Histologia 1

Universidad Nacional Autnoma de Mxico
Facultad de Estudios Superiores Iztacala

Dr. Jos Narro Robles
RECTOR
Dra. Patricia D. Dvila Aranda

DIRECTORA
Dr. Ignacio Pealosa Castro

SECRETARIO GENERAL ACADMICO
CD Rubn Muiz Arzate

SECRETARIO DE DESARROLLO Y RELACIONES INSTITUCIONALES
Dr. Raymundo Montoya Ayala

SECRETARIO DE PLANEACIN Y CUERPOS COLEGIADOS
CP Reina Isabel Ferrer Trujillo

SECRETARIA ADMINISTRATIVA
Dr. Juan Manuel Mancilla Daz

DIVISIN DE INVESTIGACIN Y POSGRADO
MC Jos Jaime vila Valdivieso

COORDINADOR EDITORIAL
Universidad Nacional Autnoma de Mxico
Divisin de Investigacin y Posgrado
Silvia Leticia Verdn Tern

Leticia Moreno Fierros
COORDINADORAS
AUTORES
Norma Rebeca Rojo Botello
Ana Lilia Garca Hernndez
Maritza Omaa Molina
Alfredo Meneses Aguirre
scar de Jess Nieto Ynez
Responsable de la edicin
FES Iztacala, UNAM
2013
Primera edicin: 6 de junio de 2013
D.R. 2013 Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Ciudad Universitaria, Delegacin Coyoacn,
CP 04510, Mxico, Distrito Federal.

Av. de los Barrios N.o 1, Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla,
CP 54090, Estado de Mxico, Mxico.
ISBN 978-607-02-3885-7
Prohibida la reproduccin total o parcial por cualquier
medio sin la autorizacin escrita del titular de los dere-
chos patrimoniales.
APOYO TCNICO
CUIDADO DE LA EDICIN Y CORRECCIN DE ESTILO
MC Laura Susana Ruiz Luna

CORRECCIN DE ESTILO
PLH Jorge Arturo vila Gmora

APARATO CRTICO
DG Jos Alfredo Hidalgo Escobedo

DISEO EDITORIAL, DIAGRAMACIN, FORMACIN
Y DISEO DE PORTADA
DG Elih Gamboa Mijangos

FORMACIN EDITORIAL
Libro financiado por el Programa de Apoyo a Proyectos

para la Innovacin y Mejoramiento de la Enseanza
(PAPIME) de la Direccin General de Asuntos del
Personal Acdemico (DGAPA), Apoyo a la Investigacn
Biomdica, PE 203607
Impreso y hecho en Mxico

Autores

Biloga y Maestra en Biologa de la Reproduccin graduada por la FES I y Doctora
en Ciencias Biolgicas de la UNAM. Toda su trayectoria acadmica ha sido reali-
zada en la FESI. Se ha especializado en desarrollar la tcnica histolgica y ha sido
autor y coautor de varias publicaciones. Imparte como Profesor Titular el Mdulo de
Biologa del Desarrollo y Cursos de Actualizacin para Profesores de la Carrera
de Biologa y Medicina en Tcnicas Histolgicas. Jurado de exmenes profesionales
para Licenciatura y Maestra. Asesor en grupos especiales de profesores de la carrera
de Medicina, a alumnos y tesistas de las carreras de Biologa, Odontologa, Medici-
na y Maestra en Tcnicas Histolgicas de Rutina, Histoqumicas, Inmunohisto-
qumicas y de Fluorescencia para microscopia Confocal.

Es profesora titular cde la FES Iztacala UNAM ydel laboratorio de Inmunidad en
Mucosas de laUnidad de Investigacin en Biomedicina, fue coordinadora de dicha
unidad. Es investigadora nacional SNI nivel 2, PRIDE nivel D. Es Biloga de la FESI,
Maestra y Doctora en Ciencias del CINVESTAV IPN.Fue investigador invitado del
CINVESTAV, ha dirigido y graduado a 8 doctores en ciencias, 7 maestros y 14 bilo-
gos, ha publicado 60 artculos, (56 en Revistas arbitradas internacionales indexadas).
Ha recibido varias distinciones: Mrito Acadmico 1999, la Presea Municipal de
la Mujer 2002, el Premio Estatal 2008 de Ciencia y Tecnologa en Salud y el Recono-
cimiento Sor Juana Ins de la Cruz 2009.
Norma Rebeca Rojo Botello

Es Cirujano Dentista de profesin y Doctora en Odontologa por la UNAM, diplo-
mada en Docencia de la Odontologa en el rea de periodoncia, Administracin M-
dica y Medicina Basada en Evidencias. Profesor de carrera FESI y de especialidad. Ha
publicado 3 Artculos como autor, 3 como coautor en revista de circulacin nacional
indexada y 2 en revista Internacional Indexada con factor de impacto 2.128 y 4.843
respectivamente, un capitulo de libro Capitulo 1, de la obra. Caries Dental. Enero del
2011. En edicin. Ha recibido varios reconocimientos: Ganadora de -XII Premio Na-
cional de Investigacin de la Fundacin Glaxo Smith Kline (segundo lugar), -Liste-
rine Becas 2007 (segundo lugar) Ganadora de 2 Medallas de plata Gabino Barreda y
una Alfonso Caso y Mencin honorifica.
Ana Lilia Garca Hernndez

Odontloga egresada de la FESI, graduada con Mencin Honorfica en el 2006. Obtuvo
tambin con Mencin Honorfica los grados de Maestra en el 2008 y de Doctora en
Ciencias Odontolgicas en Biologa Bucal de la UNAM en el 2011. Ha participado
en diversas investigaciones que han recibido premios nacionales y de las que ha pu-
blicado 3 artculos en revistas nacionales, 1 capitulo de libro y 6 artculos en revistas
internacionales indexadas y con factor de impacto. Actualmente labora como Tc-
nico Acadmico de Tiempo Completo , en el laboratorio 9 de Inmunidad en Muco-
sas de la UBIMED, de la Divisin de Posgrado e Investigacin de la Facultad de Es-
tudios Superiores Iztacala.
Maritza Omaa Molina

Es profesora de la carrera de medicina, realiz sus estudios de Licenciatura en la
carrera de Biologa de la FESI con el mximo promedio de su generacin motivo por
el cual recibi la Medalla Gabino Barreda y el reconocimiento como unos de los Me-
jores Estudiantes de Mxico (1980). Se le otorg mencin Honorfica en Licenciatura
y Maestra, se Doctor en el CINVESTAV. Ha publicado 2 artculos Nacionales, 15
Internacionales, 7 publicaciones cortas, 12 resmenes de trabajos publicados en re-
vistas indexadas, 4 Captulos de libro, ha participado en foros nacionales e interna-
cionales. Pertenece al Sistema Nacional de Investigadores Nivel I.
Alfredo Meneses Aguirre

Bilogo egresado de la UNAM FES Iztacala realiz tesis y Servicio Social en el labo-
ratorio de inmunidad en Mucosas de la Unidad de Biomedicina bajo la direccin de
la Dra. Moreno Fierros. Desarroll un modelo de alergia pulmonar murina. Actual-
mentre trabaja en la industria privada.
scar de Jess Nieto Yez

Bilogo egresado de la FES Iztacala, estudiante de maestra de la Escuela Superior de
Medicina del IPN, particip en la elaboracin del manual como becario del proyecto
PAPIME Apoyo a la Investigacin Biomdica PE203607,proyecto que apoy la elabora-
cin del presente manual cuya responsable fue la Dra. Moreno Fierros
ndice
ndice de figuras I
ndice de cuadros III
Smbolos, frmulas y abreviaturas V
Prefacio VII
Primera parte 1
Tcnica histolgica 3
1. Obtencin de la muestra 4
2. Fijacin 5
2.1. Tipos de fijadores qumicos 7
3. Inclusin 13
3.1. Deshidratacin 13
3.2. Inclusin en parafina 17
3.3. Conservacin de muestras 20
4. Cortes histolgicos 20
4.1. Soluciones adhesivas para pegar muestras 22
5. Tincin histolgica 23
5.1. Tipos de tincin histolgica 24
5.2. Colorantes 25
5.3. Tincin de cortes en parafina 27
5.4. Restauracin de la cromofilia 27
6. Montaje 27
Segunda parte 29
Tinciones histolgicas y tcnicas inmunohistoqumicas 31
7. Protocolos de tincin histolgica 31
7.1. Tincin de hematoxilina-eosina (H-E) 31
7.2. Mtodo de Pinkus orcena-giemsa 35
7.3. Tcnica para tincin de protena bsica mayor de eosinfilos 37
7.4. Tincin de mastocitos con azul de toluidina 39
7.5. Mtodo de aldehdo fucsina para clulas beta pancreticas 40
7.6. Tincin de cartlago y hueso en roedor fetal y neonatal 42
7.7. Histoqumica de los hidratos de carbono 43
7.7.1. Tcnica del PAS (cido peridico Schiff) 43
7.7.2. Tcnica del Azul Alcin 47
7.7.3. Tcnica del Azul Alcin-PAS 47
8. Tcnicas inmunohistoqumicas 49
8.1. Pasos para una correcta inmunohistoqumica 50
9. Protocolos inmunohistoqumicos con peroxidasa 57
9.1. Tcnica inmunohistoqumica con peroxidasa
en tejidos fijados con paraformaldehdo 59
9.2. Contratincin con Hematoxilina de Weigert
para IHQ 60
9.3. Tcnica para IHQ con peroxidasa en tejidos fijados
con sales de zinc 61
9.4. Tcnica para inmunohistoqumica con anticuerpos
biotinilados de muestras fijadas con sales de zinc 62
9.5. Tcnica para inmunohistoqumica con anticuerpos
biotinilados en frotis celulares 63
9.6. Tcnica para inmunohistoqumica con fijacin
en sales de zinc con anticuerpo primario sin marca
y segundo anticuerpo peroxidado 64
9.7. Tcnica para inmunohistoqumica en tejidos fijados
con paraformaldehdo con primer anticuerpo sin marca
y segundo anticuerpo peroxidado 65
10. Inmunohistoqumica con fluorescencia 66
10.1 Fundamentos 66
10.2 Preparacin del tejido para inmunofluorescencia 68
10.3 Microscopios de fluorescencia 68
11 Protocolos para inmunofluorescencia 69
11.1. Tcnica para inmunofluorescencia
en tejidos fijados con paraformaldehdo 70
11.2. Tcnica para inmunofluorescencia en
tejidos fijados con sales de zinc 71
11.3. Tcnica para inmunofluorescencia
en tejidos fijados con sales de zinc con recuperacin antignica 71
11.4. Tcnica para inmunohistoqumica con tejidos fijados
con sales de zinc para anticuerpos sin marca
y segundo anticuerpo-fluorocromado 73
11.5. Tcnica para inmunofluorescencia con anticuerpos
biotinilados de muestras fijadas con sales de zinc 74
11.6. Tcnica para inmunofluorescencia en tejidos congelados 74
11.7. Inmunofluorescencia para deteccin
de proliferacin celular con BrdU 76
11.8. Inmunofluorescencia y procesamiento histolgico
de tejidos vegetales 78
Anexo 1. Descalcificacin 81
Anexo 2. Soluciones limpiadoras y desmanchadoras de vidrio 83
Referencias 85
ndice de figuras
Figura 3.1. Tratamientos previos de las muestras antes de su inclusin 18

