UNIVERSIDAD PEDAGGICA Y TECNOLGICA

DE COLOMBIA. UPTC
Biologa Molecular

GUA PRCTICA N2

BIOSEGURIDAD Y
MANEJO DE MICROPIPETAS

1. OBJETIVOS

Identificar los riesgos qumicos, fsicos y biolgicos relacionados con el uso de los
elementos, reactivos y equipos del laboratorio de biologa celular y molecular.
Conocer el uso, manejo y desecho de sustancias irritantes, txicas, cancergenas,
teratognicas, entre otras.
Conocer las partes y el funcionamiento de las micropipetas.
Adquirir destreza en la utilizacin de pipetas para la medicin de volmenes entre
1 y 1000 L.

2. INTRODUCCIN

El laboratorio de biologa celular y molecular tiene una serie de condiciones especiales

relacionadas con el manejo de reactivos, elementos y equipos que pueden influir en la
salud del personal as como repercutir en el medio ambiente. Por ende, es importante
conocer las normas establecidas, familiarizarse con el uso de cada uno de los materiales
de trabajo para evitar cometer errores o sufrir accidentes durante su manipulacin.

Los laboratorios se clasifican como sigue: laboratorio bsico nivel de bioseguridad 1;

laboratorio bsico nivel de bioseguridad 2; laboratorio de contencin nivel de
bioseguridad 3, y laboratorio de contencin mxima nivel de bioseguridad 4. Las
designaciones del nivel de bioseguridad se basan en una combinacin de las
caractersticas de diseo, construccin, medios de contencin, equipo, prcticas y
procedimientos de operacin necesarios para trabajar con agentes patgenos de los
distintos grupos de riesgo. En el cuadro 2 se relacionan, no se equiparan, los grupos de
riesgo.

Los estudiantes y el personal del laboratorio, por lo tanto, est expuesto a una serie de
riesgos ocupacionales por agentes fsicos, qumicos y biolgicos, los cuales pueden
originar alteraciones en la salud, generalmente prevenibles si se aplican las normas de

1
bioseguridad, que incluyen el manejo correcto de material infeccioso, as como el uso de
elementos protectores, y el manejo adecuado de desechos biolgicos y reactivos
qumicos.

2.1 FACTOR DE RIESGO

Es una forma sistemtica y organizada de identificar, localizar y valorar los factores y / o
agentes de riesgo en el contexto laboral. El trmino Seguridad biolgica implica un
conjunto de medidas cientfico- organizativas y tcnicas para proteger al personal, la
comunidad y el medio ambiente. Los agentes de riesgo se clasifican en:

2.1.1 Factores de Riesgo Fsicos

2.1.2 Factores de Riesgo Qumicos
2.1.3 Factores de Riesgo Biolgicos

2.1.1 Factores y Agentes de RiesgoFISICOS: Este tipo de riesgo est determinado por una
variedad de agentes:
Mecnico: objeto en movimiento.
Trmico: altas o bajas temperaturas.
Elctrico: alto voltaje y conexiones elctricas.
Radiaciones: ionizantes y radioactivas.
Incendios.
Iluminacin.
Ruidos o vibraciones: por funcionamiento de equipos.
Microclima: condiciones de temperatura de instalacin.
Presiones anormales.

2.1.2 Factores y Agentes de Riesgo QUMICOS: Al manipular reactivos qumicos, es

necesario conocer y evaluar sus peligros y determinar la forma apropiada para su
manejo seguro. Esta informacin se obtiene de las etiquetas, hojas de seguridad
suministradas por el fabricante u otras fuentes. Las etiquetas del fabricante incluyen
el nombre del producto, el pictograma de seguridad, las frases de riesgo entre otras. El
etiquetado del puesto de trabajo se emplea cuando el producto es transferido a otro
contenedor diferente al original. All debe contener el nombre del producto, del
fabricante, frases de riesgo y consejos de prudencia. Las hojas de seguridad informan
sobre las propiedades fsicas, qumicas y toxicolgicas de una sustancia y los
procedimientos recomendados para una manipulacin segura, uso de equipos para
proteccin, primeros auxilios, tratamiento de desechos, derrames y otros. La
clasificacin de las sustancias qumicas depende de su peligrosidad, de lo cual se
establece que existen:
Txicas
Muy txicas
Corrosivas
Irritantes

