Rle du biologiste cytologiste

dans les syndromes

lymphoprolifratifs chroniques

Dr. Yal BERDA-HADDAD

CHU Conception, Marseille

7mes journes de Biologie Hospitalire

Les Mnuires, 17 Mars 2010
 Cas Clinique (1)
Mr. C. g de 87 ans, hospitalis en rhumatologie pour :
- chute et fracture vertbrale
- pneumopathie
Etat gnral : altr
Syndrome tumoral : ADP axillaire droite
Bilans biologiques :
- Biochimie : CRP 118 mg/L, Ure 13 mmol/L, Crat 120 mol/l
Prot 56 g/L, LDH 315 UI/L, 2 microglobuline 8,23 mg/l
Hypogamma. svre (4,9%)
- Immunologie :
IF : IgM lamda mc discrte + chane lgre libre mc lambda
discrte (Ratio K/L : 0.042)
Urine : PBJ lambda discte
 Cas Clinique (2)
Bilan dentre : Hmogramme
Hyperleucocytose
 Cas Clinique (3)
VL

Lymphocytose

FROTTIS SANGUIN : Vrification

-pour LYMPHOCYTOSE > 4 G/L
-pour alarmes automate ADVIA 2120 : ATYP++, LSHIFT+++

Lymphocytose vraie : oui ou non? Mature ?

Si oui : aspect morphologique des lymphocytes Monomorphe ?
Malin ?
Ticket ADVIA
 Frottis sanguins (1)

x50
x10
 Frottis sanguins (2)

x100
Lymphocytes de petite taille, cytoplasme peu abondant
Chromatine compacte: 3-4 blocs volumineux ou en blocs plus petits (aspect de damier)
Absence de nuclole visible
Au total :
Prsence dassez nombreuses ombres de Gumprcht
Population monomorphe de lymphocytes matures,
daspect bien diffrenci
 Conclusion : Cas clinique
Diagnostic Leucmie Lymphode Chronique
(LLC) voqu :
- Aspect cytologique ++
- 2 microglobuline 8,23 mg/l (N:3)
- Hypogamma. svre (4,9%)
- Prsence dun composant monoclonal (IgM)
- Age
- ADP
 Dmarche Diagnostique
Aspect morphologique vocateur dune
Leucmie Lymphode Chronique (LLC)

Orientation diagnostique

Confirmation du diagnostic cytologique

par Cytomtrie en Flux

Confrontation Cytologie / Cytomtrie en Flux

 Diagnostic de LLC (1)
Lymphocytose sanguine : > 5 G/l (1996 NCI criteria)
Nouveaux critres diagnostiques 2009 LLC: (IWCLL)

Lymphocytose B monoclonale (MBL) :

- Prvalence : 3,5% et 5% si > 60 ans
- < 5 G/L de lymphocytes B en absence dADP ou
organomgalie, cytopnies
- Reclassement 40% LLC en LLC type MBL
Cheson B D. & al, Blood, 1996; 87 (12): 4990-97 Hallek M. & al, Blood, 2008; 111 (12): 5446-56
Rawstron AC & al, Blood, 2002; 100 (2): 635-39 ASH 2009
 Une LLC typique
Mme G. ge de 78 ans GB 169 G/l

-Dcouverte fortuite GR 3,2 T/l

-AVC hmorragique Hb 122 g/l
-Abs ATCDs particuliers VGM 109 fl
Mais peu suivi sur le plan mdical Plaquettes 175 G/l
-Abs ADP PNN 3,38 G/l (2%) VL
-Abs SMG Lymphocytes 163,93 G/l (97%)
Monocytes 1,69 G/l (1%)
PNE 0 G/l
PNB 0 G/l

Population monomorphe daspect bien

diffrenci
Prsence dombres de Gumprecht
 Une LLC ou MBL ?
Mme D. ge de 53 ans
-consultation en mdecine interne GB 7,53 G/l
-bon tat gnral GR 4,18 T/l
-dcouverte fortuite Hb 136 g/l
VGM 98,4 fl
Plaquettes 273 G/l
PNN 3,19 G/l (42,4%) VL
Lymphocytes 4,03 G/l (53,5%)
Monocytes 0,24 G/l (3,2%)
PNE 0,02 G/l
PNB 0,05 G/l
Absence dalarmes qualitatives mais
Taux de lymphocytes > 4G/L
Frottis sanguin : Population monomorphe daspect bien
diffrenci
Prsence dombres de Gumprecht
 Diagnostic cytologique de LLC (2)
Forme classique ou typique : 75% des cas
Population monomorphe de petits lympho. matures (rondeur des
noyaux, chromatine compacte) associ des noyaux nus (en
nombre variable) et un petit % de lympho. atypiques :
< 10% de prolymphocytes
< 15% datypies (lymplasmocyte, noyau cliv)
< 3% de para-immunoblastes
 Diagnostic cytologique de LLC (2)
Forme classique ou typique : 75% des cas
Population monomorphe de petits lympho. matures (rondeur des
noyaux, chromatine compacte) associ des noyaux nus (en
nombre variable) et un petit % de lympho. atypiques :
< 10% de prolymphocytes
< 15% datypies (lymplasmocyte, noyau cliv)
< 3% de para-immunoblastes

