** 2100.05**
Acido asprtico 2.61 184.26
Asparagina 0.44 73.70

Aspergillus prefiere algunos aminocidos para su crecimiento y otros para la

produccin de los cidos esperados. Como se observa en la tabla los aminocidos

49
 glicina y arginina son los preferidos por este hongo para la produccin de cidos
orgnicos. Estos aminocidos son glucognicos, entran directamente al ciclo de Krebs.
La glicina se desamina para formar piruvato que luego entra al ciclo de Krebs como
Acetil CoA, mientras que la arginina entra por transaminacin a -cetoglutarato, par
seguir con el ciclo de Krebs.

MATERIALES Y REACTIVOS
PARTE A PARTE B

- Tubos de ensayo - 20 mL de solucin PDA al 2 % en agua destilada

- Gradilla - Asas microbiolgicas
- Levadura al 10 % - Solucin Tween 20 al 1 % estril
- Bao de mara - 8 erlenmeyers de 250 mL estriles
- Papel de filtro
- Centrfuga
- Solucin NaOH 0.1 M
- Pipetas de 5 mL estriles
- 4 buretas
- Solucin de glucosa a diferentes concentraciones: - Indicador fenolftalena
0.5, 1.0, 2.0 % - 16 tubos con 9 mL de agua estril
- Solucin de Na2HPO4 0.5 M - Medio de cultivo lquido con aspartato: aforar a
- Solucin de KH2PO4 0.5 M 1L con agua destilada
-Acido tricloroactico al 10 % *aspartato: 40 g
- Solucin de Nitroprusiato de sodio al 0.5 % en agua * (NH4)2SO4: 2.5 g
- Solucin de 2,4 dinitrofeni-lhidracina saturada en * KH2PO4 : 0.1 g
HCl 2 M * NaCl: 0.1 g
- Hidrxido de amonio concentrado * 10 mL solucin MgSO4 7H2O 0.11g/ 100 mL
- Hidrxido de sodio 0.1 M *10 mL solucin CuSO4 5H2O 0.024g/ 100 mL
- Sulfato de amonio slido * 10 mL solucin ZnSO4 7H2O 0.15g/ 100 mL
*10 mL solucin FeSO4 7H2O 0.010g/ 100 mL

PARTE EXPERIMENTAL

A. PRODUCCIN MICROBIOLGICA DE PIRUVATO

1. Marque dos series de tubos de tres cada una, y adicione 3 mL de las soluciones de glucosa a
concentraciones 0.5, 1.0, 2.0 %, en ambas series.
2. Prepare una suspensin de levadura al 10 % en Na 2HPO4 0.5 M y una suspensin de levadura
al 10 % en KH2PO4 0.5 M.
3. A una de las series de tubos se le adiciona 3 mL de suspensin de levadura con fosfato de
sodio y marcarlo como A; a las otras series se le adiciona 3 mL de la suspensin de levadura
con fosfato de potasio y marcarla como B.
4. Coloque todos los tubos en bao Mara a 37 0C durante una hora, agitando cada cierto
tiempo.
5. Observe la velocidad de produccin de burbujas.

50
6. Al terminar la incubacin aada a cada tubo 1 ml de cido tricloroactico al 10 % mezclado
vigorosamente y centrifugar a 2500 rpm por 10 min.
7. Separe el sobrenadante y deseche el precipitado.

IDENTIFICACION DE PIRUVATO

Reaccin con nitroprusiato de sodio

1. En un tubo de ensayo coloque 1 ml del sobrenadante obtenido y hiervalo.

2. Adicione o.5 g de sulfato de amonio slido y agite.
3. Agregue dos gotas de la solucin de nitroprusiato de sodio al 0.5 % y mezcle vigorosamente.
4. Deje deslizar unas gotas de hidrxido de amonio concentrado por la pared interna del tubo,
de manera que se estratifique. NO MEZCLAR.
5. Deje reposar por 15 minutos.
6. La formacin de un anillo verde o azul en la interfase indica afirmativo para la prueba.
7. Repita lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series.

Reaccin con 2,4 dinitrofenil-hidracina

1. Coloque en un tubo de ensayo 1 ml del sobrenadante obtenido y adicione 1 mL de la

solucin de 2,4 dinitrofenil-hidracina saturada en HCl 2 M.
2. Agite con fuerza y pase a otro tubo la mitad de la mezcla formada.
3. Adicione 1 mL de NaOH 0.1 M y mezcle.
4. Aada 1 mL de agua destilada y mezcle nuevamente. Deje reposar por 15 minutos.
5. La aparicin de un color rojo indica prueba afirmativa.
6. Repita lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series.
7. Observe la coloracin e intensidad de la misma en cada caso.

