Universitatea Tehnic Gh.

Asachi
Facultatea de Inginerie Chimic si Protecia
Mediului
Departamentul de Inginerie Organic,
Biochimic i Alimentar

Metode de extracie i separare a

vitaminelor

Student,
Moise Raluca
Gr. 2603-CPA
 Metode de extracie i purificare a vitaminelor

Vitaminele sunt substane fiziologic active necesare organismului n cantiti foarte mici.
Carena lor genereaz avitaminoz, boal ce se manifest prin tulburri caracteristice.
Vitaminele acioneaz n organism n calitate de coenzime drept reactani a unor procese
chimice ale metabolismului. Ele nu pot fi sintetizate de organismul animal ci numai de plante i
de anumite microorganisme.
Vitaminele se clasific n funcie de solubilitate n dou grupe:
o Vitamine liposolubile: vitaminele A, D, E, K.
o Vitamine hidrosolubile: vitaminele complexului B, vitamina C.
Vitaminele hidrosolubile obinute prin biosintez sunt: vitamina B2 i B12, iar procedee
mixte de sintez i biosintez sunt aplicate la obinerea vitaminei C.
Avantajele economice oferite de biosintez fac ca aceasta s fie tot mai mult utilizat pentru
obinerea vitaminelor hidrosolubile.
Un mare numr de vitamine din grupa B sunt sintetizate de microorganisme i sunt factori
eseniali de cretere ai acestora. Acestea se pot acumula endo i exocelular. Determinarea lor n
biomas i n lichidul de cultur, la dezvoltarea microorganismului Propionibacterium technicum
pe un mediu sintetic suplimentat cu tiamina i acid pantotenic, indic valori apreciabile (tabelul
1).

Tabelul 1 Biosinteza vitaminelor B cu P. technicum pe mediu sintetic

Vitamina Coninutul de vitamine dup dezvoltarea bacteriilor

/g biomas uscat /l mediu cultur
Tiamina (B1) 13 562
Riboflavina (B2) 210 420
Piridoxina (B6) 5 125
Ciancobalamina (B12) 230 0
Acid pantotenic 25 227
Acid nicotinic (PP) 524 522
Acid folic 35 73

Cultivnd Propionibacterium technicum pe mediu de cultur organic se obin valori mai

sczute de vitamine din grupa B (tabelul 2).

Tabelul 2. Biosinteza vitaminelor B de ctre Propionibacterium technicum pe mediu

organic.

Vitamine Coninutul de Coninutul de vitamine dup dezvoltarea

vitamine iniial n bacteriilor
mediu, /l /l de biomas /g lichid de
 uscat cultur
Tiamina Nedeterminat 11,8 53
Riboflavina Idem 50 Nedeterminat
Acid pantotenic 87 4,3 30,5
Piridoxina 168,4 Nedeterminat 124
Acid nicotinic 804 140 627
Vitamina B12 0 180 0

Prezena vitaminelor complexului B n subprodusele industriei fermentative a condus la

valorificarea acestora sub form de reziduu total (borhotul evaporat la sec), reziduu solubil
(filtratul borhotului evaporat la sec), sau biomas filtrat.
Aceste rezidii sub form de pulbere, sirop de 45-50% substan uscat sau chiar forma
neprelucrat se folosesc drept concentrat vitaminic n zootehnie, avicultur i biotehnologii
(tabelul 3).

Tabelul 3. Coninutul n vitamine al unor subproduse de biotehnologie n / g substan

uscat.

Vitamina Rezidiu uscat Rezidiu solubil Miceliu Miceliu uscat

borhot EtOH uscat borhot penicilin penicilin
cereale EtOH cereale
Tiamina (B1) 3-4 6-9 3-7 -
Riboflavina (B2) 7-10 15-20 20-48 7-29
Acid pantotenic 12-15 29-36 88-212 592-805
Acid nicotinic 70-90 104-160 107-180 232-333
Piridoxina (B6) 4-6 8-10 21-25 82-114
Biotina (H) 0,2-0,3 0,3-0,7 0,6-1,5 0,6-0,8