Forme atypique : 15% des cas

LLC mixte : > 15% lympho tendance plasmocytaire
et/ou noyau encoch ou cliv
LLC / PL : 10 55% de prolymphocytes
LLC pliomorphique : polymorphisme cellulaire
 LLC atypiques
LLC / PL LLC / mixte

LLC atypique T12

 Examen Cytologique : 1re ligne

-Distinguer avec +/- de certitude les LLC

typiques des autres lymphoprolifrations
- Evoquer les diagnostics diffrentiels
notamment devant des aspects cytologiques
atypiques
 Diagnostics diffrentiels (1)
- Lymphocytoses polyclonales, ractionnelles
- Autres syndromes lymphoprolifratifs :
Ex : - Leucmie prolymphocytaire
- Leucmie tricholeucocytes
- Lymphome splnique lymphocytes
villeux
- Phase leucmique du lymphome du
manteau, du lymphome folliculaire ou des
prolifrations lympho-plasmocytaires
(Maladie de Waldenstrm)
 Diagnostics diffrentiels :
Aspects cytologiques (1)
- Lymphocytoses polyclonales, ractionnelles
Run ADVIA :
-alarmes morphologiques: ATYP (LUC > 4.5%), BLAST
-alarmes quantitatives : Lymphocytes > 4 G/L

Aspect polymorphe, panach, htrogne des lymphocytes :

grande taille, contour cytoplasmique bleut, aspect
monocytaire, lymphocytes hyperbasophiles,
 Diagnostics diffrentiels :
Aspects cytologiques (2)
- Leucmie prolymphocytes :
- Hyperleucocytaire
- Lymphocytose++
- SMG

Lymphocytes de taille moyenne grande,

rapport N/C bas
cytoplasme abondant, modrment basophile,
noyau arrondi,
chromatine dense avec un volumineux
nuclole (svt centrale)
 Diagnostics diffrentiels :
Aspects cytologiques (3)
- Leucmie tricholeucocytes :
- Pancytopnie : monocytopnie (0% ADVIA)
-Rare lymphocytose mais svt
qqs tricholeucocytes circulants
- SMG (75% des cas)
Lymphocytes de grande taille,
noyau rond ou rniforme,
cytoplasme non basophile
tendu daspect chevelu,
chromatine daspect monocytaire

Aspect duf au plat.

Attention : aux artfacts, importance de la qualit des frottis..

 Diagnostics diffrentiels :
Aspects cytologiques (4)
- Phase leucmique / lymphome splnique
lymphocytes villeux :
Mme B, 83 ans, fait une chute chez elle.
Fracture du col du fmur hospitalisation en
traumatologie. GB 18,6 G/l
Sur le bilan pr-opratoire : GR 3,8 T/l
Hb 104 g/l
VGM 82,5 fl
Plaquettes 725 G/l
PNN 9,54 G/l
Lymphocytes 7,88 G/l
Monocytes 0,84 G/l
PN osinophiles 0,8 G/l
LUC: 10.4% PN basophiles 0,15 G/l
 Diagnostics diffrentiels :
Aspects cytologiques (4)
- Phase leucmique / lymphome splnique
lymphocytes villeux :
- Lymphocytose absente ou modre
- 20% de lymphocytes villeux (SLVL)
- SMG

Aspect homogne,
Lymphocytes + grand quun lympho. N
noyau rond,
cytoplasme irrgulier
avec villosits de rpartition polaire
chromatine motte, +/- nuclole
 Diagnostics diffrentiels :
Aspects cytologiques (5)
- Prolifration lympho-plasmocytaire /
Maladie de Waldenstrm :
- Lymphocytose absente ou modre

Hmaties en rouleaux

Aspect htrogne,
polymorphisme des lymphocytes :
associant lympho. N et des lympho- plasmocytes
( noyau rond, cytoplasme abondant, +/- basophile
chromatine motte, +/- nuclole) voire des
plasmocytes (noyau excentr, archoplasme)
 Diagnostics diffrentiels :
Aspects cytologiques (6)
- Phase leucmique :

