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Jorge Yez S
La fase estacionaria requiere materiales estables que no reaccionen con la fase mvil o
que no sufra un deterioro por el paso o condiciones qumicas de sta.
Para cumplir estas caractersticas se usan materiales relativamente inertes como fase
estacionaria.
- fase ligada
a) Soporte mecnico de llamado relleno
- Soportes ms frecuentes:
Gel de slice o slica g el (SiO2 n H2O)
Almica (Al2O3 n H2O)
Celulosa
Poliestireno con grupos funcionales
- Gel de slice o slica gel (SiO2 n H2O)
Partculas Porosas
Partculas Peliculares
Mallas monoltica:
Partculas porosas regulares e irregulares y no porosas o peliculares.
- Almica (Al2O3 n H2O)
- Los grupos funcionales hidroxilos (OH-) sirven para establecer uniones dbiles del tipo
dopolo-dipolo, puentes hidrgeno y uniones tipo con los solutos y de esta forma se
produce la adsorcin de molculas sobre la fase estacionaria.
- Celulosa
Se usa como soporte pero es menos frecuente por su menor estabilidad a condiciones
drsticas.
- En este caso el relleno acta como soporte fsico de la fase lquida que est ligada.
- Esta fase ligada es en escencia la verdadera fase estacionaria que interacciona fsica y
qumicamente con los solutos.
- La fase ligada son grupos qumicos determinados que pueden unirse qumicamente al
soporte segn la ecuacin general:
Ejemplo:
CH3 CH3
-HCl
Si-OH + Cl - Si - R ------------- Si - O - Si - R
CH3 CH3
soporte fase ligada Fase estacionaria ligada
Las fases ligadas se dividen por su grado de polaridad en:
- Polares
- Poco Polares
- Apolares
- HPLC en fase reversa o cromatografa en fase reversa (abreviado como RP-HPLC, del
ingls Reverse Phase HPLC).
- ser de alta pureza, ya que generalmente las impurezas daan o inactivar sitios activos
de la fase estacionaria
- estar libre de gases para no producir volumen muerto por aparicin de burbujas en el
sistema,
- polaridad
- pH
- temperatura
- fuerza inica
- propiedades pticas que puedan afectar la
deteccin de los solutos
Fases Mviles ms usadas:
Solvente (para la almina) Solvente (para la almina)
Fluoroalcanos -0.25 diclorometano 0.42
n-pentano 0.00 tetrahidrofurano 0.45
i-octano 0.01 1,2-dicloroetano 0.49
n-heptano 0.01 2-butanona 0.51
n-decano 0.04 acetona 0.56
ciclohexano 0.04 dioxano 0.56
ciclopentano 0.05 acetato de etilo 0.58
disulfuro de carbono 0.15 acetato de metilo 0.60
tetracloruro de carbono 0.18 1-pentanol 0.61
1-cloropentano 0.26 dimetilsulfxido 0.62
eter isopropilico 0.28 anilina 0.62
cloruro de isopropilo 0.29 nitrometano 0.64
tolueno 0.29 acetonitrilo 0.65
1-cloropropano 0.30 piridina 0.71
clorobenceno 0.30 2-propanol 0.82
benceno 0.32 etanol 0.88
bromoetano 0.37 metanol 0.95
eter dietilico 0.38 1,2-etanodiol 1.11
cloroformo 0.40 acido acetico Largo
1. Mezclas de solventes en F.M.
- Los solventes son usados generalmente en mezcla para conseguir as una fase mvil de
polaridad definida.
Por ejemplo:
Fase mvil constituida por metanol y agua, la polaridad de esta mezcla
aumenta a medida que se incrementa la proporcin de agua y vice versa.
Si para la elucin de los compuestos separados en una columna o en capa fina se usa un
solo solvente como fase mvil durante toda la elucin.
- Elucin en gradiente
La elucin con gradiente puede ser dinaria (dos solventes), terciaria (tres solventes) y
cuaternaria (cuatro solventes).
- peso molecular
- la solubilidad
- carga inica
- acidez
Con estos datos se debe tambin seleccionar la fase mvil y la fase estacionaria a
utilizar.
peso molecular < 1000
Cromatograf a en fase reversa Cromatograf a en fase normal Cromatograf a en fase normal Cromatograf a de intercambio i nico
0
Cromatograf a en fase reversa
fase ligada: C1 - C18 fase ligada: s lice, ciano, amino, diol fase ligada: ciano, amino, diol
peso molecular > 1000
Cromatograf a en fase reversa Cromatograf a de exclusi n molecular Tama o molecular Tama o molecular Cromatograf a de intercambio i nico
menor a 30 nm menor a 30 - 400 nm
UV-VIS
Sistema de Columnas
vlvula
Conductividad
Fluorescencia
Flowrate: 2 mL/min
Bomba HPLC
(isocrtica)
20 cm
EJEMPLOS DE SEPARACIONES UTILIZANDO HPLC
Mientras ms larga la cadena carbonada del alcano, mayor tiempo permanecer ste en la
fase estacionaria apolar (C18, octadecilo) y su tiempo de retencin ser mayor.
2.- Separacin de fenilalcanos mediante cromatografa de reparto
Las proteinas pueden ser separadas en base a su tamao mediante una fase estacionaria
que posee retculos de tamao determinado en donde son incluidas las proteinas durante
su paso por la columna.
Condiciones de la separacin
Los cationes pueden ser separados en base a su carga y tamao mediante una fase
estacionaria que posee grupos aninicos en los cuales se produce la interaccin de cargas.
A continuacin se presenta la separacin de cationes Li+, Na+, NH4+, K+, Mg++, Sr++, Ba++
en una muestra sinttica.
Condiciones de la separacin
Cromatogramas: