Universidad Politcnica de Pnjamo

Ing. En Biotecnologa

Biotecnologa Vegetal.

Eva Marcela Licea

Proyecto de investigacin: Trabajo de investigacin y de Anlisis In

silico de las respuestas del Maz durante el ests por salinidad.

Escobar Murrieta Jos Joaqun.

8B, IBT

Pnjamo, Guanajuato 18 de agosto; 2017

Contenido
I. Introduccin......................................................................................................................................... 1
II. Objetivos ............................................................................................................................................. 2
2.1. Objetivo General. ....................................................................................................................... 2
2.2. Objetivos especficos. ............................................................................................................... 2
III. Justificacin. ..................................................................................................................................... 3
IV. Marco terico. .................................................................................................................................. 4
4.1 Zea mays (Maz). ........................................................................................................................ 4
4.2 Clasificacin taxonmica. .......................................................................................................... 4
4.3. Descripcin botnica. ................................................................................................................ 4
4.4 Requerimientos ambientales. ................................................................................................... 5
4.5 Estrs en plantas. ....................................................................................................................... 6
4.6 Efectos de respuesta a estrs por salinidad........................................................................... 6
4.6.1 Efectos morfolgicos en respuesta al estrs por salinidad en Zea mays. ..................... 6
4.6.2 Efectos fisiolgicos en respuesta al estrs por salinidad .................................................. 6
4.7 Fuente de resistencia a estrs por salinidad. ......................................................................... 7
4.8 Mecanismo de resistencia a estrs por salinidad. ................................................................. 7
4.9 Estrategias para incorporar resistencia a la salinidad. ......................................................... 7
4.9.1 Transgnica. ............................................................................................................................. 7
4.9.2 Introgresin de genes y mecanismos de resistencia a la salinidad. ............................... 8
4.10 Gen ZmHTK2;1 en su implicacin en la tolerancia al estrs por salinidad en Zea
mays. ................................................................................................................................................... 9
4.11 Acuaporinas............................................................................................................................... 9
V. Metodologa. .................................................................................................................................... 11
VI. Resultados...................................................................................................................................... 17
6.1 Anlisis de secuencias bajo estrs abitico empleando programas de Lasergene
DNASTAR y MegAlign. ................................................................................................................... 17
VII. Discusiones. .................................................................................................................................. 23
VIII. Conclusiones. .............................................................................................................................. 24

ii
IX. Referencias bibliogrficas. ........................................................................................................... 25

Figura 1. Bsqueda de resultados para la obtencin de resultados del gen. ......................... 12

Figura 2. Secuencia de la protena de Z. mays. .................................................................... 12
Figura 3. Especies relacionadas con la protena. .................................................................. 13
Figura 4. Guardado de la secuencia en formato *seq. .......................................................... 14
Figura 5. Guardado de la secuencia en formato *pro. ........................................................... 14
Figura 6. Introduccin de secuencias del formato *seq. ........................................................ 15
Figura 7. Secuencia alineada en MegAlign. .......................................................................... 15
Figura 8. Reporte de alineamiento. ....................................................................................... 15
Figura 9. rbol filogentico. .................................................................................................. 16
Figura 10.Reporte de alineacin de la secuencia codificadora para la protena TIP2. .......... 17
Figura 11. rbol filogentico del alineamiento de secuencias TIP2. ...................................... 18
Figura 12. Reporte de alineacin de la secuencia de nucletido codificadora para la protena
NIP. ...................................................................................................................................... 19
Figura 13. rbol filogentico del alineamiento de secuencias NIP. ....................................... 19
Figura 15. Reporte de alineacin de la secuencia de nucletido codificadora para la protena
TIP1. ..................................................................................................................................... 20
Figura 16. rbol filogentico del alineamiento de TIP1. ........................................................ 20
Figura 17. Reporte de alineacin de la secuencia de nucletido codificadora para la protena
HTK1. ................................................................................................................................... 21
Figura 18. rbol filogentico del alineamiento de HTK1. ....................................................... 21

Tabla 1. Clasificacin taxonmica de Zea mays. .................................................................... 4

LISTA DE COTEJO
PARA TRABAJO DE INVESTIGACIN

iii
 UNIVERSIDAD POLITCNICA DE PNJAMO

DATOS GENERALES DEL PROCESO DE EVALUACIN

Nombre(s) del alumno(s): Matricula: Firma del alumno(s):

Escobar Murrieta Jos Joaqun 214030072
Producto: Trabajo de investigacin y de Nombre de la herramienta: Fecha:
Anlisis In silico de las respuestas del Maz Investigacin
durante el ests por salinidad 18/07/17

Asignatura: Periodo cuatrimestral:

BIOTECNOLOGA VEGETAL 9no

Nombre del Docente: Eva Marcela Licea De Anda Firma del Docente:

INSTRUCCIO
NES
Revisar las actividades que se solicitan y marque en los apartados SI cuando la evidencia se cumple; en caso contrario marque NO. En la columna
OBSERVACIONES indicaciones que puedan ayudar al alumno a saber cules son las condiciones no cumplidas, si fuese necesario.