Coninutul n vitamine al unor subproduse de biotehnologie se exprim n /g substan

uscat.
Cele mai mari cantiti de vitamine se gsesc n drojdii. Folosirea extractului de porumb, a
malului, a melasei n formarea mediului de cultur, favorizeaz obinerea vitaminelor
complexului B. Stimularea producerii vitaminelor se poate face prin adugarea n mediul de
cultur a unor componente din grupul complexului B: tiamin, acid pantotenic, acid nicotinic sau
biotin, sau a unor precursori. Astfel, prin introducerea -alaninei crete coninutul de acid
pantotenic, iar introducerea componentelor piridinice i tiazolice ale tiaminei mrete coninutul
n tiamin de la 20-40 /g la 650 /g (tabelul 4).

Tabelul 4. Coninutul n vitamine B al drojdiilor industriale (/g substan uscat)

Vitamina Drojdie de Drojdie de bere Drojdie furajer

panificaie
Tiamina 16-40 68-180 5-53
Riboflavina 25-80 21-80 26-70
Acid pantotenic 150-330 42-200 40-180
Acid nicotinic 240-700 281-1000 153-600
Piridoxina 25-65 23-100 35
Acid folic 19-80 19-30 4-31
Biotina 0,8-2,4 0,8-1,1 0,5-3,6
Acid 24-175 9-102 17-62
p-aminobenzoic
Inozitol 4320 2700-5000 2700-3600

Folosind drojdii industriale nu se poate obine n condiii economic avantajoase o anumit

vitamin B, se poate obine ns ntreg complexul B.
Autolizatul de drojdie se concentreaz pn la sec sau pasta de drojdie de panificaie se
suspend n ap distilat obinndu-se un concentrat de vitamine B, care dup prelucrare (uscare,
drajefiere) se comercializeaz sub denumirea de Complex B.
i alte vitamine se pot obine cu ajutorul mucegaiurilor i bacteriilor. Vitamina C apare n
cantiti mari n mediile de cultur ale microorganismului Aspergillus niger i Bacillus
prodigiosus; biotina n biosinteza acidului fumaric cu Rhizopus, riboflavina i acidul pantotenic
la fermentaia anaerob cu Bacillus polymyxa sau aerob cu Aerobacter aerogenes.

Vitamina B2 (Riboflavina)
Vitamina B2 este un factor indispensabil tuturor organismelor animale. Este o
component a coenzimei flavoproteinelor existente n toate celulele, care catalizeaz transferul
de hidrogen dintre sistemul enzimatic al coenzimelor I i V (donoare de hidrogen) i sistemul
enzimatic al citocromilor (acceptor de hidrogen).
Vitamina B2 se gsete n cantiti mari n lapte, brnz, ficat, rinichi, albuul de ou i
legume verzi.
A fost identificat prima oar de ctre Blyth (1879) n lapte, a fost izolat n stare pur n
1933 de ctre Ellinger i Koschara din lapte i de Kuhn, Szent-Gyorgy i Wagner-Jauregg din
lapte i ou.
Vitamina B2 este o pulbere cristalin de culoare galben-portocaliu, cu punct de topire
o
292 C, termostabil i foarte sensibil la radiaii ultraviolete i vizibile.
Vitamina B2, riboflavina sau 6,7-dimetil-9(1- d-ribidil)-izoaloxazina este primul
component izolat i identificat al complexului B cu urmtoarea structur:

OH OH OH
1' 2' 3' 4' 5'
CH2 CH CH CH CH2OH
N N O
H3C 8 9 1 2
7
6
H3C 5 10 4 3NH
N
O
 Aceast structur stabilit prin reacii de degradare a fost confirmat prin sintez total de
ctre Karrer i Kuhn.
Pentru biosinteza vitaminei B2 se pot utiliza ciuperci, drojdii, precum i unele specii de
Clostridium sau Lactobacillus (tabelul 1).