2
 Inflamables
Extremadamente inflamables
Comburentes (en contacto con otras producen reaccin exotrmica)
Explosivas
Nocivas
Peligrosas para el medio ambiente
Gaseosos (gases, vapores, aerosoles), slidos (polvos orgnicos o inorgnicos,
humos metlicos), lquidos (roco, neblinas), compuestos (hidrocarburos).

2.1.3 Factores y Agentes de Riesgo BIOLGICOS: Los riegos biolgicos se pueden

identificar segn: el tipo de material biolgico que se manipula, el manejo de desechos
biolgicos, el aseo y desinfeccin de las reas de trabajo, la disponibilidad de
implementos de proteccin personal, los accidentes e incidentes ms comunes como
pinchazos, cortaduras e inhalaciones.

2.2 MANEJO DE RESIDUOS

En el laboratorio es de gran importancia el conocer el lugar adecuado donde cada uno
de los residuos deben ser eliminados. Tales residuos pueden ser slidos o lquidos.

2.2.1 Slidos: Cada laboratorio cuenta con canecas para la eliminacin de residuos
slidos:

Caneca con bolsas grises: material reciclable.

Disposicin final: reciclaje comercializacin
Empaque de plstico, bolsas de polietileno, vidrio no contaminado, cajas de
cartn, hojas de papel, peridico, botellas.

Caneca con bolsa verde: material comn, residuos biodegradables.

Disposicin final: relleno sanitario
Residuos de alimentos, servilletas, barrido, colillas, icopor, papel carbn, jeringa
sin agujas.

Caneca con bolsa roja: material infeccioso, residuos slidos altamente contaminantes
en contacto con residuos txicos.
Disposicin final: cremacin
Gasas, algodn, guantes de ltex y de caucho, material de curacin, medios de
cultivo y escobillones previa esterilizacin, frascos plsticos para recoleccin de
muestras, geles como matriz para electroforesis. GUARDIANES: empleados para
la eliminacin de agujas, cuchilla, lancetas, ampollas u otros elementos cortos
punzantes, nunca se eliminan all las jeringas.
Disposicin final: incineracin.

3
 NOTA:
Reactivos como acrilamida son compuestos neurotxicos que exigen el uso de mscaras y guantes
cuando se estn preparando los geles. Despus de polimerizados no tienen tanto riesgo. Los geles
en general se descartan en bolsas rojas.
Bromuro de etidio es txico, cancergeno y mutgeno; se debe inactivar antes de su eliminacin (ver
tabla 1)

2.2.2 Manejo de residuos lquidos

Las sustancias lquidas utilizadas en el laboratorio deben ser eliminadas de acuerdo al tipo
de sustancia. Algunas requieren ser almacenadas en contenedores para su posterior
inactivacin, otras deben ser tratadas para ser eliminadas (nitrato de plata) y otras
pueden ser eliminadas a travs del cao sin consecuencias ambientales. Las soluciones
para tincin deben ser cuidadosamente descartadas.
Los medios de cultivo slidos que fueron utilizados para crecimiento de microorganismos
deben ser esterilizados antes de ser descartados. As mismo aquellos que se utilizaron
para crecimiento de material vegetal an cuando no contengan hongos, levaduras o
bacterias no patgenos.

2.3 BIOSEGURIDAD
En el laboratorio se refiere al conjunto de medidas preventivas destinadas a mantener la
vigilancia para proteger la salud.