Valor del CUMPLE

reactivo Caracterstica que cumplir (Reactivo) OBSERVACIONES
SI NO
Introduccin: Describe de forma clara y precisa la justificacin y objetivos
del trabajo y lo que se pretende adquirir, se realiza una breve revisin
15% bibliogrfica de los puntos solicitados que justifique la razn del proyecto.
Cita apropiadamente, siguiendo las reglas del sistema APA.

Objetivos: Redacta de forma congruente y clara, en infinitivo el Objetivo

10% General y los Objetivos Especficos a cumplir con la investigacin

Marco Terico: Presenta informacin reciente de investigaciones

relacionadas al estrs que se est evaluando, incluye la revisin de la
especie, su anatoma, taxonoma y fisiologa, para justificar los criterios a
evaluar, las protenas a evaluar, las rutas metablicas y cmo se expresa o
15% reprime la protena en cuestin, como afecta el estrs en estudio en la
planta, las respuestas moleculares de la planta ante el estrs, las
herramientas bioinformticas empleadas para el estudio de las respuestas
moleculares de las plantas al estrs.

Metodologa.
20% Incluye la metodologa realizada para el anlisis in silico

iv
 Discusin: Discute y justifica los resultados en base a los trabajos de
15% investigacin revisados y cita al autor correctamente.

15% Conclusiones: Redacta de forma clara con respecto a los objetivos

establecidos

Referencias Bibliogrficas. Se indica apropiadamente la bibliografa y

se encuentran todas las citas mencionadas en el cuerpo del trabajo, se
presentan la URL o DOI de los documentos consultados en internet, as
10% como la fecha de consulta. Para las citas y las referencias, se sigue las
reglas del sistema APA

100%
CALIFICACIN:

v
I. Introduccin.

Debido al aumento en la poblacin mundial, as como al aumento en el ingreso

econmico per cpita, la demanda de alimentos tambin ha aumentado. La
Organizacin Mundial de la Salud (OMS) estima que para 2030 la demanda de
productos agrcolas ser aproximadamente 60% mayor a la actual. Un porcentaje
mayor al 85% de esta demanda se deber a los pases en desarrollo, donde ocurrir
el mayor crecimiento poblacional. (FAO, 2004).

Zea mays L.es una de las especies cultivadas ms productivas. Es una planta
C4 con una alta tasa de actividad fotosinttica; tiene el ms alto potencial para la
produccin de carbohidratos por unidad de superficie por da. Fue el primer cereal a
ser sometido a rpidas e importantes transformaciones tecnolgicas en su forma de
cultivo. El xito de la tecnologa basada en la ciencia para el cultivo del maz ha
estimulado una revolucin agrcola generalizada en muchas partes del mundo.

En el pasado, la produccin agrcola ha aumentado mediante la incorporacin

de nuevas tierras cultivables; sin embargo, la disponibilidad es limitada.
Adicionalmente ha aumentado la competencia por el uso del suelo debido a la
demanda industrial, comercial y residencial. Las reas productivas son inestables y
sujetas a una constante degradacin. La degradacin del suelo por la agricultura
ocurre a tal velocidad que uno de los grandes retos para poder alcanzar la demanda
de alimentos en el futuro es disminuir y, de ser posible, revertir el deterioro del suelo o
adaptarlo a las nuevas condiciones limitantes.

La salinizacin ha sido identificada como un factor muy importante en la

degradacin de los suelos agrcolas. De acuerdo con la OMS, de los 230 millones de
hectreas que se encuentran bajo irrigacin, 45 millones estn afectadas por la
salinidad. Se estima que se pierden al ao cerca de 1.5 millones de hectreas de

1
suelos irrigados, lo cual resulta en una reduccin de aproximadamente once mil
millones de dlares en la productividad agrcola. (FAO, 2004). El objetivo de esta
investigacin tiene como propsito el estudio de los genes expresados durante el
estrs por salinidad en el cultivo de maz.

II. Objetivos

2.1. Objetivo General.

Analizar las secuencias de 5 protenas distintas que se expresan al someterse a un

estrs abitico por salinidad en la planta de maz (Zea mays).

2.2. Objetivos especficos.

Investigar 5 protenas que se expresan en el estrs abitico por salinidad.

Buscar genes ortlogos y analizar las secuencias de cada una de las protenas
en diferentes especies seleccionadas.
Generar un archivo de texto (.txt) para cada secuencia en formato FASTA y un
archivo (*.seq) en Editseq.
Traducir cada una de las secuencias a aminocidos y guardar en una extensin
*.pro.
Utilizar MegAlign Para realizar el alineamiento de secuencias mediante el
mtodo ClustalV.
Realizar arboles filogenticos e interpretar el resultado.

