Determinacin de protenas

Curso EMA
2013
Ing. Agr . Marta del Puerto
Mtodos para determinar protenas
Se basan en:

a. Propiedad de las protenas de absorber luz en el

UV
absorcin A=280nm

a. Capacidad de unirse a ciertos colorantes

Biuret
Lowry
Acido Bicinconnico BCA
Bradford

a. Formacin de derivados qumicos

 Propiedad de absorber luz en el espectro
UV
La mayora de las protenas muestran una
absorcin a 280 nm, la cual se atribuye al
grupo fenlico de la tirosina y al grupo
indlico del triptofano
Tiene la ventaja de que no es necesario utilizar
reactivos y la muestra no se daa o destruye
durante la determinacin.
 Mtodo de absorcin UV
Se determina la cantidad de luz absorbida una
solucin proteica.
Para el clculo de la concentracin de dicha
solucin se aplica la ley de Lambert Beer:

A = c l
Donde:
A = absorbancia
= Coeficiente de extincin molar.
l = longitud de la celda.
C = concentracin
 - coeficiente de extincin molecular : la cantidad de luz absorbida
por unidad de concentracin

Se utiliza el coeficiente de extincin de la Albmina de Suero Bovino

(BSA) que es de 43824 M-1 cm-1
 Mtodos colorimtricos
Usan reactivos determinantes de color

Miden por colorimetra en espectro luz visible

Usa curva de protena patrn (albumina suero

bovino)

Mtodos donde la muestra se destruye

Curva patrn para mtodos colorimtricos

Curva patrn albumina suero bovino BSA

 Mtodo de Biuret
Se basa en la formacin
de un complejo
coloreado entre el ion
Cu+2 y los grupos NH4
de los enlaces ppticos
en medio bsico (NaOH
o KOH)
Consideraciones del mtodo de Biuret
Reaccin especfica
Color violeta se lee a 540nm contra curva
estndar BSA
La intensidad del color es proporcional a la
cantidad de protena
Baja sensibilidad alta concentracin
de protena
 Mtodo de Lowry
Combina la reaccin del Biuret con la
reduccin del reactivo de FOLIN-CIOCALTEAU
por los grupos aromticos de residuos de
tirosina, triptfano, cistina cistena e histidina.
Origina compuesto azul intenso
Mide a 750nm
 Mtodo del cido bicinconnico BCA
Se basa en que las protenas reducen los iones
cpricos del reactivo BCA a iones cuprosos en
medio bsico.
Cambio de color del verde (BCA) al morado.

OH-
protena + Cu+2 Cu+1

Cu +1 + BCA BCA-Cu+1
 Mtodo de Bradford
Se basa en la unin del reactivo Comassie-
blue G250 a las protenas en medio cido

Reconoce los aa arginina, fenilalanina,

triptfano y prolina

Origina color azul intenso A=595nm

Aa que reconoce el reactivo de Bradford
 Nitrgeno total o kjeldahl
El mtodo Kjeldahl se basa en la
transformacin del nitrgeno contenido en la
muestra en sulfato de amonio mediante la
digestin con cido sulfrico en presencia de
un catalizador. El ion amonio obtenido se
transforma en medio bsico en amonaco que
se destila y valora con una solucin de cido
patrn.


DIGESTIN

n - C -NH2 + mH2SO4 catalizadores CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2

protena calor

NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN

(NH2)SO4 + 2 NaOH 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O

NH3 + H3BO3 (cido brico) NH4 + H2BO3- (in borato)

TITULACIN

H2BO3- + H+ H3BO3
 Tamao de la muestra
IMPORTANTE: homogeneizar la muestra: molido (<1mm) y
mezclado

Materiales slidos Muestras liquidas

CONT. DE PESO DE MUESTRA Conc de N Vol muestra

PROTEINA % mg mg/l ml
Mas de 5% 1000 - 5000 Menor a 20 100

5 a 30% 500 - 1500 Entre 20 y 50 50

Menos 30% 200 - 1000 Entre 50 y 100 25

 Proceso de digestin
Romper los enlaces nitrogenados y liberar el
nitrgeno como ion amonio

Digestin en medio cido H2SO4

Catalizador
Temperatura
Tiempo
 Cantidad de cido a agregar
muestra ml acido/ TRIGO
g muestra
Suelo 10.0 PC---- ----- 12.5%
CHO------- 66.6%
MG ------- 3.5%
Grasa 9.7

Protena 4.9
CALCULO
Carbohidratos 4.0
PC = 12.5% * 4.9 ml/g = 0.61
CHO = 66.5% * 4.0 ml/g = 2.66
Arcilla 0.6 MG = 3.50% * 9.7 ml/g = 0.34

TOTAL 3.61 ml cido

 CATALIZADOR AGENTE REDUCTOR

Se usa en algunos compuestos

Mejorar la velocidad y que requieren ser reducidos
eficiencia de la digestin antes de digerir
Sulfato de cromo, zinc,
MERCURIO sucrosa, acido salicilico
COBRE
SELENIO
AGENTE OXIDANTE
TITANIO
Acelera la descomposicin
Agente antiespumante
MEZCLAS

H2O2
 DESTILACION
OBJETIVO: Convertir el nitrgeno amoniacal (NH4) en
amonio (NH3) mediante el agregado de una lcali
(KOH , NaOH) que se recoge en acido brico

(NH)2SO4 + 2NaOH ---- 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O

NH3 + H3BO3 --------- NH4 + H2BO3-

ac ion borato
borico
 Titulacin y clculo de %N
El ion borato se titula con un cido dbil

H2BO3- + HCl ---------- H3BO3

Se determina el gasto de HCl para neutralizarlo

%N = NHCl x gasto x 14 x 100
peso muestra
N normalidad del acido mol/l
Gasto ml de HCl
14 g/mol peso atmico del N
100 Factor de correccin
Peso muestra gramos
 Calculo de % protena
Se usa un factor de conversin segn al % de
N de la muestra
En general se usa 6.25 = 100
16

%N x 6.25 = %PC
Factor segn la protena en estudio
 Ejemplo de determinacin
muestra P muestra Gasto % nitrgeno Factor % PC
fresca
Forraje 0.8214 14.9 2.47 6.25 15.44
fresco
Forraje 0.8383 15.7 2.55 6.25 15.94
fresco
Avena 0.5053 20.4 18.66 5.36 10.0

Hongos n2 0.2177 7.1 4.82 4.38 21.11

Pupasp512 0.2140 9.8 6.89 6.25 43.06

Base seca