Los accidentes que ocurren durante el trabajo en el laboratorio generalmente se deben a

descuido, desconocimiento o por no atender las instrucciones establecidas, generando
riesgos que pueden afectar la integridad no solo de los estudiantes, sino del personal a
cargo.
En un laboratorio de Biologa celular y molecular o de investigacin las precauciones que
se deben adoptar son las siguientes:

2.3.1 Conocer las caractersticas de toxicidad de los reactivos y manejarlos de acuerdo a

recomendaciones de los insertos y/o la ficha tcnica respectiva. (ver tabla 1)

Es importante conocer la distribucin de las diferentes secciones del laboratorio,

para evitar posibles riesgos de contaminacin de las muestras que produzcan
alteraciones en los resultados finales.
Utilizar siempre implementos de proteccin limpios (guantes, careta, tapabocas,
blusa de laboratorio)
Lavarse las manos antes y despus de trabajar en el laboratorio
No tocar con las manos enguantadas ojos, nariz u otras mucosas expuestas.
Desinfectar el rea de trabajo antes y despus de cada trabajo utilizando
hipoclorito al 1% por 15 minutos, tambin se puede utilizar alcohol antisptico.
No pipetear ningn reactivo o solucin acuosa con la boca.
Los reactivos despus de su uso, deben quedar perfectamente cerrados.

4
 Los materiales de desecho deben descartarse de acuerdo a su naturaleza:
inactivados o tratados (ver tabla 1: reactivos y especificaciones en el laboratorio
molecular) en las bolsas de basura del color adecuado y canecas dispuestas para
tal fin.

2.4 TRMINOS A CONSIDERAR

2.4.1 Carcingeno: agente que se sabe o sospecha causa cncer.

2.4.2 Mutgeno: Agente que induce mutaciones en el material gentico

2.4.3 Txico: Sustancia que ocasiona dao a la salud, por exposicin corta o
prolongada, cuando es ingerida, inhalada o absorbida por la piel o mucosas.

2.4.4 Corrosivo: Agente qumico que destruye el tejido o los materiales por contacto
directo.

Tabla 1. Especificaciones de los reactivos ms usados en el laboratorio molecular

MEDIDAS DE DISPOSICIN DEL

REACTIVO USOS EFECTOS NOCIVOS
PREVENCIN DESECHO

Inactivacin con
Se deben utilizar
Mutagnico y carbn activado o
Colorante para guantes destinados
carcinognico amberita XAD- 16,
Bromuro de Etidio tincin de cidos solo para su uso,
moderadamente eliminacin de
nucleicos tapabocas y
Txico desechos slidos en
mascarilla
bolsa roja.

Extraccin de cidos Usar guantes,

nucleicos; mscara adecuada Se almacena en
Solventes orgnicos disolventes de Txicos para el manejo de frascos oscuros e
tinciones de estos, y cmara incinerar.
protenas extractora de gases

Inflamable y no
potable. Excesiva No ingerir y
inhalacin puede evitar.inhalacin de
Extraccin de cidos causar tos, cefalea, grandes cantidades Eliminarlo diluido en
Isopropanol
nucleicos mareos, depresin del vapor.100 ml agua
mental, nauseas, pueden ser fatales.
vmitos, narcosis, la
anestesia, coma.
Evitar el contacto con Eliminarlo diluido en
EDTA Inhibidor de DNAsas Irritante
piel y mucosas agua
Tincin de ADN con Se almacena en
Usar en cmara
Formaldehdo nitrato de plata Txico frascos oscuros e
extractora
incinerar.
Acrilamida y bis Electroforesis de Es un potente Se debe usar Polimerizar y eliminar
acrilamida protenas neurotxico, guantes, mascara, en la bolsa roja

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 absorbido tapabocas. Una vez
totalmente por la polimeriza, se
piel y sus efectos son considera no txica
acumulativos. la
poliacrilamida una
vez formada se
considera no txica
Extraccin de cidos Usar guantes,
nucleicos; mscara adecuada Se almacena en
Solventes orgnicos disolventes de Txicos para el manejo de frascos oscuros e
tinciones de estos, y cmara incinerar.
protenas extractora de gases

Si es inhalado o si
Se almacena en
entra en contacto
TRIZOL Extraccin de ARN Txico frascos oscuros e
con la piel, causa
incinerar.
quemaduras