2
III. Justificacin.

El anlisis de la secuencia de ADN es el descubrimiento de similitudes funcionales

y estructurales, y las diferencias entre mltiples secuencias biolgicas. Esto puede
hacerse comparando las nuevas (desconocidas) con las bien-estudiadas y
anotadas (conocidas) secuencias. Este anlisis incluye la alineacin de
secuencias, la bsqueda en la base de datos de secuencias, el descubrimiento de
patrones, la reconstruccin de las relaciones evolutivas, y la formacin y la
comparacin del genoma. Los cientficos han encontrado que dos secuencias
similares poseen el mismo papel funcional. La comparacin se puede hacer desde
aspectos de comportamiento bioqumico o de acuerdo con la estructura de la
protena. Si hay dos secuencias de diferentes organismos son similares, se dice
que son secuencias homlogas. (Chen, 2005)

3
IV. Marco terico.

4.1 Zea mays (Maz).

El maz es una planta herbcea monocotilednea de la familia gramneas. Es originaria

del continente americano, se cree que se origin en los trpicos de Amrica Latina,
especialmente los gneros Zea, Tripsacum y Euchlaena, cuya importancia reside en
su relacin fitogentica con el gnero Zea, est gramnea es muy cultivada como
alimento y como forraje para el ganado. (Chvez, 2003)

4.2 Clasificacin taxonmica.

Tabla 1. Clasificacin taxonmica de Zea mays.

Orden. Poales.
Familia. Poaceae.
Reino. Plantae.
Subfamilia. Panicoideae.
Gnero. Zea.
Especie. Zea mays.
(Acosta, 2009)

4.3. Descripcin botnica.

El maz forma un tallo erguido y macizo. Una peculiaridad que diferencia a esta planta
de casi todas las dems gramneas es tiene el tallo hueco. La altura es muy variable y
oscila entre poco ms de 60cm (en ciertas variedades enanas) y 6m o ms; la media
es de 2,4m. Las hojas alternas son largas y estrechas. El tallo principal termina en una
inflorescencia masculina; sta es una pancula formada por numerosas flores
pequeas llamadas espculas, cada una con tres anteras pequeas que producen los
granos de polen o gametos masculinos.

4
La inflorescencia femenina es una estructura nica llamada mazorca, que agrupa
hasta un millar de semillas dispuestas sobre un ncleo duro. La mazorca crece
envuelta en unas hojas modificadas o brcteas; las fibras sedosas o pelos que brotan
de la parte superior de la panocha son los estilos prolongados, unidos cada uno de
ellos a un ovario individual. El polen de la pancula masculina, arrastrado por el viento,
cae sobre estos estilos, donde germina y avanza hasta llegar al ovario; cada ovario
fertilizado crece hasta transformarse en un grano de maz. (Flores, 2007)

4.4 Requerimientos ambientales.

Temperatura. germinacin 18 20 C; para crecimiento por da, 25 33 C y

por la noche 17 23 C.
Humedad. Estudios realizados en la Universidad de Chapingo demuestran que
la mejor respuesta del maz en trminos de rendimiento de grano y uso del agua
evapotranspirada se obtuvo cuando el cultivo tuvo condiciones adecuadas de
humedad en el inicio de las fases de diferenciacin de rganos reproductivos
(35 a 51 dds), inicio crecimiento de la mazorca (52 a 65 dds), inicio emergencia
de estigmas (65 a 69 dds), y grano lechoso (85 a 120 dds). (Chvez, 2003)
Suelos. El maz, en general, crece bien en suelos con pH entre 5.5 y 7.8. Fuera
de estos lmites suele aumentar o disminuir la disponibilidad de ciertos
elementos y se produce toxicidad o carencia. Cuando el pH es inferior a 5.5 a
menudo hay problemas de toxicidad por aluminio y manganeso, adems de
carencia de fsforo y magnesio; con un pH superior a 8 (o superior a 7 en suelos
calcreos), tiende a presentarse carencia de hierro, manganeso y zinc. Los
sntomas en el campo, de un pH inadecuado, en general se asemejan a los
problemas de micro nutrimentos. (Flores, 2007)
Luminosidad. en el cultivo de maz, se ha encontrado que hay una reduccin en
la biomasa de las races y en el volumen radical, tanto de trigo como de maz,
cuando se cultiva en condiciones de baja luminiscencia.

5
4.5 Estrs en plantas.

El termino estrs utilizado en fisiologa vegetal tiene diferentes definiciones. Se define

como estrs como cualquier factor ambiental bitico o abitico que reduce la tasa de
algn proceso fisiolgico (por ejemplo, el crecimiento) por debajo de la tasa mxima
que podra alcanzar (Lambers, 1998).

