Expresin de protenas recombinantes

en levaduras

Mercedes Goin
Laboratorio Denver Farma
rea Biotecnologa
 Eleccin del sistema de expresin

Complejidad de la molcula: estructura terciaria y

cuaternaria, modificaciones postraduccionales

Uso: investigacin, diagnstico, farmacutico

Cantidad de producto

Economa

Aspectos regulatorios
 BACTERIAS

Convenientes para crecimiento en grandes

fermentadores.
Se obtienen altos rendimientos (0,1-5 g/L).
En general las protenas tendrn metionina
N-terminal.
Es frecuente la produccin en forma de
cuerpos de inclusin.
No produce eventos postraduccionales.
Endotoxinas
 LEVADURAS

Conveniente para el crecimiento en

grandes fermentadores.
Buenos rendimientos (0.01-1 g/L).
Introduce modificaciones
postraduccionales.
La glicosilacin es distinta de la de
mamferos: high manosas
La protelisis suele ser un problema.
 CLULAS DE MAMFEROS

Los cultivos en grandes escalas son difciles de

realizar y muy costosos.

Los rendimientos son generalmente bajos (0,001-0,1

g/L).

Se producen modificaciones postraduccionales.

Para ciertas protenas puede ser el nico sistema de

expresin posible.
 PLANTAS
Se producen modificaciones postraduccionales

Expresin localizada en diferentes rganos

Expresin en estados especficos del crecimiento

Crecimiento en campo barato

La glicosilacin es distinta que la de mamferos

Eficiencias bajas de transformacin y expresin

Seguridad controvertida
EXPRESIN DE
PROTENAS EN
LEVADURAS
Produccin de protenas biofarmaceticas

Levaduras
E. coli
Cel. Eucariotas superiores

Ferrer-Miralles et al. 2009, Microb. Cell Fact. 8,17.

Saccharomyces cerevisiae
 Vectores de Saccharomyces cerevisiae

Vector Secuencias de N de copias Frec. trans- Inestabilidad

levadura /clula formacin (a) mittica (b)
Integrativos
YIp ADN homlogo 1 102 0,1 %
Reemplazo ADN homlogo 1 10 Estable
ADNr ADNr 100-200 nd Estable

Episomales
Replicadores (YRp) ARS 1-20 104 20 %
Centromricos (YCp) ARS/CEN 1-2 104 1%

Basados en 2 (YEp) ORI/STB/REP 25-200 104 2,8-0,2 %

/FLP

(a) Transformantes por g de ADN con esferoplastos

(b) Clulas sin plsmido por generacin en medio no selectivo.
Integracin cromosmica de ADN por
recombinacin homloga
 Vectores de Saccharomyces cerevisiae

Vector Secuencias de N de copias Frec. trans- Inestabilidad

levadura /clula formacin (a) mittica (b)
Integrativos
YIp ADN homlogo 1 102 0,1 %
Reemplazo ADN homlogo 1 10 Estable
ADNr ADNr 100-200 nd Estable

Episomales
Replicadores (YRp) ARS 1-20 104 20 %
Centromricos (YCp) ARS/CEN 1-2 104 1%

Basados en 2 (YEp) ORI/STB/REP 25-200 104 2,8-0,2 %

/FLP

(a) Transformantes por g de ADN con esferoplastos

(b) Clulas sin plsmido por generacin en medio no selectivo.
 Marcadores de seleccin

1-Auxotrficos. Alelos que complementan mutaciones en

cepas auxotrficas.

Ej.: LEU2, TRP1, URA3, HIS3, usados en cepas auxotrficas

para leucina, triptofano, uracilo e histidina

2-Dominantes. Se pueden usar en una mayor variedad de

cepas.

Ej: Tn903kanr: seleccin con G418

DHFR: seleccin con metotrexate /sulfanilamida
Cmr: seleccin con cloranfenicol en medio con glicerol
 Promotores y terminadores transcripcionales
Promotores de enzimas glicolticas: son los ms poderosos pero poco
regulables
Ej: PGK: fosfoglicerato quinasa
GAP: gliceraldehdo 3 fosfato deshidrogenasa
ADH: alcohol deshidrogenasa
Son inducidos varias veces por glucosa

Promotores del metabolismo de galactosa: Son los promotores

regulables ms usados.
Ej: GAL1, GAL7 y GAL10: Se inducen hasta 1000 veces por
galactosa y se reprimen por glucosa

Promotores hbridos: Ej: PGK/GAL, tiene la fuerza del promotor PGK

y la regulacin de GAL

Terminadores: slo de levaduras. En general se usa el terminador de 2

 Secrecin de protenas en Saccharomyces
cerevisiae
Para qu?

Plegamiento correcto
Evitar efectos txicos
Facilita la purificacin

Pptido seal pptido N-terminal hidrofbico

propio de levaduras

MF1: feromona
SUC2: invertasa
PHO5: fosfatasa cida
 Construccin del gen para expresar en levaduras
1- Eliminar todas las secuencias no codificantes en la regin 5no
codificante (5UTR) ya que secuencias ricas en G y estructuras 2as son
inhibitorias de la iniciacin de la traduccin

2- El ATG debe estar precedido por ADN rico en AT, preferentemente

AAAAAATG ya que esto favorece la iniciacin de la traduccin

3- Uso de codones propios del sistema

4- Usar ADNc

5- Analizar secuencia del gen por posibles sitios de poliadenilacin,

estructuras 2as cerca del ATG, sitios de glicosilacin, etc.

6- Incluir sitios de restriccin para el clonado

Problemas asociados a la produccin en S. c.

La mayora son promotores constitutivos.