Electroforesis Mantener lejos de

Se almacena en
Persulfato de (Catalizador en la otros reactivos
Oxidante frascos oscuros e
amonio polimerizacin de la inflamables. Evitar el
incinerar.
acrilamida) contacto con la piel

Existen algunas normas de precaucin universal que son necesarias tenerlas presentes en
el manejo del laboratorio.
Utilizar siempre elementos de barrera adecuados segn las necesidades: blusa,
guantes, mecheros, tapabocas, mascarillas, cmaras de seguridad, gafas, etc. para
evitar contacto de mucosas y piel con aerosoles, gotas y salpicaduras.
El lavado de manos es una de las estrategias ms sencillas pero de suma
importancia; este se debe hacer minuciosa y vigorosamente antes y despus de
tener contacto con sustancias o algn tipo de muestras.
En caso de contacto directo con la piel o los ojos deben enjuagarse
inmediatamente con abundante agua

3. USO DE MICROPIPETAS

3.1 DESCRIPCIN DEL EQUIPO

La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir

pequeos volmenes de lquidos y permitir su manejo en las distintas tcnicas
cientficas.Los volmenes captables por estos instrumentos varan segn el modelo: los
ms habituales son P20, P200 y P1000. P20 es til para volmenes de 0.5 hasta 20 L.
P200 es til para volmenes de 20 hasta 200 L. P1000 es til para volmenes de 200
hasta 1000 L

El uso de micropipetas permite emplear distintos lquidos sin tener que lavar el aparato:
para ello, se emplean puntas desechables, de plstico, que habitualmente son estriles.

6
Existen varios tipos de puntas acorde con los volmenes a medir. Generalmente para
P1000 las puntas son azules, para P200 son amarillas y para P20 pueden ser amarillas o
blancas (Tabla 1).

Las parte de una micropipeta pueden ser observadas en la Figura 1.

Tabla 1. Gua de color para el uso de micropipetas (Volmenes)

Volumen dispensado por la pipeta.

Color caracterstico utilizado para identificarla
Rango en microlitros l
0,1-2,5 l Negro
0,5-10 l Gris/Blanco
2,0-20 l Gris/Amarillo
10-100 l Amarillo
50-200 l Amarillo
100-1000 l Azul
500-2500 l Rojo

3.2 OPERACIN DEL EQUIPO

3.2.1 Tcnica de pipeteo para lquidos claros:

a. Presionar el botn superior suavemente hasta el primer tope.
b. Sumergir la punta en la solucin que se necesita pipetear estandoseguros que la punta
este bien colocada y que no haya ningn tipo deresiduos entre la punta y el cuerpo de la
pipeta.
c. Mantener la pipeta verticalmente mientras toma la solucin.
d. Descartar la solucin de la punta por presionar el botn hasta el segundotope.
e. Descartar las puntas utilizando el eyector que traen las pipetas.

3.2.2 Tcnica de pipeteo para lquidos con alta viscosidad:

a. Presionar el botn superior hasta el segundo tope.
b. Sumergir la punta en la solucin (2-3 mm) y soltar el botn despacio. Lapunta tiene
que estar bien llena.
c. Descartar el lquido de la punta presionando suavemente el botnsuperior hasta el
primer tope.

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 1. Botn pulsador

2. Tornillo del botn pulsador

3. Rueda dentada de
graduacin del volumen
.
4. Cono de la pipeta.

5. Expulsor de punta.

6. Punta descartable

Figura 1. Partes de una Micropipeta

3.3 CUIDADOS Y MANTENIMIENTO DEL EQUIPO

a. Iniciar el da limpiando la parte externa de las pipetas de polvo osuciedad.
b. Usar solamente etanol al 70% para la limpieza de la pipeta. Otro tipo desolvente no es
aconsejable.
c. Utilizar las puntas adecuadas a las pipetas y a la cantidad de solucin quese va a
medir.
d. No pipetear volmenes que sobrepasen la capacidad de la micropipeta.
e. Durante el uso y manejo las micropipetas deben permanecer en forma vertical. Una vez
terminado el uso de la micropipeta debe limpiarse el rea de acoplamiento con una
servilleta para evitar contaminacin.
f. El mantenimiento preventivo de la pipeta debe realizarse al menos dos veces al ao si
lapipeta es usada diariamente. Tal mantenimiento tiene que ser realizado por personal
especializado de mantenimiento.