4.6 Efectos de respuesta a estrs por salinidad.

4.6.1 Efectos morfolgicos en respuesta al estrs por salinidad en Zea

mays.

El maz es muy sensible a la salinidad, con una prdida de 10% de rendimiento en los
suelos en que la conductividad elctrica supera 2,5 mS/cm. El umbral para la reduccin
del crecimiento se estima en cerca de 1,7 mS/cm (Cramer & Negrao, 1994). El primer
sntoma de estrs de salinidad es el marchitamiento porque el cultivo sufre una sequa
fisiolgica ya que el agua no se puede mover del suelo a las races contra el gradiente
de potencial osmtico. Los cultivos tolerantes a las sales tienden a acumular menos
sodio, probablemente debido a las diferencias en la selectividad inica de las
membranas celulares.

4.6.2 Efectos fisiolgicos en respuesta al estrs por salinidad

A nivel fisiolgico, La salinidad tambin reduce la conductividad hidrulica de las races

y un dao duradero puede originarse debido a la acumulacin en la planta de niveles
txicos de ciertos iones, si bien la existencia de efectos txicos de iones especficos -
ms que un efecto general de los solutos- es an discutida (A., 1998). Despus de la
exposicin inicial al ClNa el calcio es desplazado de las membranas y las plantas son
ms sensibles a la sal cuando los niveles de calcio son bajos (G.R., 1994). el cido
abscico se acumula en las zonas de crecimiento de las hojas; no parece haber un

6
efecto directo de la sal sobre la fotosntesis a los niveles de inhibicin de la expansin
de las hojas.

4.7 Fuente de resistencia a estrs por salinidad.

En Zea mays al pasar el tiempo ocurre un ajuste osmtico y la planta acumula iones
de potasio, sodio y cloro. Los cultivares tolerantes a las sales tienden a acumular
menos sodio, probablemente debido a las diferencias en la selectividad inica de las
membranas celulares.

4.8 Mecanismo de resistencia a estrs por salinidad.

Se han desarrollado lneas de maz de zona templada casi isognicas que difieren en
las tasas de acumulacin de materia seca y de expansin de las hojas bajo condiciones
salinas (Saneoka, 1995) En estas lneas, la tolerancia se ha asociado con el ajuste
osmtico a travs de la formacin de glicinabetana y parece haber en ellas un solo
gen que permite su acumulacin.

4.9 Estrategias para incorporar resistencia a la salinidad.

Algunas de las estrategias que se pueden emplear para la insercin de genes que
hagan a los cultivos de maz resistentes a estrs por salinidad, se destacaran la
incorporacion de genes, de entre los cuales esta la transgenia y la introgesion de genes
de resistencia.

4.9.1 Transgnica.

La tcnica transgnica es resultado de la Biotecnologa aceptada fue un tomate elaborado

artificialmente en 1994 en Estados Unidos; luego, siguieron unas papas en Inglaterra en donde
se detect, por primera vez, que disminuan las defensas del organismo humano sufriendo
alteraciones para responder a los antibiticos.
El proceso de elaborar un alimento transgnico es el siguiente:

7
 1. Se toma cualquier trozo de una planta de inters alimenticio
2. Se asla un gen. El cientfico separa las clulas a travs de un proceso qumico
hasta llegar a una masa que es manipulada.
3. Se incorpora el gen o los genes aislados en otra clula germinal. Se colocan
nuevos genes, de otra especie, dentro de esa masa o cromosomas a travs de
un portador (virus, bacteria o antibitico) que introduce ese gen dentro de la
masa o cromosoma de la clula elegida.
4. La nueva clula se reproduce en laboratorio
5. Despus que la planta a germinado, se procede a cultivarla en campos
experimentales. Si la planta, prospera y se desarrolla, se ha obtenido una planta
transgnica. Tambin se le llama planta modificada genticamente.
http://www.olca.cl/oca/transgenicos/trans09.htm

4.9.2 Introgresin de genes y mecanismos de resistencia a la salinidad.

La introgresin gentica se refiere al hecho de introducir en una poblacin genes de

otra diferente. Este fenmeno puede perseguir el objetivo de introducir un nico gen
de inters en esa poblacin o, en el otro extremo, puede ser utilizado para sustituir
toda una poblacin por otra (cruzamiento por absorcin), inmovilidad de las plantas y
por las condiciones de infertilidad de los suelos.

En los ltimos aos, se estudiaron los mecanismos responsables de la

adquisicin de alta afinidad del K+ por las plantas. Especficamente, se han estudiado
las propiedades de los transportadores denominados HKT (high affinity K+
transporters). Para poder adecuarse a condiciones de extremada salinidad, las plantas
han desarrollado estos mecanismos adaptativos que les permiten asimilar los
nutrientes necesarios para su desarrollo ptimo, an en condiciones de baja
disponibilidad y/o en la presencia de iones txicos, como el sodio. Dentro de los ms
importantes se encuentran los involucrados en la absorcin de K+, NH4 +, PO4, etc.