B. PRODUCCIN DE ACIDO CITRICO POR Aspergillus niger

Esporulacin del hongo

1. Prepare una solucin al 2 5 de PDA: 0.4 g PDA en 20 mL de agua destilada.

2. Caliente ligeramente para evitar grumos.
3. Separe los 20 mL de PDA en dos tubos de ensayo.
4. Esterilizar durante 15 min a 151 lb.
5. a partir de un cultivo de hongos de Aspergillus niger, tome unas cuantas esporas con
asa e inocule en los tubos con PDA para su esporulacin y crecimiento.
6. Incubar durante 7 das a 30 C
7. Observe el crecimiento en los tubos

Inoculacin y Cultivo

1. Agregue 5 mL de Tween en cada tubo con la cosecha del hongo.

51
2. En un erlenmeyer con 250 mL de la solucin de cultivo, agregue la solucin de
Tween con las esporas del hongo.
3. Divida la solucin de cultivo junto con los 10 mL de tween con las esporas lavadas en
2 erlenmeyer con 130 mL de solucin cada uno.
4. Coloque en agitacin durante 10 das a 30 C a una velocidad de 150-200 rpm.

Cosecha

1. Filtre con papel filtro la solucin en los erlenmeyers. Utilice bomba de vaco para
facilitar el proceso.
2. Divida nuevamente la solucin filtrada en erlenmeyers para ser titulados.

Titulacin (Indica la cantidad aproximada de cidos orgnicos generados por el hongo)

1. Con una solucin de NaOH 0.1 M, titular 50 mL de la solucin filtrada anteriormente

(junto a 4 gotas del indicador fenolftalena).
2. Posteriormente, hacer una disolucin de 1 mL del filtrado en 9 mL de agua destilada
y titular con NaOH 0.1 M (junto a 4 gotas del mismo indicador).

RESULTADOS
1. Completa las tablas con los resultados obtenidos

SERIE A Reaccin con nitroprusiato Reaccin con 2,4 dinitrofenil-

de sodio hidracina

Glucosa 0.5 %

Glucosa 1 %

Glucosa 2 %

SERIE B Reaccin con nitroprusiato Reaccin con 2,4 dinitrofenil-

de sodio hidracina

Glucosa 0.5 %

Glucosa 1 %

Glucosa 2 %

2. Calcule para cada solucin titulada los mg de cido ctrico. Recuerde que el peso molecular
del cido ctrico es 92.13 g/mol, y la concentracin del NaOH utilizado es de 0.1 moles/Litro

52
mg (cido ctrico) Vol NaOH usado * MNaOH * PM cido ctrico * Factores

CUESTIONARIO

1. Describa el proceso de gluclisis.

2. Seale que organismos realizan la respiracin celular y cuales llevan a cabo la fermentacin.
3. Qu ventajas tiene la produccin industrial de piruvato?
4. Cul de series mostr una mayor produccin de piruvato?
5. Qu gas se libera durante el proceso?
6. Cul es el papel de la enzima piruvato descarboxilasa?
7. Describa as caractersticas de la cepa de hongo que emplear.
8. Seale l papel de los reactivos empleados en la prctica.
9. Qu es una reaccin anaplertica?
10. Por qu se emplea el hongo Aspergillus niger para este experimento?

IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE ESCHERICHIA COLI

OBJETIVOS

53
1. Reconocer las caractersticas de las bacterias.
2. Identificar mediante ensayos la bacteria E coli.

INTRODUCCION
Las pruebas bioqumicas son muy importantes para la clasificacin bacteriana. Estas
pruebas se basan en diferentes reacciones qumicas que se realizan con el fin de
clasificar las bacterias. A pesar de su microscpico tamao, las bacterias poseen una
maquinaria metablica importante. Las pruebas bioqumicas permitirn diferenciar
diferentes bacterias en funcin de las diferencias metablicas entre ellas.
El tamao de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias que
forman sobre medios slidos s son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de
caractersticas que nos ayudan a su identificacin.
A nivel morfolgico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamao, aspecto del
borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso
sobre medio lquido las bacterias producen modificaciones de inters para su
clasificacin y que tienen que ver esencialmente con las caractersticas de su
metabolismo. As se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo
hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc.
Puesto que la inmensa mayora de las bacterias son incoloras, la nica forma de
observarlas bien en el microscopio ptico consiste en incrementar su contraste con
respecto al medio. Esto se consigue mediante su teido con colorantes o mediante la
disposicin de una ptica especial de contraste, generalmente de fases, en el
microscopio.
La disponibilidad de sistemas de contraste de fases permite observar a las bacterias
vivas y determinar algunas caractersticas tales como su movimiento. Para ello,
disponer una gota de cultivo lquido, previamente agitado, sobre un portaobjetos y
taparlo con un cubre de forma que se establezca una delgada pelcula entre ambos
cristales. Posteriormente, se observa con el objetivo de contraste de 40x (tiene una
banda roja y no todos los microscopios disponen de l) y el condensador anular (se
desplaza horizontalmente y con suavidad hasta alcanzar su posicin en el camino
ptico). Con este sistema se deben de poder distinguir aquellas bacterias con