4. MATERIALES Y REACTIVOS NECESARIOS

3 juegos de micropipetas P1000, P200 y P20
Agua desionizada
Glicerina o glicerol
Tapas de cajas de petri de plstico de 2 ml
Puntas para las micropipetas (blancas, amarillas y azules)

5. PROCEDIMIENTO
5.1 MANEJO DE LA MICROPIPETA
Colocar una punta nueva, ajustada a las especificaciones de la pipeta, en el porta-
puntas de la pipeta. Evitar contaminar la punta con otras sustancias. Verificar que
la misma queda bien ajustada.

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 Presionar el mbolo suavemente hasta el primer tope. Hasta este momento la
punta de la pipeta no debe estar sumergida en el lquido (Figura 2)

Figura 2. Fases del uso de la pipeta

Sumergir la punta de la pipeta en agua (depositada en caja de Petri o en

eppendorff) en posicin vertical. Este proceso corresponde al mostrado en la
posicin 1B (primera a la izquierda).
Liberar el mbolo de forma suave para que la pipeta absorba el agua (posicin 2A).
Verificar que el mbolo se desplace hasta la posicin del lmite superior. Esperar al
menos dos segundos, antes de retirar la punta de la pipeta del lquido.
Colocar la punta de la pipeta contra la pared del recipiente en el cual ser
dispensado el lquido. Verificar que el ngulo formado entre la punta de la pipeta y
la pared del elemento receptor est entre los 30 y los 45. Si el recipiente receptor
ya tiene algn nivel de lquido, evitar que la punta de la pipeta quede sumergida en
el mismo (posicin 3A).
Dispensar el contenido de la pipeta presionando el mbolo de forma suave pero
firme, hasta el primer tope (posicin 4B). Mantener en todo momento el contacto
entre la punta de la pipeta y la pared del recipiente receptor. Frotar la punta de la
pipeta contra la pared de 8 a 10 mm, para asegurar que no quede ninguna gota de
lquido pegado a la punta de la pipeta.
Presionar el mbolo suavemente hasta que alcance el segundo tope en la carrera
del pistn (posicin 5C). Esto expulsa cualquier fraccin de lquido que hubiera
podido quedar en la punta de la pipeta, al forzar el aire de la cmara a travs del
orificio de la punta de la pipeta. Mantener el mbolo presionado en el segundo
tope, mientras se retira la pipeta del recipiente receptor. Una vez retirada la
pipeta, liberar suavemente el mbolo hasta la posicin lmite superior.
Desechar la punta de la pipeta. Para esto accionar el botn del mecanismo de
expulsin (posicin 6).

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 Verifique el uso de cada micropipeta (diferentes volmenes) por medir los
volumenes mnimos y mximos de cada una de ellas. Estos volmenes aparecen en
la micropipeta. Realice esta verificacin usando agua destilada.
Realice todos los pasos anteriores usando glicerol en lugar de agua, tenga en
cuenta que este es un lquido viscoso por lo que debe considerar que el tiempo de
aspiracin para tomar las cantidades adecuadas ser ms extenso.

5.2 PREPARACIN DE SOLUCIONES

Para la ejecucin de los siguientes procedimientos asegrese de seleccionar la
micropipeta y las puntas adecuadas.

Prepare 1 ml de una solucin de etanol a concentracin final de 5%.

Prepare 1 ml de una solucin de etanol al 70%. Luego a partir de esta solucin
(etanol al 70%) prepare 1 ml de una solucin de etanol al 30%.
Prepare una 1 ml de solucin de azul de metileno a las siguientes concentraciones:
1%, 4% y 8%. Cada una de estas soluciones debe ser preparada en eppendorff
diferentes. Verifique la concentracin de acuerdo con el % de coloracin de la
misma.