Tabelul 1. Microorganisme utilizate n biosinteza vitaminei B2

Microorganisme utilizate Productivitate

Eremothecium ashbyi > 2.000/ ml
Ashbya gossypii >2.000/ ml
Candida flareri 700-800/ ml
Clostridium accetobutilicum 80-100/ ml
Pentru biosinteza vitaminei B2 se folosesc cel mai mult Eremothecium ashbyi i Ashbya
gossypi care au productivitate mare i nu sunt sensibile la cantiti mici de ioni de fier. Cultivarea
lor la scar industrial este rentabil, dei au o durat relativ mare a procesului de
fermentaie.Studiile efectuate cu privire la mecanismul de biosintez au relevat rolul de precursor
al purinelor (xantina) hipoxantina, mresc randamentul cu 40% la introducerea n mediul de
cultur).Studiile de biosintez ntreprinse cu medii de cultur n care s-au introdus anumite
componente considerate drept precursori coninnd carbon marcat (C14) au demonstrat c atomii
din poziiile 4a i 9a a moleculei de riboflavin provin din glicin, cel din poziia 4 provine din
CO2, iar cel din poziia 2 provine din formiat. Catena lateral este grefat pe derivatul diamino-
pirimidinic, iar ciclul pirazinic i benzenic au drept precursor acetona sau diacetilul rezultai la
reducerea acetil-coenzimei A i care la rndul su se formeaz din acid piruvic prin decarboxilare
oxidativ (schema 26).
HCOOH R
H H
N N O HN N O
CO2 9 1 2 3 riboza
HC 8 7 6 4
NH2 CH2 COOH N 5 NH C8 NH
H H2N
NH3 O O
xantina 5-amino-4-ribitil
aminouracil

CH3 CO
CH3 CO
Acetoina(diacetil)
R R
CH3 CO H
H3C N N O H3C N N O
8 9 1 2 CH3 CO
7 9a
6 10 4a 4 3NH
5 NH
H3C N H3C N
O O
R: CH2 (CHOH)3 CH2 OH

Tehnologia obinerii vitaminei B2

 Obinerea prin biosintez a vitaminei B2 se realizeaz pe o linie tehnologic asemntoare
produselor de biosintez i include urmtoarele etape: sterilizarea aerului i a mediului de
cultur, fermentaia, separarea vitaminei din biomas i purificarea ei.
Procesul de biosintez a vitaminei B2 este foarte sensibil la toi factorii ce intervin n timpul
unui ciclu de fermentaie. Microorganismele productoare de riboflavin sunt foarte sensibile i
dau uor mutaii existnd permanent pericolul infeciilor. Din aceste motive sterilizarea mediului
de cultur ridic probleme deosebite.
Cele mai bune rezultate n fermentaie se obin atunci cnd sterilizarea componentelor
mediilor de cultur se face separat la 140oC timp de trei minute.
Etapa de fermentaie se poate realiza prin procedeul de fermentaie de suprafa sau
fermentaie n profunzime.
Procedeul culturii n profunzime este utilizat curent n industrie, ofer randamente mari,
economie de spaii i manoper, iar produsul obinut este omogen i de calitate.
Factorii care condiioneaz procesul de biosintez sunt: natura microorganismului, calitatea
i cantitatea inoculului, compoziia mediului, pH-ul, temperatura, aeraia, regimul de agitare,
materialul de construcie a fermentatorului i forma acestuia.
Biosinteza industrial utilizeaz ca surse de carbon: glucoza, zaharoza i maltoza.
Utilizarea melaselor conduce la randamente sczute. Se folosesc concentraii de 2-4%, iar
adaosul de mal 1% are efect favorabil asupra fermentaiei.
Sursele de azot aminic folosite sunt: peptona (extract de carne), fina de pete, extractul de
drojdie, miceliul de peniciline i tetracicline, colagenul, cleiul de oase, fina de soia, extractul de
porumb, cazeina. Aminoacizii coninui n aceste surse de azot mresc viteza de cretere a
biomasei (acidul glutamic, aspartic, asparagina) n prima etap a biosintezei i genereaz
riboflavina n a doua etap (treonina, serina, tirozina).
Dintre vitamine, inozitolul, biotina i tiamina sunt factori eseniali pentru dezvoltarea
biomasei.
Se folosesc precursori purinici n concentraii de 1,5-2x10-3 molar ca i guanin, xantin,
hipoxantin, etc. Acetia mresc activitatea mediului cu 25-40%.
Se asigur necesarul de fosfor, magneziu, zinc prin adugare de sruri anorganice. Se
lucreaz la un pH optim 6,5-7 i la temperaturi de 28-30oC.
Procesul de fermentaie se desfoar n patru faze.
n prima faz, care dureaz 20-25 de ore are loc un consum accentuat de zahr i o scdere
de pH a crui valoare, dac nu e corectat, ajunge la 5-5,5. n aceast faz nu se elaboreaz
vitamina B2, dar are loc o acumulare de mas microbian.
n faza a doua, coninutul de zahr se reduce n continuare, pH-ul scade, iar n biomas se
formeaz spori ce declaneaz formarea de riboflavin. Durata acestei faze este aproximativ tot
20-25 de ore.
n faza a treia, care dureaz aproximativ 100 de ore, zahrul este metabolizat n ntregime,
pH-ul ncepe s creasc continuu i se corecteaz cu acizi pentru meninerea valorii optime. n
acest stadiu numit faz de producie, se formeaz cantitatea cea mai mare de vitamin B2.
Riboflavina apare la nceput ca metabolit intracelular, apoi se repartizeaz ntre miceliu i mediul
apos, iar n final este deplasat preferenial n soluia apoas.
n faza a patra a fermentaiei, acumularea de riboflavin nceteaz i ncepe un proces
accentuat de autoliz a miceliului, caracterizat prin creterea brusc de pH. Aceast etap trebuie
evitat, deoarece ncepe i degradarea produsului biosintetizat.
Dinamica principalilor parametri n biosinteza industrial a riboflavinei este tipic pentru
un metabolism endocelular.
Pentru industria farmaceutic, produsul biosintetizat trebuie separat din mediul de cultur.
Dup coagulare prin acidulare i nclzire la 70oC, biomasa se filtreaz pe filtru pres la 20oC, iar
filtratul trece la separare.
Separarea vitaminei B2 din soluia nativ se poate face prin mai multe procedee:
1. reducerea chimic la dihidroriboflavin i reoxidare, conform schemei (schema 27):
R R H
H3C N N H3C N N
C O 2H C O
NH NH
H3C N C [O] H3C N C
O -H2O H O