54
flagelacin polar, que se mueven en zig-zags muy rpidos, de la pertricas, de
movimientos ms suaves y ondulados. En las inmviles se producen desplazamientos
generales por la existencia de corrientes y vibraciones en el medio de observacin.
Determinar la forma y capacidad de movimiento de la bacteria problema, y observar
tambin alguna preparacin de las de la coleccin: Pseudomonas , E.coli, etc
Para observar las bacterias teidas, hay que proceder previamente a su fijacin.
Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio lquido o dispersando en una gota
de agua una porcin de clulas crecidas en slido. Posteriormente se deshidrata el
frotis por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de
temperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras
la fijacin por calor se procede a la tincin.
Existen diferentes pruebas bioqumicas que permiten identificar las bacterias.
El indol es uno de los productos de degradacin metablica del triptofano. Las
bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y
desaminar el triptofano con produccin de indol, piruvato y amonaco. La
prueba de indol est basada en la formacin de un complejo color rojo cuando
el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este
es el principio activo del reactivo de Kovac. Se debe utilizar un medio rico en
triptofano.
La prueba del rojo de metilo es cuantitativa para la produccin de cido y
requiere microorganismos positivos que produzcan cidos fuertes (lctico,
actico, frmico) a partir de glucosa, por la va de la fermentacin cida mixta.
El piruvato, componente fundamental formado en la degradacin fermentativa
de la glucosa, es metabolizado luego a travs de varias vas, de acuerdo con los
sistemas enzimticos que poseen las diferentes bacterias. Una de dichas vas
lleva a la produccin de acetona (acetilmetilcarbinol), un subproducto de
reaccin neutra. En presencia de oxgeno atmosfrico y de hidrxido de potasio
al 40%, la acetona se convierte en diacetilo y el n-naftol acta como catalizador
para revelar un complejo color rojo.
La utilizacin de citrato por una bacteria se detecta en un medio con citrato
mediante la formacin de subproductos alcalinos. El medio incluye citrato de
sodio, un anin, como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica

55
 fuente de nitrgeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden
extraer nitrgeno de la sal de amonio, con produccin de amonaco (NH 3),
llevando a la alcalinizacin del medio.

PARTE EXPERIMENTAL
1. Para iniciar el experimento se parte del cultivo realizado en gar EMB de Levine (Ver Anexo),
tomando como colonia sospechosa la que tenga un fondo negro y presente brillo verde
metlico caracterstico.
2. Tome con un asa una colonia sospechosa y siembre en una placa de gar Nutritivo (Ver
Anexo). (OBTENCIN DEL CULTIVO PURO).
3. Incubar 24-48 horas a 37 C.
4. A continuacin se proceder a sembrar las diferentes pruebas bioqumicas:
Indol:
1. Realice una nica puncin en el centro del tubo de medio SIM, utilizando un asa
recta.
2. Incubar 24 horas a 37 C.
3. Transcurrido dicho lapso agregar 5 gotas de reactivo de Kovacs. Indol +: desarrollo de
color rojo fucsia vivo en la interfase luego de agregar el reactivo.

Rojo de metilo:
9. Inocule en un caldo RMVP con un cultivo puro del microorganismo en estudio.
10. Incubar 48-72 horas a 37 C.
11. Transcurrido dicho lapso, agregar 5 gotas de rojo de metilo. RM +: desarrollo
de un color rojo estable en la superficie del medio.

Prueba de Voges Proskauer:

1. Inocular en un caldo RMVP con un cultivo puro del microorganismo en estudio.
2. Incubar 24 horas a 37 C.
3. Transcurrido dicho lapso, agregar 0,6 mL de n-naftol al 5% y 0,2 mL de KOH al
40%. VP +: desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio.
Citrato:
1. Inocular en un caldo citrato de Koser con azul de bromotimol con un cultivo puro
del microorganismo en estudio.
2. Incubar 24-48 horas a 37 C.

56
 3. Transcurrido dicho lapso observar el color del tubo. Citrato +: coloracin azul por
alcalinizacin del medio.

RESULTADOS
Complete la siguiente tabla con los resultados obtenidos

Sulfuro Indol Motilidad RM VP Citrato

E. coli

Incgnita

CUESTIONARIO
1. Describa las caractersticas de las bacterias.
2. Qu utilidad presentan las bacterias en nuestra vida?
3. Qu importancia tiene el empleo de pruebas bioqumicas para clasificar bacterias?
4. Qu precauciones deben tomarse en el presente laboratorio?
5. A que pueden deberse los resultados falsos positivos?