en parafina
Figura 3.2. Inclusin de muestra en bloques de parafina 19
Figura 4.1. Cortes en microtomo de tejido incluido en parafina 21
Figura 7.1. Tincin hematoxilina-eosina (H-E) 32
Figura 7.2. Tincin de orcena-giemsa 35
Figura 7.3. Tincin de protena bsica mayor 39
Figura 9.1. Tincin con azul alcian e inmunohistoqumica con peroxidasa 59
Figura 11.1. Obtencin de cortes de tejido congelado con un criostato 74
Figura 11.2. Fijacin de tejido vegetal 77
Figura 11.3. Inmunofluorescencia en tejido vegetal 78
ndice de cuadros
Cuadro 1.1. Mtodos de obtencin de muestra 5

Cuadro 2.1. Tipos de fijadores qumicos 8
Cuadro 2.2. Tipos de fijacin qumica 8
Cuadro 2.3. Fijadores ms usados en inmunohistologa 9
Cuadro 3.1. Proceso de deshidratacin 14
Cuadro 3.2. Procedimiento de deshidratacin e inclusin 20
Cuadro 4.1. Soluciones adhesivas para pegar muestras 22
Cuadro 5.1. Tipos de tincin histolgica 24
Cuadro 5.2. Tipos de colorantes 26
Cuadro 7.1. Tincin de hematoxilina-eosina (H-E) 33
Cuadro 7.2. Mtodo de Pinkus orcena-giemsa 36
Cuadro 7.3. Tincin de protena bsica mayor de eosinfilos 38
Cuadro 7.4. Tincin de mastocitos con azul de toluidina 39
Cuadro 7.5. Mtodo de aldehdo fucsina 41
Cuadro 7.6. Tincin de cartlago y hueso en roedor fetal y neonatal 43
Cuadro 7.7. Tcnica del PAS 44
Cuadro 7.8. Tcnica Azul Alcin 47
Cuadro 7.9. Tcnica de Azul Alcin-PAS 48
Cuadro 8.1. Pasos para una correcta inmunohistoqumica 51
Cuadro 9.1. Tcnica IHQ con peroxidasa en tejidos fijados con 58
paraformaldehdo
Cuadro 9.2. Contratincin con Hematoxilina de Weigert para IHQ 59
Cuadro 9.3. Tcnica para IHQ con peroxidasa en tejidos fijados con sales 60
de zinc
Cuadro 9.4. Tcnica para inmunohistoqumica con anticuerpos 61
biotinilados
Cuadro 9.5. Tcnica para inmunohistoqumica con anticuerpos 62
biotinilados en frotis celulares
Cuadro 9.6. Tcnica para inmunohistoqumica con fijacin en sales de 63
zinc con anticuerpo primario sin marca y segundo anticuerpo peroxidado
Cuadro 9.7. Tcnica para inmunohistoqumica en tejidos fijados con pa- 64
ra formaldehdo con primer anticuerpo sin marca y segundo anticuerpo
peroxidado
Cuadro 11.1. Tcnica para inmunofluorescencia en tejidos fijados con pa- 69
raformaldehdo
Cuadro 11.2. Tcnica para inmunofluorescencia en tejidos fijados con sales 70
de zinc
Cuadro 11.3. Tcnica para inmunofluorescencia en tejidos fijados con sa- 71
les de zinc con recuperacin antignica
Cuadro 11.4. Tcnica para inmunohistoqumica fijacin con sales de zinc 72
para anticuerpos sin marca y segundo anticuerpo-fluorocromado
Cuadro 11.5. Tcnica para inmunofluorescencia con anticuerpos biotini- 73
lados de muestras fijadas con sales de zinc
Cuadro 11.6. Tcnica para inmunofluorescencia en tejidos congelados 75
Cuadro 11.7. Inmunofluorescencia para deteccin de proliferacin celular 76
con BrdU
Cuadro 11.8. Inmunofluorescencia y procesamiento histolgico de tejidos 79
vegetales
Cuadro A.1. Proceso de descalcificacin 82
Cuadro A.2. Soluciones limpiadoras para material de vidrio 83
Cuadro A.3. Soluciones para remover colorantes del vidrio 83
IV Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

Smbolos, frmulas
y abreviaturas
C grados centgrados H2O2 perxido de hidrgeno

g/mL microgramos por mililitro (agua oxigenada)
ADN cido desoxirribonucleico HCl 1 N cido clorhdrico 1 Normal
AEC amino etilcarbazol HCl cido clorhdrico
agua c agua corriente H-E hematoxilina-eosina
agua d agua destilada HRP peroxidasa de rbano
ARN cido ribonucleico (horseradish peroxidase)
BrdU bromodeoxiuridina h hora(s)
BSA albmina srica de bovino IC ndice de color
Cat. catlogo IHQ inmunohistoqumica
CD antgenos de diferenciacin KCl cloruro de potasio
cm centmetro kDa kilodaltones
CN cloronaftol KH2PO4 fosfato de potasio
DAB diaminobencidina monobsico
DMSO dimetilsulfxido KOH hidrxido de potasio
EDTA sal disdica del cido m micrmetro
etilendinitrilo (tetractico) M molar
FITC isotiocinato de fluorescena min minutos
g gramos mL mililitro
H2O agua mm milmetro
H2O dest. agua destilada Na2HPO4 fosfato de sodio dibsico
NaN3 azida de sodio pH potencial de hidrgeno
NaH2PO4 fosfato de sodio monobsico PM peso molecular
NaOH hidrxido de sodio pr paso rpido
nm nanmetros sol. solucin
OH alcohol TA temperatura ambiente
p/L por litro TRITC tetrametilrodamine
PBS amortiguador de fosfatos UV rayos ultravioleta
salino Xilol-alcohol abs.
PBS-Tr amortiguador de fosfatos Xilol-alcohol absoluto
salino-con tritn ZSF fijador de sales de zinc
PE ficoeritrina (phycoeritrin)
PerCp peridinin-chlorophyll-
protein complex
VI Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

Prefacio
E
l presente Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohisto-
qumicos pretende ser una herramienta prctica para apoyar
las actividades de investigacin de alumnos y profesores del
rea biomdica en las que se requiera realizar tcnicas his-
tolgicas e inmunohistoqumicas de rutina. Consta de dos partes: la
primera describe las generalidades de la tcnica histolgica, la cual
consiste en una serie secuencial de procedimientos para lograr que las
muestras puedan observarse al microscopio; en la segunda se describen
los procedimientos de diversos protocolos estandarizados de tinciones
histolgicas y tcnicas inmunohistoqumicas.
Como material adicional de apoyo didctico se incluye un disco com-
pacto que contiene dos presentaciones Power Point, en la primera, mediante
imgenes fotogrficas se muestra cmo se realizan algunos de los pro-
cedimientos para procesar tejido para realizar deteccin de antgenos
por inmunofluorescencia y se da especial nfasis al uso de la fijacin
con sales de zinc, debido a que este procedimiento ofrece importantes
ventajas: la inmunodeteccin que se realiza en cortes de tejido incluido
en parafina es ms fcil de realizar que en los congelados, porque se
obtienen cortes ms delgados de mejor calidad; se pueden utilizar anti-
cuerpos que habitualmente no reaccionan en cortes en parafina; el ahorro
de anticuerpos es significativo, pues se utilizan de 10 o hasta 100 veces
ms diluidos de los que se ocupan en la inmunohistoqumica en teji-
dos fijados con formaldehdo incluidos en parafina.
En la segunda presentacin se describen protocolos para deteccin
de algunos antgenos en tejidos murinos. Esta seccin pretende apoyar al
lector a adaptar sus condiciones experimentales identificando ms clara-
mente cmo realizar las inmunohistoqumicas guindose en protocolos
concretos estandarizados. Esta presentacin se refiere a la segunda parte
del Manual y en ella se muestran imgenes tpicas de la coloracin es-
perada de las tinciones histolgicas descritas, para apoyar al lector sobre
los resultados esperados.
VIII Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