8
4.10 Gen ZmHTK2;1 en su implicacin en la tolerancia al estrs por
salinidad en Zea mays.

Anlisis de los cambios en la expresin del transportador ZmHKT2;1 en una variedad

de Zea mays tolerante y una sensible a la salinidad, mediante el empleo de anticuerpos
especficos, mostraron que este transportador se expresa a niveles reducidos en la
variedad tolerante cuando las plantas del maz fueron expuestas a altos niveles de
Na+ , lo cual se podra relacionar con un menor transporte de este elemento txico a
las partes areas de la planta, explicando as la tolerancia de esta variedad a la
salinidad. Por el contrario, en la variedad no tolerante, la presencia de altos niveles de
Na+ no caus efecto alguno en la expresin de ZmHKT2;1, permitiendo as el
transporte de Na+ a la planta y, por lo tanto, causando los efectos negativos sobre el
crecimiento de esta variedad. (Lambers, 1998)

Estudios recientes han descubierto que el transporte de Na+ mediado por

ZmHKT2;1 es fuertemente inhibido por concentraciones bajas de K+ (M), y que, bajo
estas condiciones, el K+ es entonces transportado, debido a la alta afinidad de
ZmHKT2;1 por K+ en comparacin con Na+, la cual es cincuenta veces menor para
este ltimo.

4.11 Acuaporinas.

Las acuaporinas son protenas transmembranales, encargadas de transportar el agua

a travs de bombas Na+/k+ Estn formadas por un haz de 6 hlices que dejan una
estrecha abertura en su interior por la que pueden pasar molculas de agua, pero
evitando por completo el paso de iones. Como en todas las protenas transmembrana,
la superficie de la protena que est en contacto con la bicapa lipdica es rica en
aminocidos hidrofbicos mientras que los aminocidos polares se concentran hacia
los dos extremos de la protena. Estas protenas transmembrana son especializadas,

9
no permiten que los aniones y la mayora de los cationes grandes puedan atravesar.
Adems, hay un par de aminocidos catinicos que actan como puerta, impidiendo
el paso de cationes pequeos como el ion H3O+. (Kukulski, 2006)

La importancia de las acuaporinas recalca que no solo explican los rpidos cambios
del volumen celular causados por la entrada o salida del agua sino tambin, respuestas
de cambios fisiolgicos o a alteraciones patolgicas.

Las acuaporinas pueden activarse o desactivarse por diferentes mecanismos de

regulacin. Las acuaporinas pertenecen a la familia de las protenas integrales de
membrana (PIM), parece ser que todas las acuaporinas evolutivamente tienen su
origen en un mismo gen.

Estas protenas acuaporinas se extienden por toda la membrana celular, podemos

encontrar un mayor nmero de ellas en las clulas de rin, eritrocitos y clulas
epiteliales. Las acuaporinas forman tetrmeros en la membrana, en los que cada
monmero tiene un poro central. Estas transportan el agua formando una lnea de 10
molculas de agua como fila india que cruza en su interior, gracias a su cara hidroflica
que proporciona uniones de hidrgeno transitorias para las molculas de agua. Estas
uniones ayudan a alinear las molculas de agua en fila y las orientan por su paso a
travs de la membrana. (Kukulski, 2006)

10
V. Metodologa.

Mediante el anlisis realizado, algunas protenas que son expresadas durante el estrs
por salinidad destacan las acuaporinas que regulan el flujo de agua en la adaptacin
por este tipo de estrs, estas protenas tienden a dar una respuesta expresndose bajo
condiciones de extremada salinidad, especficamente las Protenas intrnsecas de la
membrana plasmtica(PIP), las localizadas en el tonoplasto, Protenas intrnsecas del
tonoplasto(TIP1 y TIP2) encontradas en el tonoplasto, protenas parecidas a la
nodulina26 (NIP) las cuales facilitan el transporte de glicerol, los transportadores de
alta afinidad de k+ y baja afinidad de Na+(HTK) que facilitan el movimiento de Na+ al
interior de la clula. A travs de esto se obtuvieron secuencias ortlogas para el
anlisis de alineamientos, as como la obtencin de rboles filogenticos para 5
especies que sern seleccionadas.

Paso No. 1: Obtencin de secuencias ortlogas de las protenas.

Para obtener la referencia de las protenas, se buscar en la pgina de NCBI
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov) las siglas correspondientes de la protena a analizar
junto con la especie. Posterior se seleccionar la opcin correspondiente al apartado
de Gene, se presentar la bsqueda de resultados mediante el cual se obtendr gen
de la especie Zea mays en donde se presentar el contexto genmico y de expresin.