Du lymphome folliculaire :
-Lymphocytose variable
-Poly ADP profondes
Centrocytes : Lymphocytes de taille > lympho. N
rapport N/C trs lev
cytoplasme peu visible,
noyau irrgulier, cliv (encoche troite et
profonde, clivage en coup dongle)
chromatine paisse mais non motte

Aspect monomorphe, absence de cytoplasme

Aspect en grain de caf
Centroblastes : Lymphocytes de grande taille, non cliv
cytoplasme basophile en couronne (rare)
 Diagnostics diffrentiels :
Aspects cytologiques (7)
- Phase leucmique :

Du lymphome du manteau :
-Lymphocytose au diagnostic (25% des cas)
-Poly ADP dissmines
-SMG
F. Typique : Lymphocytes de taille petite moyenne
cytoplasme peu tendu,
noyau irrgulier,
chromatine lche,
un nuclole de petite taille bien visible
Aspect homogne, contour nuclaire irrgulier

Attention : Il peut exister un certain polymorphisme en

taille et en forme mais on conserve les mmes Diag. LLC atypique
caractristiques chromatiniennes et cytoplasmiques
En Conclusion
 Diffrentiation
Important regarder: Lympho- Encoches
Diagnostics diffrentiels Plasmocytaire

Nuclole

Taille
 Confirmation diagnostique par
immunophnotypage en
cytomtrie en flux

Outil essentiel dans le :

- Diagnostic (++ pour les formes cytologiques difficiles)
- Pronostic
- Suivi
 Cytomtrie en flux (1)
Mise en vidence dune population monoclonale de
lymphocytes B immunologiquement immatures
1. Etude de la monoclonalit :
- Expression dIg de surface chaine lgre ou
dintensit faible.
2. Marqueurs de la ligne B:
B CD19, CD20, CD22, CD79b, FMC7
3. Marqueurs atypiques : CD5, CD23

Score de MATUTES : 5 marqueurs qui

permettent lattribution de points en fonction :
-de la prsence ou labsence de certains Ag la
surface des lymphocytes B
- du niveau dexpression de certains marqueurs
 Cytomtrie en flux (2)
Point
Marqueurs 0 1

IgS ++ / +++ intra ou + faible Confrontation

CD5 - + Cytologie / CMF
CD23 - +
CD22 / CD79b ++ / +++ - ou + faible
FMC7 + -
Diagnostic
fiable
Variation du score : 5 0
96 % des LLC ont un score 3:
Score = 4 - 5 : LLC typique
Score = 3 : LLC atypique
95 % des Non-LLC ont un score < 3
 Facteurs pronostiques de la LLC (1)
Facteurs clinico-biologiques
Age AEG
Synd. tumoral, Transformation de la maladie
Stade clinique (classification de Rai ou Binet)

Binet: Stade A: MS 12ans; B: MS 5ans; C: MS 2ans
Temps de doublement des lymphocytes

< 1 an MS : 6 ans

> 1 an MS : 15 ans

Surveillance 3 4 NF /an la 1re anne
Morphologie atypique (>10% prolympho.)

Anatomopathologie : type dinfiltration

-Diffuse : MS 4 ans - Autre : MS 14 ans

Marqueurs biologiques de la tumeur :

2 microglobuline (> 2-2.5 mg/l), CD23 soluble
Thymidine Kinase LDH
 Facteurs pronostiques de la LLC (2)
Cytogntique : (FISH+++ )
-aN MS : 5-6 ans - Normal MS > 10 ans
Anomalie Incidence Survie mdiane Clinique / morphologie
(%) (mois)
del 13q14 55 133
del 11q22 18 79 ADP +++
trisomie 12 16 114 morpho. atypique
del 17p13 7 32 morpho atyp. + Rs Purines
del 6q21 5 --- ADP +++
Etude molculaire : Ig VH
-Statut mutationnel des gnes des rgions variables des ch. lourdes des
Ig : mvs pronostic si absence de mutations
Cytomtrie en Flux : CD38 et ZAP 70
-Nouveaux marqueurs de substitution du statut mutationnel
- ZAP 70 + = mvs pronostic , corrl dans 75% des cas au statut mutationnel
Rponse au traitement : MRD
Vronse L & al, Ann Biol Clin, 2008; 66 (4): 371-7
 Intrt pour le patient ?
En pratique :

tude cytogntique au diagnostic

2 microglobuline

CD38, ZAP 70
Amlioration de la mdiane de survie
Mais faire un diagnostic de LLC peut encore avoir
un impact significatif sur la survie des patients
(surtout les plus jeunes..)
Dpistage des patients de mauvais pronostic