Primera parte
Tcnica histolgica
Tcnica histolgica
L
os mtodos para la obtencin de muestras de tejido utilizadas
en los estudios de microscopa ptica se engloban en la tcnica
histolgica, que abarca una serie secuencial de pasos a travs de
los cuales una muestra de tejido llega a transformarse en delgados
cortes coloreados que pueden ser observados al microscopio. En trmi-
nos generales puede decirse que el proceso histolgico pretende dar
soporte o endurecer lo suficiente las muestras para permitir la obtencin
de cortes delgados, para lo cual se recurre a la utilizacin de medios de
inclusin. Cuanto ms se endurezca la pieza y el medio de soporte, ms
delgados podrn realizarse los cortes. En funcin del tipo de corte que se
requiera utilizaremos un tipo de microtomo.
Los pasos de la tcnica histolgica son seis:
Obtencin de la muestra. Proveer el material para su estudio
al microscopio
Fijacin. Preservar el material
Inclusin. Embeber el material en un medio fcil de cortar
Corte. Lograr lminas muy delgadas que sean atravesadas por
la luz
Tincin. Visualizar los tejidos, identificar molculas en ellos
(histoqumica)
Montaje. Preservar el corte, mantenindolo aislado del aire y
deshidratado.
1. Obtencin de la muestra
Para empezar con la tcnica histolgica se debe obtener una muestra de

tejido a estudiar, por frotis, aspiracin o lavado, puncin aspiracin con
aguja fina, impronta, biopsia, puncin con trcar, o autopsia (Cuadro 1.1).
El instrumental con el cual se seccionen los tejidos debe estar muy
afilado para evitar deformar sus elementos; asimismo, se debe evitar cual-
quier otro tipo de maltrato en su manipulacin. Cualesquiera que sea
el procedimiento empleado para la obtencin, el material que resulte del
mismo debe ser inmediatamente fijado o congelado para evitar procesos
de autodestruccin de las clulas, conocidos como autolisis.
Es importante el manejo integral de la muestra: desde el tejido
seleccionado, el frasco, el tipo de fijador, el transporte y el tiempo de fija-
cin. Adems, un requisito sustancial para la inmunohistoqumica es
la preservacin de la morfologa y antigenicidad del tejido.
Toda muestra debe estar identificada desde el principio y los recipien-
tes que la contengan deben estar convenientemente etiquetados con una
referencia adecuada. Es recomendable el uso de pequeas etiquetas de
papel marcadas con lpiz dentro del frasco, ya que los alcoholes borran y
despegan las que se colocan en el exterior.
En general, todos los pasos en la tcnica histolgica son importan-
tes, desde la seleccin del tamao y zona de la muestra, la eleccin y tiem-
po de la fijacin, la deshidratacin que involucra la inmersin en el medio
de inclusin, el corte con el microtomo, la tincin y el montaje final.
Un error en cualquier paso del proceso produce resultados equvocos, por
lo que es muy importante la planificacin en el manejo de las muestras.
4 Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

Mtodos de obtencin de muestra (Cuadro 1.1).
Cuadro 1.1. Mtodos de obtencin de muestra.

Biopsia. Consiste en la extraccin Biopsia incisional Se realiza seccionando con instru-
de pequeos fragmentos de tejido mentos cortantes como el bistur.
de un organismo vivo.
Biopsia por punch Se lleva a cabo con el punch, que
es un instrumento filoso con forma
de sacabocados.
Biopsia por puncin Se elabora con agujas de biopsia
y, recientemente, tambin
con agujas del tipo intramuscular
(microbiopsia).
Biopsia endoscpica Se hace a travs de endoscopios,
instrumentos
flexibles que permiten la observa-
cin de algunas cavidades
internas del organismo.
Reseccin quirrgica. Consiste en
la extirpacin de rganos com-
pletos o de grandes partes de los
mismos a travs de un procedi-
miento quirrgico.
Autopsia o necropsia. Es el
examen de los rganos luego de
la muerte, generalmente con el
objetivo de determinar las causas
de la misma.
2. Fijacin
La fijacin es el proceso de preservacin (lo ms cercano a su estado origi-

nal en vivo) estructural y qumica de las clulas y materiales extracelula-
res; es decir, sin ser desplazadas en el espacio, las protenas estructurales y
los otros constituyentes del tejido deben volverse insolubles a los reactivos
a los que posteriormente sern expuestos.
La interaccin del fijador con los componentes moleculares de los te-
jidos para su ulterior procesamiento histolgico y estudio microscpico
mantiene estables las estructuras al estimular la formacin de enlaces cru-
zados entre las protenas y, al respecto, son las molculas grandes, par-
ticularmente aquellas que forman complejos con otras de gran tamao
para producir compuestos macromoleculares, las que mejor se conser-
van; por el contrario, las protenas y cidos nucleicos pequeos, como
primera parte Tcnica histolgica

5
el ARN de transferencia, se pierden durante la preparacin de la muestra;
no obstante, tambin puede pasar esto con molculas grandes como el
glucgeno, los proteinglicanos y los glucosaminoglicanos, as como con
lpidos neutros (Kiernan, 1990; Luna, 1968; Miller, 1996). Cabe destacar
adems que al preparar muestras para su inclusin en parafina tambin se
pierden molculas pequeas solubles o iones.
Se llama fijadores a las sustancias qumicas o a los agentes fsicos que
se utilizan para tal fin.
Cualidades de un buen fijador:
Actuar con rapidez, matando y fijando las clulas antes de que
aparezcan los fenmenos post mortem (autolisis, desintegracin)
Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta
hasta en las capas profundas de la pieza a fijar
Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presen-
taban in vivo
Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios
para su observacin ulterior (ejecucin de cortes, coloracin)
Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fija-
cin o despus de ella
No provocar o impedir la produccin de estructuras artificiales
No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o
quebradizos.
Mtodos fsicos. Los principales agentes fsicos utilizados para fijar

material biolgico son el calor y la congelacin: El calor es el ms sim-
ple de los mtodos; produce coagulacin de las protenas y licuefaccin
de los lpidos. Es utilizado en microbiologa pues se conservan muy
bien las bacterias. Este mtodo tambin se combina con el mtodo qumi-
co sobre todo porque acelera el entrecruzamiento de protenas. El material
biolgico tambin se puede procesar por congelacin, esto debe realizarse
de tal manera que se evite la formacin de cristales de hielo, pues daan al
tejido. El tamao de la muestra y la utilizacin de un crio-preservador son
importantes (el que mejor funciona es el dimetilsulfxido, DMSO, al 10%).
Este mtodo de fijacin es el de eleccin para hacer cortes al criostato.
Mtodos qumicos. La mayor parte de los fijadores qumicos son l-
quidos que afectan fsica (endurecimiento y contraccin de la muestra)

y qumicamente un tejido, su rango de penetracin es muy importante
pues es el que determina el tiempo y tamao mximo de la muestra.
2.1. Tipos de fijadores qumicos
Los fijadores qumicos se dividen en dos grandes grupos:

1. Coagulantes: son soluciones que pueden coagular protenas, trans-
formndolas en estructuras insolubles. Debido a que la arquitec-
tura del tejido se mantiene fundamentalmente por lipoprotenas
(uno de los principales componentes de membranas plasmti-
cas), por protenas fibrosas (colgeno) y globulares (nucleopro-
tenas), la coagulacin de estas protenas mantiene la morfologa
del tejido a nivel de microscopa de luz, si bien la fijacin por
coagulacin produce floculacin citoplasmtica, como as tam-
bin preservacin pobre de mitocondrias y grnulos de secrecin.
Aunque algunos de los fijadores que causan coagulacin de las
protenas citoplasmticas destruyen o distorsionan organelos como
las mitocondrias, producen una red proteica que es fcilmente
permeable a la parafina y que permite buenos cortes con el mi-
crotomo, ejemplos de estos fijadores son acetona, metanol, etanol
(Cuadro 2.1).
2. No coagulantes: estas soluciones interaccionan con diferentes
sitios qumicos de las macromolculas tisulares para establecer,
a modo de puente, uniones que originan una malla que las en-
trelaza. A diferencia de los fijadores coagulantes, la eliminacin
de las molculas de agua a partir del tejido es mucho menor, ha-
ciendo que casi todos los componentes tisulares se conserven
adecuadamente. De esta manera, y de acuerdo a los efectos que se
desencadenan en el tejido, la fijacin se produce por deshidrata-
cin, reticulizacin, formacin de sales o cambio de estado coloi-
dal. Aunque los fijadores no coagulantes convierten el citoplasma
en un gel insoluble donde los organelos estn bien preservados,

7
es ms difcil la penetracin de la parafina. El formaldehdo y el
glutaraldehdo son ejemplos de este tipo de fijadores.
Cuadro 2.1. Tipos de fijadores qumicos.