2. reducere i reoxidare biologic;

3. extracie cu solveni organici;
4. separare cu schimbtori de ioni.
Primele dou procedee sunt aplicate n industrie. Metodele de extracie cu solveni organici
i separarea cu schimbtori de ioni sunt dezavantajoase din punct de vedere economic.
Reducerea cea mai frecvent folosit n separare este cea chimic. Se utilizeaz ditionitul de
sodiu care este solubil n mediu alcalin i se descompune rapid n mediu neutru sau slab acid. n
faz apoas, la un pH 5-5,5, n raport molar 1,5:1 fat de riboflavin, se comport ca un
reductor energic.
Na2S2O4 + 2H2O H2 + 2NaHSO3
Dihidroderivatul este foarte puin solubil n ap, precipit i se filtreaz. Se usuc la aer la
40-50oC, cnd o mare parte se oxideaz. Perfectarea oxidrii se face cu H2O2 n soluie apoas
concentrat. Purificarea se face prin recristalizare din ap (figura 24).
 2 7 8 11 12
solutie cu B2
4 4
5
1 6 10

9
3

13

Figura 5. Instalaia de separare a vitaminei B2

1- aparat de reducere, 2- vas msur soluie hidrosulfit, 3- centrifug, 4- usctor, 5- turn de
oxidare, 6- aparat pentru perfectarea oxidrii, 7- vas msur HCl, 8- vas msur H2O2, 9- filtru
nuce, 10- aparat recristalizare, 11- vas msur ap (pentru diluare), 12- vas msur soluie NaOH
(pentru ajustarea pH-ului la 6), 13- rezervor.