ANALISIS DE AGUAS CONTAMINADAS

OBJETIVOS

1. Preparar diferentes medios de cultivo y manejar adecuadamente la autoclave.

57
 2. Determinar la presencia de microorganismos en aguas residuales.

INTRODUCCIN

La adopcin de la cloracin del agua para consumo humano ha sido uno de los avances
ms significativos para la salud pblica a escala mundial. Aunque la misma se
estableci como norma en la dcada de los 60, y que se ltimamente se observa un
incremento en el numero de acueductos clorados o con desinfeccin entre 2001 y el
2002- 19.8% y 20.1% respectivamente, solamente 416 acueductos tienen desinfeccin
continua y solo el 18% (363) del total de los acueductos son clorados (Laboratorio
Nacional de Aguas, 2002), en su mayora operados por AyA y ESPH.
El costo de la cloracin va a depender del mecanismo que se utilice y de la poblacin
que se abastece del acueducto. As por ejemplo, un sistema de Hipoclorito de sodio.
Es importante tener en cuenta que no basta con hacer la inversin en sistemas de
potabilizacin del agua para tener agua de calidad potable. Es necesario adems, un
estricto control de la calidad del agua, un buen programa de vigilancia sanitaria , contar
con personal tcnico capacitado y comprometido con la comunidad, as como una
sociedad civil que valore y respete el recurso hdrico como una herramienta
indispensable para el progreso sostenible de sta y de las futuras generaciones
(Miranda, 2003).
A pesar de que el ministerio de Salud conoce su responsabilidad como ente encargado
de velar por la calidad del agua de nuestro pas, en realidad, su rol est prcticamente
invisibilizado. Aunque existen los instrumentos, tales como rdenes sanitarias y la
clausura de acueductos, para exigir agua de calidad potable a los diversos operadores
de acueductos, stos nunca han sido operativos.
Es lamentable que a pesar de los significativos avances en cobertura (97.4%) y calidad
del agua para consumo humano (76% agua potable) que tiene Costa Rica, el aumento
en la incidencia de enfermedades de trasmisin hdrica provocado por el consumo de
agua no potable, demuestra que el pas esta a la puerta de una crisis de salud. Seales
claras de esta crisis son: el segundo lugar que ocupa la diarrea como causa de muerte
en las enfermedades de declaracin obligatoria-superada por el SIDA

58
La descarga directa de aguas negras a causes de ros y el uso excesivo de tanques
spticos son los factores contribuyentes de la contaminacin de los cuerpos de agua
(superficiales y subterrneas). 250,000 metros cbicos de aguas negras caen
directamente y diariamente al Ro Virilla que junto con Ro Reventazn reciben el 70 %
de total de aguas residuales sin tratar de todo el pas (La Nacin, 24/1/04). Adems, un
70 % de la poblacin costarricense utiliza los sistemas de tanque sptico en el
tratamiento del agua residual ordinaria. Muchos de ellos con graves problemas
estructurales y de funcionamiento, que han llevado a casos extremos de que por fallas
de los tanques, los dueos de las viviendas toman la decisin de conectar las aguas
negras al sistema de alcantarillado pluvial.
La deteccin de microorganismos contaminantes en alimentos y bebidas constituye
una prctica habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa. Para ello se utilizan
medios selectivos, indicadores y generales que nos permitan identificar desde el total
de bacterias contaminantes (realmente se detecta solo un cierta parte de la poblacin
total) hasta grupos de bacterias concretas, de especial inters como agentes
contaminantes por su posible peligrosidad, o por tratarse de indicadores de proceso
sufridos por el producto durante su manufacturado o su almacenamiento.
Por razones prcticas, en este experimento slo vamos a tratar de distinguir la
presencia y cantidad de estos posibles tipos de bacterias contaminantes, y se trabajar
con las cepas bacterianas de Escherichia coli, Salmonella typhimurium, y Enterobacter
aerogenes.

MATERIALES Y REACTIVOS

- 2 mecheros
- 1 agitador
- 1 mosca (magneto)
59
- 1 matraz de 500 mL
- 1 balanza
- 1 esptula
- 1 probeta de 250 mL
- 10 cajas de Petri estriles desechables
- 4 tubos de ensayo
- Autoclave
- Masking tape *
- Papel aluminio*
- Plumn indeleble*
- Trapo*
- Reactivos para los medios de cultivo (EMB, Mac Conkey, Verde brillante, Agar
nutritivo, caldo urea y Caldo TSI).Ver el anexo para su preparacin.

(Pedir el material marcado con * a los estudiantes)

PARTE EXPERIMENTAL

1. Realice los clculos pertinentes para preparar 250 mL de cada medio (por
equipo).
2. Realiza las siguientes diluciones decimales del agua contaminada en solucin
salina estril, siguiendo el siguiente esquema:

0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.9 mL SF

MUESTRA 10 -1 10 -2 10-3 10-4 10-5

3. A partir de estas diluciones hay que inocular los siguientes medios:

A. Para recuento de bacterias totales por mL,

1. Extender 0.1 mL de las tres ltimas diluciones sobre tres placas de Agar
Nutritivo (ver Anexo), e incubarlas a 37oC durante 24 h.
2. Cuente el nmero de colonias y multiplquelas por los factores de dilucin
correspondientes.