Coagulantes No coagulantes
Etanol Formaldehdo
Metanol Glutaraldehdo
Acetona Glioxal
cido pcrico Hidrato de cloral
cido tricloractico Sales de mercurio o zinc
Propanol Tetrxido de osmio
Agrupacin de los reactivos fijadores en coagulantes y no coagulantes.
Asimismo, los fijadores qumicos pueden agruparse por el tipo de fi-

jacin que producen: por deshidratacin, por reticulacin, por formacin
de sales y por cambio de estado coloidal (Cuadro 2.2).
Cuadro 2.2. Tipos de fijacin qumica.

Etanol
Por deshidratacin Metanol
Acetona
Formaldehdo
Glutaraldehdo
Por reticulizacin
Tetrxido de Osmio
Glioxal
Bicloruro de mercurio
Dicromato de potasio
cido pcrico
Por formacin de sales
cido crmico
Sulfato de zinc
Cloruro de calcio
Por cambio de estado coloidal cido actico
Agrupacin de los reactivos fijadores de acuerdo a los efectos
que se producen en el tejido.

En general, los fijadores vuelven insolubles las protenas, los cidos
nucleicos y las mucosustancias, aunque algunos agentes preservan ms a
un tipo de molcula, por lo que es comn usar mezclas de agentes fijadores
(Kiernan, 1990).
Los inconvenientes de casi todos los fijadores son su alta toxicidad,
contaminacin del medio ambiente y costo de eliminacin.
Es importante recordar que en caso de no saber cul es el fijador ideal
para una determinada muestra de tejido, debe utilizarse formol, aunque
nunca directamente de la solucin concentrada, sino diluido al 4%; el tiem-
po de fijacin debe oscilar entre 12 y 36 horas; siempre debe emplearse
abundante fijador (de 10 a 20 veces mayor volumen que la pieza a fijar).
El recipiente en el que se realice la fijacin debe tener boca ancha y debe
rotularse inmediatamente. Una regla importante para una fijacin ptima
es la de utilizar fijadores recin preparados.
En el cuadro 2.3 se describen las caractersticas y forma de prepa-
racin de cuatro fijadores usados en inmunohistologa, tres de ellos son
ampliamente utilizados (paraformaldehdo, formaldehdo y Bouin) y el
cuarto, sales de zinc, que no es tan empleado pero recomendado por
nosotros, especialmente por la buena preservacin antignica que confiere
que es una importante ventaja como se explica ms adelante.
Cuadro 2.3. Fijadores ms usados en inmunohistologa.

Paraformaldehdo
El paraformaldehdo (polmero slido del formaldehdo) es un
fijador no coagulante que permite conservar detalles estructu-
rales finos y debe usarse lo ms fresco posible; su ventaja es
que al estar en polvo, el tiempo de preparacin es controlable.
Caractersticas Se utiliza normalmente al 4%, aunque para fijar clulas para
citometra la concentracin es al 1%.
Con este fijador se obtiene muy buena preservacin ultraes-
tructural, es decir, los resultados en la morfologa son buenos
pero en la preservacin de la antigenicidad es pobre.
Paraformaldehdo (Sigma ) 4g
Soluciones
PBS o H2O 80 mL (Despus de ajustar pH llevar a 100 mL)
Calentar hasta 60 C con agitacin. Al alcanzar la temperatura,
adicionar unas gotas de hidrxido de amonio acuoso (NaOH) al
1 M hasta que se disuelva el paraformaldehdo y dejar enfriar.
Procedimiento Ajustar el pH con cido clorhdrico (HCL) 1 N o hidrxido
de sodio (NaOH) 1 N, segn el caso, hasta ajustar a pH 7.4 y
aforar a 100 mL.
Guardar a 4 C.
Observaciones No usar despus de 15 das de elaborado.

9
Formol amortiguado
El formaldehdo es un gas que se encuentra como solucin al
37-40%. Es el fijador ms utilizado y su empleo es aconsejable
en todos los casos que no se disponga de un fijador especial,
Caractersticas principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para
estudios histolgicos no inmunohistoqumicos (Kiernan, 1990).
No es un buen conservador a largo plazo, endurece mucho el
tejido y se pierde capacidad tintrea en general.
Formol al 4%
Formol al 40% 100 mL
Amortiguador de fosfatos 900 mL
Soluciones Amortiguador de fosfatos:
Fosfato monobsico de sodio 4.0 g
Fosfato dibsico de sodio 6.5 g
Agua ajustar con agua a 1000 mL
Es el fijador de eleccin para microscopa normal y con tinciones
Observaciones
de rutina.
Fijador de Bouin
Este fijador preserva muy bien el tejido conectivo, por lo que
la distorsin es mnima. En tejidos donde se debe conservar la
Caractersticas citoarquitectura es de primera eleccin (por ejemplo, testculo de
mamfero). Conserva el tejido a largo plazo. No es recomendado
para histoqumica (Luna, 1968).
Formaldehdo 250 mL
Soluciones cido pcrico saturado 750 mL
cido actico glacial 50 mL
Es importante eliminar el picrato con solucin saturada de
carbonato de litio o alcohol al 70% hasta que desaparezca
Observaciones
el color anaranjado antes de la deshidratacin, pues si no se
interfiere con la tincin nuclear.
Fijador de sales de zinc (ZSF)
Los fijadores basados en aldehdos convencionales permiten una
buena preservacin morfolgica; sin embargo, debido al entrecru-
zamiento provocado por su mecanismo de accin puede ocurrir
prdida de eptopes durante la fijacin, comprometiendo al teji-
do para un subsecuente anlisis inmunohistoqumico adecuado.
Los procedimientos de desenmascaramiento de eptopes pueden
utilizarse para revertir los efectos de la fijacin por aldehdos,
pero estos mtodos no pueden garantizar la recuperacin antig-
nica y son costosos, adems de que consumen demasiado tiempo.
Caractersticas Por tanto, recientemente la atencin se ha enfocado hacia el
uso de los fijadores no basados en aldehdos (fijadores de sales de
zinc), porque estos combinan una buena preservacin morfolgica
y antignica. Estudios comparativos han mostrado que los fijadores
basados en sales de zinc permitieron una preservacin antignica
comparable a la obtenida por crio-preservacin y una preser-
vacin morfolgica comparable a la fijacin basada en aldehdos
(Gonzlez, Anderson, Deane, Summers & Buxton, 2001; Hicks et
l., 2006; Jensen, Owens, Pedersen & Christensen, 2010).

Existen escasos datos sobre el mecanismo molecular de la fija-
cin por zinc. No obstante, por dcadas las sales de zinc se
han usado como aditivos en fijadores basados en aldehdos con
el objetivo de mejorar la morfologa de los tejidos. El acetato es
un anin caotrpico que podra actuar desestabilizando la
estructura proteica interfiriendo con la formacin de puentes
de hidrgeno; en contraste, se sabe que los iones zinc pueden
estabilizar ciertas partes de la estructura terciaria de protenas
cuando se someten a reactivos caotrpicos*. Se ha sugerido
que los efectos combinados del zinc y los iones acetato podran
Caractersticas actuar introduciendo cambios estructurales o incluso una desnatu-
ralizacin ligera de protenas en la muestra; lo cual podra esta-
bilizar las protenas de membrana plasmtica en una capa ms
rgida (Jensen et l., 2010).
Se ha reportado como desventaja del fijador basado en sales
de zinc que puede tener poca penetracin en los tejidos y causar
que se encojan ligeramente las muestras, sin embargo, en otros
reportes incluyendo en nuestros resultados- se ha observado
que este fijador es capaz de penetrar lo suficiente en casi todos
los tejidos y permitir cortes y procesamientos inmunohistoqumi-
cos (Gonzlez et l., 2001).
La inmunorreactividad de las muestras despus de la fijacin
con este reactivo es superior a la obtenida con fijadores
basados en formaldehdo (Gonzlez et l., 2001; Hicks et
l., 2006; Jensen et l., 2010).
Proporciona excelentes resultados con tinciones histoqumicas
e inmunohistoqumicas en cortes preparados a partir de
tejidos incluidos en parafina.
Presenta las ventajas de proporcionar mejor detalle nuclear,
mejor penetracin de la parafina y conservacin de los
antgenos.
Fijador de Primera eleccin para inmunohistoqumica ya que
Ventajas
la preservacin antignica es comparable a la cro preserva-
cin y la preservacin morfolgica es comparable a la fija-
cin basada en aldehdos.
Preserva adecuadamente los cidos nucleicos para una poste-
rior amplificacin de ADN (Lykidis et l., 2006).
Permite usar concentraciones muy diluidas de anticuerpos,
representando un ahorro de los mismos.
Es econmico, fcil de preparar, de almacenar y tiene baja
toxicidad; no obstante, su mayor ventaja es que puede ser
introducido como de primera eleccin en cualquier procedi-
miento histolgico de rutina o especial.
Puede tener poco poder de penetracin en algunas muestras
Desventajas como las de intestino.
La posible precipitacin del zinc (Wester et l., 2003).
Tris base 0.1 M 1.21 g (2.42 g p/200 mL)
Soluciones Acetato de calcio 0.05 g (0.1 g p/200 mL)
Agua destilada 80 mL (160 mL p/200 mL)

11
Mezclar y ajustar a pH 7.2-7.4
Aforar a 100 mL (200 mL)
Adicionar acetato de zinc 0.5 g (1 g) y cloruro de zinc 0.5 g (1 g)
Guardar en frasco mbar y refrigerar si se prepara 24 h antes
(Gonzlez et l., 2001). Preferentemente preparar al momento
de usar.
Fijar con un volumen 20 veces mayor con respecto a la muestra
por 24 h en bloques de tejido que no excedan los 2 cm.
Al cambiar fijador nuevo, cortar la muestra a bloques ms
pequeos y dejar 48 h ms.
Para muestras de tejido intestinal hay que poner bloques de
tejido no mayores de 0.5 cm para lograr adecuada penetra-
cin del fijador de zinc. Excelente fijador para hgado y bazo,
pues no endurece el tejido.
Procedimiento
Procedimiento para fijar tejido en solucin de sales de zinc. A)

Vaciar solucin fijadora en un recipiente y proteger para evitar
la oxidacin por la luz, B) colocar el fragmento de tejido en un
volumen 20 veces mayor de solucin fijadora que el del tamao
de la muestra. C y D) A las 24 horas extraer y cortar el tejido en
fragmentos ms pequeos (de 2 cm aproximadamente), y cam-
biar la solucin fijadora**.
** Para informacin detallada del procedimiento de inmunohistoqumica en tejido

fijado con sales de zinc consultar la presentacion 1 del material de apoyo.
*Un agente caotrpico es una sustancia que desorganiza la estruc-

tura tridimensional en macromolculas tales como protenas, ADN
o ARN, y las desnaturaliza; lo lleva a cabo actuando sobre las
Observaciones interacciones intramoleculares no covalentes (puentes de hidr-
geno, fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofbicas),
que tendran un papel estabilizador en la molcula. Algunos
ejemplos son la urea, la tiourea o el cloruro de guanidinio.

3. Inclusin
Para la obtencin de cortes finos es un requisito indispensable que el tejido

haya sido previamente endurecido hasta un cierto punto: cuanto mayor
sea su firmeza, tanto ms delgado resultar el corte histolgico. Con el fin
de endurecer los tejidos existen dos mtodos principales: la congelacin o
la inclusin.
La inclusin permite obtener cortes finos y homogneos, por lo que las
piezas a cortar debern tener una determinada consistencia y uniformidad.
El medio de inclusin debe ser lquido que posteriormente se solidi-
fique de manera homognea y debe, asimismo, penetrar en todos los es-
pacios libres de los tejidos. Algunos medios de inclusin son solubles en
agua, otros no; caso en el que ha de ser reemplazado por el solvente
apropiado al medio de inclusin que se utilice. Con excepcin de tejidos
congelados en los que se realizan los cortes de forma directa utilizando
un criostato, la mayor parte de las muestras para estudio histopatol-
gico se incluyen en parafina y requieren de un paso previo de deshidratacin.
3.1. Deshidratacin
Para realizar la inclusin en medios hidrofbicos como la parafina, los

tejidos fijados se deshidratan en alcoholes de concentracin creciente hasta
llegar a alcohol absoluto, esto se hace porque si se colocara el tejido en
una solucin de alcohol al 100%, el agua saldra muy rpido del tejido
y se deformara. En el cuadro 3.1 se presentan algunos puntos crticos del
proceso de deshidratacin, agentes aclarantes e inclusin y un listado
de los principales agentes deshidratantes y aclarantes utilizados.

13
Cuadro 3.1. Proceso de deshidratacin.
Deshidratacin
La deshidratacin es el proceso que tiene por finalidad la eli-

minacin completa del agua de la muestra tisular, para que se
pueda embeber (empapar) adecuadamente el tejido en aquellos
medios de inclusin que no sean hidrosolubles.
El mtodo clsico de deshidratacin es la sustitucin de agua
por alcohol, pero puede realizarse utilizando cualquier reactivo
capaz de absorber el agua de los tejidos. Las condiciones esen-
ciales de un buen agente deshidratante son dos:
1. No debe alterar la estructura tisular.
2. Debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente
aclarante.
El proceso de deshidratacin suele realizarse mediante el empleo

de alcohol etlico y en l suelen intervenir los parmetros siguientes:
Graduacin de los alcoholes: en la prctica la operacin
de deshidratacin se realiza empleando una serie de alcoho-
les de gradacin ascendente (50, 70, 80, 95, absoluto). Esto se
hace as porque la accin brusca de un alcohol de mayor grada-
Deshidratacin por
cin sobre el tejido provocara una marcada retraccin de ste. El
agentes qumicos
empleo de series ms o menos largas de alcoholes de distinta
gradacin, as como la decisin de iniciar el proceso en un
alcohol de gradacin media o menor, van a estar en funcin de
la experiencia del personal, de la fragilidad de los tejidos y del
tipo de fijador utilizado, ya que los fijadores con base alcohlica
realizan cierta deshidratacin durante el proceso de fijacin.
Volumen y nmero de baos de deshidratacin: no es necesario
o preciso que el volumen de alcohol sea demasiado alto, por lo
general suele recomendarse un volumen del bao 10 veces mayor
al de la muestra que se va a deshidratar; es decir, multiplicar el
nmero de baos: sucesivos y mltiples a fin de que:
1. Al permanecer menos tiempo en cada bao, haya menor
riesgo de endurecimiento excesivo del tejido.
2. Sea menor el ndice de saturacin de agua en alcohol, lo
que posibilita la reutilizacin del bao de alcohol.
3. Se controle mejor el grado de deshidratacin de la pieza.
4. Haya menos riesgo de alteracin tisular producida por un
cambio brusco en la fuerza de estacin del agua.
Est en funcin del volumen de los fragmentos titulares y de su

contenido en agua. Es importante tener en cuenta dos cosas:
1. Debe completarse.
2. La exposicin prolongada al agente deshidratante provoca un
endurecimiento de los tejidos.
Duracin de la A veces en investigacin se usan agentes accesorios que eliminan
deshidratacin el exceso de agua en los deshidratantes y supone un cierto ahorro
porque permite reutilizar el bao. Se utiliza el sulfato de cobre
anhidro, que sirve al mismo tiempo como indicador del grado
de deshidratacin del bao de alcohol porque los cristales de
sulfato de cobre adoptan una tonalidad azul brillante cuando el
lquido deshidratante se satura de agua.

Su finalidad no es hacer transparente el tejido, aunque en algunas
ocasiones puede ocurrir. Se trata de un proceso por el cual se
consigue la sustitucin del agente deshidratante por una sustancia
Aclaracin o miscible con el medio de inclusin que va a utilizarse.
desalcoholizacin Con ello, se pretende que toda la pieza histopatolgica se
halle embebida, empapada en un agente qumico lquido en el
que pueda disolverse el medio de inclusin y, de este modo, pene-
trar en el tejido.
Existen varios y su eleccin depender de su rapidez para eli-

minar el deshidratante. Depender tambin de la escasez de
acciones nocivas sobre los tejidos y las clulas, de la adecua-
cin del agente deshidratante y del medio de infiltracin; de
la facilidad de su eliminacin de su toxicidad, peligrosidad, y
de su coste. Tambin se denominan lquidos intermediarios y se
manejan mediante la realizacin de baos sucesivos de duracin
Agentes aclarantes variable en funcin de las caractersticas del agente y del volu-
men de la pieza.
En ocasiones se recomienda utilizar antes de los baos del
aclarante diversas mezclas de agente deshidratante con acla-
rante en diferentes proporciones.
El volumen del agente aclarante ha de ser el mismo que el
del deshidratante y el proceso se puede acelerar con una suave
agitacin, ya manualmente, ya elctrica.
Es el proceso que tiene por objeto rellenar o infiltrar completa-

mente la muestra histopatolgica con el medio de inclusin que
se va a utilizar.
El fundamento de este proceso radica en la ocupacin com-
pleta de los espacios intratisulares y extratisulares, inicialmente
rellenos por agua.
Para conseguir este efecto, es imprescindible eliminar previa-
mente todos los restos de aclarantes residuales en el tejido.
La finalidad ltima de este proceso es proporcionar a la pieza
anatmica la homogeneidad y dureza suficientes para obtener sec-
ciones finas de calidad. Se puede realizar la inclusin en distintos
medios, pero hoy da el ms elegido sigue siendo la parafina.
Las parafinas son sustancias de tipo creo que se usan habitual-
mente a temperatura ambiente, compuestas por mezclas de hidro-
carburos de cadena blanca; pueden obtenerse con una amplia
variacin de punto de fusin (entre 54 y 58 C), lo que va a con-
Infiltracin o dicionar en gran medida en histotecnologa. Su dureza est en
impregnacin funcin de su plasticidad, punto que est unos pocos grados por
debajo del de fusin y se define como la temperatura ms baja a
la que puede ocurrir una deformacin permanente sin fractura.
En la prctica diaria no se unan las parafinas cloritas sin
purificar porque se oxidan con el paso del tiempo y adoptan una
tonalidad amarillenta y una consistencia blanda.
Se suelen utilizar mezclas con polmeros plsticos con un
peso molecular controlado y con aditivos que mejoran sus carac-
tersticas de inclusin.
Infiltracin en parafina. Se realiza mediante baos sucesivos
en parafina fundida. Estos baos deben ser renovados frecuente-
mente porque se cargan del medio de aclaracin y producen dismi-
nucin del punto de fusin de la parafina y la vuelven ms blanda
y menos apropiada para el corte.
Procedimientos de infiltracin. Este procedimiento puede
hacerse, o bien de forma manual, o de forma automtica en pro-
cesadores de inclusin.