11
 Figura 1. Bsqueda de resultados para la obtencin de resultados del gen.

En el contexto genmico se present un link FASTA el cual posee el almacenaje de

la secuencia requerida para obtener los genes ortlogos. Se obtuvo la secuencia la
cual fue copiada y pegada en un block de notas.

Figura 2. Secuencia de la protena de Z. mays.

Los genes ortlogos fueron obtenidos mediante BLAST, dando click en Run BLAST,
se obtuvieron las especies relacionadas con la protena.

12
Se tom en cuenta el trmino Evalue el cual indica un valor de similitud con las
secuencias de protenas. La columna Accession indica una referencia para la
secuencia de las especies en la que se debe dar click. La obtencin de cada secuencia
fue llevada de la siguiente manera:
Al seleccionar Accession enva a una pgina en la que aparece la informacin
de la especie, por lo que debe darse click sobre FASTA.
La secuencia fue copiada y guardada en un block de notas junto con su nombre
para su posterior empleo.

Figura 3. Especies relacionadas con la protena.

Paso No. 2. Traduccin de las secuencias.

Se utiliz el desarrollo del software Editseq en el cual se introdujeron las secuencias

previamente guardadas.

procedimiento:
Se seleccion y pego la secuencia en la ventana abierta, se guard el archivo
con la extensin denominada (*seq.).
Posterior se seleccion toda la secuencia y se eligi la opcin Goodies y
Translate DNA para realizar la traduccin de la secuencia a protena.
Se guard el archivo obtenido y se destin a una carpeta donde se guardaron
los archivos con extensin (*pro.).

13
 Figura 4. Guardado de la secuencia en formato *seq.

Figura 5. Guardado de la secuencia en formato *pro.

Paso No. 3: Alineamiento de secuencias.

Se obtuvo el alineamiento de las secuencias convertidas a protenas mediante el

emple el programa MegAlign en el que se introdujeron los archivos guardados con
la extensin (*.seq.), seleccionando cada una de las especies y agregndolas para su
alineamiento.

Una vez incorporados los archivos con la extensin el programa lanzo una pestaa
nueva en la que se indic que nucletidos fueron identificados con colores distintos y
con nmeros totales presentes en cada especie, con esto se puede manipular la

14
alineacin final, as como la filogenia y las estructuras de las especies empleando el
mtodo ClustalV.

Al obtener lo siguiente:
Se seleccion la opcin Align y By ClustalV donde parece un cuadro en el
que se presenta el progreso de la alineacin de las secuencias; se seleccion
la opcin de AligmentReport y as se obtuvo el alineamiento de las secuencias.

Figura 6. Introduccin de secuencias del formato *seq.

Figura 7. Secuencia alineada en MegAlign.

Figura 8. Reporte de alineamiento.

Paso No. 4: rbol filogentico.

Posteriormente se procedi a realizar el rbol filogentico, dando click en la opcin
View y Phylogenetic Tree, MegAlign arrojo una pestaa nueva con el rbol junto
con las especies seleccionadas con anterioridad, con esto se realiz la interpretacin
del parentesco que tienen las 5 especies, con el estrs empleado.

15
 Figura 9. rbol filogentico.

Paso No. 5: Ruta Metablica.

Para la obtencin de la ruta metablica de la protena presente en las especies

vegetales con el estrs por salinidad, se dirigi a la pgina KEGG: Kioto Encyclopedia
of Genes and Genomes, donde se introdujeron los trminos de cada gen en el link
denominado como Kegg Pathway, obteniendo los resultados del mapa y sus
funciones del metabolismo para su posterior descripcin.

16
VI. Resultados.

6.1 Anlisis de secuencias bajo estrs abitico empleando programas de

Lasergene DNASTAR y MegAlign.

Primera protena: TIP2.

Se seleccion una opcin de decoracin con sombreado color rojo para as poder
identificar las regiones de la secuencia que son similares en cada una de las especies,
para esto se emple el mtodo ClustalV con el programa respectivo de MegAlign.
Posterior a esto, se muestra una captura del reporte completo del alineamiento
correspondiente a una regin en donde se present mayor similitud entre las especies.

Figura 10.Reporte de alineacin de la secuencia codificadora para la protena TIP2.

En el reporte de alineacin de la secuencia codificadora par la protena TIP2 (figura

10) la especie Zea mays muestra una diferencia entre las secuencia a diferencia de
las dems en las que se muestran pocas diferencias entre las regiones que se
muestran en la secuencia completa las cuales fueron utilizadas para el alineamiento,
lo cual sugerir que hay una relacin cercana entre las especies analizadas en
cuestin de la expresin de esta protena de esta protena intrnseca que se expresa
en el tonoplasto.