Falta de promotores fuertes. El producto representa

1-5% del total de las protenas producidas.

Inestabilidad plasmdica.

Hiperglicosilacin de glicoprotenas secretadas.

Casi todos los productos derivados de levaduras
que estn en el mercado son producidos en
Saccharomyces cereviciae

2009: la FDA apueba la 1era protena

biofarmacetica producida en una levadura
distinta de S.c. : Inhibidor de kallicrena
producida en Pichia pastoris por Dynax Inc.
 LEVADURAS METILOTRFICAS

Son capaces de utilizar metanol como nica fuente de C

Poseen capacidad de crecer a altas densidades, proceso fcilmente
escalable a grandes volmenes de produccin
La produccin de protenas heterlogas en cepas transformadas
con promotores fuertemente inducibles pueden alcanzar
rendimientos de hasta el 30 - 40% de las protenas solubles
celulares.
Sistema actualmente muy difundido
Hansenula polymorpha (Pichia angusta)

Candida boidinii

Pichia methanolica

Pichia pastoris
Pichia pastoris
 ALCOHOL OXIDASA

Son las primeras enzimas del camino metablico de

metanol y estn codificadas por dos genes AOX1 y AOX2.

A nivel proteico AOX1 y AOX2 presentan un 97% de

homologa

AOX esta constituda por un octmero de subunidades

idnticas a las que se le unen molculas de FAD.
 PEROXISOMA CITOSOL

CH3OH CH3OH
O2 AOX GSH FDH

H2O2 HCHO HCHO GS-CH2OH HCOOH CO2

CATALASA FLDH NAD NAD
1/2O2 + H2O DHAS NADH2 NADH2
Xu5P
GAP DHA
1/3 GAP constituyentes
DHA DHAP celulares
ATP
ADP FBP F6P

GAP P2
AOX tiene baja afinidad por el oxgeno. La clulas
compensan esta baja actividad cataltica sintetizando
grandes cantidades de la enzima. Cuando las levaduras
metilotrficas crecen en glucosa, AOX no es detectable,
mientras que en metanol llega a representar el 30-35% de
las protenas celulares solubles.

La sntesis de AOX est regulada a nivel transcripcional.

Promotor AOX1: fuerte, AOX2: dbil

Inductor: Metanol
Represor: glucosa, glicerol, etanol
Peroxisomas
 Vectores de expresin para Pichia pastoris

Induccin con
metanol

Cepa a
transformar
His-: GS115
Induccin
con glucosa o
glicerol
 Reemplazo gnico

Integracin del ADN en genoma

Insercin gnica
Recombinacin homloga
Insercin gnica en AOX
Reemplazo gnico
 Vectores de expresin para Pichia pastoris

Induccin con
metanol

Cepa a
transformar
His-: GS115
Seleccin de cepas recombinantes
His+Mut+ e His+Muts

Mut +

Muts

Muts

Medio MD Medio MM

Confirmacin por PCR y Southern blot

Seleccin de cepas recombinantes
His+Mut+ e His+Muts

MD MM
Caracterizacin del producto de expresin

SDS PAGE +/- DTT Western blot

Caracterizacin de la cepa productora

PCR: presencia y estabilidad del gen

Southern blot: Mut+/Muts

Dot Blot: N de copias del gen

PCR cuantitativa: N de copias del gen

GLICOSILACIN DE PROTEINAS
EN LEVADURAS

El patrn de glicosilacin en levaduras

es distinto del de mamferos
GLICOSILACIN DE PROTENAS

1- N- GLICOSILACIN

2- O- GLICOSILACIN
 Glicosilacin de protenas

Las protenas son transportadas en vesculas al Golgi

donde los hidratos de carbono sufren modificacines
N- glicosilacin: la seal para la adicin de azcares es la
misma que para mamferos (Asn-X-Ser/Thr). Tambin
ocurre O-Glicosilacin.
Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150
manosas. Adems los oligosacridos poseen uniones
terminales 1-3 glicano
 N- GLICOSILACIN

Sequon: Asn-X-Thr/Ser X: cualquier

aa menos Prolina

Asn
 O-GLICOSILACIN EN LEVADURAS

- manosa

1,2 manosa
Ser/Treo

Sequon? Abundancia inusual de ser/treo

Prolinas cerca de ser/thr
aa cargados cerca de ser/treo
 GLICOSILACIN DE PROTEINAS EN
LEVADURAS

El patrn de glicosilacin en levaduras es distinto del

de mamferos

Las protenas humanas, glicosiladas en levaduras,

pueden tener efectos inmunognicos en humanos

Alternativas para prevenir la glicosilacin en levaduras

Tunicamicina
Cepas mutantes
Enzimas para desglicosilar
No usar la va de secrecin
Mutagnesis dirigida
Pichia: 3-13 manosas. S.c. > 50 manosas
 La productividad de un sistema recombinante est
determinada por muchos factores genticos y fisiolgicos.

Posibles cuellos de botella:

Uso de codones

Nmero de copias del gen

Transcripcin eficiente usando promotores fuertes

Seales de traduccin

Translocacin determinada por el pptido seal

Procesamiento y plegamiento en RE y Golgi

Secrecin

Protelisis
 Cambio de
escala

50 ml
2.5 l Fermenters,
Shake-flask 20 l Fermenters,
with 1.5 l working
cultures with 15 l working 400 l Fermenters,
volume
volume with 300 l working
volume
COSECHA CENTRIFUGACIN
Qu construccin?

Qu precursor?

Qu promotor?
Qu pptido seal?
 Fenotipo Mut

Seleccin del clon Nivel de expresin proteica

N de copias del gen