15
Agentes deshidratantes
Es el de uso ms comn; excelente deshidratante, aunque tiene el

inconveniente de que es muy inflamable y su precio es superior
Alcohol etlico al del alcohol metlico. Para economizar se puede utilizar alcohol
etlico desnaturalizado con metanol, que tambin se deno-
mina etanol para uso industrial.
Alcohol metlico A veces se usa como sustituto del anterior. Es muy inflamable y txico.
Deshidratante muy voltil y con una accin rpida. Si el trata-

Acetona miento de los tejidos es rpido, aumenta extraordinariamente
su fragilidad.
Deshidratante lento, miscible con la parafina; por tanto, permite

Alcohol butlico o butanato
prescindir de los agentes aclarantes.
Dioxan Miscible con parafina, muy txico en espacios pequeos.
Alcohol isoproplico No puede utilizarse en la inclusin en celoidina.
No se usa. Agente de accin rpida que no causa excesiva

Tetrahidrofurano
retraccin.
Agentes aclarantes
1. Agente aclarante ms rpido

2. No disuelve la celoidina
3. Endurece poco los tejidos
Ventajas 4. Se elimina fcilmente del medio de
inclusin
5. Es fcil apreciar el punto ptimo de
dosificacin.
Xileno o xilol
1. Txico
2. Slo aclara desde alcohol absoluto
Inconvenientes
3. Tiende a volver blanquecino el tejido
4. Endurece si acta mucho tiempo.
* Inters prctico: Aclara especmenes con un grosor aproximado de unos 5 mm

entre 1 h o media hora. Es el que se utiliza rutinariamente.
1. Rpido, pero menos que el Xilol

2. Endurece menos que el Xilol y no blan-
Ventajas quea los tejidos
3. Puede conservar una muestra ms de 12 h
sin alteracin evidente.
Toluol o tolueno
1. Es txico
Inconvenientes
2. Slo se aclara desde alcohol absoluto.
* Inters prctico: Cuando no hay xilol, se usa toluol. El tiempo de aclaracin vara
entre 1 y 2 h.
1. Es relativamente rpido
2. Endurece muy rpido y no blanquea
Ventajas
3. Causa retraccin mnima
Benceno 4. Se elimina fcilmente.
1. Muy txico
Inconvenientes
2. Altamente inflamable.

1. Es muy tolerante
2. No afecta al tejido
Ventajas 3. Va bien para piezas delicadas
4. Es de accin lenta; p. ej., piel, muestras
descalcificadas.
1. El tejido tiende a flotar en la superficie y

Cloroformo
hay que poner peso en la pieza
Inconvenientes 2. La difcil eliminacin de parafina provoca
deterioro del bloque
3. Olor desagradable.
* Inters prctico: Tiempo de aclaracin para muestra de 5 mm de espesor, de 12

a 24 horas. Producto de sustitucin en circunstancias especiales.
1. Accin similar al cloroformo, pero ms

Ventajas
econmico. No es inflamable.
Tetracloruro de
1. Igual que el cloroformo
carbono (CCl4) Inconvenientes
2. Es muy txico.
* Inters prctico: Tiempo de aclaracin de 15 h puede utilizarse en piezas duras.
1. Miscible con parafina. Puede emplearse

Ventaja simultneamente como deshidratante y
aclarante.
1. Inoloro y muy txico, siempre que se uti-

Dioxano
lice es obligatorio extremar medidas de
Inconveniente
proteccin y usar campana de extraccin
de gases.
* Inters prctico: Empleo restringido a inclusiones donde est proscrito (prohibido).
3.2. Inclusin en parafina
Para las tcnicas ms frecuentes de tincin se emplea el mtodo de inclu-

sin; asimismo, para los cortes que deben observarse con el microsco-
pio ptico se usa casi exclusivamente la parafina, que ha sido utilizada
como medio de impregnacin e inclusin por ms de cien aos. Su funcin
es difundirse en los tejidos cuando est derretida en aquellos lugares en que
la muestra tena agua, habiendo sido deshidratada y tratada con un lquido
intermediario previamente (Estay, Parra y Bentez, 2008).
Despus de la deshidratacin, el tejido se pasa por solventes intermedia-

rios, que pueden ser el xileno, el benceno, el tolueno; o en alcoholes, ya sea el
isobutlico, el isoproplico o amlico; o en aceites, como el de cedro o clavo.
Todas estas sustancias tienen la particularidad de ser miscibles tanto en el

17
agente deshidratante como en la parafina. Adems, las muestras suelen trans-
parentarse al ser expuestas a estos agentes por lo que todos ellos son cono-
cidos como agentes aclarantes o lquidos intermedios.
Despus las muestras deben ser colocadas en una estufa con parafina
fundida entre 56 y 60 C, dado que sta es slida a temperatura ambiente
(Figura 3.1).
Figura 3.1. Tratamientos previos de las muestras antes de su inclusin en

parafina. A) Deshidratar la muestra y B) fundir la parafina.
Luego de impregnar el tejido, se deja solidificar la parafina junto con

aqul, constituyendo los bloques histolgicos. El procedimiento es lento,
pero los preparados son de gran calidad (Figura 3.2).
En ocasiones el tejido se impregna con acrlicos de bajo peso molecu-
lar, como el metil metacrilato, lo que permite obtener cortes ms delgados,
procedimiento conocido como microscopa ptica de alta resolucin.
Para microscopa electrnica se incluye casi invariablemente en resinas
epoxi, y los bloques resultantes, de gran dureza, son seccionados por la
navaja de diamante o de vidrio del ultra microtomo (Bozzola, 1992).
El tiempo en cada paso depende del tamao de la muestra: entre
ms grande sea ms tiempo deber emplearse para que la impregnacin
sea completa.

Figura 3.2. Inclusin de muestra en bloques de parafina. A) La inclusin en pa-
rafina se lleva a cabo calentndola por encima de su punto de fusin para que
est en estado lquido y pueda infiltrarse en el interior de la muestra. Existen
parafinas con diferente punto de fusin y dureza. B) Su eleccin depende de
la consistencia del tejido y de la temperatura ambiente del laboratorio. C) Una
vez infiltradas las muestras, se confeccionan bloques con moldes adecuados.
D y E) Al enfriarse, la parafina se solidifica y el bloque adquiere una dureza
adecuada para ser cortado con el microtomo de parafina (de deslizamiento o
de rotacin) (Samar, vila y Esteban, 2000).
Alternativamente a la parafina pueden utilizarse otros medios de

inclusin como el Paraplast (Cat. A6330 Sigma) e Histosec (Cat. 11609
Merck), entre otros, que son mezclas de parafina y plastificantes.
Los tiempos en parafina indicados en el protocolo son los mnimos
requeridos (Se pueden quedar por mucho ms tiempo siempre y cuando la
parafina se mantenga entre 60-62 C) (Cuadro 3.2).
Las altas temperaturas para la infiltracin de la parafina y tiempos
muy prolongados pueden provocar destruccin de los antgenos, perdien-
do los tejidos la inmunorreactividad.
Los bloques de parafina pueden almacenarse a temperatura ambiente
indefinidamente hasta que son cortados; no obstante, se recomienda guar-
dar en el refrigerador a 4 C cuando se vaya a usar inmunohistoqumica.

19
Cuadro 3.2. Procedimiento de deshidratacin e inclusin.
Solucin Tiempo
Agua corriente 30 min
Alcohol 70% 30 min
Alcohol 80% 30 min
Deshidratacin Alcohol 90% 30 min
Alcohol absoluto 30 min
Alcohol amlico o 60 min
(Alcohol iso-butlico o butanol) (Mnimo 24 h)
Parafina I 60 min*
Parafina II
Inclusin 60 min*
Inclusin en bloque (fundida a 60 C)
*TIEMPOS MNIMOS
Observaciones
Los tiempos de deshidratacin se determinan dependiendo del tamao de la muestra. Para mues-
tras muy pequeas (entre 0.3 y 0.5 cm) se sugieren los tiempos anteriores, los cuales habrn de
aumentar segn el tamao del bloque.
No dejar ms de 1 h en alcohol absoluto, pues se endurece y contrae el tejido.
Hay que ser muy cuidadoso al utilizar el xilol como lquido intermedio: se debe controlar el tiempo
de impregnacin, en cuanto el tejido se transparente, meter a parafina para evitar endurecimien-
to excesivo del tejido.
Para tejidos muy hidratados como los fetales empezar a deshidratar desde alcohol al 50% aumen-
tando concentraciones 10% cada vez (50, 60, 70, 80, 90 y 100%).
Para bloques de tejido muy pequeos se debe teir el tejido con eosina de trabajo y poder locali-
zarlo al manejo.
Xilol I y xilol II slo se preceden uno del otro, no hay ninguna diferencia en su contenido (xilol puro).
3.3. Conservacin de muestras
Para mantener muestras por tiempos prolongados sin que se alteren por
el fijador pueden utilizarse lquidos intermedios: alcohol butlico, amli-
co, o el aceite de cedro. Despus de la fijacin debe deshidratarse el tejido
de la manera usual hasta llegar al lquido intermedio en buena propor-
cin y dejar ah hasta que se requiera. El paso siguiente es la inmersin en
parafina, como se procede de manera habitual hasta la inclusin definiti-
va. Se puede mantener por meses en frascos bien tapados (de preferencia
en la oscuridad).
4. Cortes histolgicos
Los tejidos deben cortarse en lminas delgadas para posibilitar su observa-

cin con el microscopio; esto exige experiencia y paciencia, ya que se debe
tener en cuenta que cortes demasiado finos facilitarn el desprendimiento
de los tejidos en los mltiples lavados; en tanto que los de mayor grosor
originarn superposicin celular, dificultades en la desparafinacin y dis-
minucin en el nmero de muestras.
Los instrumentos utilizados para la obtencin de cortes son los mi-
crotomos (Figura 4.1), que constan, bsicamente, de una navaja muy afilada
que seccionar el bloque con la muestra y un mecanismo de avance auto-
mtico regulable de unos pocos micrones (usualmente entre 5 y 8).
Figura 4.1. Cortes en microtomo de tejido incluido en parafina. A) Microtomo,