Cea mai mare parte din vitamina B2 obinut prin biosintez se folosete n industria
alimentar, n prepararea concentratelor alimentare (lapte condensat, sucuri concentrate), n
prepararea unor produse farmaceutice (de obicei intr n compoziia unor amestecuri de vitamin
B cu aciune revitalizant folosite n surmenaj i convalescen).
Deficitul vitaminic este mai frecvent atunci cnd alimentaia este mai srac sau la
alcoolicii cronici. Simptomele principale n acest caz sunt: stomatit, dermatit seboreic,
anemie,etc.

Vitamina B12 (Cianocobalamina)

Cobalaminele sau cobamidele sunt vitamine din complexul B cunoscute sub denumirea
de vitamina B12. Ele au structura asemntoare hemoglobinei, format dintr-un macrociclu
porfirinic centrat pe un atom de cobalt, de care se leag o grupare de tip adenozinic i o grupare
cian pentru cianocobalamin sau hidroxi pentru hidroxicobalamin. Ciancobalamina i
hidroxicobalamina sunt cele dou forme stabile folosite ca medicament.
Vitamina B12a fost izolat n stare pur n 1948 de FolkersSmith i Parker din ficat i de
Rickes din culturile diferitelor tulpini.
Este o substan cristalin de culoare roie, puin solubil n ap, etanol i insolubil n
general n toi solvenii nepolari: benzen, eter, etc.
Structura vitaminei B12 a fost stabilit printr-un efort comun al cercettorilor din domeniul
chimiei organice i analizei fizico-chimice. Un aport deosebit l-a adus difracia cu raze X
efectuat de Crowfoot-Hodgkin n 1955.
Vitamina B12 deriv de la un sistem macrociclic numit corin care conine patru atomi de
azot inclui n cele patru nuclee pirolice (notate A,B,C,D).
Derivaii acestui sistem macrociclic se numesc corinoide. Ele sunt derivai ai unui acid
heptacarboxilic numit acid cobirinic.
 CH3 CH3
HOOC H2C H2C H
CH2 COOH
HOOC H2C
A B CH2 CH2 COOH
H3C N
H3C N +
H
H Co 2 H
HOOC H2C N N CH3
D C
H CH3
HOOC H2C H2C CH3 H CH2 CH2 COOH
CH3
Acid cobirinic

n vitamina B12 ase din carboxilii acidului cobirinic sunt amidificai ca grupe CONH2, iar
al aptelea este amidificat cu grupa -NH2 din D(-) 1-amino-2-propanol. Grupa OH din acest
alcool este esterificat cu acidul fosforic care se leag i de N-glicozida 5,6-dimetil-
benzimidazolului. Al doilea atom de azot al inelului imidazolic este coordinat de ionul de Co3+,
tricovalent, cu un numr de coordinaie ase. Ionul de Co3+ din centrul ciclului corinic se leag de
o grupare -CN, de un atom de azot din nucleul pirolic (nucleul D), iar a treia sarcin este
satisfcut de restul de ester fosforic din poriunea nucleotidic I a moleculei.

CH3 CH
H2N OC H2C H2C H 3
CH2 CONH2
H2N OC H2C 3 5 6
7
2 A4 L B 8 CH2 CH2 CONH2
II H3C 1
H3C N N 9 H
21 22
H 24
Co 23 10 H
H2N OC H2C 19 N N 11 CH3
18 D16 C 12
13
H 17 15
14 CH3
OC H2C H2C H CH2 CH2 CONH2
CH3
CH3
NH
CH2
H3C CH
O O CH3
N 4
I P 2
3 5
O O 1 6
7
OH N CH3
3' 2'
4'
1'
HOCH2 O
5'

L=CN, vitamina B12(cianocobalamina)