17
 Figura 11. rbol filogentico del alineamiento de secuencias TIP2.

El rbol filogentico del alineamiento de secuencias de la protena TIP 2 (figura 11)

muestra los anlisis de las 5 especies comparadas con la especie de inters, el cual
ofrece las relaciones que existen entre las especies. En la imagen puede observarse
la similitud que hay entre Oriza sativa y Shorgum bicolor (las cuales se encuentran
ms cercanas al rbol) en cambio Zea mays que se encuentran un poco alejadas
indican existe una separacin evolutiva por fenmenos de especiacin. Con esto
puede destacarse que esta especie puede tener una mejor resistencia a este tipo de
estrs siendo moderadamente y a los factores abiticos, desarrollando as mejores
mecanismos de adaptacin y defensa que le permita sobrevivir en condiciones de
estrs.

Segunda protena: NIP.

En el analisis de alineacin de la secuencia de nucleotidos codificadoras para las

proteinas NIP, las cuales facilitan el transporte de glicerol para regular la perdidade
agua en las celulas, mostraron una gran similitu entre las epecies Zea mays y Seteria
italica.

18
 Figura 12. Reporte de alineacin de la secuencia de nucletido codificadora para la
protena NIP.

La relacin entre Zea mays, Seteria italica y Solanum tuberrosum en la expresin de

NIP, fue de 4 nucletidos, esto indica a que comparten una regin de aminocidos
muy parecida, a diferencia de Nicotina attenuata a cul a pesar de presentar esta
protena tiene una estructura muy diferente con respecto a las dems.

Figura 13. rbol filogentico del alineamiento de secuencias NIP.

En el rbol filogentico del alineamiento de secuencias NIP, se observa que de las 5

especies comparadas se puede observar la similitud que hay entre las especies de
Zea mays y Seteria italica representando una evolucin semejante. En especial
Nicotina attenuata se encuentran ms aleadas indican la separacin evolutiva por
fenmenos de especiacin lo cual concordara con el reporte de alineacin de la
secuencia del nucletido codificante para las protenas NIP, indicando una marcada
diferencia evolutiva y tal vez una menor eficiencia en cuanto a la respuesta de esta
planta al estrs por salinidad.

19
Tercera protena: TIP 1.

En el reporte de alineacin de secuencias del nucletido codificador para la Protena

intrnseca del tonoplasto (TIP1), se logra identificar la gran variacin en las secuencias
entre las 5 especies analizadas.

Figura 14. Reporte de alineacin de la secuencia de nucletido codificadora para la

protena TIP1.

Pueden observarse las diferencias con respecto a las regiones de cada una de las
secuencias con una diferencia de 4 nucletidos entre las especies Zea mays, Setaria
itlica, Shorgum bicolor y Stipa capillacea, lo cual sugiere que existe alguna relacin
cercana entre la sntesis de esta protena entre las especies analizadas, adems de
que en las regiones se encuentran algunas deleciones en la especie Oriza sativa.

Figura 15. rbol filogentico del alineamiento de TIP1.

En el rbol filogentico del alineamiento de TIP1 (figura 16) se muestran las 5 especies
comparadas con la especie de inters que fue estudiada bajo el estrs por salinidad
existiendo una relacin cercana entre las especies Seteria itlica y Stipa capillacea,
por su parte, Oriza sativa muestra la mayor diferencia evolutiva en cuanto a la

20
formacin de esta protena expresada en el tonoplasto.

Cuarta protena: HKT1.

Para el anlisis de la alineacin de la secuencia del nucletido codificador para HTK1,

se realiz una nueva corrida y se le dio el color azul fuerte para diferenciar de las
dems.

Figura 16. Reporte de alineacin de la secuencia de nucletido codificadora para la

protena HTK1.

Con respecto al alineamiento mostrado en la figura 17 se puede determinar que hay

una relacin entre todas las especies en la formacin de esta protena la cual est
encargada de transportar k+ y Na+ a travs de la membrana, esta protena se expresa
en la epidermis y tiene la funcin de absorcin de cationes y llenado del xilema donde
se acumulan, debido a esto puede ser que sea una protena presente en ms
organismos con una estructura muy parecida y con la misma funcin.

Figura 17. rbol filogentico del alineamiento de HTK1.

En el rbol filogentico de alineamiento para HTK1 se puede observar que a pesar de

21
la gran similitud que mostro en alineamiento de a secuencia, hay una gran diferencia
evolutiva en cuanto a la especie Zea mays con respecto a las dems.

Quinta protena: PIP

Para observar la similitud que existe en las secuencias de PIP expresadas en distintas
especies como lo es Zea mays, Oryza sativa, Phoenix dactylifer, Setaria itlica y
Sorghum bicolor. se emple el mtodo ClustalV con el programa MegAlign, se
seleccion la opcin sombreada de color verde, para as poder identificar las regiones
de secuencias que son similares en cada una de las especies mencionadas con
anterioridad.

Figura 19. Reporte de alineacin de la secuencia de nucletido codificadora para la

protena PIP.