B. Determinacin de bacterias fermentadoras de lactosa

1. Extienda 0.1 mL de las diluciones 3 y 4 sobre 2 placas de agar Mac Conkey,

incubndolas igual que el anterior.

60
 2. Una vez crecidas, cuente las colonias rojas y rosceas y multiplquelas por los
factores de dilucin correspondientes.
3. Una vez efectuado el recuento, se toman varias colonias rojas y/o rosas al
azar y se extiende un inculo denso sobre la placa de agar EMB (ver Anexo).
4. Incubar a 37oC por 24 h. En este medio confirmativo para E. coli, esta
especie debe dar lugar a colonias negras con reflejos verde metalizados,
mientras que Enterobacter da colonias ms rosceas y nunca reflejos.
5. Determinar el % de E. coli sobre el total de coliformes.

0.1 mL de 3 y 4 Inocular

Incubar Incubar
Conteo Conteo

C. Determinacin de Salmonella.

1. Extender 0.1 mL de las 2 ltimas diluciones en placas de Agar verde brillante y se

incuban a 37oC por 24 h.
2. Sobre este medio se generan metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores
de las colonias se vuelvan rosa, mientas que los eminentemente fermentadores no
crecen o viran hacia el amarillo.
3. Contar el nmero de bacterias rosa.
4. En caldo de urea, slo Morganella genera color azul y en TSI Salmonella debe
aparecer con precipitados negros (por produccin de SH 2 que genera sulfuro de
hierro).

RESULTADOS

1. Calcule el % de E. coli
2. Represente los resultados en una tabla.

61
CUESTIONARIO

1. Escriba los clculos necesarios para preparar 250 mL de los medios empleados en la
clase.
2. Realice un diagrama de flujo del procedimiento a seguir en esta prctica.
3. Identifique las posibles fuentes de error.
4. Por qu es necesario emplear diferentes medios de cultivo?
5. Qu tipo de bacterias se encontraron en un mayor porcentaje en el agua residual?
6. Que importancia tiene el anlisis de aguas?

ACTIVIDAD METABOLICA

OBJETIVOS

62
1. Demostrar mediante algunas pruebas bioqumicas en medios de cultivo, la actividad
metablica de bacterias y levaduras.
2. Desarrollar destrezas en el laboratorio que le permitan al estudiante realizar algunos
ensayos bioqumicos.

INTRODUCCION

El metabolismo es toda la serie de reacciones que ocurren en los seres vivos. Estas
reacciones incluyen procesos de obtencin de energa como son: la descomposicin de
molculas orgnicas en los quimitrofos (catabolismo) o la captacin de luz para el
caso de los fottrofos, as como la sntesis de material celular a partir de nutrientes
esenciales (anabolismo). Todas las reacciones metablicas, son catalizadas por enzimas
que en su mayora funcionan dentro de la clula por lo que se conocen como
endoenzimas, hay tambin exoenzimas principalmente hidrolticas que son liberadas
por la clula para catalizar reacciones fuera de esta.
En el laboratorio, es posible conocer las caractersticas metablicas de los
microorganismos, inoculndolos en diferentes medios de cultivo, con sustratos que
pueden utilizar como fuente de energa, fuente de carbono y de otros nutrientes
esenciales, para su crecimiento.
La mayora de microorganismos, utilizan la glucosa como fuente de carbono y energa.
Al entrar a la clula, la glucosa ser oxidada en forma incompleta (fermentacin) o
completa (respiracin) dependiendo de la presencia de oxgeno y de las capacidades
enzimticas de los microorganismos.
En la fermentacin, los microorganismos obtienen 1-2 ATP/mol de glucosa y liberan
cidos orgnicos u otras pequeas molculas orgnicas como productos metablicos;
mientras que las bacterias y levaduras de catabolismo respiratorio obtienen mayor
cantidad (36-38 ATP)/mol de glucosa, CO 2 y agua. Algunas especies microbianas
pueden ser de tipo respiratorio o fermentativo de acuerdo a las condiciones de
oxigenacin.
Se han propuesto numerosas pruebas bioqumicas en medios de cultivo con
indicadores de pH, para detectar la produccin de cido o lcali; con inhibidores
selectivos como bilis, cianuro, colorantes, sulfuros, que facilitan la determinacin de
diferentes actividades metablicas como son: la capacidad para fermentar
63
carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa), catabolizar aminocidos y urea, la
produccin de enzimas especficas de tipo endo o exo como oxidasas, reductasas,
amilasas, lipasas, etc.
Algunas bacterias y levaduras tienen caractersticas coloniales y microscpicas muy
similares, lo que no permite decidir si dos cultivos pertenecen al a misma especie. Con
algunas de estas pruebas es posible su diferenciacin e incluso su identificacin,
cuando el nmero de pruebas es suficientemente amplio.
Pseudomonas aeruginosa