L=OH, hidroxicobalamina
 Deci molecula vitaminei B12 este format din dou poriuni: I partea nucleotidic coninnd
restul 5,6-dimetil-benzimidazol, riboz i acid fosforic i poriunea II ce conine sistemul
macrociclic i ionul de cobalt.
Sursele principale de vitamin B12 sunt:
o endogene - vitamina B12 se sintetizeaz de ctre bacteriile intestinale ale
rumegtoarelor;
o exogene - prin aport alimentar de proteine animale. Vitamina B 12 se gsete n ficatul
animalelor, n nmolul activ al staiilor de epurare i n culturi microbiene.
Din ficatul animalelor separarea se face prin tratare cu cianur alcalin sau acid clorhidric,
dup care concentratul este supus aciunii fermenilor digestivi sau a pepsinei i adsorbie pe
crbune activ. De pe crbune vitamina B12 se elueaz cu alcooli alifatici i din soluia alcoolic se
extrage cu solveni organici, se reextrage cu ap i se purific prin cromatografie.
Utilizarea nmolului activ de la staiile de epurare a apelor reziduale este o surs pentru
obinerea vitaminei B12 furajere.
Culturile microbiene constituie principala surs economic de obinere la scar industrial a
vitaminei B12.
Din produsele naturale au fost izolate mai multe substane cu structur puin diferit de cea
a cianocobalaminei.
Astfel, n locul 5,6-dimetilbenzimidazolului, factorul A conine un rest de 2-metiladenin,
provitamina B12 conine un rest de adenin, factorul G un rest de -hipoxantin, factorul H un
rest de 2-metilhipoxantin. Factorul B nu are 5,6-dimetilbenzimidazol, n factorul V1a (sau acidul
cobirinic) apare doar macrociclul substituit, dar ca acid liber n poziia 17, factorul WR este un
complex al vitaminei cu o protein.
Din seria analogilor de semisintez amintim B12r - conine cobalt bivalent; B12s - are cobalt
monovalent (se obine prin reducerea vitaminei B12 n mediu acid sau bazic); aquacobalamina-
conine n locul grupei CN o molecul H2O; hidroxicobalamina - conine n locul grupei CN o
grupare OH. Aquacobalamina se obine din surse naturale n absena ionilor CN, de asemenea
se obine prin reducerea sau fotoliza vitaminei B12 (B12a are drept ligand central apa, B12b - grupa
hidroxil, B12 c- ionul nitrit,etc.).
Cunoaterea mecanismului de biosintez a vitaminei B12 prezint o importan foarte mare
pentru stabilirea condiiilor optime de realizare a procesului de fermentaie. n mecanismul de
biosintez a vitaminei B12 se disting dou etape fundamentale:
a. formarea ciclului corinic;
b. ncorporarea restului nucleotidic.
Procesul simplificat al mecanismului de biosintez este prezentat n schema 28.
Vitamina B12 este produsul de metabolizare al unor actinomicete: Streptomyces grizeus, S.
olivaceus, S. aureofaciens sau a unor bacterii: Bacillus megaterium, Propionibacterium
freudenreichii, P. shermani, P.technicum.
HOOC-CH2-CH2-O-S-Enz. H2N-CH2-COOH HOOC-CH2-CH2-CO-CH-COOH
- Enz.-SH |
succinil coenzima A glicina
NH2
acid alfa-amino-beta-ceto-adipic

HOOC-CH2-CH2-CO-CH2-NH2
- CO2
acid delta-amino-levulinic

HOOC-CH2-CH2-C=O CH2-CH2-COOH HOOC-H2C-H2C- CH2 COOH

| |
CH2-NH2 O= C-CH2-NH2 CH2 NH2
NH
acid delta-amino-levulinic acid delta-amino-levulinic Porfobilinogen