B y C) Los tejidos deben cortarse en lminas delgadas, D, E y F) Los cortes
pueden recogerse con facilidad de manera seriada, G y H) Uso de Ruyter para
extender y pegar los cortes en una sola laminilla, I) Las laminillas se van colo-
cando en una canastilla para su almacenamiento.
Los cortes pueden recogerse con facilidad de manera seriada, los

que se manejan con ayuda de un pincel o aguja de diseccin se deposi-
tan sobre la superficie de un bao de agua caliente (38 C), donde con el
calor se estiran; luego se recogen sobre portaobjetos tratados con gelatina,

21
albmina, poli-L-lisina o silano y se dejan secar en una estufa para que
se adhieran al vidrio, aunque este procedimiento hace difcil el monta-
je de varios cortes en una sola laminilla.
Para mayor cantidad de muestras o cortes seriados, se recomienda el
uso de un lquido que nos permita colocar, extender y pegar los cortes en una
sola laminilla, ponindola sobre una plancha o placa de calor para exten-
der los cortes histolgicos. La solucin de Ruyter o albmina glicerinada es
muy recomendada para tales efectos, pues permite realizar todos estos pasos.
4.1. Soluciones adhesivas para pegar muestras
Debido a los numerosos lavados que deben efectuarse para las tinciones
inmunohistoqumicas, es frecuente que se desprendan los cortes, por lo
que se recomienda el uso de adhesivos para las clulas o cortes histolgicos
(Cuadro 4.1). Existen diversos mtodos como pretratamiento en portaob-
jetos para permitir la adhesin. Las laminillas con pretratamiento pueden
comprarse, pero es ms econmico tratarlas en el laboratorio.
Cuadro 4.1. Soluciones adhesivas para pegar muestras.

Silano (3-aminopropil,
trietoxisilano)
3-aminopropyl, triethoxysilane (Sigma A-3648) 3 mL
Soluciones
Acetona 97 mL
Guardar en frasco mbar a 4 C
Lavar las laminillas en alcohol absoluto (en caso de laminillas reu-
sadas)
Procedimiento
Dejar secar al aire libre
Baar las laminillas en silano (5 min)
Escurrir e incubar a 60 C por 24 h
Poli-L-Lisina
Laminillas nuevas
Poli-L-lisina (Sigma P-8960) 10 mL
Agua 90 mL
Soluciones
Laminillas usadas
HCl al 1% en Alcohol absoluto (5 min)
Poli-L-lisina al 10% (5 min)
Laminillas nuevas
Guardar en refrigeracin (No utilizarse despus de 15 das de su
preparacin).
Procedimiento La solucin rinde aproximadamente 90 laminillas/100 mL.
Laminillas usadas
Escurrir e incubar a 60 C por 24 h

Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les agrega
cantidad suficiente de la solucin para que el tejido se extienda
con ayuda del calor producido por la plancha. Se deben ubicar
Ruyter
los cortes de la manera deseada con ayuda de un pincel o aguja
(Solucin de albmina
de diseccin y entonces el exceso es retirado con ayuda de una
glicerinada para extender
pipeta Pasteur. Por efecto de la albmina, que acta como adhe-
y pegar cortes)
sivo, el tejido se pega al portaobjetos. En el caso de cortes histol-
gicos, donde se realizarn inmunohistoqumicas, es recomendable
adems el uso de laminillas tratadas con poli-L-lisina o silano.
Se requiere de dos soluciones para su elaboracin:
Solucin A
Agua destilada 80 mL
Soluciones Albmina glicerinada 20 gotas
Solucin B
Acetona 20 mL
Benzoato de metilo 20 gotas
Solucin A
Adicionar la glicerinada al agua destilada
Solucin B
Procedimiento Disolver el benzoato en la acetona
Adicionar sol. A a sol. B (en ese orden) gota a gota y muy lenta-
mente, pues de no hacerlo se forma precipitado
Filtrar y guardar a 4 C
Esta solucin de albmina glicerinada tambin se utiliza para blo-
Albmina glicerinada quear biotina endgena en inmunohistoqumica con anticuerpos
biotinilados al 3% en PBS-tritn durante 30 min.
Clara de un huevo de gallina
Soluciones
Glicerina
Albmina-glicerina 1:1
Clara de un huevo de gallina vaciar a probeta y agregar mismo
Procedimiento volumen de glicerina.
Guardar a 4 C (Dura seis meses).
5. Tincin histolgica
La histoqumica es la aplicacin de reacciones qumicas y bioqumicas

en la tcnica histolgica, con el fin de localizar y determinar de manera
cientfica ciertas sustancias o su actividad. En todas estas reacciones, o
bien se tie la sustancia que se busca o los colorantes reaccionan qumi-
camente con ella. La tincin histolgica es un proceso utilizado para pro-
veer de color a los componentes de un tejido; para ello, existen mltiples
mtodos, unos generales, otros especficos, que permiten poner de ma-
nifiesto tanto la topografa tisular, como tipos celulares concretos, deter-
minados organelos o estructuras intracelulares.

23
La tincin histolgica tambin se diferencia entre fsica y qumica. En
una tincin fsica, el colorante se disuelve en el sustrato; por ejemplo, el su-
dn III se disuelve en las grasas y se emplea para demostrar gotas lipdicas;
por su parte, en una tincin qumica, el colorante interacciona qumica-
mente con el sustrato a travs de fuerzas de van der Waals, puentes de
hidrgeno, enlaces covalentes o enlaces electrostticos.
En una tincin directa, el colorante interacciona en ese tenor con el
sustrato; en una indirecta, se hace interaccionar con el sustrato, en primer
lugar, una sustancia qumica denominada mordiente, la cual permite la
posterior interaccin del colorante y que, usualmente, es sal, hidrxido o
alumbre de metales bivalentes o trivalentes.
5.1. Tipos de tincin histolgica
Las tinciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante o

mltiples cuando se usan dos o ms (Cuadro 5.1).
Cuadro 5.1. Tipos de tincin histolgica.

Se emplean tres colorantes, cada uno de ellos con particularidades,
Tincin tricrmica de tal manera que se consigue teir con colores y estructuras dife-
rentes, permitiendo as su rpida identificacin en el microscopio.
Se realiza sobre clulas frescas, recin obtenidas, con objeto de

llevar a cabo una observacin de las estructuras teidas con las
Tincin supravital clulas vivas. Por ejemplo, se puede teir las mitocondrias de clu-
las vivas con el colorante verde jano y observarlas con el micros-
copio mientras las clulas permanecen vivas.
Procedimiento por el cual un colorante no-txico como el carmn de
litio o el azul tripn se inyecta en un organismo vivo para estudiar
Tincin vital procesos vitales de clulas capaces de acumularlo por pinocitosis
o fagocitosis, o adicionarlo al medio de cultivo para cuantificar
clulas vivas.
El colorante no tie la estructura que se desea estudiar, de tal
manera que la morfologa externa o los contornos de esa estructu-
Tincin negativa ra quedan delimitados por el propio colorante que se encuentra a
su alrededor.