En el reporte de alineamiento de la secuenciacin de nucletidos codificantes para la

protena intrnseca de la membrana plasmtica(PIP), de la familia de las acuaporinas,
las cuales se localizan en el tonoplasto y la membrana se puede identificar una gran
variacin entre nucletidos entre las 5 especies, Oryza brachyantha y Sorghum bicolor
comparten una variacin de 3 y 2 genes respectivamente con respecto al gnero Zea
mays, siendo Phoenix dactylifer la que presenta ms variacin de nucletidos

22
 Figura 20. rbol filogentico del alineamiento de PIP.

En el rbol filogentico de alineamiento PIP muestra que el gnero Zea mays. y el

Sorghum bicolor comparten una igualdad evolutiva, en cuanto a la falta una adenina
en su secuenciacin mostrada en el alineamiento de nucletidos, adems el rbol
filogentico indica gran diferencia evolutiva en el gnero Phoenix dactyfera

VII. Discusiones.

A travs de los resultados obtenidos en la respuesta a estrs inducida por salinidad ,

se logr identificar las protenas que participan en la regulacin de flujo de agua en la
adaptacin al estrs por salinidad, las similitudes mostradas en todos los anlisis
fueron identificados con los softwares DNAstar , Clustal V y MegAlign para corroborar
las similitudes que existan entre las especies y la formacin de las protenas, se
identific a travs de los mismo que el gnero Zea mays muestra la mayor
diferenciacin gentica, esto debido a la gran hibridacin y a la evolucin constante de
esta especie y talvez debido a esto la mayor resistencia a la salinidad con respecto a
otras especies como la cebolla o la zanahoria

23
VIII. Conclusiones.

La bioinformtica es una rama de la biotecnologa que en los ltimos aos ha tomado

mucha importancia ya que es posible encontrar mediante bases de datos diversa
informacin que permite conocer ms sobre alguna especie en particular y realizar
comparaciones entre diferentes especies. De la misma los diversos softwares que
existen para realizar comparaciones entre diferentes secuencias son de gran utilidad,
ya que es posible realizar alineamientos entre las secuencias ya sea de nucletidos o
aminocidos que nos permitan analizar las similitudes entre las especies y su cercana
o lejana con respecto a su evolucin a lo largo del tiempo, adems de bases de datos
de apoyo para como la pgina Centro Nacional para la Informacin
Biotecnolgica "National Center for Biotechnology Information.

Desde el punto de vista biotecnolgico, la funcin de que realiza el HTK, nos

indica que las propiedades de este transportador son adecuadas para la produccin
de plantas con el potencial de resistir niveles elevados de Na+, ya que la absorcin de
este elemento txico se podra inhibir por la presencia de K+, adems de asegurar la
toma de este ltimo.

Este trabajo me ha permitido identificar que el transportador HTK1 media el

transporte de K+ y Na+ (adems de Li+, Rb+ y Cs+) facilitando ms el movimiento de
Na+ hacia el interior de las clulas, lo cual podra indicar que este transportador es la
va de entrada de este elemento txico para las plantas. Debido a que este
transportador se expresa principalmente en clulas que rodean al tejido vascular,
posiblemente participe en el transporte a distancia de Na+ y K+, ms que en la
absorcin de estos elementos del suelo. Adems de la importancia de las acuaporinas
(PIP, TIP, NIP y SIP) recalca que no solo explican los rpidos cambios del volumen
celular causados por la entrada o salida del agua sino tambin, respuestas de cambios
fisiolgicos o a alteraciones patolgicas

24
IX. Referencias bibliogrficas.

A., B. (1998). Plant breeding for stress environments. USA: CRC press.
Acosta, R. (04 de Junio de 2009). El cultivo de maiz, su origen y clasificacin.
Cultivos tropicales, 113-120. Obtenido de
http://www.saludybuenosalimentos.es/alimentos/index.php?s1=Verduras%2FH
ortalizas&s2=Frutos&s3=Tomate
Chvez, J. (2003). Ficha tecnica: Cultivo de maz. Soluciones practicas, 7.
Chen, P. (2005). Bioinformatics Technologies. Heidelberg. Alemania: ISBN.
Cramer, & Negrao, S. (1994). Evaluating Physiological responses of plants to salinity
stress. Annals of botany.
FAO. (2004). El maz y la nutricin humana. Italia: Food and Nutrition Organization.
Flores, H. D. (2007). Gua tecnica del cultivo de maz.
G.R., C. (1994). Response of maize(Zea Mays L.) to salinity. USA, New York:
Handbook plant and soil stress.
Kukulski, W. (2006). Structure and function of Aquaporins. Alemania: Philosophisch-
Naturwissenschaftlichen Fakultt.
Lambers, H. S.-C. (1998). Plant Physiological Ecology. New York: Springer-Verlag.
Saneoka, H. (1995). Salt tolerance of glycinebetainedeficient containing maize lines.
USA: Plant physiology.

25