Inclure les patients dans de nouveaux protocoles

thrapeutiques
 Thrapeutique
Actuellement : si stade A mvs pronostic : surveillance
Stade A = Abstention thrapeutique
Si stade B ou C = Traitement (FISH : del(17p) ++)
Consensus : Fludarabine (Fludara) + Cyclophosphamide
(Endoxan) + Rituximab (Anti-CD20, Mabthra) (FCR)
- Essai (CLL8): FCR vs FC: taux et dure de rponse ++
Rponse objective 95 % (FCR) vs 88% (FC)
Rponse complte 52% vs 27%
A 2 ans : PFS 76%
Si del17p : CI la fludarabine
-Alemtuzumab (anti-CD52, MabCampath) : 30 50% de
rponse en monothrapie ou polychimiothrapie
Nouveaux agents :
-Bendamustine (essai 67% OR vs 30%): FDA 2008
-Bendamustine + Rituximab (CLL10, rechute)
-Ofatumumab : nouvel anti-CD20
ASH2009
Rle du biologiste cytologiste
dans les macrothrombopnies

A propos dun cas danomalie de

May Hegglin
 Cas clinique (1)
Jeune fille ge de 16 ans dorigine comorienne,
hospitalise pour fivre avec ruption cutane
vocatrice de varicelle.
Tableau clinique : lsions cutanes diffuses,
vsiculeuses typiques dune varicelle.
Pas de purpura. Absence dhmorragie extriorise.
Absence de HSMG
Examens radiologiques : syndrome interstitiel
vocateur dune pneumopathie varicelleuse.
Examens biologiques :
- Hmogramme demand avt son admission / son mdecin
traitant met en vidence une Thrombopnie 20 G/L.
- Absence dATCD de bilans biologiques

Schleinitz N & al, Revue de Med. interne, 2006

 Cas clinique (2)
Hmogramme son entre : GB 4,45 G/l
GR 3,81 T/l
Hb 117 g/l
VGM 88,8 fl
Plaquettes 32 G/l
VPM 16,1 fl
PNN 1,51 G/l
Lymphocytes 2,27 G/l
Monocytes 0,27 G/l
PN osinophiles 0,36 G/l
PN basophiles 0,04 G/l

Frottis sanguin :
aN quantitative : thrombopnie svre
et qualitative : VPM+++, et courbe irrgulire
 Conduite tenir au laboratoire
Vrification du caractre vraie de la thrombopnie
: - citrate? - caillot?
Observation du frottis sanguin :
- Vrification de labsence damas plaquettaire
- taille des plaquettes : grandes, gantes, anisocytose
plaquettaire
- granularit des plaquettes: dgranulation ?
Vrification / comptage optique du nombre de
plaquettes en cellule de Malassez aprs dilution en
Unopette
- Pourquoi? : Grande plaquette non prise en compte
dans les canaux de comptage.
Probable sous estimation du taux de plaquettes
Observation cytologique (1)

Prsence de macroplaquettes bien granuleuses

Estimation du taux de plaquettes sur frottis
Confirmation par cellule de Malassez

Plaquette gante
non compte
 Observation cytologique (2)

Prsence de macroplaquettes bien

granuleuses associe la prsence de
PNN ayant des Corps de Dhle dans le
cytoplasme =Inclusions bleu ple (x100)

Anomalie de May Hegglin

Corps de Dhle
 Pour le patient :

Examen du frottis primordial afin dviter des

explorations complmentaires inutiles
Variabilit intra-individuelle du taux de
plaquettes :
- difficult numrer le taux de plaquette
(technique manuelle)
- comptage en Malassez assez rare avec les
nouveaux automates (bonne dtection des taux
bas de plaquettes sauf si souci de taille..)
 Pour le clinicien :
Eliminer les autres macrothrombopnies :

- Macrothrombopnie mditerranenne

Confirmer le diagnostic : MYH9

- Code pour la chane lourde de la myosine IIA non
musculaire (NMMHC-IIA)
Eviter des thrapeutiques inefficaces
(ex: thrombopnie dorigine immunologique (PTAI) :
Coombs rythrocytaire et MAIPA : ngatifs)
Proposer une enqute familiale
Saito H & al, AM. J. Hematol, 2008, 83 : 304-306
 Marqueurs pronostiques
Nathalie Gachard et al. Haematologica | 2008; 93(2) | 215 |

Nombreux Mutation Ig VH, CD38, FISH, ZAP-70

Indpendants

Complmentaires

Valeur statistique (corrlation entre les marqueurs)

ZAP-70 / Mutation Ig VH : 87% (CD38 / Mutation Ig
VH : 65%)
ZAP-70 / CD38 : 67%
ZAP-70 + dans del (17p13)
ZAP-70 dans del (13q14)
ZAP-70 + dans stade A : 28%
ZAP-70 + dans stade B : 54%
ZAP-70 + dans stade C : 61%