cianicobalamina factorul B acid cobirinic

Tehnologia obinerii vitaminei B12

Fabricarea industrial a vitaminei B12 prin biosintez cuprinde urmtoarele faze: sterilizarea
aerului i mediului de cultur, fermentaia, separarea, purificarea i cristalizarea vitaminei B12.
Se utilizeaz n practic S olivaceus, P. shermanii, P. freudenreichii i P. technicum.
Procesul de biosintez este influenat de temperatur, pH, compoziia mediului de cultur, gradul
de aerare, precursori i modul de sterilizare a mediului de cultur.
Se utilizeaz un mediu de cultur bogat n aminoacizi eseniali, sruri de cobalt,
dimetilbenzimidazol, zaharuri. Biosinteza are loc la 30oC, n condiii de aerare minim i la pH
6,8-7 i dureaz aproximativ 70-120 de ore, pn la epuizarea surselor de carbon.
Se lucreaz cu glucoz sau zaharoz (sursa de carbon i energie), extract de porumb sau
fin de soia n cantiti mari (sursa de azot), autolizat de drojdii sau hidrolizat de cazein.
Creterea biomasei este stimulat de biotin i de anumii aminoacizi: glicin, serin, valin, acid
aspartic. Introducerea clorurii de cobalt se face de la nceputul procesului, iar benzimidazolul se
introduce dup 50-60 de ore.
n faza de inocul i prefermentare are loc creterea biomasei i formarea acidului
aminolevulinic. n absena ionilor Co2+ se formeaz n mediul de cultur porfirine, iar la
concentraii suficiente de Co2+, acidul aminolevulinic nu mai trece n mediu, ci se transform n
acid cobirinic n interiorul celulelor.
Cobalamina este coninut n biomas. Dup coagularea termic, cu electrolit sau bazic, se
filtreaz amestecul de fermentaie i se obine un prim concentrat din biomas. n biomasa uscat
de P. shermanii, concentraia vitaminei ajunge la 1500 /g n condiiile fermentrii aerobe i
2500 /g n fermentaii anaerobe. Biomasa filtrat se trateaz la 90-95oC cu acid azotos, cnd se
pune n libertate aquacobalamina i hidroxicobalamina din complecii proteici ce le conin.
Vitamina eliberat se transform, sub aciunea acidului azotos obinut n vasul 1 dintr-o
soluie de azotit de sodiu 0,5% i acid clorhidric adugat din dozatorul 2, n nitrozocobalamin,
mai stabil. Se filtreaz pe un filtru pres 3, se spal pe filtru cu ap cald (85-95oC). Dup
reunirea filtratului cu apa de splare se salefiaz n vasul 4 cu NaCl i se filtreaz din nou, apoi
se trimite la extracie (figura 25).
Pentru izolarea vitaminei B12 se folosete cel mai mult metoda extraciei selective. Din faza
apoas se extrage aqua i hidroxicobalamina cu un amestec butanol:fenol = 1:1. Extractul
organic ce conine vitamina B12 se trateaz cu ap(raport 20:1) cnd vitamina se reextrage din
solvent n ap. Soluia apoas obinut dup separarea fazelor, se trateaz cu NaCN la pH 7,5-8
cnd are loc obinerea ciancobalaminei care se supune purificrii.
Purificarea const n extracie cu solvent organic i cromatografiere. Se extrage cu amestec
de crezol-CCl4 din soluia rezultat de la cianurare, apoi se adaug un amestec de butanol-CCl4
pentru modificarea polaritii extractului i se reextrage cu ap distilat. Se obine un concentrat
de peste 10.000 /ml. Acesta se concentreaz sub vid, cnd cristalizeaz amestecul de vitamine
brute, sau se aplic o cromatografie preparativ pe coloane de Al2O3 parial activat, silicagel
activat. Eluarea se face cu aceton, amestec aceton-fenol sau aceton-ap.
La rece cristalizeaz ciancobalamina. O purificare suplimentar se poate face prin
recristalizare din ap deionizat. Concentrarea succesiv de la 25 /ml la sfritul biosintezei la
5.000-10.000 /ml dup cromatografie, face ca o bun parte din operaii s se execute la nivel de
laborator. arjele industriale de vitamina B12 sunt de 5-50 g.
Izolarea i purificarea vitaminei B12 este ilustrat n urmtoarea schem a operaiilor
(schema 29):
 HCl

2
masa bacteriana
NaNO2 apa
3

NaCl spre
extractie
Figura 6. Extracia n ap a vitaminei B12 din masa bacterian
1-reactor, 2-dozator HCl, 3-filtru pres, 4-vas de salefiere
 Vitamina B12 este un factor indispensabil creterii organismelor tinere i un medicament
foarte bun n tratamentul anemiei pernicioase.
Este esenial pentru replicarea ADN-ului. Ea intervine n creterea i maturarea celular,
fenomen evident mai ales la nivelul hematiilor i a altor celule cu proliferare intens.
Avitaminoza B12 se manifest prin anemie megaloblastic i prin leziuni neurologice
caracteristice.