Siembra en medio OF

Metabolismo oxidativo

MATERIALES Y REACTIVOS
- Gradilla
- Agitador
- Probeta de 100 mL
- 3 Erlenmeyer de 250 mL
- 3 Vaso de precipitados de 250 mL
- Mechero
- Asa de siembra
- 2 placas petri con agar almidn
- 2 tubos con campana de Durham y 5 mL de cada uno de los siguientes medios:
glucosa-rojo de fenol, lactosa-rojo de fenol, sacarosa-rojo de fenol y manitol-
rojo de fenol
- 2 tubos con 7 mL de medio SIM (sulfuro, indol, motilidad)
- 2 tubos con 7 mL de medio TSI (triple azcar hierro) solidificados en forma
inclinada
- 2 tubos con 7 mL de medio de citrato de Simmons solidificados en forma
inclinada
- 2 tubos con 7 mL de caldo urea
- 2 tubos con 7 mL de agar nutritivo blando solidificados en forma recta
- Acido tricloroactico al 5 %
PARTE EXPERIMENTAL

A. INOCULACION EN CAJAS PETRI

1. Divida en tres secciones por la parte de atrs las cajas con agar almidn (AA).

64
2. En una de las cajas petri inocule por estra simple tres cepas diferentes de
microorganismos, segn le indique el profesor.
3. En la segunda caja petri inocule en dos secciones la muestra incgnita y deje una
seccin sin inocular.
4. Incube las cajas en forma invertida a 35 oC durante 48 horas.

B. INOCULACION EN TUBOS

1. Los tubos de glucosa, sacarosa, lactosa y manitol rojo de fenol, as como el caldo
urea se inocularn con una muestra de cada microorganismo.
2. Los tubos con agar TSI se inocularan por picadura hasta el fondo del tubo.
3. Los tubos con agar nutritivo se inocularan por picadura con el asa recta.
4. Incubar los tubos a 35 oC durante 48 horas.

C. EVALUACION DE LA ACTIVIDAD METABOLICA

1. Determinar la actividad de amilasas en las cajas petri de AA por el crecimiento y

aparicin de zonas claras alrededor de las colonias.
2. Si no es posible observarlas a simple vista, agregue unas gotas de lugol a las cajas y
observe la aparicin de zonas claras sobre el medio que se coloreara de azul como
indicativo de prueba +.
3. Compare los resultados con la zona de la caja que se dej sin inocular.
4. Todas las pruebas en tubo debern interpretarse en comparacin con tubos de
control, que contienen los medios de cultivo sin inocular.
5. En los tubos de AN observar la licuefaccin del medio y agregar unas gotas de Acido
tricloroactico. Observe la aparicin de zonas claras o nubosidad en el medio.
6. En los tubos con medios de glucosa, sacarosa, lactosa y manitol rojo de fenol, hacer
observaciones a las 24 y 48 horas de incubacin. Determinar si hay crecimiento,
cambios en el color del indicador y produccin de gas en la campana de Durham.

65
 7. Reporte los resultados en una tabla, tomando en cuenta: No hay crecimiento (-),
crece un poco (+), crecimiento abundante (++); cambios de color del medio,
produccin de gas

RESULTADOS
Complete la tabla con los resultados obtenidos.

Caldo Medio Medio Medio Caldo Agar AN

Rojo SIM Citrato TSI urea almidn
fenol
Crecimiento A

Color A

Crecimiento B

Color B

Crecimiento X

Color X

CUESTIONARIO

1. Describa cules son las rutas bioqumicas de obtencin de energa de las bacterias :

a. De respiracin aerbia
b. De respiracin anaerbia
c. Fermentadoras
d. Anaerobias estrictas

2. Cul de las rutas anteriores es ms eficiente y porque?

3. Explique porque los tubos de fermentacin de azcares deben evaluarse a las 24 y
48 horas.
4. Qu resultados se esperaran observar en el caso de que un organismo
metabolizara oxidativamente la glucosa?
5. Explique porque se busca la presencia de sulfuros en el fondo del tubo de TSI y no en
la superficie.

MANEJO DE LA CABINA DE FLUJO LAMINAR

OBJETIVO
Conocer el manejo de la Cabina de Flujo Laminar.