Usualmente los cortes histolgicos se montan sobre portaobje-
tos antes de ser teidos, lo cual facilita su manipulacin; sin embar-
go, en ocasiones, sobre todo cuando se utilizan cortes gruesos
de 30-50 , obtenidos con un criostato o con un vibratomo, con-
Tincin de cortes viene realizar determinado tipo de tinciones en flotacin. Para
en flotacin ello, los cortes de tejido se mantienen sumergidos (en flotacin) en
el interior de la solucin colorante, esto posibilita el acceso del colo-
rante por ambas superficies. Este tipo de tcnica es poco comn
cuando se utilizan colorantes, pero es habitual cuando se reali-
zan tcnicas de tincin histoenzimticas o inmunocitoqumicas.
Se realiza utilizando placas de cultivo celulares; es decir, sobre

Tincin en placa clulas que se han mantenido vivas in vitro.
En ocasiones, en algunos tipos de impregnaciones metlicas, tc-

nicas de Golgi, etc., conviene realizar la tincin no sobre cortes
histolgicos, sino sobre la pieza o bloque de tejido; para ello,
Tincin en bloque el bloque de tejido se sumerge en la solucin colorante durante
un tiempo determinado. Sin embargo, los resultados finales no
se pueden valorar hasta que no se han confeccionado los cortes
y se realiza la observacin microscpica.
Para la observacin de los cortes ultrafinos con el microscopio elec-

trnico de transmisin es preciso contrastar los cortes con objeto
Tincin para de incrementar las diferencias de densidad electrnica de las dife-
microscopa electrnica rentes partes de la muestra; para ello, se recurre al empleo de sales
de metales pesados como uranio, wolframio o plomo.
El objetivo de una tincin histoenzimtica es detectar la presen-

Tincin cia de una enzima; para estos fines se recurre a una serie de
histoenzimtica reacciones qumicas que demuestran la presencia del producto
de la actividad enzimtica.
La tincin inmunohistoqumica se basa en la afinidad entre ant-

genos y anticuerpos, que es la fuerza de atraccin que entre las
molculas causa unin. En el caso de las reacciones inmunolgi-
Tincin cas, las fuerzas de afinidad son covalentes. Cabe mencionar
inmunohistoqumica que las molculas de los anticuerpos son grandes, por lo que es
posible conjugarlos con otros compuestos como fluorocromos o
enzimas sin que se modifiquen las propiedades del anticuerpo.
5.2. Colorantes
Un colorante es una molcula que tiene la capacidad de absorber radia-

ciones electromagnticas dentro de la regin del espectro visible, es decir,
entre 400 y 650 nm, no transmite ningn tipo de luz y se ven, por tanto, de
color negro. Aquellos que absorben una franja ms estrecha, transmiten
un color determinado; por ejemplo, el cido pcrico absorbe predomi-
nantemente la luz azul-violeta del final del espectro visible, dando como
resultado una luz transmitida de color amarillo.

25
Para reproducir un mtodo de tincin hay que utilizar siempre re-
activos, colorantes y agua destilada de calidad, y preparar las soluciones
colorantes en material de vidrio extremadamente limpio. Conviene tener
presente que la tcnica de tincin en s misma no es una tcnica aislada,
sino que forma parte integral de todo el proceso histolgico.
En un mismo tejido, los colorantes se comportan de forma diferente
en funcin del grado de fijacin y de la naturaleza del fijador utilizado,
pues ste interacta de forma distinta sobre las molculas que componen
los tejidos, produciendo modificaciones. Por ejemplo, se conoce que tan-
to la formalina como el tetraxido de osmio inducen basofilia en los teji-
dos, mientras que las soluciones colorantes a base de dicromato inducen
acidofilia. En comparacin con la formalina, el fijador de Carnoy in-
crementa la avidez del tejido por los colorantes, mientras que el fijador
de Zenker disminuye el grado de coloracin.
Los colorantes pueden clasificarse en inicos y no-inicos (o hidro-
fbicos). A su vez, los inicos se clasifican en cidos, bsicos y neutros
(Cuadro 5.2).
Cuadro 5.2 Tipos de colorantes.

Es aquel cuyo principio colorante es aninico (carga negativa) y
Colorante inico cido tiene, por tanto, afinidad por las estructuras tisulares cargadas posi-
tivamente, de las que se dice son acidfilas.
Es aquel cuyo principio colorante es catinico (carga positiva) y

Colorante inico bsico tiene, por tanto, afinidad por las estructuras tisulares cargadas
negativamente, de las que se dice son basfilas.
Es aquel que tiene un principio colorante aninico (carga negativa)

Colorante inico neutro y otro catinico (carga positiva).
Un colorante presenta metacromasia cuando tie ciertas estructuras

de un color diferente al suyo propio; por ejemplo, el azul de
toluidina, que tie las estructuras normalmente de color azul (tincin
Nota ortocromtica), presenta metacromasia cuando tie los grnulos de
los mastocitos de color rojo. Esta propiedad de algunos colorantes
se debe a que en algunas circunstancias los monmeros forman
dmeros, que presentan un color diferente.

5.3. Tincin de cortes en parafina
Para teir cortes en parafina debe procederse, antes que nada, a elimi-
nar sta, puesto que no existe ningn colorante que pueda teir a travs
de ella; con estos fines se recurre al proceso inverso al utilizado duran-
te la elaboracin de los bloques de parafina. Es decir, en primer lugar se
procede a una desparafinacin mediante el empleo de un disolvente, es-
to se consigue baando los portaobjetos con los cortes en un disolvente,
usualmente el xilol; a continuacin se procede a una hidratacin median-
te baos sucesivos de alcohol en graduacin decreciente. Una vez en medio
acuoso, se pueden emplear colorantes hidrosolubles.
5.4. Restauracin de la cromofilia
Cuando hay pobre tincin nuclear, sta puede deberse a una exposicin
previa del tejido en reactivos acdicos, como formalina o lquidos descal-
cificantes no neutralizados, los que para restaurar la cromofilia en cortes
ya hidratados pueden incubarse en bicarbonato de sodio acuoso al 5% o
cido peridico acuoso al 5%, toda la noche y tras un lavado en agua de
5 min, previo a la tincin (Luna, 1968).
6. Montaje
Las preparaciones permanentes se montan con medios disueltos aplica-

dos sobre la preparacin y que endurecen por evaporacin del disolven-
te. En tanto, las preparaciones histolgicas y citolgicas deben deshidra-
tarse completamente antes del montaje. Como ltima etapa debe usarse
xileno o un sustituto de ste, lo que asegura que el tejido se transparen-
te y al poner el medio de montaje se extienda perfectamente bien, pues la
mayor parte de los medios de montaje estn diluidos en xilol.
El montaje tiene lugar goteando aproximadamente 0.5 mL de un me-
dio con una varilla de vidrio sobre portaobjetos en posicin horizontal,
para rellenar el espacio intermedio entre portaobjetos y cubreobjetos. As
que quede asegurada una distribucin homognea sobre la preparacin, se

27
coloca encima un cubreobjetos limpio, de manera que no queden burbujas
de aire incluidas. A continuacin se deja la preparacin en posicin hori-
zontal hasta que despus de cerca de 20 o 30 minutos est seca y se pueda
observar al microscopio (esto aplica para el Entellan Cat. MO7951 Merck).
Las preparaciones as tratadas conservan el color como mnimo du-
rante cinco aos.
Debe usarse siempre un medio de montaje que contenga como base el
disolvente que se us en el aclaramiento, para conseguir unas propiedades
pticas y transparencia ptimas de las preparaciones.
Para capturar imgenes histolgicas o citolgicas mediante una c-
mara fotogrfica o software es importante utilizar cubreobjetos que ga-
ranticen un grosor uniforme, el ms indicado es el marcado con grosor
del nmero 1.
Medios de montaje ms utilizados son: Blsamo de Canad, resina
sinttica, Entellan y vecta shield.

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Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios Superiores Iztacala

Dra. Patricia D. Dvila Aranda

Dr. Ignacio Pealosa Castro

CD Rubn Muiz Arzate

Dr. Raymundo Montoya Ayala

CP Reina Isabel Ferrer Trujillo

Dr. Juan Manuel Mancilla Daz

MC Jos Jaime vila Valdivieso

Silvia Leticia Verdn Tern

D.R. 2013 Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios Superiores Iztacala

MC Laura Susana Ruiz Luna

PLH Jorge Arturo vila Gmora

DG Jos Alfredo Hidalgo Escobedo

DG Elih Gamboa Mijangos

Libro financiado por el Programa de Apoyo a Proyectos

Impreso y hecho en Mxico

Silvia Leticia Verdn Tern

Leticia Moreno Fierros

Norma Rebeca Rojo Botello

Ana Lilia Garca Hernndez

Maritza Omaa Molina

Alfredo Meneses Aguirre

scar de Jess Nieto Yez

Figura 3.1. Tratamientos previos de las muestras antes de su inclusin 18

Cuadro 1.1. Mtodos de obtencin de muestra 5

IV Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

C grados centgrados H2O2 perxido de hidrgeno

VI Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

VIII Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

Para empezar con la tcnica histolgica se debe obtener una muestra de

4 Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

Cuadro 1.1. Mtodos de obtencin de muestra.

La fijacin es el proceso de preservacin (lo ms cercano a su estado origi-

primera parte Tcnica histolgica

Mtodos fsicos. Los principales agentes fsicos utilizados para fijar

6 Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

2.1. Tipos de fijadores qumicos

Los fijadores qumicos se dividen en dos grandes grupos:

primera parte Tcnica histolgica

Cuadro 2.1. Tipos de fijadores qumicos.

Asimismo, los fijadores qumicos pueden agruparse por el tipo de fi-

Cuadro 2.2. Tipos de fijacin qumica.

8 Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

Cuadro 2.3. Fijadores ms usados en inmunohistologa.

Observaciones No usar despus de 15 das de elaborado.

primera parte Tcnica histolgica

10 Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

primera parte Tcnica histolgica

Procedimiento para fijar tejido en solucin de sales de zinc. A)

** Para informacin detallada del procedimiento de inmunohistoqumica en tejido

*Un agente caotrpico es una sustancia que desorganiza la estruc-

12 Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

Para la obtencin de cortes finos es un requisito indispensable que el tejido

Para realizar la inclusin en medios hidrofbicos como la parafina, los

primera parte Tcnica histolgica

La deshidratacin es el proceso que tiene por finalidad la eli-

El proceso de deshidratacin suele realizarse mediante el empleo

Est en funcin del volumen de los fragmentos titulares y de su

14 Manual de Mtodos Histolgicos e Inmunohistoqumicos

Existen varios y su eleccin depender de su rapidez para eli-

Es el proceso que tiene por objeto rellenar o infiltrar completa-