5.3 DETERMINACIN DE CONCENTRACIONES

Realice los siguientes clculos usando concentraciones basadas en % v/v; % p/v y %p/p

Que cantidad de agarosa se debe adicionar para preparar una solucin al 0.3 % a
un volumen final de 500 ml
Se necesitan preparar 500 ml de buffer 2 x SSC a partir de una solucin 20 x SSC,
que cantidad de buffer 20 x SSC debe adicionar para preparar dicha solucin?
Se necesita preparar 450 ml de una solucin de EDTA a una concentracin de 8%
(%p/v), que cantidades de este soluto debe usar para obtenerla?
Que concentracin, expresada en %p/v presenta una solucin enzimtica a la que
previamente se le adicionaron 0.83 gramos de tripsina en 600 ml de agua?
Se desea suplementar 500 ml de medio MEM con suero fetal bovino al 25%. Que
cantidad de SFB debe adicionar, para obtener esta concentracin?
En la preparacin de medios para cultivo celular, se adicionan, para 1 lt de medio,
2 gramos de bicarbonato de sodio y 5.46 gramos de hepes. Si se desean preparar
5.5 lts de medio que cantidades de estas sales debe adicionar?
Determinar las concentraciones expresadas en %p/v de las siguientes soluciones:
o 38.5 gramos de NaCl en 500 ml de agua
o 4.5 gramos de KCl en 0,75 lts de agua
o 358 gramos de bicarbonato de sodio en 2670 ml de agua

Cuntos gramos de NaNO3 son necesarios para preparar 450 ml de una solucin al
7% p/v?

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 Se disuelven 45g de NaNO3 en 300 ml de agua, Cul es la concentracin en %p/v?
Cul es la cantidad de AgNO3 necesarios para preparar 30mL de solucin al 3%
p/v?

6. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

6.1 Consultar acerca de las sustancias ms utilizadas como descontaminantes a nivel de un

laboratorio de Biologa Molecular.

6.2 Investigar el tipo de Agua que se utiliza en el laboratorio de Biologa Molecular y como
es su tratamiento (obtencin).

6.3 Consultar sobre el tipo o clasificacin de laboratorios y cabinas de flujo laminar de

acuerdo a la normas de bioseguridad.

6.4 Consulte y construya un cuadro con la simbologa utilizada en Bioseguridad. Utilice

colores.

6.5 Indique a que procedimientos debe ser sometida una micropipeta que se utiliza
diariamente para garantizar su correcto funcionamiento.

6.6 Investigue uso, funciones y mantenimiento de los siguientes equipos:

Pipetas automticas
Tubos para centrfuga
Centrfuga
Micro-centrfuga
Balanza analtica
Transiluminador de U.V.
Cmaras de flujo laminar
Cmaras de extraccin

7. BIBLIOGRAFA

Blues, J., Bayliss, D., Buckley, M., The calibration and use of piston pipettes,
National Physi- cal Laboratory, Teddington, Middlesex, UK, 2004. (www.npl.co.uk)
Digital pipette, Guide to Justor 100 series pipettes, Nichiryo Co., LTD. Maintenance
and Service Manual for Genex Mechanical Pipettes, Rev. 2/121199.
Mantenimiento y reparacin del equipo de laboratorio, diagnstico por imagen y
hospital, Ginebra, Organizacin Mundial de la Salud, 1996, 52-55.
Manual de instrucciones, Eppendorf Serie 2000.
(http://www.brinkmann.com/pdf/bs-manuals/ReferenceSeries2000.pdf)

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 Standard Operating Procedure for Pipettes, BrinkmannTM/Eppendorf SOP. 5101-
201C, Brinkmann Instruments Inc, 2001. (http://www.brinkmann.com/pdf/5101-
C201.pdf)
The Finnpipette, Instructions for Use, Labsystems, Helsinki, Finland.
Universal Medical Device Nomenclature SystemTM (UMDNS), Product Categories
Thesaurus, ECRI, 5200 Butler Pike, Plymouth Meeting, PA, USA, 2000.

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