66
DESCRIPCION DE SUS PARTES

1 Interruptores de luz y extractor montados en la parte frontal. Indicador de presin

2 Luz ultravioleta
3 Iluminacin fluorescente.
4 Filtro HEPA
5 Tomas elctricas polarizadas o puestas a tierra

FUNCIONAMIENTO
Al iniciar el trabajo
1 Conectar a una fuente de 220 voltios.
2 Poner en marcha la cabina durante 5-10 minutos, a fin de purgar los filtros y "lavar" la zona
protegida.
3 Comprobar que el manmetro situado en la parte superior del frontal se estabiliza e indica la
presin adecuada (vara con el modelo de cabina).
4 Apagar la luz ultravioleta (si estuviera encendida) y encender la luz fluorescente.
5 Limpiar la superficie de trabajo con un producto adecuado (por ejemplo, alcohol etlico al
70%).
6 Antes y despus de haber trabajado en una cabina deberan lavarse con cuidado manos y
brazos, prestando especial atencin a las uas
7 Se aconseja emplear batas de manga larga con bocamangas ajustadas y guantes de ltex. Esta
prctica minimiza el desplazamiento de la flora bacteriana de la piel hacia el interior del rea
de trabajo, a la vez que protege las manos y brazos del operario de toda contaminacin.
8 En determinados casos, adems es recomendable el empleo de mascarilla.

Durante la manipulacin
1. Todo el material a utilizar (y nada ms) se sita en la zona de trabajo antes de empezar. De
esta forma se evita tener que estar continuamente metiendo y sacando material durante el
tiempo de operacin.

67
2. Es aconsejable haber descontaminado el exterior del material que se ha introducido en la
cabina.
3. Este material se coloca con un orden lgico, de manera que el material contaminado se sita
en un extremo de la superficie de trabajo y el no contaminado ocupa el extremo opuesto de la
misma.
4. Segn el tipo de manipulacin y el modelo de la cabina, la zona de mxima seguridad dentro
de la superficie de trabajo vara. En general, se recomienda trabajar a unos 5-10 cm por encima
de la superficie y alejado de los bordes de la misma. Especial atencin se prestar a no obstruir
las rejillas del aire con materiales o residuos.
5. Una vez que el trabajo haya comenzado y sea imprescindible la introduccin de nuevo
material, se recomienda esperar 2-3 minutos antes de reiniciar la tarea. As se permite la
estabilizacin del flujo de aire. Es conveniente recordar que cuanto ms material se introduzca
en la cabina, la probabilidad de provocar turbulencias de aire se incrementa.
6. Mantener al mnimo la actividad del laboratorio en el que se localiza la cabina en uso, a fin
de evitar corrientes de aire que perturben el flujo. El flujo laminar se ve fcilmente alterado por
las corrientes de aire ambientales provenientes de puertas o ventanas abiertas, movimientos
de personas, sistema de ventilacin del laboratorio.
7. Evitar los movimientos bruscos dentro de la cabina. El movimiento de los brazos y manos
ser lento, para as impedir la formacin de corrientes de aire que alteren el flujo laminar.
8. Debe evitarse toser, estornudar o respirar con fuerza hacia el interior de la cmara. La cabeza
tiene que mantenerse totalmente fuera de la cmara, mientras que se debe trabajar lo ms al
interior de la cmara que podamos.
9. Nunca pasar objetos o manos por encima de otros objetos que descansen sobre la superficie
de trabajo.
10. Al igual que en el resto del laboratorio, no debe utilizarse el mechero Bunsen, cuya llama
crea turbulencias en el flujo y adems puede daar el filtro HEPA.
11. Cuando deban emplearse asas de platino es aconsejable el incinerador elctrico o, mejor
an, asas desechables.
12. Si se produce un vertido accidental de material biolgico se recoger inmediatamente,
descontaminado la superficie de trabajo y todo el material que en ese momento exista dentro
de la cabina.
13. No se utilizar nunca una cabina cuando est sonando alguna de sus alarmas.
Al finalizar el trabajo
1. Limpiar el exterior de todo el material que se haya contaminado.
2. Vaciar la cabina por completo de cualquier material.
3. Limpiar y descontaminar con alcohol etlico al 70% o producto similar la superficie de
trabajo.
4. Dejar en marcha la cabina durante al menos 15 minutos.
5. Conectar si fuera necesario la luz ultravioleta (UV). Conviene saber que la luz UV tiene poco
poder de penetracin por lo que su capacidad descontaminante es muy limitada.

ANEXO
Composicin de los medios de cultivo utilizados:

68
 Medio SIM: Es un medio semislido usado rutinariamente en la diferenciacin e identificacin
de cultivos de enterobacterias y que detecta la produccin de sulfuros, indol y movilidad de las
mismas.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Triptena 20.0

Peptona 6.1 Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada.

Mezclar hasta disolver; calentar agitando y hervir durante
Sulfato de hierro y amonio 0.2 un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemlisis y
esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.
Tiosulfato de sodio 0.2 Solidificar en posicin vertical.

Agar 3.5

pH final: 7.3 0.2

Medio MR-VP:

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 7.0 Suspender 17 g del polvo por litro de agua destilada.
Glucosa 5.0 Calentar suavemente agitando hasta disolver. Distribuir y
Fosfato dipotsico 5.0 esterilizar en autoclave a 118-121C durante 15 minutos.
pH final: 6.9 0.2

Agar Citrato de Simmons: Es un medio complejo de prueba de utilizacin de citrato en

enterobacterias.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de
Citrato de sodio 2.0 agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar
calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos. Distribuir
Cloruro de sodio 5.0 en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15
minutos. Enfriar en posicin inclinada.
Fosfato dipotsico 1.0

Fosfato monoamnico 1.0

Sulfato de magnesio 0.2

Azul de bromotimol 0.08

69
Agar 15.0

pH final: 6.9 0.2

Agar Nutritivo (AN): Es un medio slido complejo de uso general para el cultivo de bacterias
exigentes.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona de casena 10.0 Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden
NaCl 5.0 indicado menos el agar. Agregue el agar y caliente a
ebullicin por 1 min. Esterelizar en autoclave a 121 C
Agar 15
durante 15 min. Distribuir el medio en volmenes de 25
Extracto de carne 3.0 mL en cajas de Petri, en condiciones aspticas.
pH final: 6.5 -7.0
Caldo Nutritivo (CN): Es un medio lquido complejo de uso general para el cultivo de bacterias.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona de casena 10.0 Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden
NaCl 5.0 indicado. Distribuir en tubos de ensayo con tapn de
Extracto de carne 3.0 rosca. Esterelizar en autoclave a 121 C durante 15 min.
pH final: 6.5 -7.0

Agar de Eosina azul (EMB): Es un medio de cultivo comercial utilizado para identificacin y
diferenciacin de enterobacterias.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona de gelatina 10.0

Lactosa 5.0
Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el
Sacarosa 5.0 frasco. Calentar a ebullicin por 1 min. Esterelizar en
autoclave a 121 C durante 15 min. Distribuir el medio en
K2HPO4 volmenes de 25 mL en cajas de Petri, en condiciones
2.0
aspticas.

Eosina 0.4

0.065
Azul de metileno

Agar 13.5

Caldo urea: Es un medio lquido que se emplea para la identificacin de bacterias,

particularmente para diferenciar los miembros del gnero Proteus de Salmonella y Shigella.

70
 Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Urea 20.0

K2HPO4 9.5 Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden

indicado. Distribuir en tubos de ensayo con tapn de
rosca. Esterelizar en autoclave a 121 C durante 15 min
KH2PO4 9.1

Extracto de levadura 0.1

Rojo de fenol 0.01

Ajustar el pH a 6.8

Agar de hierro y triple azcar (TSI): Medio comercial para identificar y diferenciar
enterobacterias. Se basa en la formacin de sulfuros y fermentacin de glucosa, sacarosa y
lactosa.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Lactosa 10.0

Sacarosa 10.0

Dextrosa 10.0
Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden
Mezcla de peptonas 20.0 indicado. Calentar a ebullicin durante 1 min
Distribuir 7 mL en tubos de ensayo con tapn de rosca.
Esterelizar en autoclave a 121 C durante 15 min. Dejar
Tiosulfato de sodio 0.2 solidificar el medio en forma inclinada

Rojo fenol 0.025

Agar 13

Sulfato de amonio frrico 0.2

Ajustar el pH a 7.3

Caldo Rojo de fenol: Es un medio con diferentes azcares (glucosa, sacarosa, manitol) para
pruebas de fermentacin.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Azcar 20.0

71
KH2PO4 9.1
Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden
K2HPO4 9.5 indicado. Ajustar el pH. Distribuir 7 mL en tubos de
ensayo con tapn de rosca. Colocar un tubo de Durham
Invertido. Esterelizar en autoclave a 121 C durante 15
Extracto de levadura 0.1 min.

Rojo de fenol 0.01

Ajustar el pH 6.8 a 7.0

Agar Almidn: Se emplea para determinar actividad amidoltica.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Almidn 10.0

Peptona de casena 5.0

Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden
indicado. Ajustar el pH. Calentar a ebullicin durante 1
NaCl 8.0
min. Esterelizar en autoclave a 121 C durante 15 min.

Extracto de carne 3.0

Agar 15.0
Ajustar el pH 6.5 a 7.0

Agar Papa-Dextrosa (PDA): Es un medio slido complejo comercial de uso general para el
cultivo de hongos.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Glucosa 20.0 Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden
Agar 15.0 indicado. Ajustar el pH. Calentar a ebullicin durante 1
min. Esterelizar en autoclave a 121 C durante 15 min.
Extracto de papa 4.0
Distribuir el medio en volmenes de 25 mL en cajas de
Petri, en condiciones aspticas.
pH final: 5.6

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